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CCuuaaddeerrnnoo ddee PPrrááccttiiccaass
MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGÍÍAA CCLLÍÍNNIICCAA
CCuurrssoo 22001122--1133
FACULTAD DE FARMACIA
Alumno:
1
LUNES
ASPECTOS GENERALES
Normas de bioseguridad en el laboratorio
Medios de contención
Niveles de bioseguridad
Gestión y tratamiento de los residuos
Aspectos generales infecciones urinarias
Toma de muestra de orina
REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA
ANÁLISIS CUANTITATIVO
ORINA L-1
Siembra de la muestra de orina
(Bote nº 2)
en Agar CLED
ANÁLISIS CUALITATIVO
ORINA L-2
Siembra de la muestra de orina
(Bote nº 1) en Agar Cromogénico y Agar MacConkey
ANÁLISIS CUALITATIVO
MUCOSA FARÍNGEA
L-3 Toma de muestra
de mucosa faríngea
L-4 Siembra
de dos placas de Agar Sangre
L-5 Siembra
de una placa de Agar Salino Manitol
2
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA CLÍNICA LABORATORIO DE NIVEL DE BIOSEGURIDAD 2
Los agentes biológicos se clasifican en cuatro grupos de riesgo en
función de los siguientes factores:
Virulencia
Dosis infectiva del microorganismo
Disponibilidad de tratamiento
Modo de transmisión en el laboratorio
Riesgo de difusión en la comunidad
Viabilidad del microorganismo en el entorno
GRUPO
DE RIESGO PATOGENICIDAD
1
No suelen causar enfermedad en personas sanas
2
Causan infecciones moderadas o graves
Las infecciones suelen ser de buen pronóstico
Generalmente no se transmiten por vía aérea Se suelen transmitir por contacto o ingestión
Es difícil su propagación en la comunidad
Existen tratamiento y profilaxis eficaces
3
Causan infecciones graves
Algunos se transmiten por vía aérea
Pueden propagarse en la comunidad
La terapia es de eficacia variable
4
Causan infecciones graves o muy graves
Muchos se transmiten por vía aérea Se propagan fácilmente en la comunidad
La terapia no es muy eficaz
3
GRUPO
DE RIESGO ALGUNOS EJEMPLOS
1
BACTERIAS:
Escherichia coli
Staphylococcus epidermidis
Lactobacillus bulgaricus Streptococcus lactis
Streptomyces sp.
HONGOS:
Saccharomyces cerevisiae
Penicillium roqueforti
2
BACTERIAS:
Bordetella pertussis
Clostridium botulinum Clostridium tetani
Corynebacterium diphtheriae
Staphylococcus aureus
Streptococcus sp. Haemophilus influenzae
Salmonella enterica
Shigella sp.
Yersinia enterocolitica Legionella
Neisseria sp.
Treponema pallidum
HONGOS:
Aspergillus sp.
Candida sp.
Cryptococcus neoformans
VIRUS:
Adenovirus Rotavirus
Virus de la hepatitis A
Virus de la gripe
Virus del sarampión Virus de las paperas
Virus de la rubéola
PARÁSITOS:
Cryptosporidium sp.
Entamoeba histolytica
Toxoplasma gondii
Trichinella
4
3
BACTERIAS:
Bacillus anthracis
Brucella
Escherichia coli enterotoxigénica Francisella tularensis
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium leprae
Rickettsia Salmonella typhi
Shigella dysenteriae
Yersinia pestis
HONGOS:
Blastomyces dermatitidis
Coccidioides immitis
Histoplasma capsulatum
VIRUS:
Virus de la encefalitis de California
Virus de la encefalitis equina americana
Virus de la estomatitis vesicular Virus de la hepatitis B
Virus de la hepatitis C
Virus de la hepatitis D
Virus de la fiebre amarilla Virus de la inmunodeficiencia humana (HIV)
PARÁSITOS:
Echinococcus Leishmania brasiliensis
Leishmania donovani
Plasmodium falciparum
Taenia solium
Tripanosoma cruzi
4
VIRUS:
Virus de la viruela
Virus de la fiebre hemorrágica de Crimea (Congo) Virus de Marburg
Virus Ébola
5
Según el grupo de riesgo al que pertenezca un determinado
microorganismo su estudio deberá ser llevado a cabo en laboratorios
con mayores o menores medidas de bioseguridad.
MICROORGANISMOS
RIESGO
PROVOCADO
TIPO DE
LABORATORIO
GRUPO DE RIESGO
1
INDIVIDUAL Bajo
COLECTIVO Bajo
BÁSICO
(Enseñanza)
GRUPO DE RIESGO 2
INDIVIDUAL Moderado COLECTIVO Moderado
SEGURIDAD (Hospital)
GRUPO DE RIESGO
3
INDIVIDUAL Elevado
COLECTIVO Elevado
ALTA SEGURIDAD
(Diagnóstico
especializado)
GRUPO DE RIESGO
4
INDIVIDUAL Elevado
COLECTIVO Elevado
MÁXIMA
SEGURIDAD
(Servicio estatal)
Los microorganismos incluidos dentro del grupo de riesgo 2
constituyen la mayoría de los que se manipulan habitualmente en los Laboratorios de Microbiología Clínica.
Por lo que se refiere a las prácticas de nuestra asignatura estos
son los microorganismos que normalmente podremos encontrar en
las muestras personales que se han tomado, y que se van a manipular tratando de establecer la identificación y susceptibilidad
antimicrobiana de algunos de ellos.
6
MEDIOS DE CONTENCIÓN
El término contención se utiliza para describir los métodos que
hacen segura la manipulación de los agentes infecciosos en el laboratorio y su objetivo es reducir al mínimo la exposición del
personal y del entorno a agentes potencialmente patógenos.
Para la seguridad de los laboratorios de Microbiología Clínica son
importantes tres elementos de contención:
1. BARRERAS PRIMARIAS:
Constituyen la primera línea de protección y pertenecen a esta categoría los siguientes elementos:
Batas
Gorros Guantes
Gafas
Mascarillas
Cabinas de Seguridad Biológica
2. BARRERAS SECUNDARIAS:
Se refieren a las normas que deben cumplirse para la construcción de un Laboratorio de Microbiología Clínica tales como:
Alicatado
Paredes Grifos
Interruptores
Aparatos que generan ruido
Aparatos que generan calor
etc.
7
3. PROCEDIMIENTOS ESTÁNDAR:
Se refieren a la metodología de funcionamiento del laboratorio y de
la manipulación de las muestras clínicas.
1. Personal autorizado.
El laboratorio de Microbiología Clínica es un espacio restringido
y solo pueden permanecer en él personas autorizadas. Estas
personas deben conocer al responsable de seguridad del laboratorio.
2. Meticulosidad en el trabajo. Las personas deben trabajar concentradas en las
manipulaciones que están realizando y realizar todo su trabajo
con meticulosidad para minimizar el riesgo de salpicaduras,
pinchazos, cortes, formación de aerosoles, etc.
3. Costumbres improcedentes.
Las personas no deben llevarse a la boca lápices u otros
objetos.
4. Cabinas de bioseguridad.
Las actividades que generan aerosoles o salpicaduras, tales como la esterilización del asa y la agitación en “vortex”, deben
realizarse en cabinas de bioseguridad. También deben utilizarse
cabinas de bioseguridad cuando se manipulen muestras clínicas
sospechosas de contener agentes infecciosos de transmisión aérea, tales como las muestras respiratorias.
5. Material punzante y cortante. Es muy importante desechar el material punzante o cortante
(agujas, hojas de bisturí, etc.) en recipientes específicos para
ese material. No envainar las agujas una vez utilizadas.
6. Material contaminado
Desechar el material contaminado en recipientes adecuados.
Recipientes de seguridad para material de vidrio. Recipientes de
plástico o metálicos para esterilización o incineración.
7. Lavado de las manos
Se deben lavar las manos después de cada tarea o accidente. Siempre se deben lavar las manos ANTES DE SALIR DEL
LABORATORIO. Utilizar jabón neutro y frotar al menos durante
20 segundos antes de aclarar con agua.
8. Informar al Responsable de Seguridad del Laboratorio
Cualquier accidente o anomalía debe comunicarse al
responsable de seguridad del laboratorio.
8
NIVELES DE BIOSEGURIDAD
Existen cuatro niveles de bioseguridad que se corresponden con los
cuatro grupos de riesgo en que se clasifican los agentes infecciosos.
MUESTRA CLÍNICA
SOSPECHOSA DE
CONTENER
MICROORGANISMOS
TIPO DE
LABORATORIO
RECOMENDADO
PARA SU ESTUDIO
NIVEL DE
BIOSEGURIDAD
QUE DEBE TENER
EL LABORATORIO
Grupo de Riesgo 1 Básico 1
Grupo de Riesgo 2 Seguridad 2
Grupo de Riesgo 3 Alta Seguridad 3
Grupo de Riesgo 4 Máxima Seguridad 4
GESTIÓN Y TRATAMIENTO DE LOS RESIDUOS
Ante la posibilidad de contraer infecciones en el laboratorio al manipular una muestra clínica o un cultivo, parece razonable realizar
un tratamiento particularizado de los residuos infecciosos antes de
eliminarlos como residuos urbanos.
Objetos punzantes y cortantes
Los objetos punzantes y cortantes, como agujas, pipetas Pasteur de
vidrio y otros, constituyen un claro riesgo de inoculación accidental de
microorganismos. Se depositan en recipientes específicos resistentes a la punción y con cierre hermético. Es muy importante cerrar
correctamente estos recipientes, que deben ser autoclavados o
incinerados antes de desecharlos.
Líquidos infecciosos Los líquidos infecciosos deben recogerse en recipientes herméticos y
someterlos a esterilización.
Residuos sólidos Los residuos sólidos (muestras clínicas, medios de cultivo sembrados,
etc.) deben ser incinerados o esterilizados por autoclave antes de ser
desechados.
9
ASPECTOS GENERALES DE LAS INFECCIONES URINARIAS
En una persona sana el tracto urinario está libre de
microorganismos. Únicamente existe microbiota normal de forma permanente en la mucosa de la uretra.
Las infecciones del tracto urinario están causadas generalmente por
bacterias de la microbiota intestinal que, ascendiendo por la uretra,
alcanzan la vejiga urinaria y en algunos casos progresan afectando a los uréteres y los riñones.
Las infecciones urinarias se presentan con mayor frecuencia en las
mujeres que en los hombres. Ello es debido a la cortedad de la uretra lo cual facilita el tránsito de la microbiota intestinal hasta la uretra.
Por otra parte, existen ciertos modos de conducta o estados
fisiológicos que pueden favorecer la aparición de infecciones en el
tracto urinario:
- Relaciones sexuales
- Cambios morfológicos durante el embarazo
- Hipertrofia de la próstata - Reflujo vesicouretral
- Introducción de sondas permanentes
Las infecciones extrahospitalarias suelen ser monomicrobianas, mientras que las infecciones intrahospitalarias suelen ser
polimicrobianas.
RECOGIDA DE LA MUESTRA DE ORINA
SEGÚN TÉCNICA DEL CHORRO MEDIO
La técnica más utilizada para la recogida de muestras de orina es la
llamada TÉCNICA DEL CHORRO MEDIO. Esta técnica, que vamos a
describir seguidamente, es la correcta para establecer conclusiones válidas acerca del diagnóstico de un paciente. Sin embargo, y por
conveniencia de la práctica de laboratorio que vamos a realizar, la
toma de la muestra de orina la haremos, intencionadamente, de
forma incorrecta (frasco nº 1) para aumentar la probabilidad de encontrar microorganismos con los cuales poder seguir trabajando el
resto de los días de la semana, y de forma correcta (frasco nº 2) para
realizar un análisis cuantitativo de la muestra de orina que se está
procesando.
10
TÉCNICA DEL CHORRO MEDIO (METODOLOGÍA CORRECTA)
Se procede primero al lavado de las manos. Seguidamente, se lava
con agua y jabón la zona genital, se enjuaga con abundante agua y
se seca bien.
Recogida del chorro medio:
Se empieza a orinar y se recoge en el bote solo la muestra del “chorro medio”, es decir, NO SE DEBE RECOGER NI LA PRIMERA
NI LA ÚLTIMA PARTE DEL CHORRO DE ORINA. Se tapa bien el
bote, se rotula y se lleva al laboratorio lo más pronto posible. Si van
a transcurrir más de dos horas hasta su llegada al laboratorio el transporte debe realizarse manteniendo la muestra en frío (la
refrigeración no es necesaria en el caso de la muestra recogida para
las prácticas).
RECOGIDA DE LA MUESTRA DE ORINA PARA LA REALIZACIÓN
DE LA PRÁCTICA
Para la realización de la práctica realizaremos dos tomas de muestra en dos botes. Ambas tomas se recogerán por la mañana
temprano y habiendo tenido como mínimo una retención de 6-8 horas
sin orinar. Se procederá en la forma siguiente:
1. En el bote que llamaremos nº 1 se recogerá la primera porción de
orina. En este bote, la orina recogida habrá arrastrado la microbiota
existente en la mucosa uretral. Aunque esta no es la forma correcta
para hacer una evaluación del número de bacterias existentes en la orina, nos permitirá realizar un ANÁLISIS CUALITATIVO de la
muestra estudiada.
2. En el bote que llamaremos nº 2 se recogerá la muestra del chorro
medio. Esta muestra la vamos a considerar válida para realizar el
ANÁLISIS CUANTITATIVO de la muestra en estudio aunque no
se haya realizado el lavado de los genitales.
3. El resto de la orina no se recoge.
11
L-1 ANÁLISIS CUANTITATIVO DE ORINA
Siembra de la muestra de orina (Bote nº 2) en
Agar CLED
Se trata de sembrar una cierta cantidad de la muestra de orina para hacer un recuento total del número de microorganismos
presentes. El número obtenido se referirá al índice de Kass y se
establecerán conclusiones acerca de posibles infecciones del tracto
urinario (ITU).
Medio de cultivo utilizado.
Utilizaremos como medio de cultivo una placa de Agar CLED (Cistina-Lactosa-Deficiente en Electrolitos) que es un medio no
selectivo y diferencial que permite realizar la identificación presuntiva
de los principales patógenos que causan infecciones del tracto
urinario. En este medio, la deficiencia en electrolitos dificulta el
movimiento de bacterias muy móviles, como Proteus, que acabarían invadiendo toda la placa, enmascarando e impidiendo el recuento de
otras colonias.
METODOLOGÍA:
1. Introducir verticalmente en el bote de orina nº 2 un asa de
plástico estéril y calibrada de 1 μL. El bote nº 2 se corresponde con la orina tomada del chorro medio.
2. Sembrar una placa de Agar CLED en la forma indicada:
- Repartir la gota en la placa en forma diametral
- Con la misma asa hacer estrías para aislar colonias - Incubar la placa inoculada a 37º C durante 24 horas.
12
L-2 ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA
Siembra de la muestra de orina (Bote nº 1) en
Agar Cromogénico y Agar MacConkey
Se trata de sembrar una muestra de orina en medios de cultivo
para aislamiento de colonias y posterior identificación de una
enterobacteria que pudiera estar presente en la muestra de orina.
Medios de cultivo utilizados.
Utilizaremos una placa de Agar Cromogénico (medio no selectivo y
diferencial) y otra de Agar MacConkey (medio moderadamente
selectivo y diferencial). El carácter diferencial se traduce en que las
colonias crecidas presentan diferentes pigmentaciones en función de su capacidad para utilizar ciertos sustratos (presentes en el Agar
Cromogénico) y la lactosa (presente en el Agar MacConkey).
MEDIO CULTIVO
AGENTES INHIBIDORES
CRECIMIENTO GRAM +
CRECIMIENTO GRAM -
CARÁCTER DIFERENCIAL
AGAR
MACCONKEY
Sales biliares Cristal violeta - + SÍ
AGAR CROMOGÉNICO
NO + + SI
METODOLOGÍA
Sembrar la placa de Agar MacConkey de la siguiente manera:
1. Con un asa (de plástico) calibrada de 10 μL agitar el bote nº 1
desde el fondo.
2. Tomar 10 μL de la muestra con el asa y descargarlos en un
sector de la placa (sector 1) realizando estrías. Repetir la
descarga dos veces más. En total se habrán descargado 30 μL.
3. Después de la tercera descarga, sembrar otros sectores de la
placa (del sector 2 hasta el sector 7) arrastrando inóculo en
cada ocasión del sector anterior, en la forma que se indica en
el esquema, pero sin tomar más inóculo.
13
Descargar 30 μL
de la muestra
en el sector 1
Inoculación para aislamiento de colonias en Agar MacConkey
Sembrar la placa de Agar Cromogénico de la siguiente manera:
1. Dividir la placa de Agar Cromogénico en dos, dibujando un
diámetro en la base de la placa con el rotulador negro. Por
parejas, cada alumno sembrará la mitad de la placa.
2. Tomar 10 μL de la muestra con el asa y realizar estrías
continuas desde un extremo a otro de su mitad de la placa. Se
puede sembrar horizontal o verticalmente.
3. Después de la tercera descarga, sembrar otros sectores de la
placa (del sector 2 hasta el sector 7) arrastrando inóculo en
cada ocasión del sector anterior, en la forma que se indica en
el esquema, pero sin tomar más inóculo.
Tras la incubación en Agar MacConkey, las bacterias que fermentan
la lactosa producen ácidos que cambian el pH del medio, por lo que
se produce el viraje del indicador. En función de la mayor o menor
cantidad de ácidos liberados, el pH baja más o menos y las colonias
6
5
4
7
1 2
3
14
aparecen finalmente con diferentes colores. Esta diferencia en la
coloración nos permite establecer una identificación presuntiva del
microorganismo que ha dado lugar a la formación de la colonia. De
igual manera, la utilización de los sustratos en el Agar cromogénico produce la diferente coloración de las colonias crecidas.
En días sucesivos realizaremos observaciones microscópicas y
pruebas bioquímicas tratando de identificar alguna de las enterobacterias que pudieran estar presentes originariamente en la
muestra de trabajo.
L-3 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA
Toma de muestra de microbiota presente
en la mucosa faríngea
Realizaremos una toma de muestra de la mucosa faríngea donde existe una población microbiana muy abundante. El objetivo de la
práctica es sembrar esta muestra en medio de cultivo para el
aislamiento de colonias y posteriormente realizar observaciones
microscópicas y pruebas bioquímicas tratando de identificar cocos Gram positivos pertenecientes a los géneros Staphylococcus y/o
Streptococcus.
METODOLOGÍA
1. Con ayuda de un depresor estéril presionar la lengua hacia
abajo.
2. Utilizando un hisopo de algodón estéril tocar la mucosa faríngea realizando una ligera presión al tiempo que se gira la punta del
hisopo.
3. La toma de muestra descrita se realiza entre dos compañeros de forma recíproca.
4. Inmediatamente después se siembra la muestra en dos placas
de agar sangre en la forma que se describe en el siguiente apartado.
15
L-4 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA
Siembra de las placas nº 1 y nº 2 de Agar Sangre
Medio de cultivo utilizado:
AGAR SANGRE
Medio No selectivo
Componentes específicos Sangre desfibrinada de oveja al 5%
Eritrocitos intactos
Utilización preferente Utilización general
Observación de hemólisis
METODOLOGÍA
1. Siembra de la placa de Agar Sangre nº 1. Descargar el
hisopo en un sector próximo al borde de la placa y después
continuar sembrando el resto de la placa haciendo estrías muy próximas de forma que no quede agar sin inocular entre ellas.
El sector donde hemos descargado inicialmente el hisopo lo
llamaremos “zona densa”.
16
2. Siembra de la placa de Agar Sangre nº 2. Tomar con el asa
de metal inóculo de la “zona densa” de la placa nº 1 y sembrar la placa nº 2 haciendo estrías continuas y próximas
entre si comenzando en un borde de la placa.
L-5 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA
Siembra de una placa de Agar Salino Manitol
Medio de cultivo utilizado
Utilizaremos una placa de agar salino manitol. Este medio es
altamente selectivo debido a la elevada concentración de cloruro
sódico que contiene (7,5%). Este medio resulta muy recomendable para el aislamiento de Staphylococcus aureus a partir de muestras
clínicas que lleven poblaciones bacterianas mixtas. Numerosas
especies bacterianas son inhibidas en su crecimiento en este medio.
Los estafilococos coagulasa positivos (S. aureus) resisten la elevada
concentración salina del medio y, además, al fermentar el azúcar
manitol, acidifican el medio formando colonias de color amarillo que
aparecen también rodeadas de una zona de color amarillo. Los estafilococos coagulasa negativos (S. epidermidis, S. saprophyticus)
son capaces de soportar la alta concentración salina pero no son
capaces de fermentar el manitol. Las colonias son transparentes
presentando la tonalidad rojiza propia del medio de cultivo.
Dirección antero-posterior
de la siembra en estrías
Zona densa
donde se ha
descargado el
hisopo
17
Los enterococos (Enterococcus) también pueden soportar la alta
concentración salina y algunas especies de este género pueden
fermentar el manitol y dar lugar a la aparición de colonias amarillas.
METODOLOGÍA
1. Realizaremos una nueva toma de muestra de mucosa faríngea
en la misma forma que ya se ha descrito para realizar la siembra de la placa de agar sangre nº 1.
2. Sembraremos la placa de agar salino manitol deslizando
uniformemente el hisopo por toda la superficie de la placa en una dirección antero-posterior.
LUNES
APUNTES PERSONALES
18
19
MARTES
REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA
ANÁLISIS
CUANTITATIVO ORINA
M-1 Lectura
de la placa de Agar CLED
ANÁLISIS CUALITATIVO
ORINA
M-2 Identificación presuntiva
de las colonias crecidas en las placas de
Agar Cromogénico y Agar MacConkey
M-3 Tinción de Gram
de colonias aisladas en las placas de
Agar Cromogénico y Agar MacConkey
M-4
Prueba de la citocromo-oxidasa
a la presunta enterobacteria
M-5 Siembra de la colonia seleccionada
en Agar MacConkey
M-1 ANÁLISIS CUANTITATIVO DE ORINA
Lectura de la placa de Agar CLED
Se trata de conocer el número de microorganismos que están
presentes en cada mL de orina y, en función del resultado, establecer conclusiones “teóricas” acerca de si existe o no infección en el tracto
urinario.
Desde 1956 se vienen siguiendo los parámetros establecidos por KASS:
20
Nº DE BACTERIAS EN ORINA
Nº> 105/mL
Bacteriuria significativa
Probable infección
105/mL > Nº > 10
4/mL
Diagnóstico dudoso Debe repetirse el análisis con otra
toma
Nº< 104 / mL
Bacteriuria no significativa
Probable contaminación
AGENTES MICROBIANOS
AISLADOS FRECUENTEMENTE
EN CASOS DE INFECCIONES URINARIAS
INDIVIDUO SIN FACTORES
PREDISPONENTES
INDIVIDUO CON FACTORES
PREDISPONENTES
FRECUENTES Escherichia coli Proteus mirabilis Klebsiella pneumoniae
Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Otras enterobacterias Enterococos Candida albicans Staphylococcus epidermidis
POCO
FRECUENTES
Enterococos
Staphylococcus saprophyticus
Corynebacterium urealyticum
METODOLOGÍA:
1. Cada alumno contará el número de unidades formadoras de colonias crecidas en la placa de Agar CLED que sembró ayer
lunes con el asa calibrada de 1 μL.
Se contarán todas las colonias. Para realizar el recuento podemos ayudarnos de un transiluminador existente en el
laboratorio. Puede darse la circunstancia de que no aparezcan
colonias crecidas, o por el contrario que el número sea tal alto
21
que no puedan ser contadas con exactitud. En tales
circunstancias el profesor indicará la conclusión que debe
establecerse.
2. Conocido el número de colonias que han crecido en la placa
debemos considerar que tales colonias han crecido a partir de la
muestra de orina tomando la cantidad de 1 μL. Para establecer
las conclusiones teóricas siguiendo los parámetros de KASS
debemos referir el número de colonias encontrado a la cantidad
de 1 mL.
Ejemplo práctico
Cantidad de orina tomada con el asa 1 μL 0,001 mL
Número de colonias crecidas en la placa 56
Número de bacterias / mL orina
56 x 103
56.000 (= Nº)
0,56 x 105 (= Nº)
Parámetros
de KASS
Nº > 105 (100.000) Bacteriuria significativa
Nº < 104 (10.000) Bacteriuria no significativa
105 > Nº > 10
4 Bacteriuria dudosa
Conclusión del ejemplo Bacteriuria dudosa
22
M-2 ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA
Identificación presuntiva de las colonias crecidas sobre las
placas de Agar Cromogénico y Agar MacConkey
Esta práctica la iniciamos ayer lunes sembrando muestras de orina en
dos placas con diferentes medios de cultivo. Recordemos que las dos placas que habíamos sembrado eran: Agar MacConkey y Agar
Cromogénico.
La identificación presuntiva que vamos a realizar estará basada en
los diferentes colores que presenten las colonias, lo cual es el resultado de las diferencias existentes en la capacidad de las
bacterias para utilizar la lactosa presente en el Agar de MacConkey y
descomponer los sustratos presentes en el Agar Cromogénico.
Utilización de la lactosa
1. La lactosa, que es un nutriente externo, debe penetrar dentro
de la célula bacteriana para ser metabolizada. Para ello es
necesario una enzima (beta-galactósido-permeasa) que “transporta” la lactosa desde el exterior hasta el citoplasma
bacteriano.
2. Una vez en el citoplasma bacteriano la lactosa debe ser desdoblada en sus dos componentes (glucosa y galactosa),
para lo cual es necesaria la existencia de otra enzima (beta-
galactosidasa). Los dos monosacáridos resultantes pueden ser
metabolizados por diferentes rutas catabólicas, produciéndose
una mayor o menor cantidad de liberación de ácidos.
3. Por todo lo anterior, resulta evidente que para que un
microorganismo pueda utilizar la lactosa debe poseer las dos
enzimas. Si carece de alguna de ellas el microorganismo no puede utilizar la lactosa.
4. Con respecto al enzima beta-galactósido-permeasa, existen
ciertos microorganismos con una actividad permeasa intensa (fermentadores fuertes o rápidos) y otros con una actividad
débil (fermentadores débiles o tardíos). Ello se traduce, en
una rápida y abundante liberación de ácidos o en una liberación
lenta y escasa, respectivamente.
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FERMENTACIÓN DE LA LACTOSA POR ENTEROBACTERIAS
Microorganismo Fermentador
de lactosa
Tipo
fermentación
de la glucosa
Liberación
ácidos
Liberación
CO2
Escherichia coli Fuerte Acido mixta Muchos Poco
Enterobacter
aerogenes Fuerte Butilén-glicólica Pocos Mucho
Klebsiella
pneumoniae Fuerte Butilén-glicólica Pocos Mucho
Citrobacter Lento Ácido mixta Muchos Poco
Serratia Lento Ácido mixta
Butilén-glicólica Muchos Pocos
Poco Mucho
Salmonella
Shigella Proteus
Edwarsiella
Providencia
NO FERMENTAN LA LACTOSA
MICROORGANISMO MACCONKEY CLED
Escherichia coli Roja-Rosada Precipitado
Amarillas Grandes
Enterobacter Rosadas
No mucosa Amarillas Grandes
Klebsiella Rosada Mucosa
Amarillentas
Azuladas Grandes
Citrobacter Incolora-Roja Amarillas
Serratia Roja-Rosada No mucosa
Azul intenso
Staphylococcus aureus Rosada
Puntiforme Amarillas Pequeñas
Staphylococcus epidermidis Rosada
Puntiforme Amarillas Pequeñas
Proteus Incolora Azules
24
METODOLOGÍA:
Se observarán las colonias crecidas en Agar MacConkey y Agar
Cromogénico y en base al color se establecerán identificaciones
presuntivas.
M-3 ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA
Tinción de Gram de colonias aisladas y crecidas en las placas
de Agar Cromogénico y Agar MacConkey
METODOLOGÍA:
1. Se harán tinciones de Gram de colonias individuales que hayan
crecido en estas dos placas. Deben observarse bacilos cortos Gram negativos (color rojo) para su posible correspondencia
con enterobacterias.
CRECIMIENTO EN AGAR
CROMOGÉNICO
β-Galactosidasa
Hidrólisis lactosa
β- Glucosidasa
Hidrólisis celobiosa
Triptofano Desaminasa
Trp
Pigmentación colonia
E. coli + Rosa
Enterococos + Azul
Turquesa
Coliformes + + Azul oscuro
Púrpura
Proteus Morganella Providencia
+ Halo marrón
Pseudomonas Verde
Marrón
Estafilococos Blanco Crema
S. saprophyticus Rosa
Blanco pálido
Estreptococos Blanco
25
2. Muy importante. Cada alumno deberá controlar con
exactitud la relación existente entre lo que se está observando
al microscopio y la colonia de la cual fue realizada la tinción (de
qué placa procede y qué color tenía la colonia).
TINCIÓN DE GRAM
Tomar con el asa una pequeña cantidad de la colonia a estudiar
Realizar una extensión sobre una gota de agua en el portaobjetos
Secar en la parte alta del mechero
o
en una plancha con control de temperatura
Fijar la extensión pasando el portaobjetos por la llama del mechero
Cristal violeta 2 minutos
Lavar abundantemente con agua
Lugol (mordiente) 2 minutos
Lavar abundantemente con agua
Alcohol 96º (decoloración) 10-20 segundos
Lavar abundantemente con agua
Safranina 2 minutos
Lavar abundantemente con agua
Secar en la parte alta del mechero
Añadir aceite de inmersión y observar con el objetivo 100X
26
M-4 ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA
Prueba de la citocromo-oxidasa de presunta enterobacteria aislada en
Agar Cromogénico o Agar MacConkey
Se realizará la prueba de la oxidasa a aquella colonia:
a) Aislada sobre Agar Cromogénico o Agar MacConkey.
b) Identificada presuntamente como una enterobacteria
(en función del color de la colonia en el medio correspondiente
y de su comportamiento en la tinción de Gram).
METODOLOGÍA:
Prueba de la citocromo-oxidasa
La citocromo oxidasa es un complejo formado por los
citocromos a y a3 (citocromo-oxidasa = complejo a+a3). Este
complejo es el último de la cadena respiratoria y transfiere directamente los electrones al oxígeno molecular.
A Depositar unas gotas del reactivo tetrametil-para- fenilén diamina (existente en unas ampollas de plástico)
sobre un trozo de papel de filtro.
Este reactivo es incoloro en estado reducido.
B Tomar con un palillo de madera (las asas de hierro
dan falsos positivos) una muestra de la colonia a
investigar y extenderla encima de las gotas del reactivo.
C Si el microorganismo posee el enzima citocromo-
oxidasa, el enzima capta los electrones del reactivo y los transfiere directamente al oxígeno molecular.
Como resultado el reactivo se oxida.
El reactivo es azul intenso en estado oxidado.
D El resultado debe observarse en un tiempo inferior a
30 segundos. Un tiempo más prolongado conduce a
una oxidación espontánea del reactivo y a un falso positivo.
E Interpretación:
No hay cambio de color Oxidasa – Azul intenso Oxidasa +
27
M-5 ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA
Siembra de 1 colonia (presunta enterobacteria procedente de
Agar Cromogénico o Agar MacConkey) en Agar MacConkey
El objetivo de esta siembra es tener masa suficiente de la presunta
enterobacteria para realizar otras pruebas.
METODOLOGÍA:
Tocar con un asa estéril una porción de la colonia a la que se haya
realizado tinción de Gram, con el resultado de la aparición de bacilos
Gram negativos, y que haya dado la prueba de la oxidasa negativa, y hacer estrías en dirección antero-posterior sobre una placa de Agar
MacConkey.
MARTES
APUNTES PERSONALES
28
29
MIÉRCOLES
REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA
ANÁLISIS
CUALITATIVO MUCOSA FARÍNGEA
X-1
Observación de halos de hemólisis en las placas de Agar Sangre nº 1 y nº 2
X-2
Tinción de Gram
de presuntos cocos Gram + crecidos en:
placa de Agar Sangre nº 2
X-3
Observación de la placa de Agar
Salino Manitol
y tinción de Gram de colonias aisladas
X-4 Siembra
de cocos Gram + en sectores sobre la
placa de agar sangre nº 3
X-1 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA
Observación de halos de hemólisis en las placas
de Agar Sangre nº 1 y nº 2
En el agar sangre se puede conocer la capacidad de ciertas bacterias para producir enzimas extracelulares (hemolisinas) que
actúan sobre los glóbulos rojos provocando distintos tipos de
hemólisis:
Beta hemólisis Lisis completa de los glóbulos rojos
Halo transparente alrededor de la colonia
30
Alfa hemólisis
Lisis parcial de los glóbulos rojos
Se abren poros en la membrana
Salida de hemoglobina al medio
Oxidación del grupo hemo
Formación de biliverdina (color verdoso)
Halo verdoso alrededor de la colonia
Aproximación interpretativa según relación
tamaño colonia / tamaño halo de hemólisis:
Relación Podría tratarse de
Colonia grande / Halo hemólisis pequeño Staphylococcus
Colonia pequeña / Halo hemólisis grande Streptococcus
Aproximación interpretativa según observaciones
Colonia Morfología
celular Podría ser
Grande
Amarillenta-Incolora
Beta-hemolítica
Células esféricas
Racimos irregulares
Staphylococcus
aureus
Pequeña
Blancas-Grisácea
No hemolítica
Células esféricas
Racimos irregulares
Staphylococcus
epidermidis
Grande
Blancas-Amarillenta Anaranjada
No hemolítica
Células esféricas Racimos irregulares
Staphylococcus saprophyticus
31
Pequeña
Grisáceas-Translúcida Beta-hemolítica
Células esféricas
Células ovoides
Aisladas-Parejas Cadenas
Streptococcus
pyogenes
Pequeña Grisáceas-Translúcida
Alfa-hemolítica
Células esféricas Células ovoides
Aisladas-Parejas
Cadenas
Streptococcus
pneumoniae
Pequeña
Gris
Alfa-hemolítica
No hemolítica
Células esféricas
Células ovoides
Aisladas-Parejas
Cadenas
Grupo Viridans: S. mutans
S. salivarius
S. bovis S. mitis
METODOLOGÍA:
1. Se observarán las placas de agar sangre denominadas nº 1 y nº 2. Dada la técnica utilizada para la siembra la placa nº 1
deberá tener crecimiento en masa, mientras que sobre la placa
nº 2 deberían observarse colonias aisladas.
X-2 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA
Tinción de Gram de presuntos cocos Gram + crecidos en:
la placa de Agar Sangre nº 2
METODOLOGÍA:
1. Tinción de Gram de colonias bien aisladas sobre la placa
de agar sangre nº 2. Igual que con las demás tinciones, es muy
importante controlar la correspondencia entre la colonia y la
observación que se está haciendo al microscopio.
2. Interpretación:
Agrupación Morfología celular Posible
Racimos Esféricas Staphylococcus
32
Aislados Parejas Cadenas cortas Cadenas largas
Esféricas/ Ovaladas Streptococcus
X-3 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA
Observación de la placa de Agar Salino Manitol
y tinción de Gram de colonias aisladas
Este medio resulta muy adecuado para el aislamiento de S. aureus a partir de muestras nasales, faríngeas y fecales. Este
microorganismo es capaz de soportar la alta concentración salina del
medio (7,5 % NaCl) y de fermentar el manitol (formación de ácidos y
viraje del indicador con formación de halos amarillos alrededor de la colonia que también adquiere color amarillo).
Otras especies también pueden crecer en este medio con
producción de ácidos, por lo que la identificación definitiva deberá ser confirmada por pruebas bioquímicas.
Microorganismo Fermentación
Manitol Colonia
S. aureus SI Halo amarillo
S. epidermidis No Incoloras
S. urealyticus Si Halo amarillo
S. xylosus Si Halo amarillo
S. lentus Si Halo amarillo
S. simulans Si Halo amarillo
S. saprophyticus Variable Halo amarillo o incoloro
S. haemolyticus Variable Halo amarillo o incoloro
Enterococcus faecalis Si Halo amarillo
Enterococcus faecium Variable Halo amarillo o incoloro
Enterococcus avium Si Halo amarillo
Enterococcus durans Variable Halo amarillo o incoloro
33
METODOLOGÍA:
1 Observación de las colonias crecidas en el medio atendiendo al
color que presentan.
2. Realizar tinción de Gram de colonias aisladas y observar al microscopio para determinar la morfología y la agrupación
celular, si existe.
X-4 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA
Siembra de cocos Gram positivos en sectores
sobre la placa de Agar Sangre nº 3
Los cultivo identificados como cocos Gram + serán seleccionados
para sembrar una nueva placa de agar sangre que llamaremos nº 3. Pretendemos con ello, pasadas 24 horas de incubación, obtener
cultivos puros y abundantes de cocos Gram + que serán sometidos a
pruebas de caracterización enzimática para poder identificarlos.
METODOLOGÍA:
1. Rotulación de la placa:
Tomaremos la placa de agar sangre nº 3 y la dividiremos en
sectores, tantos como colonias diferentes hayamos identificado
pertenecientes a cocos Gram positivos, sea cual sea su
morfología celular (esférica u ovalada), sea cual sea su agrupación (racimos, células aisladas, parejas, etc.) y sea cual
sea su procedencia (Agar Sangre o Agar Salino Manitol).
Para dividir la placa en sectores se rotulará la base en forma radial.
34
2. Siembra de los sectores:
Cada sector será inoculado con un cultivo diferente de cocos
Gram positivos.
MIÉRCOLES APUNTES PERSONALES
SECTOR 1
SECTOR 3
SECTOR 2
PLACA ROTULADA EN TRES SECTORES
35
36
37
JUEVES
REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA
ANÁLISIS CUALITATIVO
ORINA
J-1 Siembra de Agar KLIGLER
a partir de colonias crecidas en
Agar MacConkey
J-2 Siembra de la galería API 20 E
a partir de colonias crecidas en
Agar MacConkey
PRUEBA DE BAUER-KIRBY
(ANTIBIOGRAMA) J-3
Siembra de una placa de Agar M.H.
a partir de colonias crecidas en
Agar MacConkey
PRUEBA DE ÉPSILON (DETERMINACIÓN
DE LA CMI) J-4
Siembra de una placa de Agar M.H. a partir de colonias crecidas en
Agar MacConkey
ANÁLISIS CUALITATIVO
MUCOSA FARÍNGEA
J-5 Siembra de la galería API STAPH a partir de placa de Agar Sangre nº 3
J-6 Siembra de la galería API STREP
a partir de placa de Agar Sangre nº 3
J-1 ANÁLISIS CUALITATIVO DE ORINA
Siembra de un tubo de Agar Kligler
a partir de colonias crecidas en Agar MacConkey
El medio Kligler se utiliza preferentemente para la identificación de
enterobacterias. La lectura del medio no es suficiente para la
identificación de especies ni siquiera para la identificación de géneros.
No obstante, después de ser inoculado con una enterobacteria su
38
lectura establece un “abanico” de varios géneros de enterobacterias
capaces de dar los resultados observados.
La lectura del medio Kligler nos proporciona datos
interesantes del microorganismo inoculado
Capacidad de utilizar fermentativamente la glucosa
Capacidad de utilizar fermentativamente la lactosa
Capacidad de producir SH2 durante el metabolismo
Capacidad de producir un abundante desprendimiento de gases
Composición fundamental del medio Kligler
Peptona Fuente de C y energía
Lactosa/Glucosa (10/1 g/L) Fuente de C y energía
Sulfato ferroso Fuente de Fe
Tiosulfato sódico Fuente de S
METODOLOGÍA:
1. Inóculo a utilizar
El medio será inoculado individualmente por cada alumno con la
“presunta” enterobacteria que tiene aislada y crecida abundantemente en su placa de Agar MacConkey.
2. Fondo y superficie del tubo de agar inclinado
Al tratarse de un medio sólido con la superficie inclinada
podemos distinguir en el tubo dos partes diferenciadas:
Fondo En condiciones de anaerobiosis
Pico de flauta En contacto con el oxígeno
3. Inoculación del tubo de Agar Kligler
Utilizando un hilo de siembra, tomar inóculo de la placa de Agar
MacConkey donde se ha aislado en cultivo puro una
39
enterobacteria procedente de la muestra de orina.
Posteriormente:
a Inocular el tubo en picadura sin llegar a tocar el fondo
b Retirar el hilo de siembra en línea recta
c Inocular la superficie en estrías
a b c
Las estrías aparecen continuas
Pero se hacen en zig-zag sin interrupción
J-2 SIEMBRA DE LA GALERÍA API 20 E
A partir de colonias crecidas en Agar MacConkey
El API 20 E es un conjunto de pruebas de caracterización
enzimática que se utiliza para la identificación de enterobacterias y de otros bacilos Gram negativos.
El sistema API 20 E está constituido por una galería que contiene 20 micropocillos, cada uno con diferentes metabolitos estériles y
deshidratados que serán ensayados para determinar si existe (o no)
la actividad enzimática específica en la bacteria que estamos tratando
de identificar.
40
METODOLOGÍA:
1. Elección del inóculo
Para la inoculación de la galería API 20 E cada alumno dispone
de una placa de Agar MacConkey que sembró con una
“presunta” enterobacteria. Sin embargo, la inoculación de la galería será realizada conjuntamente por cada lateral de mesa
constituido por seis alumnos.
Esto nos lleva a la necesidad de tener que seleccionar una única placa de MacConkey por cada lateral de mesa. Será
seleccionada aquella cuyo conjunto de datos haya sido el más
convincente para pensar que se trata de una enterobacteria
(color de la colonia en las placas, observación de la morfología celular al microscopio y prueba de la oxidasa). Para ello, los
alumnos de cada lateral consultarán sus datos y decidirán cuál
será la placa seleccionada.
2. Preparación de la suspensión
a) Preparar la placa de Agar MacConkey seleccionada.
b) Utilizar una ampolla conteniendo 5 ml de Medio para
Suspensión. Introducir la ampolla abierta en “Densimat”
para ir midiendo la Densidad Óptica (D.O.).
c) Con un hisopo tocar varias colonias existentes en la placa
y suspender la masa microbiana en la ampolla.
d) Repetir la operación hasta conseguir una suspensión
coincidente con 0,5 de la escala de McFarland.
5 2 1 5 7 7 3 5
+ +-
Code n°: 5 215 773 (55)
++
5
5- Identification de la souche
Se référer au catalogue pour identifier la souche à l’aide du code
Résultats de la galerie:
Résultats reportés sur la fiche d’identification
Cúpula
Tubo
41
3. Preparación del soporte de la galería
Es necesario incubar la galería API 20 E en condiciones de
humedad dada la pequeña cantidad de suspensión que
contendrán los micropocillos. De lo contrario, durante la
incubación durante 24 horas a 37º C, se secarían y las pruebas no se podrían leer.
Para ello, existen unos soportes con pequeños alvéolos que
se llenarán con agua de grifo. El exceso de agua se desecha.
4. Colocación de la galería API 20 E encima del soporte
Se depositará la galería encima del soporte que contiene los alvéolos llenos de agua. El soporte, que ya contiene la galería,
será colocado en posición ligeramente inclinada.
42
5. Llenado de micropocillos con la pipeta de inoculación:
6. Inoculación de los micropocillos
a) Llenado del “Tubo” de los 20 micropocillos
Depositar inóculo gota a gota dejándolo deslizar por la
pared lateral de cada micropocillo. Llenar toda la parte del micropocillo que hemos denominado “Tubo” (para ello
interrumpir el llenado del micropocillo al llegar al nivel
donde comienza la parte denominada “Cúpula”). Debe
llenarse el micropocillo sin que se formen burbujas, ya que ello propiciaría un ambiente oxigenado en el fondo
del micropocillo.
b) Adición de inóculo en la cúpula En algunos pocillos se debe añadir más inóculo para llenar
también la “Cúpula”. Estos son los pocillos cuyas iniciales
de la actividad enzimática que se investiga aparecen
“encerradas” en una especie de “compartimiento”. Por ejemplo:
43
CIT
c) Adición de parafina en la “Cúpula”
En algunos pocillos hay que añadirl parafina en la cúpula
para crear durante la incubación un ambiente anaerobio.
Son aquellas cuyas iniciales de la actividad enzimática investigada aparecen subrayadas. Por ejemplo:
ADH
d) Rotular la galería e incubar a 37º C.
J-3
PRUEBA DE BAUER-KIRBY (ANTIBIOGRAMA)
Siembra de una placa de Agar Müeller-Hinton (M.H.)
para determinar el diámetro de los halos de inhibición
Con la realización de esta prueba tratamos de determinar cómo
afectan diferentes antimicrobianos al crecimiento de un
microorganismo.
Esta prueba realizada con gran frecuencia en hospitales durante el
tratamiento de pacientes con procesos infecciosos utiliza agentes microbianos aislados de estos pacientes. La utilidad radica en referir
los resultados que se obtengan en el laboratorio a unas tablas ya
confeccionadas y que permiten establecer conclusiones acerca de la
efectividad, o no, de tratar a un paciente con un determinado
antibiótico.
Para realizar esta práctica vamos a seguir la técnica descrita por
Bauer y Kirby, utilizando como inóculo bacteriano la “presunta” enterobacteria aislada de las muestras de orina y crecidas en la placa
de Agar MacConkey.
Medio de cultivo utilizado.
Utilizaremos como medio de cultivo el llamado Agar de Müeller-Hinton. Es el medio recomendado por la OMS para realizar pruebas
de susceptibilidad antimicrobiana. Existen varias razones que llevan a
la utilización de este medio, pero una de las más importantes es que
en este medio no se forma PABA (ácido para-amino-benzoico) el cual inhibe la actividad de algunos antibióticos y sulfamidas.
44
METODOLOGÍA:
1. Trazar una circunferencia sobre el papel de filtro existente en el puesto de trabajo utilizando como molde la misma placa de
M. H. que va a ser sembrada.
2. Al retirar la placa señalar sobre el papel de filtro tres puntos
internos en posición triangular que sean, aproximadamente,
equidistantes entre ellos y equidistantes del borde de la
circunferencia.
4. Con un hisopo de algodón estéril tomar colonias de la placa de
Agar MacConkey e inocular un tubo de caldo hasta alcanzar una
turbidez equivalente a 0,5 en la escala de McFarland. Introducir el
hisopo en el tubo, empapar bien y descartar el exceso de líquido presionándolo contra el vidrio. Deslizar el hisopo suavemente por
toda la superficie de la placa. Repetir la siembra dos veces, girando la
placa 120 º cada vez.
Se trata de repartir el inóculo
por toda la superficie de la placa en forma densa y uniforme,
para obtener un crecimiento confluente.
4. Colocación de los discos de antibiótico trabajando en la proximidad del mechero.
a) Los discos vienen envasados en unos dispensadores de
plástico. Depositar tres discos de antibióticos diferentes en la tapadera de la placa que va a ser utilizada.
b) Situar la placa sembrada encima de la circunferencia
dibujada en el papel de filtro.
c) Con unas pinzas (pasadas previamente por la llama del
mechero) coger cada disco de antibiótico y depositarlo en
45
la placa sembrada, haciéndolo coincidir con cada uno de
los puntos dibujados en posición triangular, los cuales se
ven por transparencia.
d) Con la punta de la pinza presionar ligeramente cada disco
de antibiótico depositado en la placa ya sembrada.
e) Si algún disco se coloca mal situado no se puede volver a coger para desplazarlo al sitio correcto.
f) Rotular la placa e incubar a 37 ºC.
J-4 TIRA ÉPSILON (DETERMINACIÓN DE LA CMI)
Siembra de una placa de Agar Müeller-Hinton
a partir de colonias crecidas en Agar MacConkey
Mediante esta prueba se puede determinar el valor de la
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) que es la mínima
concentración de antibiótico que impide el crecimiento visible de un
microorganismo. El valor de la CMI, que es un parámetro obtenido en
el laboratorio para cada combinación de especie bacteriana- antibiótico, es de gran utilidad. Igual que ocurría con los diámetros
de los halos de inhibición, los valores de la CMI también pueden ser
utilizados para establecer el tratamiento antibiótico más adecuado de
administrar a un paciente que padece un determinado proceso infeccioso.
Como inóculo bacteriano se utiliza la misma suspensión que hemos
preparado anteriormente para realizar la prueba de Bauer-Kirby. Como antibiótico utilizaremos unas tiras de papel que están
impregnadas de un único antibiótico. Lo trascendente de estas tiras
rectangulares de papel es que por una de sus caras existen líneas
transversales de ese antibiótico en concentraciones decrecientes; mientras que por la otra cara de la tira aparecen unas cifras
numéricas que se corresponden exactamente con las concentraciones
de antibiótico existentes sobre la otra cara.
METODOLOGÍA:
1. La práctica será realizará colectivamente por cada mesa. De
esta forma los 12 alumnos llevarán a cabo la determinación de un único valor de la CMI.
46
2. Elegiremos como inóculo uno de los tubos de caldo preparados
anteriormente para realizar la prueba de Bauer-Kirby.
3. Siembra del inóculo
Se realizará la siembra de otra placa de M.H. siguiendo la misma metodología ya descrita anteriormente para la
realización de la prueba de Bauer-Kirby.
4. Colocación de la tira Épsilon.
Estas tiras vienen en unos envases y de ellos cogeremos una única tira con cuidado de no tocarla por sus caras. Debemos
manejarla con pinzas y cogerla por uno de sus extremos. Con
posterioridad, colocaremos la tira rectangular con las cifras
numéricas hacia arriba sobre el centro de la placa.
Tira de Épsilon con
un gradiente de
concentración
expresado en μg/mL
Halo elíptico de difusión del
antibiótico.
La parte ensanchada de la
elipse se
corresponde con
la zona donde el
antibiótico presenta una
mayor
concentración
Halo elíptico de
inhibición del
crecimiento
Zona de
crecimiento microbiano
Valor numérico de la MIC
(0,06 μg/mL)
47
J-5 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA
Siembra de la galería API STAPH
a partir de la placa de Agar Sangre nº 3
El API STAPH es una galería semejante a la descrita en el API 20 E.
La diferencia consiste en las actividades enzimáticas que se detectan en cada micropocillo. Es una prueba que nos permite identificar la
especie de Staphylococcus que ha sido inoculada.
Recordemos que ayer miércoles cada alumno sembró una placa de agar sangre por sectores, denominada nº 3. Los sectores fueron
inoculados con cocos Gram positivos, con independencia de si
pertenecían a alguna especie de Staphylococcus o de Streptococcus.
Para la elección del inóculo que va a ser utilizado debemos saber
qué sectores existentes sobre la placa de agar sangre nº 3 se
corresponden con Staphylococcus y qué sectores se corresponden con
Streptococcus. Para obtener este dato realizamos la prueba de la
catalasa, la cual nos diferencia entre los dos géneros:
Staphylococcus Catalasa +
Streptococcus Catalasa –
Prueba de la catalasa
La catalasa es un enzima que descompone el peróxido de
hidrógeno en H2O y O2 (oxígeno molecular).
Ciertos anaerobios facultativos que no poseen actividad catalasa
son capaces de descomponer el peróxido de hidrógeno por acción de
otras enzimas, llamadas peroxidadas, pero que se muestran menos efectivas y más tardías en su mecanismo de acción que la catalasa.
METODOLOGÍA:
a) Depositar unas gotas de peróxido de hidrógeno encima de un
portaobjetos.
b) Con un palillo de madera (no asas de metal que dan falsos
positivos) tomar una muestra del inóculo a investigar.
c) Depositar el inóculo encima de las gotas de peróxido de
hidrógeno.
48
Burbujeo intenso en menos de 30 segundos Catalasa +
No burbujeo en menos de 30 segundos Catalasa –
Burbujeo débil pasados 2-3 minutos
Catalasa -
1. Investigación de sectores catalasa +/- sobre la placa de agar sangre nº 3.
Cada alumno debe investigar sobre los sectores crecidos en su
placa de agar sangre nº 3 cuáles de ellos son catalasa + y cuáles son catalasa -. Para ello, deberá seguir la metodología
descrita anteriormente y anotar el resultado de cada sector.
Placa de Agar Sangre Nº 3
Prueba individual de cada alumno
Investigación de cada sector
Sectores que han sido inoculados con cocos Gram +
PRUEBA DE LA CATALASA
La siembra del API STAPH será realizada conjuntamente por
cada lateral de mesa, utilizando como inóculo aquel sector
catalasa + cuyos resultados previos hayan sido los más satisfactorios.
2. Elección del sector catalasa + a utilizar como inóculo.
a) Después de realizar la prueba de la catalasa habrán salido varios sectores catalasa + en el conjunto de las seis
placas de agar sangre nº 3 investigadas.
b) Se elegirá aquel sector que resulte más apropiado:
- La prueba catalasa + haya sido muy clara.
- Que el sector tenga un crecimiento abundante.
- +
API STAPH API STREP
49
- Que dicho sector, recordando datos de días pasados, se corresponda al microscopio con cocos
Gram + de forma esférica y agrupados en racimos.
3. Preparación de la suspensión.
a) Abrir una ampolla API STAPH MEDIUM y colocarla en
DENSIMAT para medir D.O.
b) Con un hisopo recoger masa microbiana de un sector
catalasa + y resuspenderla en el líquido de la ampolla hasta conseguir una densidad óptica coincidente con
la escala 0,5 de McFarland.
4. Inoculación de la galería.
Seguir exactamente la misma metodología descrita para la inoculación del API 20 E.
5. Rotular e incubar (24 horas a 37º C).
50
J-6 ANÁLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARÍNGEA
Siembra de la galería API STREP a partir de la placa de
Agar Sangre nº 3
El API STREP es una galería semejante a las ya descritas como API 20 E y API STAPH. Las diferencias radican en las actividades
enzimáticas que se detectan en cada micropocillo. Es un sistema que
nos permite identificar la especie de Sreptococcus que ha sido
inoculada. Asimismo, esta galería también nos permite identificar otros géneros de cocos Gram +, tales como Enterococcus,
Aerococcus, Gemella, etc.
Para elegir el inóculo que va a ser utilizado debemos saber qué sectores existentes sobre la placa de agar sangre nº 3 se
corresponden con cocos Gram + y catalasa -, datos que ya hemos
obtenido anteriormente.
También en este caso la inoculación de la galería será realizada conjuntamente por los alumnos de un lateral de mesa.
METODOLOGÍA:
1. Elección del sector catalasa - a utilizar como inóculo.
a) Después de realizar la prueba de la catalasa habrán salido varios sectores catalasa - en el conjunto de las seis
placas de agar sangre nº 3 investigadas.
b) Se elegirá aquel sector que resulte más apropiado:
- La prueba catalasa - haya sido muy clara.
- El sector tenga un crecimiento muy abundante.
- Que dicho sector, recordando datos de días
pasados, se corresponda al microscopio con cocos
Gram + de forma ovalada.
2. Preparación de la suspensión.
a) Abrir una ampolla CONTENIENDO 2mL de MEDIO
SUSPENSIÓN y colocarla en DENSIMAT para medir D.O.
51
b) Con un hisopo recoger masa microbiana de un sector
catalasa - y resuspenderla en el líquido de la ampolla
hasta conseguir una densidad microbiana coincidente con
la escala 4 de McFarland.
3. Inoculación de la galería.
a) Siguiendo la metodología descrita a propósito del API 20 E
inocular los 10 primeros micropocillos (son más
pequeños que los restantes).
b) Abrir una ampolla de vidrio conteniendo GP Medium y
verter el contenido sobre el resto de suspensión que ha
sobrado después de la inoculación de los primeros 10 micropocillos.
c) Inocular con esta nueva suspensión el resto de los micropocillos.
e) Los micropocillos que han de inocularse completamente y
a los que hay que añadir parafina siguen la misma metodología descrita a propósito del API 20 E.
4. Rotular e incubar (24 horas a 37º C).
JUEVES APUNTES PERSONALES
52
53
VIERNES
REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA
PRUEBA DE BAUER-KIRBY V-1
Lectura del Ø de la placa de M.H.
PRUEBA DE ÉPSILON V-2 Lectura
de la CMI
ANÁLISIS CUALITATIVO
ORINA
V-3 Lectura
del Agar KLIGLER
V-4 Lectura
del API 20 E
ANÁLISIS CUALITATIVO
MUCOSA FARÍNGEA
V-5 Lectura
del API STAPH
V-6 Lectura
del API STREP
V-1 LECTURA DEL Ø DE LA PLACA DE M.H.
METODOLOGÍA:
Utilizando una regla milimetrada se mide el diámetro del halo de
inhibición incluyendo el diámetro del disco:
- Un halo de diámetro pequeño no significa que la bacteria
sea resistente a ese antimicrobiano.
- Un halo de diámetro grande no significa que la bacteria
sea sensible a ese antimicrobiano.
Para concluir si la bacteria es resistente o sensible a un determinado antimicrobiano
se realiza la medida del diámetro del halo
de inhibición y se acude a unas tablas ya
previamente confeccionadas.
54
TABLA DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA
PARA ENTEROBACTERIAS
Ø HALO INHIBICIÓN
(mm) VALOR DE
CMI (µg/mL)
ANTIMICROBIANO CONTENIDO
DEL DISCO R I S R S
Ampicilina (AM) 10 µg ≤13 14-16 ≥17 ≥32 ≤8
Amoxicilina-Ácido
clavulánico (AMC) 20/10 µg ≤13 14-17 ≥18 ≥32/16 ≤8/4
Gentamicina (GM) 10 µg ≤12 13-14 ≥15 ≥8 ≤4
Neomicina (N) 30 µg ≤12 13-16 ≥17 - -
Kanamicina (K) 30 µg ≤13 14-17 ≥18 ≥25 ≤6
Estreptomicina
(STR) 10 µg ≤10 11-14 ≥15 - -
Tetraciclina (TE) 30 µg ≤14 15-18 ≥19 ≥16 ≤4
Ácido nalidíxico
(NA) 30 µg ≤13 14-18 ≥19 ≥32 ≤8
Cloranfenicol (C) 30 µg ≤12 13-17 ≥18 ≥32 ≤8
Penicilina (P) 30 µg ≤17 18-20 ≥21 - -
Vancomicina (V) 30 µg ≤14 15-16 ≥17 - -
55
V-2 LECTURA DE LA CMI
METODOLOGÍA
Observar la zona de inhibición del crecimiento en forma de elipse. La
parte más ancha de la elipse se encuentra en la zona de
concentración más elevada del antibiótico en la tira, y la parte más
estrecha de la elipse intercepta un punto de la tira con el cultivo que
corresponde al valor de la CMI en la escala de números. Leer la CMI obtenida para la combinación establecida entre el antibiótico
existente en la tira y el inóculo bacteriano investigado.
56
V-3 LECTURA DEL AGAR KLIGLER
FUNDAMENTOS BIOQUÍMICOS
Para llegar a la comprensión de las reacciones bioquímicas
debemos considerar:
1) La concentración de Lactosa es muy superior a la de Glucosa
(10/1).
2) La superficie, en contacto con el oxígeno, sufre una alcalinización de forma biológica, de tal manera que las
bacterias que están en superficie realizan el metabolismo
oxidativo de las proteínas con liberación de aminas que
alcalinizan el medio y neutralizan la débil acidificación que existía. Debido a la alcalinización, la zona superficial tiende a
mantenerse de color rojo.
3) El medio vira a color amarillo cuando se produce una
acidificación (pH < 6,8).
4) El medio lleva tiosulfato de sodio. Algunas enterobacterias (con
independencia de su metabolismo normal) son capaces de
utilizar el tiosulfato como aceptor de electrones. Como consecuencia se forma SH2, el cual reacciona con los
compuestos de hierro que estén presentes y forman un
precipitado negro compuesto de sulfuro ferroso.
UTILIZACIÓN DE NUTRIENTES
1. La glucosa empieza a utilizarse como fuente de carbono hasta
su agotamiento.
Como consecuencia de la fermentación, se liberan ácidos que hacen bajar el pH y todo el tubo aparece de color amarillo.
2. Al mismo tiempo, como fuente de nitrógeno, se empiezan a
utilizar las peptonas (péptidos) a través de la descarboxilación oxidativa, aunque solo en la superficie del tubo donde hay
oxígeno. Esto produce la alcalinización del medio que hace subir
el pH. Esta subida del pH provoca que la superficie vuelva a
presentar color rojo.
3. Si el microorganismo es capaz de utilizar la lactosa, se produce
una fuerte acidificación y el color rojo de la superficie vuelve a
ser amarillo. Si no es capaz de utilizar la lactosa la superficie permanece de color rojo.
57
EXISTENCIA DE PRECIPITADO NEGRO EN EL FONDO DEL TUBO
En algunos casos el color amarillo del fondo resulta enmascarado
por un precipitado de color negro debido al sulfuro ferroso. Para formar este precipitado, es necesario que el pH sea ácido. Por tanto,
la existencia de un precipitado negro obliga a pensar que en el fondo
se ha fermentado el azúcar y que habría existido un color amarillo
originario que después fue enmascarado por el negro del sulfuro ferroso.
TABLA DE LECTURA
PICO
FONDO
Rojo
Rojo
Rojo
Amarillo
Rojo
Negro
Amarillo
Amarillo
Fermentación glucosa
(acidificación débil)
- + + +
Fermentación lactosa
(acidificación fuerte)
- - - +
Color negro (formación SH2) - - + -
ESPECIES TÍPICAS
Pseudomonas Shigella
Providencia Serratia
Citrobacter Salmonella
Proteus
E. coli Enterobacter
Klebsiella
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V-4 LECTURA DEL API 20 E
MICRO POCILLO
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
ADICIÓN DE REACTIVO
NEGATIVO POSITIVO
1 ONPG β-Galactosidasa NO Incoloro Amarillo
2 ADH Arginina dehidrolasa NO Amarillo Rojo/Naranja
3 LDC Lisina Descarboxilasa NO Amarillo Naranja
4 ODC Ornitina descarboxilasa NO Amarillo Rojo/Naranja
5 CIT Utilización del citrato NO Verde pálido
Amarillo Azul verdoso
Azul
6 SH2 Producción de SH2 NO Incoloro
Grisáceo Depósito negro
7 URE Ureasa NO Amarillo Rojo
Naranja
8 TDA Triptófano desaminasa Percloruro
férrico Amarillo Marrón oscuro
9 IND Producción de indol Reactivo Kovacs Amarillo Anillo rojo
10 VP Producción de acetoína VP1 + VP2 Esperar 10 minutos
Incoloro Rosado
Rojo
11 GEL Gelatinasa NO
No difusión
Pigmento negro
Difusión
Pigmento negro
12 GLU Fermentación Oxidación
NO Azul
Azul verdoso Amarillo
13 MAN Fermentación Oxidación
NO Azul
Azul verdoso Amarillo
14 INO Fermentación
Oxidación NO
Azul
Azul verdoso Amarillo
15 SOR Fermentación
Oxidación NO
Azul
Azul verdoso Amarillo
16 RHA Fermentación Oxidación
NO Azul
Azul verdoso Amarillo
17 SAC Fermentación Oxidación
NO Azul
Azul verdoso Amarillo
18 MEL Fermentación
Oxidación NO
Azul
Azul verdoso Amarillo
19 AMY Fermentación
Oxidación NO
Azul
Azul verdoso Amarillo
20 ARA Fermentación Oxidación
NO Azul
Azul verdoso Amarillo
21 OX Citocromo oxidasa Prueba ya realizada
Considerarla como prueba número 21
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METODOLOGÍA
Después de 18-24 horas de incubación a 37º C se debe realizar la
lectura de la galería según la coloración que presenten los
micropocillos. Algunos de ellos son de lectura directa sin necesidad de
añadir ningún reactivo; en cambio, para la lectura de otros es
necesaria la adición de ciertos reactivos. En función de la coloración que adopte se anotarán los resultados +/- de cada micropocillo.
Para realizar la lectura se deben seguir las indicaciones establecidas
en la tabla donde se especifica cuáles son los micropocillos de lectura directa y a cuáles hay que añadir algún reactivo, incluyendo el tipo de
reactivo y las coloraciones que se corresponden con resultados
positivos y negativos.
Los resultados +/- de cada prueba individual se trasladan a una
hojilla donde aparecen las pruebas realizadas. Asimismo, los
resultados +/- se transforman en valores numéricos según la
siguiente tabla. En total existen 7 grupos de 3 pruebas.
Después de consignar los resultados numéricos obtendremos un código constituido por siete números. Existen unas tablas donde se
busca la correspondencia entre los códigos encontrados y los
microorganismos con los cuales se corresponden. También se puede
realizar la identificación utilizando un programa informático.
VALOR NUMÉRICO DE LAS PRUEBAS
POSITIVAS Y NEGATIVAS
CONSIDERAR GRUPOS DE 3 PRUEBAS
Prueba - 1ª / 2ª / 3ª
Posición Valor 0
Prueba +
1ª Posición Valor 1
2ª Posición Valor 2
3ª Posición Valor 4
60
V-5 LECTURA DEL API STAPH
MICRO
POCILLO
ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA
ADICIÓN DE
REACTIVO NEGATIVO POSITIVO
1 O Testigo negativo NO Rojo -
2 GLU
Acidificación a
partir del
carbohidrato
NO Rojo Amarillo
3 FRU NO Rojo Amarillo
4 MNE NO Rojo Amarillo
5 MAL NO Rojo Amarillo
6 LAC NO Rojo Amarillo
7 TRE NO Rojo Amarillo
8 MAN NO Rojo Amarillo
9 XLT NO Rojo Amarillo
10 MEL NO Rojo Amarillo
11 NIT Reducción de nitratos a
nitritos NIT1 + NIT2
Esperar 10 minutos
Incoloro
Rosa pálido Rojo
12 PAL Fosfatasa alcalina ZYM A + ZYM B Esperar 10 minutos
Amarillo Violeta
13 VP Producción de acetil-metil-carbinol
VP 1 + VP 2 Esperar 10 minutos
Incoloro Violeta Rosado
14 RAF
Acidificación a partir del
carbohidrato
NO Rojo Amarillo
15 XYL NO Rojo Amarillo
16 SAC NO Rojo Amarillo
17 MDG NO Rojo Amarillo
18 NAG NO Rojo Amarillo
19 ADH Arginina dihidrolasa NO Amarillo Naranja
Rojo
20 URE Ureasa NO Amarillo Rojo
Violeta
21 LSTR Resistencia a lisostafina
Prueba no realizada (considerar +/-) Considerarla como prueba número 21
METODOLOGÍA
Seguir las mismas indicaciones especificadas para el API 20 E.
61
V-6 LECTURA DEL API STREP
MICRO
POCILLO
ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA
ADICIÓN DE
REACTIVO NEGATIVO POSITIVO
1 VP Producción de acetoína VP 1 + VP 2 Esperar 10 minutos
Incoloro Rojo
Rosado
2 HIP Hidrólisis NIN Esperar 10 minutos
Incoloro Azul pálido
Azul fuerte Violeta
3 ESC β-glucosidasa NO
Incoloro
Amarillo pálido Gris claro
Negro
4 PYRA Pirrolidonilarilamidasa ZYM A + ZYM B Esperar 10 minutos
Incoloro
Naranja pálido Naranja
5 αGAL α-galactosidasa ZYM A + ZYM B Esperar 10 minutos
Incoloro Violeta
6 βGUR β-glucuronidasa ZYM A + ZYM B Esperar 10 minutos
Incoloro Azul
7 βGAL β-galactosidasa ZYM A + ZYM B Esperar 10 minutos
Incoloro Violeta pálido
Violeta
8 PAL Fosfatasa alcalina ZYM A + ZYM B Esperar 10 minutos
Incoloro
Violeta pálido Violeta
9 LAP Leucina arilamidasa ZYM A + ZYM B Esperar 10 minutos
Incoloro Naranja
10 ADH Arginina dihidrolasa NO Amarillo Rojo
11 RIB
Acidificación
NO Naranja/Rojo Amarillo
12 ARA NO Naranja/Rojo Amarillo
13 MAN NO Naranja/Rojo Amarillo
14 SOR NO Naranja/Rojo Amarillo
15 LAC NO Naranja/Rojo Amarillo
16 TRE NO Naranja/Rojo Amarillo
17 INU NO Naranja/Rojo Amarillo
18 RAF NO Naranja/Rojo Amarillo
19 AMD NO Naranja/Rojo Amarillo
20 GLYG NO Naranja/Rojo Amarillo
21 Tipo de hemólisis Beta hemólisis (+) valor 4 Alfa hemólisis (-) valor 0
METODOLOGÍA
Seguir las mismas indicaciones especificadas para el API 20 E.
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VIERNES
APUNTES PERSONALES
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64
65
OPINIÓN PERSONAL, VOLUNTARIA Y ANÓNIMA SOBRE LAS PRÁCTICAS REALIZADAS
GRUPO DE PRÁCTICAS AL QUE USTED HA ASISTIDO
INDIQUE AQUÍ SU GRUPO:
VALORACIÓN GLOBAL EN ESCALA DE 0-10
INDIQUE AQUÍ SU VALORACIÓN:
Los comentarios que usted realice serán utilizados para la mejora de
las prácticas en cursos sucesivos
Esta hoja deberá entregarla el último día a la finalización de la práctica del viernes.
Describa aspectos tales como: interés de las prácticas, organización,
claridad de las explicaciones, etc.
66
67
INFORME DE PRÁCTICAS
Nº. REF. LAB. Microbiología
Nombre
Apellido
Nº de
registro
Fecha de nac.:
Sexo (V o H):
Número de cama:
Iniciales del
solicitante
Manifestaciones clínicas
Solicitud hecha por
SE DEBEN RELLENAR TODOS LOS RECUADROS. DE NO SER ASÍ, NI
LA MUESTRA NI EL FORMUILARIO SERÁN ACEPTADOS EN EL
LABORATORIO
Clave +++ = Profuso ++ = Moderado
S = Sensible R = resistente
Muestra
Terapia antibiótica actual: Investigación precisa solicitada: microscop, cult, sens.
Viajes relevantes:
Fecha recogida
de muestra:
Hora:
Firma:
Fecha en que
se recibió la
muestra en el
laboratorio:
Hora:
Firma:
ASPECTO:________________________________________
__________________________________________________
__________________________________________________
MICROSCOPÍA: Leucócitos___________________________
Hematíes__________________________
Cel. Epitel. ________________________
Cocos gram positivos_________________________________
Cocos gram negativos_________________________________
Bacilos gram positivos________________________________
Bacilos gram negativos________________________________
CULTIVO: CO2 ANAER. Tª AMB . 24h) 48h)
1. ________________________________________________
2._________________________________________________
3._________________________________________________
Comentarios:_______________________________
__________________________________________
SENSIBILIDAD A LOS
ANTIBIÓTICOS
S I R
Penicilina
Eritromicina
Flucoxacilina
Amoxicilina
Sulfamida
Trimetoprim
Nitrofurantoína
Ác. Nalidíxico
Gentamicina
Mezlocilina
Tetraciclina
Metronidazol
Muestra LCR ORINA ESPUTO TORUNDA RASP. LÍQUIDO HECES
