Cos’è la terapia genicaCos’è la terapia genica

Per terapia genica si intende l'introduzione di un gene che ha come effetto quello di prevenire o correggere una condizione patologica.

Tipi di terapia genicaTipi di terapia genica

Somatica: Manipolare l’espressione genica in cellule del paziente, permettendo di trasferire tale mutazione alla progenie

Germinale: modificare geneticamente le cellule germinali per trasferire il cambiamento alla progenie

StrategieStrategie terapeuticheterapeutiche

• Sostituire/inattivare una mutazione negativa dominante (sostituire il gene dominante nel suo locus o degradare selettivamente il suo RNA)

• Compensare una mutazione che causa la perdita di una funzione cellulare (sostituzione del gene perso o difettivo) ad esempio in patologie autosomiche recessive o autosomiche dominanti caratterizzate da aploinsufficienza)

Strategie terapeuticheStrategie terapeutiche

• Uccisione diretta di cellule patologiche (in genere tumorali)

• Uccisione di cellule patologiche mediata dal sistema immunitario (tumori)

Il vettoreIl vettore

• Per trasferire il transgene nella cellula bersaglio è necessario disporre di un sistema in grado di veicolarvi all’interno il DNA, cioè un VETTOREVETTORE.

• Un vettore efficiente deve: Essere selettivo Entrare facilmente nelle cellule-target Essere esprimibile in elevate quantità Essere sicuro

• Esistono due grandi categorie di vettori che consentono il trasferimento genico:

Vettori non viraliVettori non virali: si basano sull’uso di DNA, da solo o complessato a molecole che ne facilitino l’ingresso nella cellula.

Vettori viraliVettori virali: si basano sull’utilizzo di virus opportunamente modificati in modo tale da poter veicolare il loro genoma all’interno delle cellule bersaglio, senza dare malattia.

VETTORI VIRALIVETTORI VIRALI• I virus hanno un'ottima tendenza ad infettare le cellule ed ad inserirvi il proprio DNA sia integrandolo sia sotto forma d'episoma.

• Rispetto ai sistemi di trasferimento non virali, quindi, hanno un'efficienza nettamente maggiore.

• I virus attualmente studiati quali vettori per la terapia genica sono Retrovirus Adenovirus Virus AdenoAssociati

• Si ottengono inserendo il gene di interesse nel genoma di diversi tipi di virus, sotto il controllo di un promotore forte.

• Il virus viene reso incapace di riprodursi autonomamente, per evitare la diffusione di virus ricombinanti (virus difettivo). A tal scopo molti geni virali dei vettori sono rimossi e sostituiti dal gene bersaglio e da elementi regolatori

Clonaggio con doppia digestioneClonaggio con doppia digestione

GCTTAA

AGCTT A

DNA ligasi

GAATTCCTTAAG

EcoRI

AAGCTTTTCGAA

HindIII

GAATT

CCTT

AAG

AAGCTT

TTCGAA

GAATTCCTTAAG

AAGCTTTTCGAA

AATTC G

ATTCGA

EcoRI HindIII

Gene target

GAATTCCTTAAG

AAGCTTTTCGAA

AATTC G

ATTCGA

EcoRI HindIII

pShuttle pShuttle

pShuttle+

Gene target

DNA ligasiDNA ligasi

GAATT

CCTT

AAG

AAGCTT

TTCGAA

DNA ligasi

Vettori viraliVettori virali

Virus difettivi: possono essere prodotti solo grazie a particolari linee cellulari capaci di complementare i difetti del virus. La loro preparazione deve seguire queste fasi obbligate:

1. Costruzione del genoma ricombinante

2. Trasfezione del DNA nella linea cellulare capace di produrre le particelle virali (linee di packaging)

3. Raccolta e analisi del virus

Vettori virali: Vettori virali: caratteristiche principalicaratteristiche principali

• Retrovirus : Sono stati i primi virus ad essere studiati per la terapia genica. Possono infettare solo cellule in divisione e si integrano stabilmente in maniera casuale.

• Lentivirus : derivati del virus dell'HIV, possono infettare cellule quiescenti e si integrano stabilmente in maniera casuale.

• Adenovirus: Sono espressi ad alti livelli, non si integrano stabilmente e danno grosse reazioni immunitarie.

• Virus adeno-associati (AAV): integrazione sito specifica ed espressione stabile nel tempo, difficile produrli ad alto titolo. Non causano patologie.

• Il genoma tipico contiene tre geni:– gag: codifica per le proteine strutturali– pol : codifica per gli enzimi trascrittasi inversa, proteasi e integrasi– env: codifica per le proteine di membrana– Psi (ϕ): Sequenza necessaria per il packaging (impacchettamento)

RetrovirusRetrovirus• I retrovirus presentano due filamenti di RNA complessati con varie proteine, un capside ed un involucro lipidico (envelope). Possiedono una funzione di trascrittasi inversa, capace di sintetizzare una forma di DNA complementare che può integrarsi nel DNA cromosomico.

• Ad ognuna delle due estremità esiste un segmento di DNA, formato dalle unità ripetitive terminali o LTR. Queste unità LTR agiscono come promoter, regolando l’espressione dei geni virali edinoltre permettono al virus di integrare il proprio genoma entro i cromosomi delle cellule infettate.

• I vettori retrovirali possono veicolare inserti di DNA lunghi sino a 8kb.

• Il retrovirus si lega a specifici recettori situati sulla membrana cellulare della cellula ospite (il recettore CD4 della superficie cellulare e recettore delle chemochine a sette domini transmembrana associato a G protein).

• Si ha quindi la fusione dell’involucro lipidico virale con quello della cellula, e il virus viene rilasciato nel citoplasma e l’RNA viene liberato dall’involucro capsidico.

• L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNAin DNA a doppio filamento nel citoplasma della cellula infetta.

• Il DNA lineare migra nel nucleo e vieneintegrato nel DNA della cellula ospite mediante l’enzima integrasi prodottodal virus. Il DNA integrato è chiamatoprovirus.

• L’apparato della cellula ospite trascrive il provirus producendo RNA virali che saranno incapsidati nei nuovi virioni.

Ciclo vitale di un RetrovirusCiclo vitale di un Retrovirus

Vettori retrovirali difettivi per replicazioneVettori retrovirali difettivi per replicazione

Linea cellulare di packaging: Fibroblasti 3T3 murini

Plasmide

GeneGeneLTR Psi +

Particelle virali ricombinanti

Psi -Gag Pol EnvLTR

Virus difettivo integrato

GeneGeneLTR Psi +

Psi -Gag Pol EnvLTR

Virus difettivo integrato

LentivirusLentivirus

• I Lentivirus sono una sotto-classe di retrovirus di cui condividono la morfologia ed il ciclo replicativo ma a differenza dei precedenti, possono infettare ed integrarsi anche in cellule quiescenti

• Hanno una struttura più complessa:

– oltre ai geni gag, pol ed env, il genoma contiene due geni regolatori , tat e rev essenziali per il controllo dell’espressione genica, ed un numero variabile di geni accessori.

• Derivano dal virus dell'HIV opportunamente modificato per garantire la sicurezza del ricevente.

Vantaggi

• Il DNA del vettore si integra stabilmente nel genoma

• Il gene terapeutico viene trasmesso alle cellule figlie in seguito a divisione cellulare.

Limiti

• L’infezione delle cellule richiede la replicazione cellulare, cosa che esclude il loro utilizzo nella cura delle patologie che interessano i tessuti non in divisione come quelle del sistema nervoso.

• Si integrano nel genoma cellulare in modo relativamente casuale, provocando inserzioni mutageniche con potenziale danno alle cellule

• La loro produzione è estremamente costosa

• La semplice iniezione dei vettori retrovirali non è sufficiente per una terapia genica in vivo, perchè essi vengono uccisi dal sistema Immunitario umano mediante l'attivazione del complemento.

I Retrovirus nella terapia genicaI Retrovirus nella terapia genica

• L’adenovirus è un patogeno naturale dell’uomo con un genoma a DNA a doppio filamento.

• Ad oggi se ne conoscono ben 51 sierotipi, in grado di infettare 6 diverse specie, causando un’ampia gamma di patologie diverse, da malattie respiratorie a congiuntiviti, a gastroenteriti.

• I vettori adenovirali possono essere prodotti con titoli elevatissimi e solitamente accettano inserti grandi sino a 7-8kb.

• L'ingresso nelle cellule avviene mediante endocitosi mediata da recettori, ma il DNA inserito non sembra integrarsi e quindi l'espressione dei geni inseriti può essere mantenuta solo per brevi periodi.

• Può infettare molti tipi di cellule

AdenovirusAdenovirus

• Tutti gli adenovirus hanno una simmetria icosaedrica

• Essi sono composti da 252

capsomeri di cui 240 esoni

e 12 pentoni al vertice dell’icosaedro

• Una glicoproteina (Fibra) protrude dal centro del pentone. Essa è responsabile dell’attacco del virus al recettore della cellula ospite.

StrutturaStruttura

ITR E1A/BL5

E2B ITRE3L1 L2 L3 L4

VAE4

genoma virale

Il genoma degli adenovirus è apprissimativamente di 36 kb Sono individuabili regioni codificanti per geni espressi precocemente (early, E) e tardivamente (late, L).

Ai due lati del genomasi trovano le cosiddettesequenze terminaliinvertite (ITR, Inverted Terminal Repeat) le quali sono necessarie per la replicazione del virus.

Nel nucleo cellulare vengono espressi per primi i geni E1 (detti precoci immediati) chepermettono la transattivazione dei geni E2 ed E4 che determinano il blocco dellasintesi proteica cellulare e partecipano alla replicazione del DNA virale.

Una volta che è iniziata la replicazione, vengono attivati i geni tardivi che codificano per le proteine strutturali che nel nucleo cellulare si assemblano intrappolando il DNA dell'adenovirus virale.

GenomaGenoma

• Il legame dell’adenovirus alla superficie cellulare avviene in due fasi:

- Le proteine della fibra virale interagiscono con il recettore CAR (recettore degli adenovirus coxsackie).

- La regione RGD del pentone interagisce con alcune integrine di membrana (53 o 55)

• Il legame promuovel’internalizzazione perendocitosi mediata da recettore in una vescicolaricoperta da clatrina.

• Il virus lisa la vescicola endosomiale

• il capside rilascia il genoma a DNA nel nucleo.

CAR Integrin

lysosome

Microtubules

Dynein

Nucleus

Cell membrane

Viral gene transcription

Receptor-mediated endocytosis

Endosomal escape

Cytoplasmic transport

Ciclo vitale di un AdenovirusCiclo vitale di un Adenovirus

VETTORI ADENOVIRALIVETTORI ADENOVIRALI

• Inserimento del gene terapeutico mediante ricombinazione omologaricombinazione omologa (quantità massima di DNA trasportato : 8 kb)

• Gli adenovirus ricombinanti usati come vettori presentano una delezione almeno della regione E1 il che rende il virus difettivo per la replicazione

ITR E1A/BL5

E2B ITRE3L1 L2 L3 L4

VAE4

genoma virale

genoma virale

ITR E1A/B

transgene vettore navetta

ITRL5

E2B ITRE3L1 L2 L3 L4

VAE4

vettore adenovirale

transgene

ricombinazione

Generalmente gli adenovirus ricombinanti presentano una delezione sia della regione E1 che di quella E3.

Si è visto, però, che talune cellule infettate da questo vettore esprimono i geni rimanenti in quantità basse, ma sufficienti ad evocare una risposta citotossica ingrado d'eliminarle.

Studi successivi hanno permesso d'ottenere vettori ricombinanti aventi anche una delezione delle regioni E2 o E4 ma ciò ha determinato una riduzione dell'espressione genica.

VETTORI ADENOVIRALIVETTORI ADENOVIRALI

VETTORI ADENOVIRALI HDVETTORI ADENOVIRALI HD

Attualmente si è ottenuta una terza generazione di vettori ricombinanti (Helper Dependent o anche high Capacity) in cui tutti i geni virali sono stati eliminatie sono rimaste solamente le regioni ITR e la sequenza di packaging a fianco del gened'interesse.

La produzione di questo tipo di virus utilizza cellule trasfettate stabilmente con E1 ed una ricombinasi chiamata CRE, che è in grado di tagliare il segnale di impacchettamento delvirus helper contente tutti i geni virali tranne E1,e che ha la funzione di provvedere allatrascrizione di tutte le proteine del capside del vettore helper dependent.

Il virus helper al contrario non può impacchettarsi in quanto mancante del segnale di impacchettamento poiché exciso dalla proteina CRE.

genoma virale plasmidico

ITR

transgenevettore navetta

ITR E2A/B ITR

L1 L2 L3 L4

VA

E4

transgene

E2A/B ITR

L1 L2 L3 L4

VA

E4

promoter

promoter

ITR E2B ITR

transgenepromoter

taglio mediato da Cre

loxP

L5

L5

ricombinazione in cellule 293

Vantaggi

• Largo numero di tipi cellulari bersaglio ed alta efficienza .

• Non richiede che la cellula ospite sia in divisione.

• Il DNA virale esiste come episoma e non si incorpora stabilmente nel genoma delle cellule bersaglio, eliminando così il rischio di cancerogenesi.

Limiti

• Rapida inattivazione delle cellule infettate dall’adenovirus.

• Avviene una progressiva perdita dell’episoma che porta generalmente ad una espressione transitoria.

Gli Adenovirus nella terapia genicaGli Adenovirus nella terapia genica

• I virus adeno-associati sono virus umani non patogeni che appartengono alla classe dei parvovirus (piccoli virus a DNA a singolo filamento).

• Il virione è molto piccolo e privo di un involucro lipidico.

• Le ridotte dimensioni del virione non permettono l’inserimento di DNA esogeno di lunghezza superiore a 4 Kb e questo comporta notevoli limitazioni al loro utilizzo.

• Ad oggi ne sono stati descritti 11 sierotipi, in grado di infettare cellule di diversi tessuti, anche non attivamente proliferanti.

Virus Adeno-associato (AAV)Virus Adeno-associato (AAV)

StrutturaStruttura

Il loro genoma è costituito da un singolo filamento di DNA costituito da due geni:

Rep che codifica per le proteine implicate nella replicazione e nell'integrazione

Cap per le proteine del capside.

A ciascuna estremità vi è una sequenza regolatoria terminale ripetuta, ITR (inverted terminal repeats), di145bp contenente un promotore.

Quando tale virus viene utilizzato come vettore, i due geni rep e cap vengono sostituiti con il gene di interesse e le regioni regolatrici ad esso correlate.

Gli AAV sono incapaci di replicare autonomamente:

Il loro ciclo vitale richiede la presenza di un virus di dimensioni superiori (virus helper), quasi sempre un adenovirus o un herpes virus.

In assenza del virus helper, l’AAV si integra in una regione ben precisa sul cromosoma 19 ed esprime i suoi geni a livelli molto bassi, infettando la cellula in modo latente.

Se questa cellula viene poi infettata da un virus “helper”, il genoma dell’AAV viene estratto dal DNA genomico e replicato, le proteine virali vengono prodotte ad alti livelli, avviene l’assemblamento delle particelle virali e il loro rilascio.

Il vettore basato sui virus adenoassociatiricombinanti è costruito sostituendo il geneterapeutico a cap e rep. La produzione d'unsimile vettore la si ottiene trasfettando una linea cellulare (HEK293) con un plasmide contenente i geni cap e rep e Successivamente infettandola con unadenovirus helper difettivo per E1.

Ciclo vitale di AAVCiclo vitale di AAV

Vantaggi

• Non causano infiammazioni e non sono responsabili di nessuna patologia che colpisca l’uomo.

• Mancanza di reazioni immunitarie → questi virus danno luogo ad un'espressionegenica a lungo termine e con un elevato grado di sicurezza.

• Normalmente il virus non modificato si integra nel genoma della cellula bersaglio ad uno specifico locus del cromosoma 19, eliminando così il rischio di inserzioni casuali.

Limiti

• Hanno una ridotta capacità a trasportare geni estranei (solo 4 kb, la metà rispetto agli adenovirus).

I Virus AdenoAssociati nella terapia genicaI Virus AdenoAssociati nella terapia genica