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SECRETARIA DISTRITAL DE SALUD

BETALACTAMASAS COMO MECANISMO DE RESISTENCIA EN

BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Y SU DETECCIÓN POR PCR CONVENCIONAL

SANDRA YAMILE SAAVEDRA ROJAS

Bacterióloga UCMC MSc Microbiología UN

Laboratorio de Microbiología facultad de Medicina Universidad Nacional de Colombia

BETALACTÁMICO


Suárez C.(2009). Enferm InfeccMicrobiolClin. 27(2):116–129

ETAPAS DE FORMACIÓN DE LA PARED CELULAR

SECRETARIA DISTRITAL DE SALUDSuárez C.(2009). Enferm InfeccMicrobiolClin. 27(2):116–129

MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS BETALACTÁMICOS

SECRETARIA DISTRITAL DE SALUDSuárez C.(2009). Enferm InfeccMicrobiolClin. 27(2):116–129

MECANISMOS DE RESISTENCIA A

BETALACTÁMICOS

� Betalactamasas� Alteración de permeabilidad de la membrana externa (perdida o reducción de porinas).� Aumento de bombas de extrusión� Modificación de dianas de acción (Mutación en las proteínas de unión a la penicilina).


Suárez C.(2009). Enferm InfeccMicrobiolClin. 27(2):116–129

BETALACTAMASAS

1. Definición: Enzimas catalíticas que actúan hidrolizando el enlace amídico del anillo betalactámico.

2. Existen dos esquemas de clasificación para las betalactamasas:

� Clasificación molecular según Ambler� Clasificación Funcional según Bush-Jacoby-

Medeiros

SECRETARIA DISTRITAL DE SALUDBush, K. (2010). AAC. 54 (3): 969 - 976

ESQUEMAS DE CLASIFICACIÓN DE LAS BETALACTAMASAS

AMBLERGRUPO BUSH-JACOBY (2009)

SUSTRTOINHIBIDO POR

REPRESENTANTEAc. Clav. EDTA

A

2a Penicilinas Si No PC-1

2b Penicilinas y cefalosporinas de primera generación Si No TEM-1, TEM-2, SHV-1

2be Cefalosporinas de espectro extendido y monobactámicos Si No TEM-3, SHV-2, CTX-M-15, PER-

2br Penicilinas No No TEM-30, SHV-10

2ber Cefalosporinas de espectro extendido y monobactámicos No No TEM-50

2c Carbenicilinas Si No PSE-1, CARB-3

2ce Carbenicilina y cefepime Si No RTG-4

2eCefalosporinas de espectro extendido (no actúa e sobre

monobactámicos)Si No CepA

2f Carbapenemes Variable No KPC, IMI, SME

B3a Carbapenemes No Si IMP, VIM, GIM, SPM, SIM

3b Carbapenemes No Si CAU, GOB, FEZ

C 1 Cefalosporinas y cefamicinas No No AmpC, CMY-2, FOX, MIR, ACT,

D

2d Cloxacilina Variable No OXA-1, OXA-10

2de Cefalosporinas de espectro extendido Variable No 0XA-11, OXA-15

2df Carbapenemes Variable No OXA-23, OXA-24, OXA-48

Bush, K. (2010). AAC. 54 (3): 969 - 976


BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO

� Definición: Son enzimas capaces de conferir resistencia a penicilinas, cefalosporinas de primera, segunda y tercera generación y aztreonam (pero no a carbapenémicos y son inhibidas por inhibidores de betalactamasas como acido clavúlanico).

�Enzimas clase molecular A y D


Paterson. (2005). CMR. 18 (4): 657 - 686

BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO (BLEE)


ENZIMAS CLASE A� Enzimas tipo SHV (excepto SHV-1).� Enzimas tipo TEM (excepto TEM-1 y TEM-2).� Enzimas tipo CTX-M� Enzimas BLEE menores tipo PER, GES, VER

ENZIMAS CLASE D� Enzimas tipo OXA de espectro extendido (OXA-11, OXA-13, OXA-15, OXA-18)

Paterson. (2005). CMR. 18 (4): 657 – 686. Poirel (2010). AAC. 54: 24 - 38

DETECCIÓN DE BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO


1. Las pruebas fenotípicas solo permiten establecer expresión de enzimas BLEE

2. Detección del tipo especifico de enzima BLEE (evaluar presencia de genes codificantes de estas enzimas como genes: blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA, blaPER).

3. Técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (técnica gold estándar).

Paterson. (2005). CMR. 18 (4): 657 – 686. Poirel (2010). AAC. 54: 24 - 38

CARBAPENEMASAS1. Es la familia más versátil de betalactamasas.

2. Carbapenemasas tipo serina de las clases A (KPC, NME, IMI, SME) y D (OXA-23, OXA-24, OXA-58).

3. Carbapenemasas clase B (VIM, IMP, SPM, GIM, SIM).

4. Las carbapenemasas poseen el más amplio perfil de hidrólisis descrito para betalactamasas y puede ser utilizado para la orientación en las pruebas fenotípicas.


Poirel (2010). AAC. 54: 24 – 38. Nordmann (2009). Lancet Inf Dis. 9: 228-236

CARBAPENEMASAS


Queenan A. (2007). CMR. 20 (3): 440 - 457

CARBAPENEMASAS


1. Las pruebas fenotípicas solo permiten establecer expresión de enzimas carbapenemasas tipo A y B y no D.

2. La detección del tipo especifico de enzima carbapenemasa se realiza (evaluando la presencia de genes codificantes de estas enzimas como genes: blaKPC, blaVIM, blaIMP, , blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-58).

3. La reacción en cadena de la polimerasa (técnica gold estándar).

Poirel (2010). AAC. 54: 24 – 38. Nordmann (2009). Lancet Inf Dis. 9: 228-236

ENZIMAS AmpC O CEFALOSPORINASAS

1. Se diferencian de las cefalosporinasas clase A por su perfil de inhibición ya que las enzimas AmpC son resistentes a la inhibición por ácido clavulánico y son más activas frente a cefamicinas como cefoxitin.

2. Pueden ser codificadas a nivel decromosoma o plásmidos.


Jacoby (2009). CMR. 22: 161 - 182


1. Codificada cromosomalmente e inducible Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens y Pseudomonas aeruginosa

2. Codificada cromosomalmente no inducible en A. baumannii y E. coli.

3. Adquiridas o plásmidicas (CMY, FOX, ACT, MIR, DHA, MOX) en Klebsiella spp, Salmonella spp yProteus mirabilis (no poseen AmpC cromosomal).


Jacoby (2009). CMR. 22: 161 - 182


1. En E. coli un fenotipo AmpC puede ser sobrexpresión de AmpC cromosomal o presencia de AmpC plásmidica

2. Detección fenotípica no permite determinar las diferentes enzimas AmpC plásmidicas, es necesario realizar técnicas como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

3. La sobrexpresión del gen AmpC se realiza a través de una PCR-transcriptasa reversa (RT-PCR) en tiempo real.

SECRETARIA DISTRITAL DE SALUDJacoby (2009). CMR. 22: 161 - 182

TÉCNICAS MOLECULARES PARA DETECCIÓN DE BETALACTAMASAS

1. Existen diversas técnicas moleculares para realizar la detección de genes codificantes de betalactamasas siendo el método estándar y convencionalmente utilizado la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del ingles Polimerase Chain Reaction) ya sea la PCR de tipo convencional o la variante PCR en tiempo real.

2. La secuenciación del producto de amplificación (permite la genotipificación de la enzima) estas es la técnica gold standard para conocer la secuencia de aminoácidos de la enzima en estudio


REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

1. Síntesis in-vitro de grandes cantidades de un segmento de acido nucleico.

2. El procedimiento requiere:� ADN en estudio� Dos oligonucleótidos iniciadores específicos (forward y reverse).� Polimerasa estable al calor.� Desoxirribonucleótidos (dNTPs) dATP, dGTP, dTTp, dCTP


Torres (1995). Elementos. 3: 16 - 21

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

1. La reacción requiere de ciclos repetidos de tres pasos que incluyen cambios en temperatura :� Denaturación del acido nucleico.� Alineación� Extensión



REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)


PCR SIMPLE Y PCR MÚLTIPLEX


1. PCR simple: Se analiza un único segmento de ADN o un único gen en la reacción.

2. PCR Múltiplex: Se analizan diferentes genes en una sola reacción, este tipo de ensayo busca reducir costos. Para su realización se necesita tener en cuenta:� Diseño de oligonucleotidos inicidores.� Productos de amplificación


EVALUACIÓN DE PRODUCTOS OBTENIDOS EN LA PCR


1. Para la detección de los productos obtenidos en la PCR (amplímeros) en una PCR convencional son evaluados por electroforesis en geles de agarosa y visualizados a través de tinciones como bromuro de etidio o SYBR GREEN

2. Pero también se pueden evaluar por hibridización utilizando sondas especificas (técnica Hyplex) .

EJEMPLO DE PCR SIMPLE CONVENCIONAL


A continuación se muestra un ejemplo de una PCR simple para la detección del gen blaKPC en aislamientos de Klebsiella pneumoniae resistentes a carbapenémicos, positivos para la prueba de Hodge y negativos para prueba fenotípica de metaloenzimas



INICIADOR SECUENCIA 5’ – 3’

TAMAÑO

ESPERADO DEL

AMPLIMERO

blaKPC F

blaKPC R

5’ ATG TCA CTG TAT CGC CGT CT TTT 3’

5´TCA GAG CCT TAC TGC CC 3’

893 pb

Bradford (2004). Clin Inf Dis. 39: 55 - 60



� M: Marcador de peso molecular 1 Kb Invitrogen� 1 a 7: Muestras positivas para el gen blaKPC� CN: Control negativo

Foto Laboratorio de Microbiología Universidad Nacional de Colombia

REPORTE DE PCR SIMPLE CONVENCIONAL


El resultado que reportamos es aislamientos de K. pneumoniae positivos para el gen blaKPC sin establecer la variante de la enzima que poseen estos aislamientos, para esto es necesario realizar una reacción de secuenciación del producto de amplificación.

EJEMPLO DE PCR MÚLTIPLEX CONVENCIONAL


A continuación se muestra un ejemplo de una PCR multiplex para detectar los genes codificantes de carbapenemasas tipo OXA en aislamientos de A. baumannii resistentes a carbapenémicos.



NOMBRE DE

INICIADORSECUENCIA DE INICIADORES TAMAÑO

blaOXA-23-likeForward 5’ GAT CGG ATT GGA GAA CCA GA 3’

Reverse 5’ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT 3’501 pb

blaOXA-24-LikeForward 5’GGT TAG TTG GCC CCC TTA AA 3’

Reverse 5’ AGT TGA GCG AAA AGG GGA TT 3’246 pb

blaOXA-51-LikeForward 5’ TAA TGC TTT GAT CGG CCT TG 3’

Reverse 5’TGG ATT GCA CTT CAT CTT GG 3353 pb

blaOXA-58-LikeForward 5’AAG TAT TGG GGC TTG TGC TG 3’

Reverse 5’ CCC CTC TGC GCT CTA CAT AC 3’599pb

Woodford (2006). Int J Antimicrob agents. 27: 351-353



� Muestra 1 : Marcador de peso molecular 1 Kb Invitrogen� Muestras 2 – 7: : Muestras positivas para diferentes genes blaOXA

Woodford (2006). Int J Antimicrob agents. 27: 351-353

Foto tomada de Woodford (2006)

REPORTE DE PCR MÚLTIPLEX CONVENCIONAL


� Aislamientos 2 y 4 positivos para carbapenemasas del subgrupo OXA-23 Like y a la carbapenemasa de ocurrencia natural OXA-51 Like.

� Aislamiento 3 positivo para carbapenemasas del subgrupo OXA-24 Like y a la carbapenemasa de ocurrencia natural OXA-51 like.

� Aislamiento 5 y 6 positivo para carbapenemasa de ocurrencia natural OXA-51 like.

�Aislamiento 7 positivo para carbapenemasa OXA-58 like.


CASO 1


ENUNCIADO Y PREGUNTA 1

Observe la siguiente tabla que describe los iniciadores utilizados para amplificar genes que codifican enzimas AmpC de tipo plasmidicas y compare los tamaños del amplímero esperado con el resultado visualizado en el gel.

¿en el aislamiento en estudio se obtuvo amplificación utilizando que juego de iniciadores?.


OLIGONUCLEOTIDOS INICIADORES PARA AMPLIFICAR GENES AmpC PLASMÍDICOS


FOTO. Amplificación de genes AmpC plasmídicos

M: Marcador de peso molecular de 1Kb (invitrogen)1: Aislamiento en estudioCN: Control Negativo


RESPUESTA 1

Iniciadores FOX ó iniciadores FOX-F y FOX-R


PREGUNTAS 2

¿Como reportaría el resultado observado en el gel?


RESPUESTA 2

Aislamiento productor de enzimas AmpC tipo FOX o aislamiento productor de enzimas FOX


CASO 2


ENUNCIADO Y PREGUNTA 1

Observe la siguiente tabla que describe los iniciadores utilizados para amplificar genes tipo blaKPC que codifican enzimas KPC y compare el tamaño del amplimero esperado con los resultados visualizados en el gel.

¿En los aislamientos 1 y 2 como reportaría el resultado?.


OLIGONUCLEOTIDOS INICIADORES PARA AMPLIFICAR GENES blaKPC


FOTO. Amplificación de genes blaKPC

M: Marcador de peso molecular de 1Kb (invitrogen)CP: Control PositivoCN: Control Negativo1: Aislamiento 1 del estudio2: Aislamiento 2 del estudio


RESPUESTA 1

Aislamientos productores de enzimas KPC

SECUENCIACIÓN

1. Técnica gold estándar para determinar la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN en estudio.

2. Para realizar la secuenciación de ADN es necesario emplear los oligonucleótidos iniciadores (Forward y Reverse) que permitan amplificar y secuenciar el fragmento de ADN de interés.

3. Los análisis de los resultados obtenidos de la secuenciación se realiza con el uso de herramientas bioinformáticas para establecer los nucleótidos y la identidad de la secuencia evaluada (en el caso de un amplímero del gen blaKPC posterior a la secuenciación podemos especificar que el aislamiento es portador de la enzima KPC-3).


OTRAS TÉCNICAS MOLECULARES PARA IDENTIFICACIÓN DE VARIANTES DE

BETALACTAMASAS

Sin embargo existen otros métodos que no usan la secuenciación para identificar la variante de las betalactamasas como son:

� Análisis del polimorfismo del gen amplificado por PCR (PCR-RFLP) ,

� Análisis del polimorfismo conformacional de cadenas sencillas de ADN (SSCP por las siglas del inglés: Single Strand Chain Polymorphism).

� Ensayos de restricción del producto de amplificación � Microarreglos


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