PRACTICAS MEDICINA2011

UNIVERSIDAD NACIONAL JOSE FAUSTINO SANCHEZ CARRION

FACULTAD DE HUMANAE.A.P DE MEDICINA HUMANA

CUADERNO DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA

ALUMNO:………………………………………………

DOCENTES: Dra. Zoila F. Honorio DurandDra. Emma del R. Guerrero HurtadoMg. María Luisa S. Solano Timoteo

HUACHO-2011

Dra. Zoila Honorio Duran

PRESENTACION

TODO CONCEPTO TEORICO DEBE PROBARSE, PERO PARA QUE EL TRABAJO SEA EFECTIVO DEBEMOS DE PROGRAMAR LO QUE QUEREMOS HACER.

POR ESO PRESENTAMOS EL CUADERNO DE LABORATORIO, CUYO DESARROLLO NOS PERMITA COMPROBAR DICHOS CONCEPTOS.

TODO SERA MAS LLEVADERO SI ANTES DE INGRESAR AL LABORATORIO LEES TU CUADERNO, PARA CONOCER EL TEMA A DESARROLLAR, TRAES LOS MATERIALES A UTILIZAR Y DURANTE LA PRACTICA APLICAS LO ESTUDIADO EN CLASE.

EL TRABAJO EN LABORATORIO, ES MUY ESPECIAL, TENEMOS QUE PREPARARNOS PARA TENER ÉXITO.

TODO DEPENDE, EN ESPECIAL DE TI.

Las docentes

NORMAS DEL LABORATORIO DE BIOQUIMICA

- 2 -


En el Laboratorio de Bioquímica se exige: respeto, limpieza, cuidado en el uso de materiales, equipos y muchos deseos de trabajar, por eso antes de ingresar al laboratorio debes tener en cuenta lo siguiente:

1.- Previamente leer tu cuaderno para saber lo que vas a hacer en el Laboratorio

2.- Tener puesto tu mandil, de preferencia de algodón de color blanco.

3.- Tener el cabello recogido (gancho, cinta, etc).

4.- Tener en cuenta la limpieza del lugar donde vas a trabajar.

5.- Llevar a la mesa sólo tu cuaderno de laboratorio.

6.-Antes de usar cualquier material preguntar al docente.

7.-Dejar limpio el laboratorio para que los demás compañeros puedan seguir trabajando.

PROGRAMACION

- 3 -


1. Determinación de pH de muestras biológicas.

2. Determinación de ácidos titulables en orina como efecto de

una dieta.

3. Espectrofotometría

4. Factores que alteran la actividad catalítica de los enzimas.

5. Determinación de la Actividad de Succinato Deshidrogenasa

6. Digestión enzimática del almidón.

7. Determinación de glucosa en sangre

8. Acción de la lipasa pancreática.

9. Determinación de Triglicéridos

10. Determinación de Colesterol en sangre.

11. Hidrólisis enzimática de las proteínas. Propiedades de

aminoácidos y proteínas.

12. Cromatografía de capa fina.

13. Obtención de cadena de ácidos nucleicos.

- 4 -


INTRODUCCION

Las prácticas que se desarrollaran en el presente semestre se harán en plasma, orina, saliva y en alimentos.La sangre será extraída de la punción venosa y punción cutánea.

Como conocimiento previo debemos de saber la conservación de las muestras, según el análisis que se quiera realizar ya que los metabolitos pueden sufrir alteraciones estructurales por factores externos que van a dificultar su reconocimiento.

Aún sabiendo mantener las muestras en forma adecuada, el análisis bioquímico sólo se completa con el conocimiento del manejo instrumental y de materiales de laboratorio en forma adecuada.

Las sesiones de laboratorio van a estar alternadas con el desarrollo

de prácticas instrumentales, con el Objetivo de que antes de

realizar el análisis en los especimenes biológicos debemos de

saber el fundamento y el uso adecuado de los equipos del

laboratorio.

Práctica Nº 01

- 5 -


DETERMINACIÓN DE pH DE LIQUIDOS BIOLOGICOS.

I.-GENERALIDADES.-

Tal como se ha estudiado en las clases teóricas, la concentración de H+ es vital para los procesos biológicos.Es importante también determinar la concentración de H+ en los alimentos, como control de calidad.El método más exacto es por potenciometría. Con la finalidad de cumplir con el objetivo señalado en la introducción estudiaremos las características de un potenciómetro.

Las técnicas potencio métricas se basan en la medición de una fuerza electromotriz (f.e.m) producida por una célula electroquímica. En forma básica, la célula consiste de dos electrodos de alambre cada una sumergida en una solución distinta, constituyendo cada una la semicélula. Las soluciones tienen compuestos o iones fácilmente reducibles u oxidables y están unidos a través de un puente de agar/cloruro de potasio.

Estas soluciones pueden coger electrones del alambre, cargándose éstos positivamente, estableciéndose una diferencia de potencial entre la solución y el alambre. El metal es parte de un circuito, y así, si un compuesto menos reductor u oxidante está en contacto con el otro metal, habrá un flujo de electrones (una corriente) el que queda registrado por el circuito potenciométrico (que une a los 2 alambres).

A fin de establecer valores, una de las semicélulas es considerada como Electrodo de referencia, tales como de:

- 6 -


Hidrógeno, se usa un gas de hidrógeno puro a presión constante y como metal platino recubierto de negro de platino, y solución de HCl, (1,228 mox 100ml de HCl) estableciéndose un potencial estable en el platino por el equilibrio entre el gas de hidrógeno y los hidrogeniones.

La desventaja de este electrodo es que no debe haber presencia de oxígeno, es decir en la muestra no debe contener oxidantes ni sales metálicas porque se destruye fácilmente, en el caso que contenga proteínas, puede haber reacciones químicas entre el hidrógeno gaseoso y los componentes de la solución problema (muestra).

Electrodos de calomelanos, tiene como solución cloruro mercurioso (calomelanos) y cloruro potásico, en contacto con cloruro mercurioso sólido y mercurio.

Hg / Hg2Cl2 / KCl saturado // disolución muestraEl no es sensible a los iones de H+.

Electrodo de vidrio que en reemplazo a los calomenanos presenta plata/ cloruro de plata en una disolución de HCl.

Ag / AgCl / HCl

El electrodo de vidrio es mucho menos susceptible a las interferencias y puede emplearse para determinar una amplia gama de pHs, (la solución problema puede contener sales salinas y agentes reductores y oxidantes), sin embargo a pH muy alcalinos, mayores de 9 ò 10, es menos exacto y se torna sensible al Ion sodio. El electrodo de vidrio se asa en que ciertos tipos de vidrio de borosilicato son permeables a iones de H+ pero no a otros cationes o aniones.

- 7 -


NOTA: Los electrodos nuevos o secos deben ser remojados en una solución tampón 7,0 durante varias horas.Los electrodos siempre deben de guardarse en agua destilada, pues si se secan se provoca un cambio del potencial asimétrico, por lo que se va a requerir calibrar el aparato.Los cambios de temperatura provocan desplazamiento del pH, especialmente en soluciones alcalinas, por lo que se recomienda tomar nota de la temperatura de la muestra.NOTA: Los potenciómetros generalmente son estandarizados con una solución de pH conocido. Entre los más usados tenemos:

1. Ftalato monobásico de potasio 0,050M de pH 4,01

2.-Fosfato de potasio monobásico 0,025M y Fosfato de sodio dibásico 0.025M con un pH de 6,86

3.-Tetraborato sódico 0,010 M de pH 9,18

Siempre hay que verificar los niveles de la solución de KCl dentro del electrodo, si está por debajo de lo normal, adicionar la solución saturada de KCl por el orificio superior ayudándose con una jeringa descartable sin aguja.

La membrana de vidrio no debe ser tocada o secada en forma brusca, ya que es muy sensible a los pasos de iones de H.Si las lecturas son lentas en estabilizar o no son reproducibles, se recomienda reactivarlo, sumergiendo el electrodo en HCl 0,1 M durante 2 horas.No se debe medir el pH de muestras muy concentradas de proteínas ni de muestras precipitadas porque pueden taponar el orificio que pone en comunicación el KCl /es el puente salino) del electrodo con la solución problema.

- 8 -


Con la finalidad de medir el contenido de acidez en el estómago, se utilizan electrodos de estómago (que pueden ser deglutidos), en caso de detectar las úlceras.

Otros electrodos especiales se usan para determinar el pH de la piel, del músculo y otros fluidos corporales.

II.- OBJETIVO.

Al término de la práctica el alumno debe de explicar el fundamento del potenciómetro o pHmetro y calcular las concentraciones de H+ y OH- de las muestras biológicas.

III.-MATERIALES

Vasos de precipitaciónFrascos lavadores con agua destiladaPotenciómetro con sensibilidad de 0,001 pH

IV.-PROCEDIMIENTO.-

Tomar en cuentas lo indicado en NOTAS, Calibrar el potenciómetro con patrones de pH 7,0 y 4,5.

Lavar con agua destilada el electrodo (tener cuidado ya que el bulbo es muy sensible).Colocar la muestra en el vaso de precipitación, introducir el electrodo teniendo en cuenta que la muestra cubra el bulbo de vidrio.Tomar nota de la temperatura y de la lectura de pH

- 9 -


Lavar inmediatamente el electrodo con agua destilada

V.- RESULTADOS.-

Completa el siguiente Cuadro

muestra temperatura pH pOH H+ OH-

Interprete los resultados

Práctica Nº 02

DETERMINACION DE ACIDOS TITULABLES EN ORINA

- 10 -


I.- GENERALIDADES.-

Las fuentes del ácido titulable son a través de 2 vías:Exógenos.- Los alimentos que contienen altas concentraciones de cloruro, fósforo o azufre como la palta, carne, pescado, aves, huevos, cereales, nueces son formadoras de ácidos en los líquidos corporales. El S de los AA (METIONINA Y CISTEINA) se oxidan hasta ácido sulfúrico, el fosfato de los fosfolípidos y otros que contienen fósforo se oxidan a ácido fosfórico (los dos ácidos son fijos, no volátiles).

Endógenos.- A través de los procesos metabólicos se general ácidos inorgánicos como sulfatos y fosfatos y como ácidos orgánicos tenemos mayormente al ácido láctico y a los cetoácidos

En condiciones fisiológicas la acidez titulable urinaria se debe en gran parte a los fosfatos.La acidez es baja en las infecciones de las vías urinarias, por transformación de la urea en amoniaco, en las dietas ricas en vegetales o por la ingesta de álcalis.La acidez es alta en caso de una acidosis, en caso de ayuno, procesos febriles y ciertos trastornos cardiorrenales, después de ejercicios violentos o por la ingestión de una dieta rica en carne o de ciertas frutas como el caso de las ciruelas

Carga ácida urinaria diaria:

Acidez titulable (H2PO4-) = 25-30 mEqAcidez no titulable (NH+ 4) = 30-35 mEqH+ libres = pH 5,0 = 0,01 mEqEn el caso de expresarlo en ml de NaOH 0,1N gastados el valor normal es de 250 a 400 ml

- 11 -


II.- OBJETIVO

1.-Comparar mediante valoración del ácido titulable en orina el efecto de una dieta rica en proteínas y de una dieta rica en vegetales.

III.- MATERIALES Y REACTIVOS

Solución de NaOH 0,1 NErlemeyer de 250mlBureta de 50mlSolución alcohólica de fenolftaleina al 1%Oxalato de potasio pulverizado

IV.-PROCEDIMIENTO

Método de Folin.Recoger en un frasco limpio con tapa y de boca ancha, es preferible recoger la primera orina de la mañana, desechando el primer chorro. El análisis debe ser dentro de las 2 horas de haber sido recogida la muestra o refrigerarlo de 2 a 8 ºC Medir unos 25 ml de orina y colocarlo en el erlenmeyer de 250ml de capacidad.Añadir unos 15 gramos de oxalato de potasio para precipitar el calcio y evitar la formación de fosfato de calcio.Añadir III gotas de fenolftaleína. Mezclar.

- 12 -


Titular con una solución de NaOH 0,1N álcali hasta cambio de color ligeramente rosado persistente Anotar el volumen gastado.

La cantidad de álcali añadido equivale a la acidez titulable urinaria, que se expresa como una cantidad determinada de mili equivalentes de hidrógeno excretado en el mismo tiempo.

Interprete los datos obtenidos de acuerdo al objetivo planteado

Práctica Nº 03

ESPECTROFOTOMETRIA

- 13 -


I.- GENERALIDADES.-

Son métodos de análisis cuali y cuantitativos, basados en la interacción de la luz con los átomos y las moléculas de las sustancias problemas que se quieren analizar, pudiéndose identificar compuestos desconocidos por su espectro de absorción característico en el UV, VIS o IR. Así como también se pueden determinar las concentraciones de compuestos conocidos midiendo la absorción de luz a una o más longitudes de onda, generalmente a la longitud de onda de máxima absorción.A fin de que la presente práctica facilite el entender, aplicar y explicar el método en la determinación de los metabolitos bioquímicos indicadores del estado de salud del hombre se explica algunas de las propiedades de la luzLa luz se manifiesta mediante radiaciones electromagnéticas la cual puede considerase como corpuscular o en la forma de onda.Algunas propiedades físicas de la luz se entienden mejor mediante sus características de onda. Otras propiedades pueden explicarse a través de su naturaleza corpuscular o de partículas.

Las características de una onda son:

UN CICLO

: longitud de onda: distancia a la que se mueve la onda durante un ciclo. Unidades:

Aº (armstrongs) = 10-10 m cm (centímetro) = 10 7 nm

- 14 -


nm (nanómetro) = 10-9 m = 10 -6 mm = 10-7 cm m (milimicras ) = 10 -6 mm : período: tiempo que se requiere para que un ciclo completo pase por un punto. Unidad: seg/ciclo o s/ciclo : frecuencia de oscilación: número de ciclos que se presenta en cada segundo. Unidad ciclos/seg Hz.

La relación entre la longitud de onda () y la frecuencia () para una onda de luz es:

= C

C es la velocidad de luz (3,0 x 108 m/s ó 3,0 x 1010 cm/s)La relación entre la frecuencia y el período es inverso: v = 1/T La luz por su naturaleza corpuscular o de partículas puede considerarse como una corriente de paquetes de energía que se desplazan a gran velocidad (3,0 x 10 10 cm/s).Estos paquetes de energía se denominan fotones.La frecuencia ( ) de la teoría ondulante puede relacionarse con la energía de los fotones (E) de la teoría de las partículas mediante la Ecuación de Planck.

E = h

h es la constante de Planck cuyo valor es de 6,63 x 10 -34 joule . s

- 15 -


El número de onda es una característica de onda que es proporcional a la energía y se define como el número de ondas por centímetro:

= 1/

Unidad: cm -1

La radiación electromagnética se divide en regiones denominadas:Ondas de radio, Microondas, Infrarrojo, Visible, Ultravioleta y Rayos X, las que se encuentran asociadas con las longitudes de onda, número de ondas, frecuencias y energía, se presentan en el siguiente gráfico.

El espectro óptico o electromagnético es detectado por equipos especiales como:

FOTOCOLORIMETRO: Cuya zona de observación es en la Zona visible: (400 á 700 nm).

ESPECTROFOTOMETRO: Estas pueden ser de dos clases:1. Espectrofotómetro UV que comprende de 10 á 400 nm. * UV cercano 200 á 400 nm * UV lejano 10 á 200 nm2. Espectrofotómetro IR que comprende de 760 á 10 000 nm * IR cercano 0,75 á 2,50 m * IR medio 2,50 á 5,00 m * IR lejano 5,00 á 10 m

- 16 -


Las moléculas biológicas absorben las radiaciones de la región UV cercana (200 á 400 nm). Las proteínas lo hacen en el UV lejano debido a los enlaces peptídico, mientras que la Fenilalanina, Tirosina y Triptófano absorben a 280 nm lo cual constituye el fundamento de una técnica muy sensible para determinar proteínas sin que se destruya la muestra.

Los esteroides, las bases púricas y pirimidínicas, nucleósidos y nucleótidos lo hacen también en la región UV.Los enlaces o grupos funcionales como: amino, carboxilo, metilo, amida absorben las radiaciones de la región IR.La molécula o parte de ella que se excita por la luz como consecuencia de la absorción de ésta se denomina CROMOFORO.

Cuando la luz continua se hace pasar a través de un prisma, la luz sufre una dispersión de sus longitudes de onda componentes. Cuando estas longitudes de onda dispersas se les hacen pasar a través de una celda que contiene la muestra problema (átomos o moléculas), la luz emergente deja de ser continua ya que parte de las ondas de luz han interaccionado con los átomos o moléculas y han sido absorbidos por éstos.

Las longitudes de ondas faltantes se detectan cuando la luz emergente de la celda que contiene la muestra problema incide sobre una placa fotográfica o sobre algún dispositivo o detector. A este procedimiento se le denomina ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION.

Dibuje las partes básicas de un espectrofotómetro típico.

- 17 -


La longitud de onda en la que las moléculas o átomos de la muestra absorben con mayor intensidad la luz, se denomina “LONGITUD DE MAXIMA ABSORCION”.

Los procesos de absorción de las radiaciones electromagnéticas son explicados por la Ley de Lambert-Beer que relaciona la intensidad de la luz incidente (Io) y la transmitida (It) en función de la concentración de las moléculas y átomos que absorben la luz.

Su expresión es:

A = log Io/It = e. l. C ó

A = - log It/Io = e. l. C

Donde:A: Absorbancia o Extincióne : Coeficiente de extinción molar. Valor constante que

depende de la naturaleza de la sustancia y de la longitud de onda.

L : ancho del recipiente de la muestra = 1 cm C : Concentración de la muestra problema

A.- Uso del Espectrofotómetro.

Vamos a aplicar los conceptos hasta hoy estudiados usando el espectrofotómetro UV, para el cual usaremos un reactivo coloreado como ejemplo antes de usar las muestras que usaremos para el análisis de glucosa.

- 18 -


II.- MATERIALES Y REACTIVOS

Equipos: Balanza analítica Espectrofotometro UV Muestra: solución de Permanganato de Potasio (KMnO4 ) 4 mg/litro.

III.- PROCEDIMIENTO

4.1 Búsqueda de la longitud de onda ( ) óptima para la muestra .-

Encender el espectrofotómetro 30 min antes de empezar a trabajar.

Seleccionar la región visible (VIS) del espectro, e Iniciar las lecturas desde 400 nm.

Colocar en la cubeta agua destilada y llevar a CERO de Absorbancia y 100% de Transmitancia.

Colocar en otra cubeta la solución problema. Realizar la lectura en Absorbancia y anotar el

valor obtenido. Aumentar la a 420 nm . Recuerde que cada

vez que se cambie de longitud de onda es necesario graduar el instrumento en CERO con agua destilada en la cubeta. Luego: LEER la absorbancia.

Repetir la misma operación DE 20 nm cada vez hasta llegar a 700 nm

En el papel milimetrado dibuje la Curva Espectral A vs

- 19 -


DATOS:

Lectura (A) Lectura (A)

Explicación de los resultados:

Práctica Nº04

FACTORES QUE ALTERAN LA ACTIVIDAD CATALITICA DE LOS ENZIMAS

- 20 -


I.- GENERALIDADES.-

Las enzimas son proteínas biocatalizadores, sensibles de modificar su actividad por la alteración de las condiciones de su medio de acción ya que actúan solo bajo condiciones definidas de pH, temperatura, concentración de sustratos, cofactores, etc.

Sobre los cofactores hay que recordar que los enzimas para su actividad requieren de sustancias no proteicas que pueden ser de naturaleza orgánica (coenzimas) o inorgánicas (minerales) los que cumplen funciones especificas como la de coordinar entre el centro activo del enzima con el sustrato antes de la transformación de éste a producto.

Hay medicamentos que actúan como competidores de las vitaminas las que son coenzimas y por lo tanto bloquean la acción de los enzimas o lo que es más inhiben la síntesis de los enzimas específicos, por ejemplo el metrotexato (MTX), empleado para el tratamiento de la leucemia y artritis reumatoide que libera al folato de la enzima hidrofolato reductasa.

Los enzimas se clasifican por su acción en seis clases; también toman el nombre genérico según el sustrato por ejemplo los enzimas proteo líticos como la pepsina, quimotripsina, tripsina, etc.

II. OBJETIVO

Demostrar el efecto de los factores: Concentración de Sustrato, Concentración de Enzima, pH y Temperatura sobre la actividad enzimática de la Amilasa salival sobre el almidón.

- 21 -


III.- MATERIALES Y REACTIVOS.

Solución de almidón al 1%Enzima: Solución de alfa amilasa salival dializada 1%Sol. Buffer fosfato 0,1M a pH 4,6; 6,8 y 9,0Sol. Yodo iodurada (Lugol)Sol Cloruro de sodio 0,2%

IV.- PROCEDIMIENTO:

Colección de la saliva : El alumno donante no debe haber ingerido alimento unas 2 horas antes como mínimo. Previamente se tiene que enjuagar la boca con agua, luego manteniendo la boca cerrada por unos 5-7 minutos esperará que su boca se llene de saliva. Luego en un vaso dejará fluir por gravedad la saliva para evitar que se forme espuma.

Preparación de la solución de saliva al 1%: Previamente la saliva recolectada se debe de filtrar y luego medir 1ml y diluirlo con agua destilada en una fiola de 100ml

Seguir las indicaciones de las siguientes tablas.-

a.- Batería Nº01

Reac.\tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9

- 22 -


Sol. Almidón 1%

1 1 1 1 1 1,5 1 1 1

Buffer pH4,6

- - - 5 - - - - -

Buffar pH 6,8

5 5 - - 5 5 5 5 5

Buffer pH 9,0

- - 5 - - - - - -

Sol. NaCl 1,4 1,4 1,4 1,4 1,4 1,4 - 1,4 1,4Agua dest. 2,6 2,0 2,0 2,0 2,4 1,5 3,4 2,0 2,0 HOMOGENIZAR CADA TUBO

Colocar en baño maría a 37ºC los tubos del 1 al 7 por 5 minutos.El tubo 8 llevar a 0ºC por 5 minutos y el tubo 9 a baño maría de 100ºC por 5 minutos

Cumplido los 5 minutos, agregar la solución enzimática, como se indica en el siguiente Cuadro:

Sol. enzimático

0,0 0,6 0,6 0,6 0,2 0,6 0,6 0,6 0,6

MEZCLAR BIEN CADA TUBO SIN RETIRARLO DEL MEDIO EN QUE SE ENCUENTRAN

Continuar la incubación, considerando un control de 20 minutos, desde el momento que el preparado enzimático fue agregado a cada tubo.

Cumplido el tiempo exacto de 20 minutos, medir 0,5 ml de cada tubo y añadir a la bateía Nº02 tal como se indica en la siguiente

- 23 -


Tabla

b.- Batería Nº02.

Reac\tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9Sol HCl 0.05N (ml)

2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

Sol. Lugol (ml)

5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

Incubado (ml)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

MEZCLAR.

Explicar los resultados

APLICACIONES DE MODELO DE LINEWEAVER BURCK: CINETICA ENZIMATICA

- 24 -


GENERALIDADES.- La cinética de Michaelis-Mentes describe la velocidad de reacción de muchas reacciones enzimáticas. Su nombre es en honor a Leonor Michaelis y Maud Menten. Este modelo sólo es válido cuando la concentración del sustrato es mayor que la concentración de la enzima.

Los parámetros cinéticos de una enzima son el Km y la Vmax.

Recordemos los que significa el Km (Constante de Michaelis-Menten):

• Concentración de sustrato para la que se alcanza la velocidad igual a la mitad de la máxima (Vmax)

• Afinidad de un enzima por un sustrato determinado• Permite comparar la afinidad de un enzima por distintos

sustratos y la afinidad de varios enzimas por el mismo sustrato

• Se puede determinar con facilidad en el laboratorio• La velocidad de reacción es muy sensible a cambios en

[S] en la zona de Km.

Las Km y Vmax pueden determinarse con mayor facilidad y en forma experimental aplicando el recíproco de la Ecuación de Michaelis-Menten conocido como ecuación de Lineweaver-Burk:

Lo que facilita la gráfica para calcular las constantes cinéticas: Km y Vmax.

- 25 -


formas de INHIBICION ENZIMATICA.

Cuando se usa para determinar el tipo de inhibición de la enzima, la Lineweaver-Burk puede distinguir competitivos, no competitivos y acompetitivos inhibidores con las respectivas características ya estudiadas en teoría.

OBJETIVO:

Demostrar la aplicación del gráfico de Lineweaver-Burk en el cálculo de Km y Vmax con datos teóricos y los obtenidos mediante un trabajo experimental.

PROCEDIMIENTO:

1.- TEORICO: Al estudiar la cinética de inhibición de cierto enzima se han obtenido los resultados de la tabla siguiente:________________________________________________Sustrato

- 26 -

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/06/Lineweaver-Burke_plot.PNG%00%E5%A1%B9%EF%92%81%E1%B4%BB%E4%A1%BF%E2%B2%AF%E5%B6%82%E8%97%84%E6%8C%A7%00%00%EA%AE%A5


(mM) v (μmol/min)

[I]= 0 [I]= 0,1 mM [I]= 1 mM

0,02 1,18 2,90 2,52 0.05 1,43 5,00 4,02 0.10 1,54 6,67 5,02 0.20 1,60 8,13 5,72 0.50 1,64 9,09 6,25

Determinar gráficamente: a) el tipo de inhibición; b) el valor de Km del enzima; c) la velocidad máxima y d) el valor de Ki

Sol.: a) Inhibición acompetitiva; b) Km= 0,05 mM; c) Vmax= 10 μmoles/ min;d) Ki= 0,2 mM.

2.- EXPERIMENTAL:

2.1.-Materiales y reactivosSustrato: soluciones de glucosa a diferentes concentracionesEnzima: glucosa oxidasa8 tubos de ensayo pequeños9 pipetas de 1mlAgua destiladaHCl concentrado

2.2.-ProcedimientoPreparar soluciones de glucosa de las siguientes concentraciones: 1; 2,5; 5,0; 10; 25 y 100 mM

- 27 -


2.3.- Seguir las indicaciones expuestas en el siguiente Cuadro:

REAC/TUBO

1 2 3 4 5 6 7

Sol. glucosa 0,1ml de…

- 1mM

2,5mM

5,0mM

10mM

25mM

100mM

Agua (ml) 0,1 - - - - - -Rvo. Color(ml)

0.9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9

Agitar, incubar 20 min a temperatura ambiente. Al finalizar la incubación, agregar 3 gotas de HCl concentrado. Agitar levemente.

Leer a 492 ó 505 nm.

ABSORBANCIA CONC. mg/ml

GRAFICO: Usando los resultados elaborar un gráfico de Lineweaver-Burk y calcular Km y Vmax.

Práctica Nº05

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE SUCCINATO DESHIDROGENASA

I.- GENERALIDADES.-

- 28 -


Durante el proceso metabólico se llevan a cabo reacciones en las que hay transferencia de electrones desde un dador (el reductor) hasta un aceptor electrónico (el oxidante). En ciertas reacciones de oxido reducción la transferencia de electrones se realiza por medio de la transferencia de átomos de hidrógeno por lo que una deshidrogenación equivale a una oxidación, estas reacciones son catalizadas por deshidrogenasas las que se encuentran ampliamente distribuidas. La cadena respiratoria es el proceso donde se dan mayormente estos tipos de reacciones, dando origen a los enlaces fosfóricos del ATP. Ejm.:

NADH + CoQ CoQ Reductasa NAD + CoQH2

Otro ejemplo de estas reacciones se dan en el ciclo de Krebs:

Succinato + FAD Succinato deshidrogenasa Fumarato + FADH2

La oxidación del succinato a fumarato es catalizado por el complejo de la succinato deshidrogenasa (succinato deshidrogenasa). Este complejo consiste en varios polipéptidos e incluye un grupo prostético FAD unido covalentemente a un residuo de histidina de la enzima, proteínas con fierro y azufre y una molécula de citocromo. Estos cofactores de transporte de electrones participan en la remoción de electrones del succinato y en la donación de electrones a la ubiquinona.En el experimento esos electrones son transferidos a través del FADH2, centro Fe-S hasta un aceptor artificial como el azul de metileno (oxidado) el cual al reducirse presenta un cambio en su espectro de absorción (incoloro).

II.- OBJETIVOS

- 29 -


Demostrar la actividad de las deshidrogenasas

III.-MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de prueba homogeneizado de HígadoFiolas Acido succínicoPipetas Azul de metilenoTermómetros ClNa 0,9%Mechero vaselina líquida

IV.- PROCEDIMIENTO

4.1Determinación de la Presencia de deshidrogenasas, Seguir las indicaciones del siguiente cuadro:

Soluciones/tubos 1 2 3

Ml homogeneizado de hígado 2* 2 2Gotas de azul de metileno 2 2 2Ml vaselina líquida 2 2 -*Previamente hervido

Llevar a Baño Maria de 37ºC. Controlar el tiempo que demora cada tubo en decolorar el azul de metileno.

4.2 investigación de la deshidrogenasa succínica

Soluciones /tubos

1 2 3 4 5

ml. de homogenizado

1 1 1 1 2

sol. buffer pH 1 1 1 1 1

- 30 -


7.4Ac. Succinico 0. 2N

- 1 1 2 1

Agua destilada 2 1 0.8 - -Azul de metileno gotas

2 2 4 2 2

Mezclar, añadir 0,5 ml. de vaselina. Llevar a baño María a 37 ºC.

Explique los resultados.

Práctica Nº06

DIGESTION ENZIMATICA DEL ALMIDÓN

I.-GENERALIDADES.-

El almidón es el polisacárido principal fuente de energía para el hombre. Estructuralmente está constituido por dos cadenas: la amilosa (polímero de D- glucosas unidas por enlaces α 1-4 , de

- 31 -


forma lineal helicoidal) y la amilopectina (polisacárido de D-glucosas unidas por enlaces α 1-4 y α 1-6 de forma ramificada).

El enzima α amilasa, presente en la saliva y en la secreción pancreática es la responsable de la hidrólisis de los enlaces α 1-4 glucosídicos del almidón, a pH 6,8-7,2. Los productos finales de su acción catalítica es un alto porcentaje de maltosa, glucosa, isomaltosas y dextrinas.

II.- OBJETIVO:

. Determinar los productos de la acción enzimática en la digestión del almidón.


1.- Baño María2.-Tubos de precipitación3.- Sol. de almidón al 1%4.- Buffer fosfato 0,1 M pH 6,85.-Sol. HCl 0,5 N6.-Sol. NaCl 0,9%7.- Reactivo de Lugol8.- Reactivo de Benedict

IV.- PROCEDIMIENTO

1.- Solución de saliva al 1%.- Proceder igual a la Práctica Nº 04.

2.- Digestión del almidón: Seguir las indicaciones

Tubos 1 2 3Sol. almidón 1% 1,0 1,0 1,0

- 32 -


Buffer fosfato pH 6,8

0,5 0,5 -

Sol HCl 0,5 N - - 1,2Agua destilada - 1,2 0,5Sol NaCl 0,9% 1,2 - -

Llevar a B.M. a 37 ºC por 5 minutos. Luego añadir 0,5 ml de sol. de saliva al 1% en los 3 tubos.

Incubar a B.M a 37 ºC por 10 minutos y cada 3 minutos agitar cada tubo para evitar que se sedimente el almidón.Retirar del Baño María y agitando cada tubo preparar las siguientes baterías:3.- Reconocimiento de los productos por reacción con el Lugol:

Tubos 1 2 3Digestión 1 1,0 - -Digestión 2 - 1,0 -Digestión 3 - - 1,0Sol. HCl 0,5 N 0,5 0,5 0,5Reactivo de Lugol 2,0 2,0 2,0

Mezclar cada tubo y observar los resultados:

Interpretar:

4.- Reconocimiento de los productos por reacción con el Benedict:

Tubos 1 2 3Digestión 1 0,5 - -

- 33 -


Digestión 2 - 0,5 -Digestión 3 - - 0,5Reactivo Benedict 0,5 0,5 0,5

Mezclar cada tubo y llevar a Baño María hirviente por 5 minutos. Dejar reposar y comparar los precipitados.

Interpretar los resultados

Práctica Nº07

DETERMINACION DE GLUCOSA EN PLASMA

I.-GENERALIDADES.-

- 34 -


Los carbohidratos de la dieta están constituidos por azúcares simples (Glucosa, fructosa y galactosa), disacáridos (sacarosa, lactosa y manosa) y complejos (almidón).Las enzimas, como la amilasa y, demás enzimas glucolíticas presentes en el intestino convierten a los disacáridos y al almidón en hexosas, siendo la glucosa la principal.La función principal de la glucosa es como fuente de energía para el trabajo de las células. Rol que cumple cuando ingresa a las células donde se activa por acción de la Hexocinasa, la cual presenta 4 isoenzimas (I, II, III y Glucocinasa).

El transporte de la glucosa a través de la membrana celular, mayormente se encuentra relacionado con la Insulina quien junto con el hígado regula los niveles de glucosa sérica.

Los niveles altos de glucosa en suero caracteriza a la enfermedad conocida como Diabetes I y II. práctica.Químicamente la glucosa puede estar bajo la forma de una estructura aldehídica (estructura abierta) y que por el pH fisiológico se encuentra bajo la forma enodiólica (Cíclica). El equilibrio entre la forma aldehído/enodiol permite que la glucosa pueda ser reducida y oxidada con facilidad.La determinación de la glucosa se basa en la capacidad reductora de este azúcar sobre el ión cúprico (Cu++) a quien transforma en ión cuproso (Cu+). Este ión monovalente en un medio alcalino y en calor se transforma en óxido cuproso (Cu2O). Este compuesto puede ser detectado por diferentes métodos como: Folin-Wu, Somogyi-Nelson y las modificaciones de estos conocidos como Benedict. Sin embargo, sólo son indicadores cualitativos o semicuantitativo.

Actualmente la determinación de glucosa en suero se realiza por métodos enzimático como el conocido:

- 35 -


MÉTODO ENZIMATICO (TRINDER)–GLUCOSA-OXIDASA (GOD), cuyo fundamento es que : “ la glucosa es oxidada por la Glucosa oxidasa a ácido glucónico más peróxido de hidrógeno, el agua oxigenada en presencia de una peroxidasa produce la copulación oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4AF), dando lugar a la formación de un cromógeno rojo-cerezo con absorbancia máxima a 505 nm.

GLUCOSA+ O2 + HOH GOD Ac.Glucónico + H2O2

H2O2+4AF +fenol CROMOGENO + 4 HOH

II.-OBJETIVO: Determinar y cuantificar a través de método enzimático los

valores de glucosa en el plasma por espectrofotometría.


Muestra: plasma-Tubos de ensayo 13 x 100 mm-Baño Maria-Espectrofotómetro a 505 nm-Kit de Trabajo de procedencia conocida.

IV.- PROCEDIMIENTO

DETERMINACIÓN DE LA GLUCOSA EN SOLUCION PREPARADA: Proceder según las indicaciones del Cuadro siguiente:

- 36 -


Tubos Blanco(b)

Estándard(s)

Desconocido (D)

Estándard (ul) - 20 -

Muestra (ul) - - 20

Rvo.trabajo (ml) 2.0 2.0 2.0

Incubar a 37°c por 10 minutos.Retirar de B.M y enfriar a chorro de agua fría por 1-3 min.

Llevar a lectura espectrofotométrica a 505 nm., llevando el aparato a cero con el blanco.

CALCULOS:

GLUCOSA (g/L) = D x F

DETERMINACION DEL FACTOR (F):

Resultados:

Práctica Nº08

ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREATICA

I.- GENERALIDADES.

- 37 -

F = 1.0 g/lt Lec.Est


La lipasa, al igual que la amilasa; tripsina y pepsina, pertenecen a las hidrolasas, diferenciándose de otros estearasas por actuar específicamente en la interfase éster–agua y ser inactiva frente a sustratos hidrosolubles.

Es secretado por las células acinosas del páncreas y actúa a pH alcalino. Su acción hidrolítica la ejerce a nivel de yeyuno, favorecido por la propiedad emulsificante de las sales biliares (glicocolato y transcocolato) posición;rompen los enlaces ésteres de la glicerina (triglicéridos en α liberando β – monoglicéridos los que serán atacados posteriormente por lipasas específicas para β– posición o por las isomerasas quienes cambian la posición β por pero debido a que la acción de las isomerasas es lenta; los productosα de la digestión de trigliceridos son: abundantes monoglicéridos, pequeña cantidad de di y triglicéridos, glicerol y ácidos grasos libres.La lipasa pancreática, de gran interés clínico, se presenta en la sangre en escasas concentraciones (0 a 1.5 unidades de Cherry Grandall), niveles altos son indicadores de pancreatitis aguda, carcinoma de páncreas, peritonitis aguda y obstrucción intestinal.

II.- OBJETIVO Demostrar experimentalmente la hidrólisis enzimática de los triglicéridos.

III.- ACTIVIDAD EXPERIMENTAL MATERIALES Pipetas simples de 5 y 10 ml

- 38 -


Baño María 37ºCBureta de 50 mlMatraces 125 ml

REACTIVOSBuffer fosfato pH 8.0Hidróxido de sodio 0.1 NHidróxido de sodio 0.01 NSolución alcohólica fenolftaleínaSolución de pancreatina y sales biliares.

IV.- PROCEDIMIENTO.- Muestra con que se trabajará la Experiencia: Aceite Neutralizado.

1.-- Neutralización del aceite de pepita.– Colocar 50 ml. De aceite de pepita en un matraz, añadir 2 gotas de solución alcohólica de fenolftaleína. Mezclar y agregar poco a poco Hidróxido de Sodio 0.01 N hasta una coloración ligeramente rosada.

2.- Solución de pancreatina y sales biliares.- Para su preparación se hará uso de fármacos comerciales como el Helopanzyn que contiene 200 mg. de pancreatina y 50 mg. de sales biliares.Disolver 5 pastillas en 100 ml. de buffer fosfato pH 8.0.

3.- Hidrólisis del aceite de pepita (Triglicérido).- Seguir las indicaciones del siguiente cuadro.

SOLUCIONES TUBOS 1 2 3 4 g aceite neutralizado 2 2 2 2

- 39 -


ml buffer fosfato pH 8.0 4 4 - 4 ml. agua destilada 10 - 4 -

Agitar bien. Si el color ligeramente rosado no persiste añadir Hidróxido de Sodio 0.1 N poco a poco agitando continuamente hasta obtener el color.

Añadir ml. de solución pancreatina a los tubos, 2 y 3 al tubo 4 el mismo volumen pero previamente hervida. Llevar a B.M. de 37°C por una hora.Titular el contenido de cada tubo con Hidróxido de sodio 0.01 N hasta color rosado usando solución alcohólica de fenolftaleína como indicador.

CALCULOS:

A.G.L% = Gasto NaOH N/100 x Fact.conversión Ac.Oléico x N x 100gramos de muestra

Interpretar.-

Práctica Nº09

DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS

I.- GENERALIDADES.-

Es la forma como se encuentran almacenados los lípidos en los tejidos adiposos. Forman parte de las lipoproteínas. Pueden ser exógenos o endógenos.

- 40 -


Se encuentran en mayor porcentaje en los quilomicrones y en la VLDL.

La determinación de TG totales se fundamenta en las siguientes reacciones:

Trigliceridos + H20 Glicerol + Acidos grasosLPL

Glicerol + ATP Glicerol 3 fosfato + ADPGK

Glicerol 3 fosfato + O2 Dihidroxicetona fosfato + H2O2GPO

POD2H2O2 + 4-amino antipirina + 4-clorofenol Rojo de

Quinona + 4H2O

El rojo quinona es leído a 510 nm a una temperatura de 37 ºC.

II.- OBJETIVODeterminar la concentración de triglicéridos en sangre.


Muestra:Suero o plasma

REACTIVOS:

- 41 -


Buffer pH 6,9 40 mmol/L 4-Clorofenol 5.0 mmol/L Lipoprotein Lipasa 1,4 U/ml Glicerol Kinasa1,0 U/ml Glicerol 3 fosfato oxidasa 1,5 U/ml Peroxidasa 0,5 U/ml 4 Amino antipirina 0,4 mmol/L ATP 1,0 mmol/L Magnesio 5,0 mmol/L Detergentes

ESTANDAR:

Triglicéridos 2,2 mmol/L ó 200 mg/dl

IV.- PROCEDIMIENTO.- Según las indicaciones

Blanco Estándar Muestra

Reactivo de trabajo

1 ml 1ml 1ml

Estándar - 10 ul -

Muestra - - 10 ul

- 42 -


Mezclar e incubar a 37ºC por 5 minutos. Leer a 510 nm.

CALCULOS:

mg/dl = Conc estandar X Lectura de Muestra Lectura de estándar

VALORES DE REFERENCIA:

Varones: 0,68 – 1,88 mmol/L ó 60,2 – 166,4 mg/dlMujeres: 0,63 – 1,60 mmol/L ó 56,6 – 141,6 mg/dl

Resultados e interpretación

Práctica Nº 10

DETERMINACION DE COLESTEROL EN SANGRE

I.- GENERALIDADES.-

El colesterol presente en el organismo humano, procede de la dieta el que es absorbido a nivel del tracto intestinal junto con los ácidos grasos.

- 43 -


También se obtiene por síntesis (en el hígado) a partir del acetato por vía del escualeno.El colesterol está integrado por las lipoproteínas VLDL ( 13%) + LDL (70%) + HDL (17%).

Quizá es el líquido de mayor interés particular, se encuentra en los más variados tejidos (nervioso, graso, bilis donde puede formar gran parte de los cálculos biliares, sangre, entre otros), es excretado normalmente por las heces, donde también se encuentran algunos de sus derivados (coprosterol).

El colesterol es uno de los principales componentes de la fracción insaponificable de la sangre, donde 2/3 se encuentran sobre la forma estérica y 1/3 libre. Esa proporción es normalmente constante y las dos porciones se hallan débilmente ligadas a las proteínas plasmáticas (+/- 75% en las beta-lipoproteínas).

II.- OBJETIVO

Determinar y cuantificar a través de método enzimático los valores de Colesterol sanguíneo.


Método: ENZIMATICO – COLESTEROL-OXIDASA (CHOD) - TRINDER

Fundamento: El Colesterol es oxidado enzimáticamente por el colesterol-oxidasa (CHOD) previa hidrólisis enzimática de los ésteres mediante una Lipasa de origen fungal.

- 44 -


El agua oxigenada generada en la oxidación, produce la copulación oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4AF), mediante una reacción catalizada por la peroxidasa.El producto es una quinona roja con absorbancia máxima 505 nm.

LIPASA

ESTERES DE COLESTEROL COLESTEROL + AG

COLESTEROL + 02 CHOD Colesten-3-ona + H2O2

H2O2 + 4AF + FENOL 4 POD (P-benzoquinona-mono-imino)-

fenazona + 4H20

REACTIVOS: Solución Stándard de Colesterol: 2 g/litro Solución de Enzimas: .

-Lipasa Fungal (300 U/ml)-Colesterol-oxidasa (34 U/ml)-peroxidasa (20 U/ml)

Solución 4-aminofenazona: 25 mmol/litro Solución de Fenol: 55 mmol/litro.

IV.- PROCEDIMIENTO.-

Toma demuestra: Paciente en Ayuno por 12 – 16 Horas- Se debe proceder a la extracción de 5 cc. De sangre, tomada en un tubo de 13 x 100 mm.- Cada muestra será centrifugada a 2500 rpm x 5 min. y se separará el suero, en otro tubo.

- 45 -


NOTA: Si se trabaja con plasma, la muestra de sangre debe haber sido tratada solamente con Heparina como anticoagulante. Seguir las indicaciones de la tabla

Tubos Blanco (B) Estandar (S) Muestra

Estandard (ul) ---- 20 ---

Muestra (ul) ---- ---- 20

Rvo.Trabajo (ml) 2.0 2.0 2,0

- Incubar a 37°C por 15 minutos o 30 min. a temperatura ambiente.- Retirar de B.M. y enfriar a chorro de agua fría por 1-3 min.

- Llevar a lectura espectrofotométrica a 505 nm., llevando el aparato a CERO con el BLANCO.

CALCULOS:

DETERMINACION DEL FACTOR (F) :

F = 2.0 g/lt S

VALORES DE REFERENCIA :

SUERO o PLASMA: HOMBRES: 1,72 á 2,48 g/L.

- 46 -

COLESTEROL (g/L) = M x F


MUJERES : 1,75 á 2,40 g/L.


Práctica Nº 11

HIDRÓLISIS DE LAS PROTEINAS: PROPIEDADES DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

I.- GENERALIDADES.-

Las proteínas son polímeros de aminoácidos unidos por enlaces amídicos denominado peptídico. La hídrólisis enzimática se

- 47 -


realiza en un medio ácido con la acción de la pepsina, renina o en medios alcalinos (pH 8,0) por acción de la tripsina, quimotripsina, carboxipeptidasa, aminopeptidasa, etc.Los productos de la acción enzimática son aminoácidos libres, peptidos de diversos números de aminoácidos.

Químicamente el grado de hidrólisis se puede determinar por el incremento de los grupos carboxílicos, amínicos o ambos.El incremento en grupos amino se puede medir por titulación con álcali en presencia de formaldehído o etanol.

En la titulación por el formol se forman compuestos mono o dimetilólicos. Así se reduce grandemente la basicidad aparente de los grupos amino, de tal manera que los N-hidroximetilaminoácidos pueden titularse con álcali y fenolftaleina en la misma forma que los ácidos grasos.

Cada equivalente de álcali consumido corresponde a un equivalente de enlace peptídico escindido.

II.-OBJETIVO:

Determinar el grado de hidrólisis de la proteína por titulación de losN-hidroximetilaminoácidos.


Muestra: caseína Baño María, Bureta, Erlemeyer

- 48 -


Sol. Carbonato de sodio al 0,3% Tolueno Sol. de pancreatina al 2% Sol. NaOH 0,02N Sol de Formol neutralizado con NaOH al 0,1 N Indicador de fenolftaleína 1%

IV.-PROCEDIMIENTO:

1.- Solución de caseína: disolver 2g de caseína en 75ml de una solución de carbonato de sodio al 0,3%, añadir unas gotas de tolueno y fenoftaleína. Si la solución no es alcalina añadir álcali hasta que la solución se torne de color rosado. Continuar disolviendo la caseína y añadir HCl 0,1N. hasta que el color rosado desaparezca.

2.- Hidrólisis de la proteína.- En un erlemeyer medir 40ml de sol. de caseína en carbonato de sodio al 0,3%, añadir 10ml de sol. de pancreatina al 2% y agitar por medio minuto. Tomar 10ml de la mezcla de la digestión y proceder a titularla según la técnica que se indica más abajo.

Poner el resto a incubar a 40ºC tomando muestras cada 30minutos hasta completar 90 minutos. Titular las muestras y anotar los resultados.

3.-Titulación.- Tomar 10ml de la mezcla de digestión, colocarla durante un minuto en baño maría a 100ºC para inactivar la enzima, enfriar, añadir 10 ml de formol y III gotas de fenoftaleína, mezclar y titular con NaOH 0,02 N.

Resultados e Interpretación

- 49 -


Práctica Nº12

CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA

I . GENERALIDADES.-

La separación de compuestos (de una muestra problema) por cromatografía es una de las técnicas más recomendadas en los trabajos de bioquímica, la ventaja es de que los compuestos no sufren cambios en su estructura. Para obtener los resultados

- 50 -


deseados se recomienda la atención y cuidado cuando se preparan los materiales, reactivos y la muestra.

El fundamento de la técnica cromatográfica se basa en la separación de los compuestos (solutos) por la distribución física de ellos entre dos sustancias conocidas como fases: estacionaria y móvil o dinámica.

La fase estacionaria estacionaria puede ser un sólido o un líquido (o sorbente). El sorbente tiene como soporte a un sólido denominado matriz. Por otro lado, la fase móvil o estacionaria puede ser líquida o gaseosa, ésta fase es conocida como solventes o eluyentes.

Los compuestos o solutos de una muestra problema que se encuentran disueltas en la fase móvil y van a separarse dependiendo de la fuerza de atracción de éstos por la fase estacionaria. Los componentes fuertemente atraídos se mueven más lentamente, desplazándose los demás compuestos de la muestra.

La cromatografía puede ser de las siguientes clases: Cromatografía de Adsorción, Cromatografía de Intercambio Iónico, Cromatografía de Partición, Cromatografía en Capa Fina y Cromatografía en Columna, Cromatografía de Alta Resolución, Cromatografía de Gases, Cromatografía de Plasma.

Como un resumen de las características de algunas clases de cromatografía comentaremos que: En la C. de Adsorción los compuestos son adsorbidos en la fase estacionaria creándose un equilibrio entre los compuestos ( que deseamos separar ) unidos al soporte y los otros que están libres en la solución. La unión va a depender de las cargas, fuerza de Van der Waals, interacciones bipolares, enlaces de hidrógeno

- 51 -


entre los solutos y el soporte y por la estructura de los solutos. Esta clase de cromatografía se recomienda para las sustancias que son muy solubles en solventes orgánicas y poco solubles en agua.

En la C. de Intercambio Iónico, la separación de los compuestos se hacen sobre un soporte o matriz insoluble que contiene iones intercambiables con los iones del medio que le rodea. Las sustancias que se desean separar deben de poseer cargas iónicas opuestas a la del soporte para que se pueda adsorber por enlace electrostática.

El soporte o matriz son resinas especiales para el tipo de solutos que se quieren separar (cationicos o anionicos), por ejemplo las resinas de intercambio iónico son ideales para separar a los aminoácidos los que son fácilmente ionizables por los grupos químicos que poseen (-COOH, -OH, -NH2 ).La C. de I.I. se recomienda para las sustancias que son ionizables e hidrosolubles.

La C. de partición es útil para los compuestos que son muy solubles en solventes orgánicos y poco solubles en agua. Por ello, el compuesto al mezclarse en los dos solventes (agua y solvente orgánico) se van a encontrar equitativamente en ellos. La razón de la concentración el compuesto en los dos solventes es constante y se conoce como coeficiente de partición (alfa).

= Concentración de X en Solvente 1 Concentración de X en Solvente 2

En la C.P., generalmente el solvente agua permanece en la fase estacionaria (puede ser una columna o una película de material inerte). El solvente orgánico es la fase móvil que va ha estar

- 52 -


saturado con agua. La sustancia o solutos se van a separar si el coeficiente de partición es diferente a 1. A esta clase de cromatografía pertenece la Cromatografía en papel, la que será empleada en la presente práctica.

La Cromatografía en capa fina es muy semejante a la del papel, usa como soporte sustancias como gel, sílica gel. Tiene ventajas sobre la C. de papel, una de ellas es de que puede separar sustancias que se encuentren en bajas concentraciones, el método es más rápido, se puede usar materiales corrosivos, altas temperaturas, etc.

II.- OBJETIVOS

1.- Separar los aminoácidos de una mezcla a través de la cromatografía en papel.2.- Identificar los aminoácidos separados a través de su Rf.


* Mezcla de aminoácidos* Solvente: Butanol: Acido acético: agua (4 : 1 :5)* Aminoácidos Patrón

* Cámara Cromatográfica* Revelador: Sol.de Ninhidrina 10% (pesar 0,3 g de ninhidrina y disolver en 95 ml de butanol y 5ml de ac. acético)* Estufa

- 53 -


* Pipetas Pasteur y/o capilares* Papel Watman* Pinzas* Tijeras* Regla y lápiz

IV.- PROCEDIMIENTO:

* Cortar el papel Watman (usar la pinza para coger el papel) en forma de tiras.* A una distancia de 1-2 cm del extremo inferior de la tira trazar una línea con el lápiz.* Sobre e la línea (en el extremo izquierdo) sembrar con cuidado la mezcla de aminoácidos usando para ello la pipeta pasteur y/o el capilar, siguiendo las instrucciones del Profesor.* En el extremo derecho (sobre la línea sembrar el patrón de aminoácidos.* Esperar que seque. Colocar con mucho cuidado la tira de papel en la cámara de vidrio que contiene los solventes (los cuales habrán sido colocados con anticipación en la cámara el que permanecerá cerrada a fin de que se sature).* Dejar que los solventes asciendan hasta el extremo superior del papel.* Sacar con cuidado el papel de la cámara y trazar una línea con el lápiz que indique el desplazamiento final del solvente (debe ser hasta unos 2 cm antes del extremo final)* Rociar el papel con el revelador (tener cuidado de no inhalar los vapores).* Medir la distancia (desde la línea inicial) de desplazamiento del solvente y de las manchas.* Dividir los valores: distancia (cm) del recorrido de las manchas sobre la distancia del desplazamiento del solvente.

- 54 -


El Valor encontrado corresponde al Rf de cada aminoácido.

Interprete los Resultados:

Práctica N°13

OBTENCIÓN DE CADENA DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

I.- INTRODUCCION.-

El ADN y el ARN son transportadores de la información genética de la célula, así mismo tienen funciones estructurales y metabólicas.

- 55 -

Distancia en cm del punto de partida hasta el centro de la mancha Rf = Distancia del Pto de partida hasta el


Casi todas las células contienen ADN, pero la cantidad presente en algunos tejidos es pequeña. Además, algunos tejidos contienen actividades altas de desoxiribonucleasa (DNasa ) lo cual fragmenta el ADN.

Para la liberación y aislamiento del ADN en forma soluble se logra mediante la destrucción de las membranas celulares y de las membranas de las partículas sub-celulares, núcleo, etc; igualmente por la disposición de los complejos ADN-proteína por desnaturalización proteica.

El ADN es insoluble en alcohol, pero se disuelve en soluciones salinas . Para purificar el ADN se efectúan por ello, una serie de precipitaciones alcohólicas y extracciones salinas.Para evitar que durante el aislamiento se produzcan cambios estructurales en la molécula debemos considerar los agentes capaces de producir tales alteraciones:

La la tensión mecánica y condiciones físicas que puedan acortar y separar las dos cadenas.La DNasa presente en el homogenizado inhibir con Citrato de Sodio para ligar Ca ++ y Mg ++ los cuales son cofactores de la DNasa.Temperaturas superiores a 80ºC.

II.- OBJETIVOS.-

- Observar las fibras que corresponden a la naturaleza fibrosa del ADN.

III.- MATERIALES Y METODOS.-

- 56 -


Materiales:- Mortero u homogenizador- Matraz o probeta con tapa de 50 ml.- Vaso de 100 ml.- Varilla de vidrio- Tubos para centrífuga- Papel secante o filtroReactivos:- Tejido gonodal de concha de abanico- Solución salina 0.1 M NaCl - Dodecil Sulfato de Sodio- NaCl 5M- Mezcla de cloroformo – alcohol isoamílico (24:1)- Etanol absoluto

IV.- FUNDAMENTO.-

Se basa en que el ADN es soluble en soluciones de alta concentración iónica (solución salina 5M), pero insolubles en soluciones de baja concentración iónica (0.05 – 0.25 mol-l) y precipitan en alcohol absoluto frío.

V.- PROCEDIMIENTO.-

1.- Pesar 1 g. de tejido gonodal de argupectum purpuratus “concha de abanico” , al que se ha quitado previamente todo el tejido conjuntivo. Colocarlo en un mortero u homogenizador .

2.- Añadir 5 ml. de solución salina 0.1M . Homogenizar y centrifugar a 800 rpm por 10 min..

- 57 -


3.- Resuspender el residuo en 12.5 ml. de solución salina 5M y colocar esta suspensión en un Matraz o probeta con tapa de vidrio. Añadir 1 ml. de SDS (Dodecil Sulfato de Sodio) al 25%. Agitar suavemente durante 10 minutos.

4.- Añadir 5 ml. de NaCl 5 M. Agitar suavemente. Tener en cuenta que la solución es muy viscosa.

5.- Añadir 12.5 ml. de cloroformo – alcohol isoamílico (24 : 1), teniendo cuidado de sujetar la tapa de vidrio; agitar lentamente durante 30 minutos para mezclar las dos fases.

6.- Centrifugar a 10 000 rpm por 10 minutos.

7.- Separar la fase acuosa (superior), colocarlo en un vaso de 100 ml. Hay que cuidar de que no se mezcle con la fase lechosa que se ha formado en el tubo de centrífuiga.

8.- Añadir en fase aproximadamente 2 volúmenes de etanol absoluto frío. Con la varilla de vidrio se enrollan las hebras de ADN que se han formado.


- 58 -


BIBLIOGRAFIA

1.- Angel, G,; Angel, M. (1997).- Interpretación Clínica del Laboratyorio. Edit. Medica Panamericana 5ta. Edic. Bogotáa.

2.- Bohinski, R. (1991).- Bioquímica.- Edit. Addison-Weslewy Iberoamericana

3.- Freifelder, D. (1990).- Técnicas de ioquímica y Biología Molecular. Edit. Reverté, S.A. Barcelona

- 59 -


4.- Karp, Gerald (1998).- Biologia Celular Molecular Edit. Mc Graw-Hill Latinoamericana S.A.-México

5.- Murray, R.; Granner,D.; Mayes, P.; Rodwell, V. (1994). Bioquímica de Harper. Edit. El Manual Moderno, S.A. de C.V. México

6.- Plummer, D. T.- (1981).- Introducción a la Bioquímica Práctica. Edit. Mc Graw-Hill Latinoamericana S.A.-México.

7.-Billingham, M.S. / Wheeler, M.J. / Hall, R.A. - (1991) - Pruebas Funcionales Bioquímicas. Guía para las Exploraciones Especializadas en Bioquímica Clínica. Edic.Mayo,S.A – España.

8.-Fuentes, A.X. / Castiñeiras, L.M.J. / Queraltó, C.J.M. - (1998) – Bioquímica Clínica y Patología Molecular. Vol.II. Edic.2da. Edit.Reverté, S.A. – España.

9.-King, J. - (19681) – Enzimología Clínica. Edit.Acribia – España.

10.Kaplan, L. Pesce., A.J. - (1986) – Química Clínica – Técnicas de Laboratorio Fisiopatología- Métodos de Análisis. Edit. Médica Panamericana –Argentina.

11.Organización Panamericana de la Salud (OPS) / Instituto Internacional de Ciencias de la Vida (ILSI) – North American- (1990) – Conocimientos Actuales sobre Nutrición.. Edic.6ta. Publicaciones Científicas Nº32.

- 60 -


12.-.Plummer, D.T. - (1981) – Introducción a la Bioquímica Práctica Edit. Mc Graw-Hill Latinoamericana S.A. – México.

13.-Thorpe, W. V. / Bray, H.G. / James, S.P. (1984) – Bioquímica Edit. Continental, S.A. – México.

14.-Vanatta, J.C. / Fogelman, M.J. (1993) – Manual de Equilibrio Hidroelectrolítico de Moyer. Edit. Limusa – México.

- 61 -

PRACTICAS MEDICINA2011

Documents

Transcript of PRACTICAS MEDICINA2011