การตรวจคดกรองการตดเชอ Mycobacterium leprae

ในผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย โดยชดทดสอบทางภมคมกนวทยา

ชนดรวดเรว

Screening test of Mycobacterium leprae infection in

paubacillary Leprosy patients by Rapid serological test

โดย

นายสทธศกด งามวชราพร

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตร

เทคนคการแพทยมหาบณฑต คณะสหเวชศาสตร

คณะสหเวชศาสตร มหาวทยาลยธรรมศาสตร

ปการศกษา 2558 ลขสทธของมหาวทยาลยธรรมศาสตร

การตรวจคดกรองการตดเชอ Mycobacterium leprae ในผปวย

โรคเรอนประเภทเชอนอย โดยชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรว

โดย

นายสทธศกด งามวชราพร

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตร เทคนคการแพทยมหาบณฑต

คณะสหเวชศาสตร มหาวทยาลยธรรมศาสตร ปการศกษา 2558

ลขสทธของมหาวทยาลยธรรมศาสตร

Screening of Mycobacterium leprae infection in paubacillary Leprosy patients by Rapid serological test

BY

Mr.SUTTHISAK NGAMWACHIRAPORN

A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF THE MASTER OF MEDICAL TECHNOLOGY

FACULTY OF ALLIED HEALTH SCIENCE THAMMASAT UNIVERSITY

ACADEMIC YEAR 2015

COPYRIGHT OF THAMMASAT UNIVERSITY

หวขอวทยานพนธ การตรวจคดกรองการตดเชอ Mycobacterium leprae ในผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย โดยชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรว

ชอผเขยน นายสทธศกด งามวชราพร

ชอปรญญา เทคนคการแพทยมหาบณฑต

สาขาวชา/คณะ/มหาวทยาลย ภาควชาเทคนคการแพทย

คณะสหเวชศาสตร

มหาวทยาลยธรรมศาสตร

อาจารยทปรกษาวทยานพนธ

อาจารยทปรกษาวทยานพนธรวม

อ.ดร.สรนารถ ชเมยน

รศ.ดร.พอ.ถวลย ฤกษงาม

ปการศกษา

2558

บทคดยอ

การตรวจการตดเชอโรคเรอนทางหองปฏบตการในปจจบนโดยทวไป ใชการทดสอบโดยการกรดผวหนง (Slit skin smear) เพอคนหาเชอ Mycobacterium leprae ในผปวยโรคเรอนซงขอจ ากดของการตรวจโดยวธนจะใหผลลบปลอม ในกลมผปวยประเภทเชอนอยเนองจากการจะตรวจเชอโรคเรอนดวยวธการกรดผวหนง จะตองมจ านวนเชอมาก จงจะสามารถใหผลบวกกบการทดสอบนได อกทงการทดสอบดวยวธมาตรฐานโดยการเพมจ า นวนสารพนธกรรมของเชอ M.leprae (Polymerase Chain Reaction)มขอเสยทมราคาแพง ใชเครองมอจ าเพาะและอาศยเจาหนาททมประสบการณในการตรวจวเคราะห ดงนนจงจ าเปนตองมการทดสอบคดกรอง (Screening test) ผปวยในกลมนกอนทน าไปทดสอบดวยวธมาตรฐา นโดยการศกษาวจยครงนเลอกใชชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนด Rapid serological test ชนดทตรวจหา anti PGL-1 ทมโปรตนลกผสมชนดML0405 และ ML2331 เรยกวา LID-1 น ามาทดสอบในกลมผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอยเปรยบเทยบกบการตรวจดวยวธมาตรฐาน ซงผลการศกษาทไดพบวาในกลมผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอยทใหผลลบกบการทดสอบการกรดผวหนง ใหผลบวกจรง 5 ราย (คดเปนรอยละ 50) ใหผลบวกปลอม จ านวน 4 ราย (คดเปนรอยละ 40) และใหผลลบปลอมจ านวน 1 ราย (คดเปนรอยละ 10) เมอเทยบกบวธมาตรฐาน จากผลการทด สอบจะเหนไดวา ชดตรวจทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรวมความไวสงถงรอยละ 90 แตมความจ าเพาะต าเพยงแครอยละ 50 ดงนนการทดสอบดวยชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนด Rapid serological testนจงนาจะมประโยชนในการคดกรองเบองตน(Screening test) จากการทดสอบ กอนทจะน าไปทดสอบดวยวธมาตรฐานเพอเปนการลดคาใชจายในการตรวจวนจฉยโรคเรอน นอกจากนยงสามารถตรวจคดกรองผปวยประเภทเชอนอยไดอยางรวดเรว ซงเปนการปองกนไมใหการด าเนนของโรครนแรงมากขน ซงจะเปนประโยชนอยางมากในกลมประชากรจ านวนมากทจ าเปนตองตรวจโรคเรอน เชน การตรวจแรงงานตางดาว และการตรวจผอาศยรวมบาน

ส าคญ:( ภาษาไทย) โรคเรอนผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอยการทดสอบภมคมกนวทยาชนดรวดเรว การตรวจคดกรอง การกรดผวหนง

ABSTRACT

Detection of Leprosy disease in general laboratory is slit skin smear (SSS) test to identify Mycobacterium leprae. However, this technique causes false negative in Paucibacillary Leprosy (PB) patients due to the limit of detection. The conventional method to amplify the M.leprae, Polymerase Chain Reaction (PCR), has disadvantage such as expensive and high technical skill requirement. These is an important to have a screening test that has a high sensitive and specific, rapid, simple and cheap method for prevention and control the progressive of leprosy disease in PB patients.At the present, the immunology of Rapid serological test commonly used in American composes of PGL-1 fusion protein (ML0405 and ML2331) called LID-1to detect the antibodies induced by M.leprae infection. This study aims to evaluate the Rapid serological test to diagnose PB patients. The results were confirmed by conventional PCR. It was found that the PB patients with negative for SSS testing were true positive in 5 patients (representing 50%) and false positive in 4 patients (representing 40%). One patient was false negative (representing 10%). Results showed a high sensitivity as 90% but low specificity just only 50%. Therefore, the rapid serological test can be used to screen the PB patients with SSS negative and no clinical symptoms. It is a useful method for rapid diagnosis in PB patients that can detect in the early stages resulting in the reduction of the worse clinical outcomes and reduce the detection cost.

Keyword: Leprosy, Paucibacillary Leprosy, Rapid Serological test, screening test, slit skin smear

กตตกรรมประกาศ

วทยานพนธเรองการตรวจคดกรองการตดเชอ Mycobacterium leprae ในผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย ดวยชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรว (Screening test of Mycobacteriam leprae infection in paubacillary Leprosy patients By Rapid serological test) ฉบบนเปนสวนหน งของวชาวทยานพนธ (ท.น.892 ) ภาควชาเทคนคการแพทย คณะสหเวชศาสตร มหาวทยาลยธรรรมศาสตร ประจ าปการศกษา 2559 ไดส าเรจลลางไปไดดวยดเนองดวยความอนเคราะหและความชวยเหลอจากบคคลหลายทาน จงขอขอบคณทกทานดงน

อาจารยดร .สรนารถ ชเมยน อาจารยท ปรกษา และ รศ .พอ .ดร.ถวลย ฤกษงาม อาจารยประจ าภาควชาเทคนคการแพทย คณะสหเวชศาสตร มหาวทยาลยธรรมศาสตร กรณาใหค าปรกษา และค าแนะน าในการปฏบตการ การวเคราะหผลวจย รวมถงชวยแนะน าการแกปญหาอปสรรค ก ากบการด าเนนงาน ตลอดจนการท ารปเลมวทยานพนธจนส าเรจเปนฉบบสมบรณ

นายแพทยอาจนต ชลพนธ ผอ านวยการสถาบนราชประชาสมาสย ทกรณาอนญาตใหใชสถานทส าหรบด าเนนการวจย แพทยหญงกลประภสสร ไปรยายตกล และนายแพทยทวฤทธ สทธเวคน กรณาแนะน าการท าวจย ทเกยวของกบลกษณะทางคลนกของโรคเรอน

คณสมเกยรต มหาอดมพร หวหนากลมสนบสนนการรกษา คณอภษฎา รศม หวหนางานเทคนคการแพทย ดร .นฤมล ใจด คณมานจ ชนนพร กลมนโยบายและแผน และเจาหนาทหองปฏบตการสถาบนราชประชาสมาสย ทกทาน ทใหค าแนะน าดานการใชเครองมอ และชวยใหขอมลทเปนประโยชนตอการวจย

สทธศกด งามวชราพร

มหาวทยาลยธรรมศาสตร

พ.ศ.2559

สารบญ

หนา

บทคดยอภาษาไทย (1)

บทคดยอภาษาองกฤษ (2)

กตตกรรมประกาศ (3)

สารบญตาราง (8)

สารบญภาพ (9)

รายการสญลกษณและค ายอ (10)

บทท 1 บทน า 1

1.1 ความเปนมาและความส าคญ 3

1.2 วตถประสงคของงานวจย 3

1.3 ขอบเขตของการวจย 4

1.4 ค าส าคญ 5

1.5 ประโยชนทจะไดรบ 5

1.6 การพทกษสทธกลมตวอยาง 5

บทท 2 วรรณกรรมและงานวจยทเกยวของ 6

2.1 โรคเรอน 6

2.1.1 โรคเรอนและการตดตอ 6

2.1.2 ลกษณะอาการทพบ 6

2.1.3 ภาวะความพการ 7

2.1.4 การแบงกลม 8

สารบญ (ตอ)

หนา

2.1.4.1 โรคเรอนประเภทเชอนอย (Paucibacillary Leprosy) 8

ผปวยชนด Tuberculoid (TT)

2.1.4.2 โรคเรอนประเภทเชอมาก (Multibacillary Leprosy) 9

ผปวยชนด Borderline Borderline leprosy (BB)

ผปวยชนด Borderline lepromatous leprosy (Bl)

Lepromatous leprosy (LL)

2.1.5 อบตการณ 10

2.1.6 การวนจฉยโรคเรอน 13

2.1.7 ระบบภมคมกน 14

2.2 เชอแบคทเรย Mycobacterium leprae 18

2.3 การตรวจวนจฉยเชอ Mycobacterium lepraeในผปวยโรคเรอน 18

2.3.1. การกรดผวหนง (Slit skin smear) 18

2.3.1.1 การรายงานเชงปรมาณ (Bacteriogical index) 19

2.3.1.2 การรายงานผลเชงคณภาพ (Morphology index) 20

2.3.2 การตรวจทางพยาธวทยา (Histopathology) 23

2.3.3 การตรวจทางแอนตบอด (Serology testing) 23

2.3.4 การตรวจทาง Immuno-histochemical reaction 23

2.3.5 การตรวจทางชวโมเลกล (Molecular biology) 24

สารบญ (ตอ)

หนา

บทท 3 วธการวจย 30

3.1 การคดกรอง 30

3.2 ทดสอบตวอยางเลอดของผปวยประเภทเชอนอย (paucibacillary) 30

โดยชดทดสอบภมคมกนวทยาชนดรวดเรว (Rapid serological test)

3.3 วธทดสอบของชดทดสอบ 31

บทท 4 ผลการวจยและอภปรายผล 34

4.1 การศกษาขอมลพนฐานของผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย 34

4.2 ผลการทดสอบเปรยบเทยบการทดสอบแตละวธ 35

4.3 การเปรยบเทยบผลการทดลองระหวางผล Slit skin smear 36

กบ Rapid Serological test

4.4 การเปรยบเทยบผลการทดลองระหวางผลการทดสอบ 36

Rapid Serological test กบ Conversional PCR

4.5 ผลจากขอมลการอยรวมบานกบผปวยโรคเรอนและระยะเวลา 36

บทท 5 สรปผลการวจยและขอเสนอแนะ 37

5.1 สรปผลการวจย 37

5.2 ขอเสนอแนะ 39

สารบญ (ตอ)

หนา

รายการอางอง 41

ภาคผนวก

ภาคผนวก ก ตวอยางแสดงความยนยอมเขารวมการวจยของอาสาสมคร 45

ภาคผนวก ข ขอมลส าหรบอาสาสมครงานวจย 47

ประวตผเขยน 51

สารบญตาราง

ตารางท หนา

2.1 แสดงความชกผตดเชอโรคเรอนและผตดเชอรายใหมใน 102 ประเทศ 12

จดท าองคการอนามยโลก ป ค.ศ.2014

2.2 การรายงานผลเชงปรมาณตามแบบ Ridley logarithmic scale 19

2.3 แสดงเปอรเซนตผลการทดสอบ ดวยวธ NESTED PCR / ND-O BSA /LID-1 (ELISA) 25

2.4 แสดงการทดสอบดวยวธ Rapid Serological test 2 ชดการทดสอบ 26

2.5 ผลจากการทดสอบผปวยทงสองกลมดวยวธ PCR 27

2.6 เปรยบเทยบความไว (Sensitivity) ของ Conversional PCR กบ Real time PCR 27

2.7 ผลจากการทดสอบ เนอเยอทไดจากผปวยโรคเรอนทงสองประเภทดวยเทคนค PCR 28

4.1 แสดงผลการทดสอบผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย ดวยวธการกรดผวหนง (SSS) 35

ชดตรวจทางภมคมกนชนดรวดเรวและวธมาตรฐาน Polymerase Chain Reaction

สารบญภาพ

ภาพท หนา

1.1 แสดงวธการด าเนนการวจย 4

2.1 แสดงความชกของผปวยโรคเรอนตามพนทโลกป ค .ศ.2014 13

2.2 แสดงถงลกษณะการแบงกลมของผปวยโรคเรอนตามระดบภมคมกน 14

2.3 แสดงสวนประกอบสวนประกอบผนงเซลเชอ Mycobacterium leprae 16

2.4 แสดงรปรางและการเรยงตวของ Mycobacterium leprae 17

2.5 ลกษณะการตดสทนกรด (Acid fast bacilli) ทแตกตางกนของเชอ 21

Mycobacterium leprae ทใชในการรายงานเชงคณภาพ

2.6 ลกษณะเชอโรคเรอนทยอมตดส Acid fast baccilli (Zielh-neelson stain) 22

3.1 แสดงสวนประกอบของชดทดสอบชนด Raid serological test 32

3.2 แสดงการอานผลการทดสอบวธทดสอบภมคมกนวทยาชนดรวดเรว 32

รายการสญลกษณและค ายอ

สญลกษณ/ค ายอ ค าเตม/ค าจ ากดความ

SSS

PCR

PB

MB

TT

BT

BB

BL

LL

Slit Skin Smear

Polymerase Chain Reaction

Paucibacillary Leprosy

Multibacillary Leprosy

Tuberculoid

Borderline Tuberculoid Leprosy

Borderline Borderline leprosy

Borderline lepromatous leprosy

Lepromatous leprosy

บทท 1 บทน า

โรคเรอน (Leprosy) เปนโรคตดตอเรอรงทผวหนงและระบบประสาทสวนปลาย เกดจากการตดเชอแบคทเรย Mycobacterium leprae ซงพบไดในสงแวดลอมทวไปแบคทเรยชนดนสามารถผานเขาสรางกายทางบาดแผลรอยถลอก และสามารถตดตอจากคนสคนไดผานทางเดนหายใจ (Respiratory transmission) (1) ระบบภมคมกนทท าหนาทส าคญในการเกดโรคในผปวยโรคเรอน คอภมคมกนชนดพงเซลลหากผทรบเชอ M.leprae มระดบของภมคมกนชนดพงเซลลไมเพยงพอทจะสามารถท าลายและยบยงการแพรกระจายของเชอ M.leprae ไดโดยผปวยทมระดบภมคมกนชนดพงพาเซลลนอยจะเปนผปวย ประเภท เชอมากและผปวยทมระด บภมคมกนปานกลางหรอมาก ผปวยจะเปนผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย (PB) ผทตดเชอแบคทเรย M.leprae สวนใหญจะไมมอาการในทนท ประชากรรอยละ 97 จะสรางภมคมกนทสามารถท าลายเชอ M.leprae ได ทงนประชากรทไดรบเชอเพยงรอยละ 3 เทาน น จะสามารถพฒนาไปเปนโรคเรอนเพราะกลไกทางภมคมกนของรางกายไมสามารถท าลายเชอได และเมอตดเชอโรคเรอนในรางกายแลวเชอจะสามารถแบงตวในรางกาย จะท าใหเกดอาการทผวหนงเกดวงดางขาวหรอผนนนแดงเปนวงแหวนซงการกระจายของวงดางขาวจะอยสวนหน งสวนหนงใดของรางกาย นอกจากนเชอยงสามารถท าลายเสนประสาทสวนปลาย ท าใหมอาการชา ไมมเหงอออกเมอผปวยตดเชอเปนเวลานานจะท าใหกลามเนอออนแรงหรอเปนอมพาต และมความพการ อบตการณการเกดโรคเรอนในประเทศไทย (2) ในป พ.ศ. 2557 อตราความชกโรค เทากบ 0.09 ตอประชากรหมนคน และ อตราการตรวจพบผปวยใหม 0.32 ตอประชากรแสนคน และอตราการตรวจพบผปวยใหม 0.66 ตอประชากรแสนคนของ ชาวตางดาวทมารบจางท างานในประเทศไทย ถงแมวาอบตการณและอตราการตรวจพบผปวยใหมจะลดลงอยางตอเนองในแตละป แตปญหาดานสาธารณสขคอการเกดความพการของผปวย ซงอาจเกดจากหลายสาเหตเชน ความลาชาในการตรวจคดกรองท าใหการแบงตวของเชอโรคในรางกายด าเนนไปจนเกดเปนโรคไดหรอการเกดผนหรอวงดางขาวไมเปนอปสรรคในการใชชวตประจ าวน ผปวยจงอาจไมไดใหความสนใจเขารบการรกษาในสถานพยาบาล จนท าใหการด าเนนของโรคเลวรายลง

โดยเทคนคการตรวจวนจฉยโรคเรอนในปจจบน คอวธการกรดผวหนง (slit skin smear หรอ SSS) จงเปนวธมาตรฐาน (Standard method) ทใชในปจจบนซงใชการกรดลงไปทผวหนงและเกบสวนทเปนเนอเยอ (Tissue pulp) มายอมหาเชอแบคทเรย การทดสอบนมขอดในการตรวจวนจฉยในกลมโรคเรอนประเภทเชอมากเพราะปรมาณเชอ M.leprae ใตผวหนงมากกวาผปวยประเภทเชอนอย แตจะใหผลการทดสอบทเปนบวกต าๆ ในกลมโรคเรอนประเภทเชอนอย (PB) โดยปรมาณเชอ M.leprae ทสามารถตรวจพบไดใตผวหนงตองมปรมาณเชอ 10,000 ตวตอกรมชนเนอจงจะตรวจพบโดยวธ SSS ดงนนผปวยประเภทเชอนอย (PB) จะไดผลการทดสอบเปนลบ นอกจากนวธ SSS ยงตองอาศยทกษะและความช านาญของบคลากรทกรดผวหนงและรายงานผลทดสอบซงหากแพทยมความตองการยนยนในผปวยประเภทเชอนอยนจะสงตรวจทางพยาธวทยาชนเนอ ซงใชเวลาในการทดสอบนานเพราะตองอาศยพยาธแพทยทมทกษะเชยวชาญในการตรวจพยาธสภาพของชนเนอ ดงนนการใชการทดสอบคดกรองเบองตน (Screening test) นาจะมประโยชนกบผปวยชนดเชอนอยหรอผปวยทรอยโรคไมชดเจน เพอใหการตรวจคดกรองโรคเรอนรวดเรวมากขน

ปจจบนการตรวจคดกรองทางภมคมกนโดยชดทดสอบทางภมคมกนวทยา ชนดรวดเรวโดยอาศยหลกการการเกดปฏกรยาระหวางแอนตเจนกบแอนตบอดทประยกตมาจากวธ การตรวจความจ าเพาะของปฏกรยาดวยเอนไซม (ELISA)ปฏกรยาการทดสอบจะเกดทแผน Membrane สวนมากจะเปน Nitrocellulose โดยแผนทดสอบจะประกอบดวยเสนแถบควบคมการทดสอบ (Control line) และ เสนแถบทดสอบ (Test line) ซง เสนแถบควบคมการทดสอบใชประเมนคณภาพความพรอมใชของชดทดสอบและเสนแถบทดสอบจะใชแอนตบอดหรอแอนตเจนทตดฉลากดวยสารทมสเชน Colloidal Gold โดยสามารถตรวจพบการตดเชอ M.leprae ในผปวยประเภทเชอนอยทตรวจไมพบเชอดว ยวธ SSS ซงชดทดสอบ ทางภมคมกนชนดรวดเรว มความไวและความจ าเพาะสง ใชงานงาย สะดวก ราคาถกและอานผลไดอยางรวดเรว จะชวยสนบสนนการตรวจวนจฉยโรคเรอน ท าใหการตรวจคดกรองผปวยโรคเรอนมประสทธภาพและผปวยไดรบการรกษากอนทการด าเนนของโรคจะพฒนาถงขนพการ

ดงนนการตรวจทางแอนตบอดส าหรบผปวยชนดเชอนอย จงนาจะมประโยชนในดานการเปนวธ การทดสอบคดกรองเบองตน (Screening test) ทชวยในการวนจฉยของแพทยนอกเหนอจากวธกรดผวหนง (SSS) โดยจากขอมลการทดสอบดวยวธในอดตจะพบปญหากา รใหผลบวกปลอมในผรวมบานกบผปวยเปนระยะเวลานาน (Household contact) ท าใหผลการทดสอบทไดไมนาเชอถอ แตในปจจบนจากขอมลการวจยโดยใชชดทดสอบภมคมกนวทยาชนดรวดเรว ใหผลการทดสอบทนาเชอถอมากกวาชดทดสอบทผลตออกมาในระยะเรมแรก เนองจ ากการพฒนาชดทดสอบโดยใช fusion protein (LID-1) ทเปนการรวมกนของโปรตน ML0405 and ML2331

(Leprosy IDRI Diagnostic 1 [LID-1]) ทไดจากแหลงระบาด (Hyper- endemic area) ในประเทศเวเนซเอลาและประเทศบราซล จาก The Infectious Disease Research Institute ท าใหผลการทดสอบในงานวจยตางๆจะมอตราการตรวจพบการตดเชอโรคเรอนมากขนกวาในอดต ซงประโยชนของชดทดสอบนคอ สามารถตรวจพบแอนตบอดจ าเพาะไดตงแตระยะเรมแรกและกอนทผปวยจะพฒนาไปเปนโรค(4) ดงนนการใชชดทดสอบนรวมกบการตรวจวนจฉยพนฐานทางหองปฏบตการนาจะมสวนชวยคดกรองผปวยทตดเชอโรคเรอนประเภทเชอนอย (PB) เพอชวยในการตรวจวนจฉยเละการวางแผนการรกษาตอไป

1.2 วตถประสงคของการวจย

เพอประเมนประสทธภาพชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรว ในการตรวจวนจฉยการตดเชอโรคเรอน ในผปวยโรคเรอนชนดเชอนอย (paucibacillary : PB)

1.3 ขอบเขตของการวจย

การวจย การศกษาครงนไดด าเนนการโดยตรวจวนจฉยผปวยทตดเชอ Mycobacterium leprae ในผปวยโรคเรอนชนดประเภทเชอนอยรายใหมทยงไมไดรบการรกษาดวยยา Multidrug therapy (MDT) และตรวจไมพบเชอดวยวธ Slit skin smear จ านวน 10 ราย โดยอาศยชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรว เปรยบเทยบกบวธ Conversional Polymerase Chain Reaction (PCR) ซงเปนวธการตรวจยนยนการพบเชอ (ดงแสดงในรปท 1.1) สถานทเกบตวอยางสถาบนราชประชาสมาสยสถานบ าบดโรคผวหนงวดมกฏและโรงพยาบาลสรนธร จงหวดขอนแกน โดยผปวยจะไดรบการเจาะเลอดจากนกเทคนคการแพทยผช านาญและเกบเลอดใสสารกนเลอดแขง (Plain tube) เพอใชตรวจทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรว และเกบชนเนอเยอ Slit skin smear (SSS) เพอท าการสกดดเอนเอและน าไปทดสอบโดยวธ PCR

ภาพท 1.1 แสดงวธการด าเนนการวจย

1.4 ค าส าคญ (Keyword) ของการวจย

(ภาษาไทย) การกรดผวหนง ผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย การทดสอบภมคมกนวทยาชนดรวดเรว

(ภาษาองกฤษ) Slit skin smear, Paucibacillary leprosy patient, Rapid serological test

ตวอยางผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย จ านวน 10 ราย ซงคดกรองโดยแพทยหรอผเชยวชาญ

1.เจาะเลอดผปวย โดยใชหลอดเลอดทไมมสารกนเลอดแขง เพอทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรว

2.ทดสอบการกรดผวหนงSSS และเกบปลายมดเบอร 15 เพอ

ทดสอบดวยวธ Polymerase chain reaction

น าผลการทดสอบทไดมาเปรยบเทยบกน

1.5 ประโยชนทคาดวาจะไดรบ

1.5.1ประเมนประสทธภาพชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรวในการตรวจวนจฉยการตดเชอโรคเรอน ในผปวยโรคเรอนชนดเชอนอย (Paucibacillary) เพอใชประโยชนเพอใชคดกรองผปวยกอนท าการทดสอบดวย การกรดผวหนง (Slit skin smear)

1.5.2เปนขอมลพนฐานส าหรบการน าชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรว ไปประยกตในการตรวจ กลมตวอยางอนๆเพอเปนการคดกรอง เชน แรงงานตางดาว เปนตน

1.6 การพทกษสทธกลมตวอยาง

การศกษาวจยนไดผานความเหนชอบจากคณะอนกรรมการจรยธรรมการวจยในคน มหาวทยาลยธรรมศาสตร (รหสโครงการ 005/2559)

การศกษาวจยครงนผวจยจะบนทกขอมลและเกบตวอยางเลอดและใบมดทเหลอใชของอาสาสมครและการรกษาความลบ ขอมลเกยวกบอาสาสมครงานวจย ผวจยใชการก าหนดรหสโดยจดการปกปด เพอเปนการรกษาความลบผปวย ซงผวจยสามารถเขาถงขอมลไดเพยงผเดยวและการรายงานผลงานวจยจะก าหนดเปนตวเลข แทนผปวยซงไมสารถระบถงตวบคคลได ซงจ านวนเลอดทเหลอและใชในงานวจยนไดถกท าลายตามมาตรฐานขยะตดเชอของสถาบนราชประชาสมาสยและเมองานวจยสนสดแลวการเผยแพรงานวจยจะเปนลกษณะรายงานเปนภาพรวม

บทท 2 วรรณกรรมและงานวจยทเกยวของ

2.1 โรคเรอน

2.1.1 โรคเรอนและการตดตอ

โรคเรอนเปนโรคตดเชอเรอรงทเกดจากการตดเชอแบคทเรย Mycobacterium leprae บรเวณของผวหนงและเสนประสาทสวนปลาย เปนโรคทสามารถรกษาใหหายขาดได เมอไดรบการวนจฉยโรคและรบการรกษาทถกตองและรวดเรวแตถาผปวยไมไดรบการวนจฉยไดอยางถกตอง จะท าใหเกดปญหาคอการด าเนนของโรคในผปวยโรคเรอนจะพฒนาไปเปน ผปวยพกา รเชน ตาบอด ไมสามารถเดนไดอยางปกต หรอหยบจบสงของไมไดเนองจากเกดความพการ ซงจะกอใหเกดปญหาสาธารณสขในการดแลรกษา ทงยงกอปญหาดานจตใจและสงคม คอมความทกขกงวลกบสภาพรางกาย ไมสามารถประกอบอาชพไดตามปกต ขาดรายไดเลยงครอบครว ถกสงคมหรอชมชนรงเกยจ

การแพรเชอ M.lepraeในผปวยสามารถแพรเชอไดสองชองทางคอ ทางเยอบจมก และผวหนงทแตกเปนแผล (Lepromatous ulcer) แตเชอโรคเรอนทออกจากเยอจมก จะมความส าคญในทางระบาดวทยา(1)วธการแพรเชอจากทางเดนหายใจสวนบนพบวาผป วยชนด Lepromatousทยงไมเคยไดรบการรกษา สามารถปลอยเชอโรคเรอนผานทางเยอบจมกออกมาในสงแวดลอมไดประมาณ 10 ลานตวตอวนและเชอสามารถมชวตอยนอกรางกายไดนาน 9 วน (1) ผรบเชอคอประชาชนสวนใหญทอาศยอยในบรเวณทโรคเรอนเปนโรคประ จ าถน (Endemic area) ผอยรวมบานกบผปวยโรคเรอนชนดเชอมาก เปนเวลานานมโอกาสสงขน 4-10 เทาทจะตดเชอโรคเรอน (1)

2.1.2 ลกษณะอาการแสดงทพบในโรคเรอน

อาการของโรคเนองจากโรคเรอนเปนโรคเรอรง M.leprae มการแบงตวแบบชาๆ ดงนนระยะฟกตวของโรคจงมระยะเวลานาน จงเปนโรคเรอรง (Chronic illness) แตบางครงผปวยโรคเรอนอาจเกดโรคแทรกซอนอยางเฉยบพลน เรยกวา โรคเหอ (Reaction) ซงเปนโรคทไมไดเกดจากเชอโรคเรอนโดยตรง แตเปนอาการตอบสนองจากรางกายทตอตานเชอโรคเรอนและมโรคเรอนทผปวยบางคนอาจสามารถหายเอง (Self-healing leprosy) คอ ผปวย Tuberculoid leprosy ใน

กลมประเภทเชอนอย เสนประสาททเกยวของกบโรคเรอไดแก เสนประสาทใหญ (Nerve trunk) ทถกท าลายในโรคเรอนมกเปนเสนประสาทใหญทอยตนๆ พาดผานปมกระดกและขอ และเชอโรคเรอน

ยงมกท าลายเสนประสาทคท 5 (Cranial nerve V, trigeminal nerve) และเสนประสาทคท 7 (Cranial nerve VII, Facial nerve) แตเชอโรคเรอนไมท าลายสมองและไขสนหลงโดยโรคเรอนจะท าใหเสนประส าทแขงและโตกวาปกต มอาการกดเจบทเสนประสาท และเมอท าลายใยประสาทเปนบางสวนหรอทงหมด กอใหเกด อาการชา กลามเนอออนแรง หรอผวหนงแหง ซงผลกระทบเปนการท าลายเสนประสาทแบบปฐมภม (Primary damage) (1) และเมอเสนประสาทถกท าลายไปเรอยๆจะเกดแผลเปน (Scar) ในเสนประสาทนน แผลเปนจะเรยกวา ภาวะพงผด (Fibrosis) โดยภาวะพงผดจะขดขวางการท างานของใยประสาทน าค าสงและใยประสาทรบความรสก ท าใหกลามเนอออนแรงและอาการชาตามมา และการเกดภาวะพงผด สามารถท าใหเกดความพการซ าซอนตามมาเชน กลามเนอออนแรงน าไปสการหดรง อาการชาน าไปสการเกดแผล โดยสรปการหดรงและแผลเปนการท าลายเสนประสาทแบบ (Secondary nerve damage) (1)

2.1.3 ภาวะความพการ(Disability) ในผปวยโรคเรอนมกมสาเหตเรมตนจากมการสญเสยหนาทของเสนประสาทท าใหในระยะแรกมการสญเสยการร บความรสกทผวหนงบรเวณตางๆ เชนทฝามอหรอฝาเทา และตอมาอาจท าใหกลามเนอตางๆไมสามารถท างานไดตามปกตและแบงออกเปน ๒ ระดบคอ

2.1.3.1 ระดบท 1 หรอความพการขนตน (Primary deformities)เปนความพการทเกดในผปวยโรคเรอนทมสาเหต มาจากเสนประสาทสวนปลายมการสญเสยหนาทซงอาจเกดจากโรคเหอ (Lepra reaction) หรอจากเสนประสาทอกเสบแบบเงยบ (Silent neuritis) และไดรบการรกษาชาเกนไปท าใหเสนประสาทเสยหนาทอยางถาวร โดยผปวยทมความพการระดบนจะมอาการชาทบรเวณผวหนงหรออวยวะทเสนประสาทนนๆไปเลยง เชน มอเทาชา กระจกตาชา หรอมกลามเนอออนแรง เชน ขอมอตก (Wrist drop) เทาตก (Foot drop) กลามเนอนวมอไมมแรง ตาหลบไมสนท (Lagothamos) เปนตน

2.1.3.2 ระดบท 2 หรอความพการขนตาม (Secondary deformities) เปนความพการทเกดตอเนองมาจากความพการขนตนและไมไดมการดแลรกษาทดพอจนท าใหอวยวะทมอาการชาเกดมแผลและอกเสบเรอรงและมการท าลายของอวยวะเกดขนตามมา หรอกลามเนอทออนแรงมการหดสนและเกดการผดรปของอวยวะตามมา

2.1.4 การแบงกลม(4, 5)

ในป พ.ศ. 2509 Ridley และ Joplingไดจ าแนกชนดของโรคเรอนโดยมวตถประสงคเพอใชในงานวจย โดยใชอาการแสดงออกทางคลนก ผลการตรวจเชอดวยวธ Slit skin smear ลกษณะทางพยาธวทยาจากการตรวจชนเนอ รวมทงการทดสอบทางภมคมกนวทยารวมดวยการจ าแนกชน ดของโรคเรอนตามหลกเกณฑนเปนทยอมรบทงจากแพทย ทปฏบตงานเชงวจยและแพทยทใหการดแลผปวยโรคเรอนโดยตรง องคการอนามยโลก (WHO) ไดแนะน าใหใชในภาคสนามโดยใชอาการแสดงทางคลนกและผลการตรวจเชอดวยวธ Slit skin smear เทานนกเพยงพอในการจ า แนกชนดของโรคเรอน โดยรวมแลวแบงประเภทเปน

2.1.4.1 โรคเรอนประเภทเชอนอย (Paucibacillary Leprosy: PB) หมายถง กลมผปวยโรคเรอนชนด Indeterminate (I), Tuberculoid leprosy (TT) และ Broderline tuberculoid (BT)

Indeterminate (I)

ผปวยชนดนเปนระยะเรมตนของโรค รอยโรคจะมผนขนาดเลกขนาดเทาเหรยญบาท ขอบเขตนนไมชดเจน อาการชาไมชดเจน เสนประสาทไมโต จงไมครบหลกเกณฑในการวนจฉยโรคเรอน ผลการทดสอบการกรดผวหนง Slit skin smearมกเปนลบ

Tuberculoid leprosy (TT)

ผปวยทเปน Tuberculoid leprosyจะมภมคมกนคอนขางด แตระดบของภมคมกนไมเพยงพอทจะท าลายเชอ M.leprae ในรางกายแตเพยงพอทจะควบคมการแบงตวของเชอ ท าใหเชอ M.leprae จ านวนไมมากนถกกกขง(imprisoned) ในบางสวนของรางกายเทานนดงนนผปวยชนด tuberculoid จะมผนจ านวนไมมาก อาจมเสนประสาทโต อยใกลเคยงกบผน เนองจากภมคมกนทคอนขางดจงสามารถควบคมไมใหเชอกระจายออกจากรอยโรค รอยโรคจงมขอบเขตชดเจน และไมมลกษณะการแพรกระจาย เชน ไมมขอบเขตทไหลออก (streaming edges) หรอ ลกษณะผนเลกๆกระจายรอบผนใหญ (satellite lesion) รอยโรคจงมลกษณะ วงดางราบ ขนาดเลก แหงเหงอไมออก มกพบขนรวง สจางกวาสผวปกต (hypo pigmentation) การกระจายขางเดยวของรางกาย เสนประสาทใหญ (nerve trunk) บรเวณใกลเคยงกบรอยโรคผวหนงผลการทดสอบการกรดผวหนงslit skin smearมกเปนลบ

Borderline tuberculoid leprosy (BT)

เปนชนดทพบบอยทสด ผปวยชนด Borderline tuberculoid leprosy จะมภมคมกนต ากวาชนด tuberculoid เลกนอย จงมอาการแสดงทางคลนกคลายกน แตลกษณะอาการทางผวหนงและเสนประสาท จะมจ านวน มากกวาและกระจายไดไกลกวา รอยโรคจะเปนวงดางขาว ขนาดไมแนนอน เหงอไมออก สวนใหญขอบเขตชดเจนแตมบางสวนเรมไมชดเจนและไมเรยบ (irregular edges) อาจพบลกษณะการกระจาย เชน พบผนเลกกระจายออกจากผนใหญ (satellites) อาการชาชดเจน การกระจาย ขางเดยว หรอสองขางของรางกายแบบไมสมมาตร (asymmetrical) เสนประสาทโต ผลการทดสอบการกรดผวหนง Slit skin smear ผปวยครงหนงมผลเปนลบอกครงหนงเปนบวกต าๆ 1+ถง 2+

2.1.4.2 โรคเรอนประเภทเชอมาก (Multibacillary Leprosy: MB) หมายถง กลมผปวยโรคเรอน ชนด , Borderline borderline leprosy (BB) ,Broderline lepromatous (BL)และ Lepromatous leprosy (LL)

Borderline borderline leprosy (BB)

เปนชนดทภมคมกนยงไมแนนอนอาจมภมคมกนเปลยนแปลงและสงผลใหลกษณะรอยโรคเปลยนแปลงไดในเวลา 2-3 เดอน มโอกาสพบโรคเรอนชนดนนอยทสด เพราะอาจจะพฒนาเปนชนด Borderline lepromatous leprosy ลกษณะรอยโรคเปนผนแดงนนหนา มรอยบมตรงกลาง (punch-out) ขอบในเหนชดเจน ขอบนอกลาดลงกลนไปกบผวหนงปกตการกระจาย ขางเดยวหรอสองขางของรางกายแบบไมสมมาตร (Asymmetrical) เสนประสาทโตหลายเสนผลการทดสอบการกรดผวหนง Slit skin smear1+ถง 3+

Borderline lepromatous leprosy (BL)

เปนชนด ทภมคมกนคอนขางต า จงพบเชอจ านวนมากสงผลใหลกษณะรอยโรคมลกษณะเปนผนวงแหวนชนด Punched-out ผนชนดแทรกในผวหนง (Infiltration) ตมแดง (Nodule) ขอบเขตไมชดเจน ชาเฉพาะผนขนาดใหญ หรอผนวงแหวน จ านวนรอยโรคมาก การกระจายสองขางของรางกาย แตไมสมมาตร เสนประสาทโต ผลการทดสอบการกรดผวหนง Slit skin smear 3+ถง 5+

Lepromatous leprosy (LL)

ผปวยชนดนมภมตานทาน ต ามาก จงมจ านวนเชอ M.leprae แบงตวและแพรกระจายใน บรเวณผวหนงทวรางกายและในสวนอนเชน ตบ มาม ตอมน าเหลองซงชนดอนไมพบการแพรกระจายเชนเดยวกนน รอยโรคมลกษณะเปนผนชนดแทรกในผวหนง (Infiltration) ตมแดงขนาดเลก (Papule and nodule) ผวเปนมน ขอบเขตไมชดเจน ไมชา หรอผนวงแหวน จ านวนรอยโรคมาก การกระจายสองขางของรางกาย สมมาตรอยางแทจรง (True symmetrical) ผลการทดสอบการกรดผวหนง Slit skin smear4+ถง 6+

2.1.5 อบตการณ

ในพนททมความชกของโรคเรอนสง (High endemic area) ชวงอายของผปวยทพบมากอยในชวงอาย 10-14 ป และ 30-60 ป และโอกาสจะพบนอยในเดกอายต ากวา 5 ป การพบโรคเรอนในเดกแสดงใหเหนวาพนทนนยงมการระบาดอยางรนแรง โรคเรอนจะพบในเพศชายมากกวาเพศหญง และพบชนชาตผวขาว (caucasian) มากทสด รองลงมาเป นคนผวเหลอง (mongoloid) อนเดยและชนชาตแอฟรกา ตามล าดบ(2) การศกษากอนหนานพบวาการแสดงออกของยนบางตวทมหนาทเกยวของกบการท างานของระบบภมคมกนตอเชอ (Host parasite interaction) มผลตอความไวของการเกดโรคเรอนคนชาวเอเชยและอนเดยทเกด mutationในบรเวณ HLA-DR2 และ HLA-DR3 จะไวตอการเกดโรคเรอนชนด Tuberculoid และชาวอนเดยและบราซลทเกด mutation ใน HLA-DQ1 จะไวตอการเกดโรคเรอนชนด Lepromatous(6)

รายงานอบตการณจากงานรกษาและปองกนควบคมโรค(2) จ านวนผปวยโรคเรอนในทะเบยนรกษาทวประเทศ ณ วนท 31 ธนวาคม 2557 พบผปวยโรคเรอนจ านวน 570 คนคดเปนอตราความชกโรคเรอน (Prevalence rate: PR) 0.09 คนตอประชากร 10,000 คน (ขอมลจากส านกทะเบยนกลาง กรมการปกครอง จากประชากรในประเทศไทย จ านวน 65,124,716 คน) โดยจ าแนกไดดงน

ผปวยใหมทคนพบในชวงระหวางวนท 1 ตลาคม 2557 – 30 กนยายน 2558

มจ านวนทงสน 183 คน คดเปนอตราการคนพบผปวยใหม (Detection rate: DR) 0.03คน ตอประชากร 10,000 คน โดยจ าแนกไดดงน

กลมการรกษา ประเภทเชอมาก (MB) 133 คน (72.67 %)

ประเภทเชอนอย (PB) 50 คน(27.32 %)

ผปวยใหมพการระดบ 2 22 ราย (12.02 %)

ผปวยใหมเดก 6 ราย(3.27 %)

ตารางท 2.1 ตารางแสดงความชกผตดเชอโรคเรอนและผตดเชอรายใหมใน 102 ประเทศ

จดท าองคการอนามยโลก ป ค.ศ.2014

WHO region จ านวนผตดเชอ (อตราผ

ตดเชอตอประชากร 10,000 คน)

จ านวนผตดเชอรายใหม (ตอประชากร

100,000 คน)

African 19,968 (0.26) 18,597 (2.44)

Americas 29,967 (0.33) 33,789 (3.75)

Eastern mediteradian 2,212 (0.04) 2,342 (0.38)

South-East Asia 119,478 (0.63) 154,834 (8.12)

Western Pacific 3,929 (0.02) 4,337 (0.24)

Total 175,554 (0.31) 213 ,899 (3.78)

ทมา The World Health Organization (WHO)

ภาพท 2.1 แสดงความชกของผปวยโรคเรอนตามพนทโลกป ค .ศ.2014

ทมา The World Health Organization (WHO)

2.1.6 การวนจฉยโรคเรอน

องคการอนามยโลก (WHO)(1) ไดใหค าจ ากดความ ซงถอเปนหลกส าคญในการวนจฉยโรคเรอนไวดงน อาการแสดงส าคญ (cardinal signs) คอ

2.1.7.1ตรวจพบรอยโรคผวหนงทมลกษณะเฉพาะของโรคเรอน เชน ผนวงดางขาว

2.1.7.2 ตรวจพบอาการชาขอใดขอหนงดงตอไปน

2.1.7.1.1 ชาทรอยโรคผวหนง

2.1.7.1.2 ชาทผวหนงบรเวณทรบความรสกจากเสนประสาทสวนปลายทถกท าลายโดย เชอโรคเรอน

2.1.7.3 ตรวจพบเสนประสาทโต

2.1.7.4 ตรวจพบเชอรปแทงตดสทนกรด (Acid fast bacilli) จากการกรดผวหนง (slit skin smear) โดยถาพบอาการแสดงอยางนอย 2 ขอ จาก 3 ขอแรกหรอพบขอ 4 เพยงขอเดยวใหการวนจฉยวา เปนโรคเรอน

2.1.7 ระบบภมคมกนของรางกายตอเชอโรคเรอน

ภาพท 2.2 แสดงถงลกษณะการแบงกลมของผปวยโรคเรอนตามระดบภมคมกน

ทมา http://www.thelancet.com/journals

ระบบภมคมกนทเกยวของกบโรคเรอน แบงไดเปนการใชระบบภมคมกนของรางกาย 2 ประเภทคอ ระบบภมคมกนประเภทพงเซลล (Cell Mediate Immunity : CMI) ทใช T-Lymphocyte เปนเซลลหลกในการควบคมกลไกการท า งานของระบบน โดยม Helper T cell (Th cell) และ Suppressor T cell เปนตวท างานแบบใชเซลลและระบบภมคมกนแอนตบอด (Humoral Immunity) โดยใช B-Lymphocyte เปนตวควบคมกลไกการท างานของระบบ โดยเชอโรคเรอนเปนเชอทไมมพษ (Non toxiccity) การบกรกเขาเซลลจงด าเนนไปอยางชาๆ โดยทแบงตวและเจรญเตบโตภายในเซลล เชน เซลลประสาทสวนปลาย แมคโครฟาสก ท าใหกลไกการตอบสนองของภมคมประเภทแอนตบอด (Humoral Immunity) ท างานไดไมดคอ ไมสามารถสรางแอนตบอดเพอเปนภมตานทานตอการตดเชอโรคเรอนได แต เมอเชอโรคเรอนถกขบออกนอกเซลล เนองจากผลของยาจะถกแอนตบอดมารวมตวกนกบสารอนทหลงออกมาเกดเปน Immune complex จะเกดการอกเสบทบรเวณเนอเยอเปนภาวะแทรกซอนโรคเหอชนดทสอง (Type II leprosy reaction) คอตมเหอ ( Erythema nodosum leprosum ) เปนอาการทผวหนงในผปวยทมระดบภมคมกนคงท คอ ตมใตผวหนง สแดง กดเจบ แทรกอยในรอยโรคชนด Lepromatous leprosy หรอ Borderline

lepromatous ทเปนทเดมหรอเกดขนในผวหนงปกตในรายทเปนมากจะมหนองรวมดวย คอตมอกเสบทเปนหนอง (pustular ENL) หรอถารนแรงมากจนแตกเปนแผลเรยกวา Ulcerating ENL สวนแอนตเจนทถกขบออกนอกเซลล เมอถกกลไกของปฏกรยาตอบสนองโดยใชเซลล (CMI) จะท าใหเกดโรคเหอชนดทหนง (Type I leprosy reaction) ซงจะพบในผปวยทมระดบภมคมกนไมคงท คอ Broderline tuberculoid , Broderline borderline leprosy และ Broderline lepromatous อาการแสดงทางผวหนงเรยกวา ปฏกรยายอนกลบ (reversal reaction) โดยรอยโรคผวหนงทไดการรกษาแลว รอยโรคผวหนงจะแบนราบลง สแดงนอยลงแตเมอเกดโรคเหอชนดท 1 ผวหนงเดมจะบวมมากขน สแดงและเปนมน

2.2เชอแบคทเรย Mycobacterium leprae

ตามอนกรมวธานเชอ M.leprae จดอยใน Order Actinomycetalis และ Family Mycobacteriacae ซงจดเปนเชอประเภททตองอาศยอยในเซลล (Obligate intracellular organism) คณลกษณะทส าคญของเชอ M.leprae รปรางเปนทอนอาจเปนรปทอนตรงหรอโคงเลกนอย (straight rods or slightly curved) ขนาดความยาว 1-8 ไมโครเมตรและเสนรอบวง 0.3 ไมโครเมตร เหมอนกบเชอในกลม Mycobacteria ตวอน มการแบงตวแบบ Binary fission โดยมระ ยะเวลาแบงตว 11- 13 วนซงถอวาแบงตวชามากเมอเปรยบเทยบกบ Mycobacterium tuberculosis ทมระยะเวลาแบงตว เพยง 20 ชวโมงท าใหการด าเนนของโรคเมอตดเชอ M.leprae จงใชเวลานาน จ านวนเชอทมชวตนอยทสดทสามารถท าใหเกดการตดเชอ (Minimal infection live dose) คอ 3-40 ตว (1) แบคทเรยในกลม Mycobacteria จะมความแตกตางของผนงเซลลกบแบคทเรยในกลมอนคอมโครงสรางผนงเซลลเปน Peptidoglycan-arabinogalactan-mycolic acid โดยแกนกลางของผนงเซลลจะประกอบขนจาก N-acetylglucosamineกบ N-glycolylmuramateดวยพนธะเปบไทนและเชอมตอชน galactanโดย arabinogalactan โดยทชน Peptidoglycan จะเชอมตอกบ Mycolic acid และในสวนชนนอก (capsule) จะมไขมนทเรยกวา PGL-1 (รปท 2.3)ทสามารถเหนยวน าใหรางกายมนษยสรางแอนตบอดทจ าเพาะตอเชอ M.leprae ซงมการศกษาวจยชวยสนบสนนเชนปฏกรยาในชนลาเมนตของ Schwanncell ของPGL-1(7) การตดสแกรมจะตดสแกรมบวก สามารถตดสทนกรด Acid fast stain (AFB) ทมสวนประกอบของ Carbol-fuchsin โดยจะมลกษณะเฉพาะของเชอโรคเรอนคอ การรวมกลมของเชอเรยกวา Globi ซงจะมจ านวนตวเชอเปน

จ านวนมากหลายรอยตว เนองจากเชอโรคเรอนเปนเชอทอาศยอยใน Macrophage(6) และในกลมเลกๆทจบกลม จะเรยงตวตามยาว (Parallel หรอ bundles of cigars )ไมสามารถเคลอนทได (Non-

motile) ไมมสปอร (Non-spore-forming) และไมสามารถเพาะเชอบนอาหารเลยงเชอได (Non-cultivable) แตสามารถเลยงใหอยรอดไดในระยะสองถงสามสปดาหใน Axenic cultures (6) จงจ าเปนตองเพาะเลยงในสตวทดลอง เชน ต วนมเกาลาย (nine-banded armadillo: Dysypusnovemcinctus)(10,11) ซงมอณหภมของรางกายประมาณ 32-35 องศาเซลเซยส จงสามารถอธบายการเจรญเตบโตของเชอ M.lepraeทมกเกดพยาธสภาพในเนอเยอสวนทอณหภมต ากวา อณหภมเฉลยของรางกายมนษยท 37 องศาเซลเซยส

ภาพท 2.3 แสดงสวนประกอบสวนประกอบผนงเซล ทประกอบดวย Mycolyl-arabinogalactan-

peptidoglycan เชอ Mycobacterium leprae

ในสวนชนของผนงเซลทมสวนประกอบของไขมนในปรมาณสงท าใหการยอมส Gram stainใหผลการตดสหลงจากดผานกลองจลทรรศนไมดเนองจากสไมสามารถซมเขาสผนงเซลล

ได ดงนนการยอมสเพอการวนจฉยจะใชวธการยอมสทนกรด (Acid-fast staining) เนองจากเชอทตดสแลวไมสามารถลางออกไดงาย ดวย acid-alcohol จงไดจ าแนกแบคทเรยกล มนเปนพวกทนกรด (Acid fast bacteria ,AFB) โดยวธของ Ziehl-Neelsen stain ซงเปนวธทตองใชความรอนชวยใหเซลลตดสดขนเปนวธท WHO ใหการรบรองวาเปนวธมาตรฐานในการวนจฉยเชอโรคเรอน (12 )และจากการศกษาดวยกลองจลทรรศนก าลงขยายธรรมดา (Light microscope) หรอกลองจลทรรศนก าลงขยายพเศษ (Electron microscope) จะไมสามารถแยกความแตกตางระหวางเชอ M.Leprae (รปท 2.4 A) ตวเดยว ๆกบ Mycobacterium tuberculosis ได (รปท 2 B) แตจะใชการเรยงตวเปนกลมกอน (Globi) ทเปนลกษณะพเศษของเชอทไมมใน Mycobacterium tuberculosis(4)

( A ) ( B )

ภาพท 2.4แสดงรปรางและการเรยงตวของ Mycobacterium leprae (A) และ Mycobacterium tuberculosis (B) ทยอมโดยใช Acid fast stain (12)

การตดตอสามารถตดตอทางเดนหายใจ ( Respiratory transmission ) จากคนสคนเพราะพบเชอจ านวนมากในเยอบจมกและน ามกของผปวย Lepromatousโดยจากผลการทดสอบฉดละอองฝอยทมเชอโรคเรอนใหหนตดเชอโรคเรอนและน ามาตรวจพบวาในตวหนมเชอ M.leprae ทยงมชวตอย และมการพบการตดเชอโรคเรอนในตวนมเกาลาย (wild armadillos) ทอาศยอยทางตอนใตของสหรฐอเมรกาและลงชมแปนซ(12) เชอโรคเ รอนทอยในน ามกทในสภาพแวดลอมภายนอก สามารถมชวตอยไดนาน 1- 7 วน การตดตอโดยการสมผสทางบาดแผลรอยถลอกเชอโรคเรอนไม

สามารถผานผวหนงปกตจงไมมการตดตอโรคจากการสมผสผวหนงปกตของผปวยระยะฟกตว (incubation peroid) ของเชอ M.leprae เปนเชอทแบงตวชาทสด เจรญเตบโตไดดทอณหภม 27-30 c เชอไมมความรนแรง(low pathogenicity) หรอเปนพษต า (low toxic) มการแบงตวแทรกซมเนอเยอไปเรอยๆโดยไมมอาการและอาการแสดงชดเจนอาการทางคลนกสวนมากเกดจาก host response อตราการเกดโรคโดยปกตคนทรบเชอ M.leprae จะมเพยงรอยละ 3 เทานนทสามารถพฒนาไปเปนโรคเรอนไดเพราะประชากรสวนใหญจะมภมคมกนทสามารถท าลายเชอ M.leprae ไดโดยสมบรณและไมมการด าเนนของโรคไปเปนโรคเรอน ภมคมกนทผดปกตของผปวยโรคเรอนทแตกตางกนสงผลใหลกษณะอาการแตกตางกนดวย ในผปวยโรคเรอนทมภมคมกนผดปกตปานกลาง หลงรบเชอแลวสามารถยบยงเชอในการแบงตวไดบางสวน ดงนนอาการจงแสดงเพยงสวนหนงสวนใดของรางกายเทานนโดยผทภมคมกนผดปกตตงแตมภมคมกนแบบเ ซล (CMIR) ผดปกตนอยจนถงไมมเลยผปวยกจะแยกตามชนดของผปวยโรคเรอนเรยงตามล าดบคอชนด Indeterminate (I), Tuberculoid leprosy (TT) , Borderline tuberculoid leprosy (BT) Broderline borderline leprosy (BB),Broderline lepromatous (BL) Lepromatous leprosy (LL) โดยเชอ M.leprae ทไดรบเขาสรางกายจะแบงตวในรางกายมากพอจะเกดอาการทผวหนง และมอาการทางเสนประสาทสวนปลายจงถอวา เปนผปวยโรคเรอนแลว

2.3 การตรวจวนจฉยเชอ Mycobacterium leprae ในผปวยโรคเรอน สามารถท าไดหลายวธ ดงน

2.3.1. การกรดผวหนง (Slit skin smear)(9, 12)

การกรดผวหนงตรวจหาตวเชอโดยตรง หรอ slit skin smear เปนวธการทตองปฏบตตามค าแนะน าขององคการอนามยโรค (WHO) วธการทดสอบจะเลอกต าแหนงทดสอบตามหลกมาตรฐาน คอ ตงห ทองแขน และบรเวณทมรอยโรค ทงนรอยโรคทผวหนงของผปวยโรคเรอนทเหมาะสมแกการตรวจหาเชอ คอรอยโรคไมแตกเปนแผล เมอไดต าแหนงทดสอบตองบบดวยนวมอใหแนนเพอจะไมใหมเลอดออกมาผสมกบ tissue pulp ทตองการเพราะจะท าใหการมองผานกลองจลทรรศนเพอคนหาตวเชอยาก แลวใชใบมดขนาดเบอร 15 กรดบรเวณผวหนงใหเปนบาดแผลยาว 5 มลลเมตร ลก 2 มลลเมตร เมอได tissue pulp แลวน ามาเสมยรบนไสลดและยอมส Ziehl –Neelsen stain โดยตวเชอ Acid fast bacilli ทพบจะตดสแดง และพนหลงจะตดสน าเงน และพบการเรยงตวเปนแบบเกาะกลมแนน (Globi) ซงการรายงานผลการทดสอบมการรายงาน 2 แบบ คอ

การรายงานเชงปรมาณ (Bacteriogical index, BI) และ การรายงานผลเชงคณภาพ (Morphology index, MI)

2.3.1.1 การรายงานเชงปรมาณ (Bacteriogical index, BI) เปนการหาปรมาณความหนาแนนของ M.leprae ซงก าหนดใหมคาตงแต 0 ถง 6+

ตารางท 2.2 การรายงานผลเชงปรมาณตามแบบ Ridley logarithmic scale

BI=0 ไมพบเชอ จ านวน 100 วงกลอง

BI=1+ พบ 1-10 ตวโดยเฉลย จ านวน 100 วงกลอง

BI=2+ พบ 1-10 ตวโดยเฉลย จ านวน 10 วงกลอง

BI=3+ พบ 1-10 ตวโดยเฉลย จ านวน 1 วงกลอง

BI=4+ พบ 10-100 ตวโดยเฉลย จ านวน 1 วงกลอง

BI=5+ พบ 100-1000 ตวโดยเฉลย จ านวน 1 วงกลอง

BI=6+ พบมากกวา 1,000 ตวโดยเฉลย จ านวน 1 วงกลอง

เนองจากการเรยงตวของ M.leprae จบกลมแนน (Globi) ท าใหไมสามารถนบจ านวนไดถกตอง จงใชการประเมนอยางคราว ๆ อาจจะประเมน Globi ขนาดใหญจะแทนการนบประมาณ 100 ตว กลม Globi ขนาดเลกจะแทนการนบประมาณ 30 ตว โดยทวไปหลงจากการรกษาแลว เชอทเหลอจะเปนเชอทตายแลวมลกษณะรปรางเปนทอน (Fragmented form) หรอ ผง (Granular form)

2.3.1.2 การรายงานผลเชงคณภาพ (Morphology index, MI) เปนการดรปรางลกษณะของตวเชอผานกลองจลทรรศน โดยการพบตวเชอทตดสแบงเปน 3 ลกษณะคอรปแบบ Solid, Fragmented และ Granular

รปแบบ Solid การตดสของตวเชอจะมลกษณะเปนแทงหรอโคงเลกนอยตดสสม าเสมอความยาวมากกวาความกวาง 4 เทาตดสสม าเสมอ ไมมชองวางการพบตวเชอทเปนลกษณะนบงชวา เปนเชอทมชวต (Viable) อยในผปวยโรคเรอนระยะตดตอทยงไมไดรบการรกษา หรอการร กษาไมไดผลการกลบมาเปนซ า

รปแบบ Fragmented การตดสของตวเชอ จะลกษณะยงเปน แทงหรอโคงเลกนอย แตตดสไมสม าเสมอ เชอจะแตกเปนทอนเลกๆ มชองวางเลกๆทไมตดสแสดงถงการเขาท าลายเชอจากยาทผปวยไดรบการรกษาในระยะแรก เชอโรคเรอนรปแบบนทพบไมท าใหเกดโรค

รปแบบ Granular การตดสไมสม าเสมอ เปนเชอโรคเรอนทถกท าลายจนสมบรณ และไมสามารถท าใหเกดโรคแลวเพราะเชอทพบตายแลว ซงเปนเชอโรคเรอนทรอการก าจดออกนอกรางกาย

โดยสรปจะชวยการตรวจวนจฉย ส าหรบผปวยใหม และผปวย ทกลบมาเปนซ า (Relapsed disease) การตรวจพบ Fragmented form และ Granular form จะท าใหบงชถงการรกษาผปวยประเภทตดตามเฝาระวง (1)

ภาพท 2.5 ลกษณะการตดสทนกรด (Acid fast bacilli) ทแตกตางกนของเชอ

Mycobacterium leprae ทใชในการรายงานเชงคณภาพ

ทมา http://odpc2.ddc.moph.go.th/lab/Leprosy.htm

ภาพท 2.6 ลกษณะเชอโรคเรอนทยอมตดส Acid fast baccilli (Zielh-neelson stain)

ทมา http://microbeonline.com/wp-content/uploads/2012/05/Leprosy-bacillus.jpg

ขอดของการท าการทดสอบ การกรดผวหนงตรวจหาเชอ Acid fast bacilli คอมความจ าเพาะสง (100 เปอรเซนต ) เพราะไมม Mycobacterial skin infection อนทตรวจพบปรมาณ Acid fast bacilli เปนจ านวนมากในผวหนง และเปนวธท องคการอนามยโลกแนะน าใหเปน Cardinal sign ในการวนจฉยการตดเชอโรคเรอน ในการตรวจวนจฉยโรคเรอนประเภทเชอมาก (MB) จะใหผลการทดสอบบวก แตขอเสยคอปรมาณ Bacteriogical index (BI) ทพบในโรคเรอนประเภทเชอนอย (PB) จะมSensitivity ต าในกลมนสวนมากจะตรวจไมพบเพราะปรมาณเช อทนอยทจะสามารถตรวจโดยวธนเทากบ 104 ตอชนเนอทได 1 กรม (AFB per gram of tissue) (9,12)และขอเสยเกยวกบบคลากรทตองอาศยทกษะความช านาญการกรดผวหนงและการรายงานผล ประโยชนของการตรวจหาเชอโรคเรอนโดยวธการกรดผวหนงคอ ใชวนจฉยหรอ ชวยยนยนการวนจฉยโรคเรอน ใชจ าแนกชนดโรคเรอน ใชตดตามผลการรกษาโรคเรอน และใชวนจฉยผปวยโรคเรอนทกลบมาเปนใหม (Relapse)

2.3.2 การตรวจทางพยาธวทยา (Histopathology)

การตรวจทางพยาธวทยาชนเนอเปนการทดสอบเพอคนหาตวเช อโรคเรอนทตดส Acid fast bacilli หรอการพบ Epithelioid granuloma ในเสนประสาท เนองจากการตรวจทางพยาธวทยาไมไดเปน Gold standard และมความจ าเพาะนอยกวา การทดสอบโดยการกรดผวหนง Slit skin smear เพราะการตรวจทางพยาธวทยาจะอาศยการเปลยนแปลงของพยาธส ภาพจากรอยโรคนนเปนปจจยส าคญในการทดสอบ

2.3.3 การตรวจทางแอนตบอด (Serology testing)

การตรวจทางภมคมกนในงานตรวจวนจฉยโรคเรอนจะเปนการตรวจเพอชวยสนบสนนการการทดสอบการกรดผวหนง (SSS) การตรวจหาแอนตบอดจ าเพาะตอ M.Leprae เปนวธการทงายไมยงยากในการตรวจ และมราคาไมแพง ชวยในการตรวจภาคสนาม (field work) เรมตนจากการตรวจวดระดบแอนตบอด PGL-1 โดยใชวธการ immune enzymatic assay (ELISA) ,passive hemagglutination, in gelatin particle, dipstick และ rapid lateral flow test ซงการตรวจระดบ anti PGL-1 แสดงถงจ านวนของเชอ M.leprae และยงมประโยชนในการชวยวนจฉยอาการทางคลนก คอในผปวยโรคเรอนประเภทเชอมาก(MB)จะมระดบของไตเตอรสง เมอเทยบกบระดบของผปวยเชอนอย(PB) การทดสอบนอาจไมเหมาะสมกบบคคลทอาศยรวมบานกบผปวยชนดเชอมากเปนระยะเวลานาน ซงอาจจะท าใหตรวจพบระดบ Anti–PGL-1 ไดเปนบวกปลอม ปจจบน The Infectious Disease Research Institute, สหรฐอเมรกา ไดพฒนาโดยน า fusion protein มารวมกบ ML0405 และML2331 โดยใชชอเรยกวา LID-1 เพอพฒนาช ด rapid serological test ในการตรวจคดกรองผตดเชอโรคเรอนใหม และใหผลดในชวงท าการรกษาโดยโปรตน anti LID-1 ,anti-ML0405 และantiML2331จะลดลงตามทงสองกลม (PBและMB) ซงใหผลด ในการตดตามการรกษารวมถงการกลบมาเปนซ า (disease relapsed)(19)

2.3.4 การตรวจทาง Immuno-histochemical reaction

การตรวจทาง Immuno-histochemicalreaction เปนการตรวจโดยใช Monoclonal หรอ Polyclonal Antibody ทใชในการตรวจวด M.Leprae Antigen เปนวธทมความจ าเพาะสงและความไวสงเปนวธทเหมาะสมกบการตรวจหาการตดเชอในระยะเรมแรกหรอในกลมเชอนอย (10) โดยทวไปในการตรวจวนจฉยโรคเรอนสวนมากจะใช S-100 และ heat shock protien Lipoarabinomannan และ PGL-1 glycolipid ยกเวนส า หรบ Anti-PGL-1 เมอน าทางยอมทาง

Immuno-histochemical reaction อาจจะท าใหผลบวกกบบางโรคเชนโรคผวหนงเรอรง โรคออโตอมมน (21) แอนตบอดตอ S-100 โมเลกลจะแสดงออกในระบบประสาทสวนปลาย อาจจะพบทบรเวณชนdermalของเสนประสาทเกดการอกเสบไปในระบบประสาทสวนปลายบรเวณผวหนง(20)

2.3.5 การตรวจทางชวโมเลกล (Molecular biology)

ในงานตรวจทาง ชวโมเลกลสวนมากจะตรวจเชอทเตบโตชาหรอไมสามารถเพาะเลยงตามปกตได การตรวจทาง Polymerase Chain Reaction (PCR) ส าหรบโรคเร อนเรมตนท ป 1989 (27) การตรวจทางชวโมเลกลสามารถตรวจแยกปรมาณและชนดไดดกวาเมอเทยบกบ วธการตรวจเชอดวยกลองจลทรรศน สามารถ Amplified ไดทง ดเอนเอ Deoxyribonucleic acid (DNA) และ อารเอนเอ Ribonucleic acid (RNA) อยางไรกตามการตรวจดวยวธ นจะตองใชผเชยวชาญและเครองมอทเหมาะสมดงนนการทดสอบนจงเหมาะสมกบงานวจยตางๆ

การใชประโยชนของ PCR คอใชในการตรวจยนยนผปวยชนดเชอนอย (PB) ตดตามการรกษา และตรวจหาการดอยา (MDT) การกลบมาเปนซ ารวมถงการเขาใจกลไกการตดตอของเชอโร คเรอน โดย Conventional PCR nested PCR และ Real-time PCR จะใชในการตรวจหาเชอ M. leprae มขอดในการตรวจเชอไดรวดเรว มความไวและความจ าเพาะสงและตรวจหาจ านวนของปรมาณเชอได สวนขอดของวธ Reverse transcriptase PCR of M.Lepraeribosomal RNA จะสามารถแยกเชอมชวตได

งานวจยทเกยวของ

จากการเปรยบเทยบผลเชงปรมาณ BI จากการท าวธ Slit Skin Smear เทยบกบการท าท Bacillary index จาก Granuloma พบวาในกลมผปวยประเภทเชอนอย (Paucibacillary, PB) ชนด Borderline tuberculoid leprosy (BT) ผปวยประเภทนจะพบจ านวน BI มากกวาการท าวธ Slit Skin Smear ดงนนจะเหนไดวาการเลอกต าแหนงในการกรดผวหนงมผลตอคา BI ทได เมอเปรยบเทยบกบวธ Whole-blood nest PCR ส าหรบการตรวจ Specific DNA ของเชอโรคเรอนในการวนจฉยโรคเรอนของ Yan และคณะ (20) ไดเปรยบเทยบการท า Nested PCR กบการทดสอบ ELISA หาแอนตบอดคอ ND-O-BSA test และ LID-1 IgG

ตารางท 2.3 แสดงเปอรเซนตผลการทดสอบ ดวยวธ NESTED PCR/ ND-O BSA /LID-1 ((ELISA)

ประเภทผปวยโรคเรอน NESTED PCR ND-O BSA (ELISA) LID-1 (ELISA)

ผปวยประเภทเชอมาก (MB) 95.20 % 97.96 % 89.80 %

ผปวยประเภทเชอนอย (PB) 70 % 70 % 53.30 %

เฉพาะ Borderline tuberculoid leprosy (BT) ทผล SSS positive

75 % 79.17 % 58.33 %

ผลการทดสอบในกลมผปวยประเภทเชอมาก (MB) พบการตรวจวด NESTED PCR / ND-O BSA (ELISA) / LID-1 (ELISA) ไดดงน positive 95.2 เปอรเซนต /positive97.96เปอรเซนต/positive 89.8เปอรเซนตผลจากการทดสอบในกลมผปวยประเภทเชอนอย (PB) พบการตรวจวด NESTED PCR / ND-O BSA (ELISA) / LID-1 (ELISA) ไดดงน positive 70เปอรเซนต / positive 70เปอรเซนต / positive 53.3เปอรเซนตเฉพาะ Borderline tuberculoid leprosy (BT) ผล AFB positive NESTED PCR / ND-O BSA (ELISA) / LID-1 (ELISA) ไดดงน positive 75 เปอรเซนต / positive 79.17 เปอรเซนต / positive 58.33 เปอรเซนต จากผลการทดสอบจะพบวากลมผปวยประเภทเชอมาก (MB) เมอน ามาทดสอบหาโปรตน PGL-1 (9)โดยวธ ELISA ระดบแอนตบอดจะเรยงล าดบมากไปนอยคอ IgG ,IgM และ IgA ตามล าดบ กลมผปวยประเภทเชอนอย (Paucibacillary, PB)ระดบแอนตบอดจะเรยงล าดบมากไปนอยคอ IgG ,IgM และ IgA เหมอนกนแตแตกตางกนทระดบ Optical density (ท 450 nm) ผปวยประเภทเชอมาก (MB )จะมความเขมขนสงกวาเพราะมการตดเชอมากกวาดงนนการเลอกใชชดทดสอบเพอใหเกดประโยชนตอการวนจฉยจงควรค านงถงการตรวจวดไดของผปวยทงสองประเภท

จากการศกษาการตรวจพบการตดเชอโรคเรอนของ Malcom S. duthie และคณะ(21,22) ท าการวจยการตดเชอโรคเรอนในผปวย Cebu skin clinic ประเทศฟลปปนสโดยใชชดการทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรว ทดสอบการตดเชอโรคเรอนดวยช ดทดสอบสองชดทดสอบประกอบดวย ชดทดสอบ SD Leprosy (Yongin ,South Korea)ทตรวจหาแอนตบอดทจ าเพาะตอเชอโรคเรอนคอ PGL-1IgM โดยใช NDO-bovine serum albumin (NDO-BSA) และอกชดทดสอบคอ NDO-LID (OrangeLife, Rio de Janeiro Brazil)ตรวจหาแอนตบอดทจ าเพาะ ตอ

เชอโรคเรอนคอ PGL-1 IgM โดยใช NDO-bovine serum albumin (NDO-BSA)และ แอนตบอดทจ าเพาะตอ LID-1 ซงเปนโปรตนสงเคราะหทไดจากเชอ M.leprae ยนท MLO0405 และ ML2331 และใชการอานผลของ NDO-LID test ดวยโปรแกรมสมาทโฟน ชนดแอนดรอย ผานเลนสกลองทรบสญญาณความเขมขนของเสนแถบแสดงผลการทดสอบtest band และ เสนแถบควบคมการทดสอบ (control band)และจะค านวณตามกราฟทเปนสดสวนของการแสดงความเขมของของเสนแถบแสดงผลการทดสอบtest band และ เสนแถบควบคมการทดสอบcontrol band(21)ไดผลการทดสอบผปวยประเภทเชอนอย (PB)จ านวน 19 รายใหผลบวกตอชดทดสอบ SD Leprosyและวธ NDO-LID test คอ 0และ 52.6 เปอรเซนตตามล าดบและผปวยประเภทเชอมาก (MB)จ านวน 48 รายทใหผลบวกตอชดทดสอบ SD Leprosy และวธ NDO-LID test คอ 77.1 และ 93.8 เปอรเซนตตามล าดบซงจากการทดสอบสามารถเทยบผลการทดสอบระดบความเขมของเสนแถบการทดสอบ (Test line) แปรผนไปตามBacteriological index (BI)กลมผปวยเชอมาก (MB) หลงจากท าการทดสอบในผปวยทรบการรกษาแลวเมอมาตดตามผลการรกษาตามก าหนดเวลา

ตารางท 2.4 แสดงการทดสอบดวยวธ Rapid Serological test 2 ชดการทดสอบ

ประเภทผปวยโรคเรอน NDO-LID test SD Leprosy

ผปวยประเภทเชอมาก(MB) 93.8 % (48) 77.1 %(48)

ผปวยประเภทเชอนอย(PB) 52.6 % (19) 0 % (19)

จากการศกษาของ Adalbarto R. และคณะ (24 )ไดท าการตรวจการตดเชอ M.lepraeดวยวธ PCR ในผปวยโรคเรอนหลงการรกษาจ านวน 38 ราย แบงเปนผปวยโรคเรอนประเภทเชอมาก 17 ราย (44.7%) ผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย 21 ราย (55.3%) จากสงสงตรวจทแตกตางกนพบวา จากการตรวจโดยใชจากเลอด 17 ราย (MB 10 PB 7) PCR positive 7(70%) 5(71%) ตามล าดบ จากเนอเยอ 4 ราย (MB 1 PB 3) PCR positive 1(100%) 2(66%)

ตารางท 2.5 ผลจากการทดสอบผปวยทงสองกลมดวยวธ PCR

ประเภทผปวยโรคเรอน เลอด (บวก/ราย) เนอเยอ

ผปวยประเภทเชอมาก(MB) 7(10) 70% 1(1) 100%

ผปวยประเภทเชอนอย(PB) 5(7) 71% 2(3) 66%

จากการศกษาของ Alejandra และคณะ (23) ท าการศกษาเปรยบเทยบระหวางผลของ Conversional PCR กบ Real time PCR โดยใช primer เดยวกนและสงสงตรวจชนดเดยวกนไดผลดงตารางท 2.6

ตารางท 2.6 เปรยบเทยบความไว (Sensitivity) ของ Conversional PCR กบ Real time PCR

DNA

Conversional PCR Real time PCR

Smear-positive cases

PCR+

PCR sensitivity

29/29 29/ 29

100 % 100 %

Smear-negative cases

PCR+

PCR sensitivity

17/18 18/18

94.4 % 100%

จากการศกษาของAlejandra และคณะ (24) ไดท าการรวบรวมการวนจฉยโรคเรอนดวยวธ PCR ในงานคลนกโรคเรอนพบวาประโยชนในการทดสอบดวยวธ PCR มประโยชนในการวนจฉยโรคเรอนในผปวยโรคเรอนทเพงไดรบเชอหรอผรวมบาน (House hold contact) กบผปวย

โรคเรอนประเภทเชอมากเปนเวลานาน การวนจฉยผปวยทหลงรบการรกษา และ เรมตนของการการทดสอบดวยวธ PCR จะใชตวอยางจากชนเนอ (Skin biopsy) แตหลงจากนนมการประยกตสงสงตรวจทแตกตางคอ ปสสาวะ ไมพนส าลปายจาก Nasal swab เยอเมอกจากชองปากเปนตน (17)ความแตกตางของ Sequences ทใชเปนเปาหมายของการทดสอบดวยวธ PCR จะใชยนท 36-kDa antigen , 18-kDaantigen ,65-kDaantigen ,16S rDNA เปนตน จากตารางการทดสอบดวย PCR โดยใชสงสงตรวจเปนชนเนอจะพอจ าแนกผลการทดสอบดงน

ตารางท 2.7 ผลจากการทดสอบ เนอเยอทไดจากผปวยโรคเรอนทงสองประเภทดวยเทคนค PCR (25)

DNA Targets PCR Method Result

Pra-36 KDa PCR Southern hybridization

Taqman real time PCR

87-100 % MB

36-60 % PB

89 % BI+ 74% BI-

18 KDa PCR Southern hybridization

99 % MB 74 % PB

RLEP Southern hybridization

PCR

100% BI+ 100 % BI-

100 % MB 73 % PB

Ag85B Taqman real time PCR 100 % MB 73 % PB

ทมา PLOS Neglected Tropical Diseases A

และจาก การศกษาของ Ravindra P. และคณะ (25)ไดประเมนเปรยบเทยบ ยนเปาหมายประกอบดวย RLEP rpoT Sod A และ 16S rRNA จากสงสงตรวจคอ Slit skin smear เลอด และในดนรอบรอบทพกผปวยโรคเรอน ผลการทดสอบทไดคอ RLEP ไดผลคอ SSS ในเลอด ในดนทดสอบ 83%100%และ 36% ตามล าดบและเมอเปรยบเทยบผลเฉพาะผปวย SSS และ ในเลอด RLEP จะมอตราการตรวจผปวย BI negative ไดดกวา 16S rRNA SodA และ rpoT จะเหน

ไดวาจากผลการทดสอบ RLEP มความจ าเพาะส าหรบการใชเนอเยอจาก SSS และในเลอด ผวจยจงเลอก RLEP เปนยนเปาหมายของการวจยครงน

บทท 3 วธการวจย

3.1 การคดกรองตวอยางและจ านวนประชากร

แพทยผท าการตรวจวนจฉยโรคเรอนหรอผเชยวชาญ เปนผคดกรองผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย (Paucibacillary) จ านวนตวอยางทใชในงานวจยนเนองจากเปนการศกษาวจยในเบองตน (preliminary research) และอตราความชกของผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอยรายใหมในประเทศไทยทผานมามจ านวนไมมากคอประมาณปละ 50 ราย สดสวนของประชากรของงานวจยน จงเลอกประชากรเพอน ามาวเคราะหจ านวน 10 รายซงจะเกบขอมลพนฐานคอ เพศ อาย เวลาในการอาศยอยรวมบานกบผปวยโรคเรอน

3.2 การทดสอบตวอยางเลอดของผปวยประเภทเชอนอย (paucibacillary, PB) โดยชดทดสอบภมคมกนวทยาชนดรวดเรว

3.2.1 ขนตอนการแยกน าเหลอง น าเลอดทเหลอจากการทดสอบในงานประจ าของผปวยน ามาทดสอบภายใน 2 ชวโมงโดยปน

เหวยงโดยใช Centrifuge ทความเรวรอบ 2,000 รอบตอนาทแยกเมดเลอดแดงออกจากน าเหลองแยกเอาเฉพาะน าเหลองเพอท าการทดสอบทางภมคมกนวทยาตอไป

กรณการรบเลอดทเหลอจากการทดสอบในงานประจ าของผปวยจากสถานทภายนอกสถาบนราชประชาสมาสย น าเลอดทไดมาออกจากกระตกเกบความเยนอณหภม 2-8 องศาเซลเซยส ตงทงไวทอณหภมหอง 15- 30 นาท กอนน าไปปนเหวยงโดยใชความเรวรอบ 2,000 รอบตอนาท แยกเอาเฉพาะน าเหลองเพอท าการทดสอบทางภมคมกนวทยาตอไป

3.3.2 วธทดสอบของชดทดสอบ

3.3.2.1 ดดน าเหลองทปนแยกเอาเมดเลอด แดงออกแลวดวย เครองดดอตโนมต จ านวน 10 ไมโครลตร ลงในชองใสน าเหลองของชดทดสอบ และใส Buffer ทมากบชดทดสอบจ านวน 100 ไมโครลตร ลงในชอง ชองใสน าเหลองเพอทดสอบ

3.3.2.2 ทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 10 นาท รออานผลทดสอบดวยตาเปลา ผลบวกคอ เกดเปนแถบเสนท เสนแถบทดสอบและเกดแถบเสนท เสนแถบควบคมคณภาพ

ผลลบคอไมเกดเปนแถบเสนท เสนแถบทดสอบ เกดแถบเสนท เสนแถบควบคมคณภาพ 3.3.3 วธการเพมจ านวนเชอ M.leprae ดวยวธ Polymerase Chain reaction (PCR) ตวอยางใบมดทไดจากวธ SSS ถกสงไปยงสถาบนเอกชน เพอท าการเพมจ านวนเชอโดยวธ

PCR ซงผลทไดเปนการยนยนการพบเชอ M. leprae โดยจะน าไปเปรยบเทยบกบผลทไดจากวธ Rapid serological test

ภาพท 3.1 แสดงสวนประกอบของชดทดสอบชนด Rapid serological test

ทมา Improvement of the stability of immune chromatographic assay for the quantitative detection

http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/ay/c4ay01173b#!divAbstract

ภาพท 3.2 ภาพแสดงการอานผลการทดสอบวธทดสอบภมคมกนวทยาชนดรวดเรว

3.3.3 วเคราะหผลการทดลอง

เปรยบเทยบผลการทดลองทไดจากชดทดสอบ Rapid serological test กบวธมาตรฐาน PCR

วหนง ผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอยของประเทศไทย

1.กระดาษกรอง เพอทดสอบดวยวธ Polymerase chain reaction

2.น าผลการทดสอบทไดมาเปรยบเทยบผลเปนรอยละ

บทท 4 ผลการวจยและอภปรายผล

4.1 การศกษาขอมลพนฐานของผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย

4.1.1 ผปวยจ านวน 10 ราย

เพศ ชาย 7 ราย

หญง 3 ราย

อาย 30 - 40 ป 4 ราย

40 – 50 ป 5 ราย

มากกวา 50 ป 1 ราย

ขอมลใกลชดรวมบานผปวยโรคเรอน

ไมอยรวมบานกบผปวยโรคเรอน 3 ราย

อยรวมบานกบผปวยโรคเรอน 7 ราย

4.2 ผลการทดสอบเปรยบเทยบการทดสอบแตละวธ

จากการทดสอบดวยชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรว เมอเทยบกบวธมาตรฐาน PCR พบวาจะใหผลบวกจรง (True positive) จ านวน 5 รายคดเปนรอยละ 50 และใหผลบวกปลอม (False positive) จ านวน 4 ราย คดเปนรอยละ 40 และใหผลลบปลอม (False negative) คดเปนรอยละ 10 เมอเทยบกบวธมาตรฐาน PCR

ตารางท 4.1 แสดงผลการทดสอบผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย ดวยวธการกรดผวหนง (SSS)

ชดตรวจทางภมคมกนชนดรวดเรว และ วธมาตรฐาน PCR

เบอร

ผล Slit Skin Smear

ผลการทดสอบ

apid Serological

ผล PCR

ใบมด SSS

ประวตรวมบานผปวย

มาก

กวา

10 ป

นอย

กวา

10 ป

ไมม

control POS POS POS /

control NEG POS NEG /

10 NEG POS POS /

20 NEG POS NEG /

30 NEG NEG POS /

40 NEG POS POS /

50 NEG POS NEG /

60 NEG POS NEG /

70 NEG POS NEG /

80 NEG POS POS /

90 NEG POS POS /

10 NEG POS POS /

4.3 การเปรยบเทยบผลการทดลองระหวางผล Slit skin smear กบ Rapid Serological test ไดผลดงน

จากผลการทดสอบผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย 10 ราย ท าการทดสอบดวยวธ Slit skin smearทงหมดใหผลเปนลบ และเมอท าการทดสอบดวยวธทดสอบ Rapid Serological test พบวา จ านวน 10 ราย ใหผลบวก 9 ราย

4.4 การเปรยบเทยบผลการทดลองระหวางผลการทดสอบ Rapid Serological test กบ Conversional PCR ไดผลดงน

จากผลการทดสอบผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย 10 ราย ท าการทดสอบดวยวธ Rapid Serological Testทงหมดใหผลเปนบวกรอยละ 90 และเมอท าการทดสอบดวยวธทดสอบ Conversional PCR พบวา จ านวน 10 ราย ใหผลบวก 5 ราย

ก าหนดใหผลการทดสอบดวยวธ Conversional PCR เปนวธทดสอบยนยนการตดเชอโรคเรอนพบวา

ไดผลบวกปลอม (False positive) 40 เปอรเซนต

ไดผลลบปลอม (False negative) 10 เปอรเซนต

4.5 ผลจากขอมลการอยรวมบานกบผปวยโรคเรอนและระยะเวลา

63 % ของผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย (PB) มประวตสมผสกบผปวยประเภทเชอมาก (MB)

9 % ของผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย (PB) มประวตสมผสกบผปวยประเภทเชอมาก (MB)

18 % ของผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย (PB) ไมมประวตสมผสกบผปวยโรคเรอน

บทท 5 สรปผลการวจยและขอเสนอแนะ

การศกษาวจยค รงนเปน การประเมนชดทดสอบทางภมคมกนวทยาอยางรวดเรว (Rapid Serological Test)เปนชดทดสอบคดกรองเบองตนในผปวยประเภทเชอนอยในกลมผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย (PB) เพราะกลมผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย (PB) สวนใหญมผลการทดสอบวธการกรดผวหนง (Slit skin smear) ใหผลลบหรออาจใหผลทไมชดเจน ซงการทดสอบนตองอาศยความช านาญของบคลากรในการกรดผวหนง การอานผลการทดสอบทถกตอง รวมถงการควบคมคณภาพสทนกรดทใชยอม (Zielh- Neelsen stain) ดงนนจงตองมการยนยนผลดวยวธมาตรฐาน Polymerase Chain Reaction (PCR) ซงเปนวธหาสารพนธกรรมหรอดเอนเอ (DNA) ของเชอ M.leprae เพอยนยนการพบเชอ โดยวธมาตรฐาน PCR นตองอาศยความช านาญของบคลากรในการทดสอบและแปลผล มราคาแพง ตองอาศยเครองมอทจ าเพาะและใชสารกอมะเรงงานวจยนจงไดท าการทดสอบประสทธภาพของชดตรวจทางภมคมกนวยาชนดรวดเรว เพอใชเปนการคดกรองผปวยประเภทเชอนอย (PB) ซงผปวยในกลมนใ หผลการตรวจดวยวธการกรดผวหนง (SSS) เปนลบ(1) เนองจากปรมาณเชอโรคเรอนบรเวณใตผวหนงมจ านวนไมเพยงพอทจะสามารถทดสอบปรมาณเชอมนอยกวา 104 ตวตอกรม (1) ชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรวเปนวธการทใชตรวจแอนตบอดทจ าเพาะตอแอนตเจน ชนด PGL-1 และ LID-1 (ML0405 ML2331) โดยจากผลทดสอบในงานวจยน ในผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอยจ านวน 10 ราย การทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรว สามารถคดกรองผปวยวาเปนบวกไดถง 9 ราย (90%)งานวจยนเมอเปรยบเทยบกบงานวจยของ Malcom S. และคณะ (21,22) ท าการวจยการตดเชอโรคเรอนในผปวย Cebu skin clinic ประเทศฟลปปนสโดยใชชดการทดสอบทางภมคมกนวทยา ชนดรวดเรวชนดเดยวกนในผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย (PB) จ านวน 19 รายใหผลการทดสอบบวกจ านวน 10 ราย (51%) แตเนองจากจ านวนผปวยทแตกต างกน ดงนนจ านวนผปวยททดสอบควรมจ านวนมากกวาน ผลการทดสอบอาจมการเปลยนแปลงได

ผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย (PB) จ านวน 10 รายใหผลบวกดวยวธทดสอบภมคมกนชนดรวดเรวซงเปนการตรวจทางภมคมกนวทยาไดในอตราสวนรอยละ 90 ในขณะทการทดสอบดวยวธ Conversional PCR ของการวจยทใชเปนวธยนยนการมเชอโรคเรอนหรอมชนสวนของ DNA ไดผลการทดสอบเปนบวกในอตรารอยละ 50 และพบผลบวกปลอม (False positive) 40 % ผลลบปลอม (False negative) 10 % จากผลการทดสอบทงสองวธจะเหนไดวา การทดสอบ

ดวยวธ ทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรวทผลการทดสอบเปนบวก แตเมอน ามาทดสอบดวยวธConversional 0PCR แลวใหผลการทดสอบเปนลบ (False negative) อาจเกดจากสาเหตจากความไวของชดทดสอบตอตวเชอในกลม Mycobacterium ซงในเอกสารของชดทดสอบไมไดระบ สงรบกวนการทดสอบ หรอ ในผปวยจ านวน 2 ราย (คดเปนรอยละ 10) ทเมอตรวจดวยวธการตรวจทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรวใหผลลบ แตเมอยนยนผลดวยวธมาตรฐาน PCR ผลทไดแสดงถงการใหผลลบปลอม (False negative) ซงผลลบน อาจเกดจากผปวยเพงไดรบเชอ M.leprae และรางกายยงไมไดสรางแอนตบอดตอตวเชอ ซงกรณนอาจจะเปนไปไดเนองจากการตดเชอโรคเรอนมระยะเวลาในการฟกตวนาน การด าเนนของโรคเปนไปอยางชาๆ หรอปจจยทชดทดสอบใชโปรตน ML0405 and ML2331 มาใช รวมกบ PGL-1 antigen ทน ามาจากแหลงระบาดของประเทศเวเนซเอราและประเทศบราซลทเลอกใชในงานวจยนท าใหมความไวสงมาก ตามการคดเลอกโดยใชโปรตนสงเคราะหจ านวน 21 ชนดทจ าเพาะกบเชอโรคเรอนประกอบดวย โปรตน ML0022 , ML0051 , ML0098 , ML0176 , ML0276 , ML0393 , ML0405 , ML0489 , ML0491 , ML0540 , ML0810 , ML0811 , ML0840 , ML1383 , ML1556 , ML1632 , ML1181 , ML1481 , ML1633 , ML1685 , ML2028 , ML2044 , ML2055 , ML2203 , ML2331 , ML2346 , ML2358 , ML2380 , ML2541, ML2603, ML2629, ML2655, and ML2659 พบวาโปรตนทมความไวและจ าเพาะส งสดไดแก ML0405 ML2331 และ ML2055จะเหนไดวาชดทดสอบใชแอนตเจน ML0405และML2311 (LID-1) ทงนความแตกตางของลกษณะพนธกรรมของการศกษาในประชากรทแตกตางคอชนผวขาว(Caucasian) มโอกาสเปนโรคเรอนไดมากทสด รองลงมาคอคนผวเหลอง (mongoloid) อนเดย และชนชาตแอฟรกาตามล าดบ และการแสดงออกของยนบางตวมผลตอความไวในการเกดโรคเรอน โดยมหนาทเกยวของกบการท างานของระบบภมคมกนตอเชอ การเกดการผาเหลาในบรเวณ HLA-DR2 และ HLA-DR3 ท าใหชนชาตเอเซยและอนเดยมความไวตอการเกดโรคเรอนชนด Tuberculoid และการเกดการผาเหลาบรเวณ HLA-DQ1เกยวของกบการเกดโรคเรอนชนด Lepromatous จะเหนไดวายนกมสวนประกอบในการเกดเปนโรคเรอนได ดงนนการทดสอบทางภมคมกนวทยาปจจบนจะอาศยประโยชนในการทดสอบทางภมคมกนวทยานอกเหนอจากโปรตนสงเคราะหดงกลาว จะนยมศกษาในยนทแตกตางกนโดยอาศยน าหนกโปรตนทยนผลตออกมา เชน 34 Kda (Gene ML0158) 35 Kda

MMP-1 (Gene ML0841 ESAT-6 Protein(Gene ML0050) 10  kDa Protein (Gene groES

ML0380 ) 15  kDa Protein (gene lsr2 ML0234) 18  kDa Protein(Gene hsp18 ML1795)

30  kDa Protein (gene ML0849) 45 kDa Protein(Gene ML0411) และ MMP-II (Bfr) Proteingene bfrA (ML2038) or pseudogene bfrB (ML0075) ดงนนจะเหนไดวาการทดสอบทางภมคมกนวทยามความหลากหลายการใชแอนตเจนเปนตวกลางในการทดสอบระดบภมคมกน

ประโยชนในการทดสอบเปนไปตามความเหมาะสมของการทดสอบ เชนการทดสอบเพอการคดกรอง การทดสอบเพอหาความแตกตางของระดบแอนตบอดของชนดหรอประเภทของผปวยโรคเรอน จากวตถประสงคหลกของงานวจยนคอเพอประเมนชดทดสอบการตดเชอโรคเรอนประเภทเชอนอย (PB) เปนชดทดสอบเพอคดกรอง (Screening test)ในหองปฏบตการนอกเหนอจากวธมาตรฐานท WHO แนะน าคอ การกรดผวหนง SSS เพอประเมนจ านวนตวเชอและรปรางลกษณะเชอการทดสอบภมคมกนชนดรวดเรว ในงานวจยนจะมความไวสงเมอเทยบกบการทดสอบยนยนการตดเชอConversional PCR แตมความจ าเพาะต า จงนาจะเปนประโยชนในการคดกรองชวยแพทยวนจฉยในรายทผปวยทมารบการรกษาทมอาการทางคลนกไมชดเจนคลมเครอ กอนทผปวยท าการกรดผวหนงทมความเจบมากกวาการเจาะเลอดและลดการรอคอยเนองจากการสงตอทางพยาธวทยาเพ อยนยนตอไป

5.2 ขอเสนอแนะ

จากงานวจยนจ านวนประชากรผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย (PB) ทใชในการประเมนชดทดสอบมจ านวนนอย เนองจากปรมาณการพบผปวยในกลมนมจ านวนไมมากแตในการประเมนชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรว (Rapid Serological Test)ในกลมผปวยโรคเรอนประเภทเชอมาก (MB) นาจะไมเกดประโยชนนกเพราะผปวยโรคเรอนประเภทเชอมาก การแสดงอาการของโรค เชน ทต าแหนงผวหนง เสนประสาท จะมลกษณะชดเจนทางดานคลนก ซงแพทยผท าการวนจฉยสามารถวนจฉยตามอาการลกษณะทพบได ดงนนการเกดประโยชนในการใชชดทดสอบประเภทนนนคอใชเปนชดทดสอบเบองตน (Screening test) ทสะดวกและรวดเรวในกลมการคดกรองผปวยทคลมเครอเพอเฝาระวงโรคทรบการตรวจจ านวนมากและไมตองการเวลาในการรอคอยนานเชนการตรวจคดกรองส าหรบแรงงานตางดาวกอนเขาท างานในประเทศไทย การตรวจการตดเชอในภาคสนาม กอนทจะทดสอบวธการทเปนมาตรฐานตอไป แตการเลอกใชชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรว (Rapid Serological Test) มจ านวนหลายผลตภณฑ การเลอกใชชดทดสอบจะตองเลอกจากชดทดสอบทถกประเมนกอนทน าไปใชเพอใหเหมาะสมกบกลมประชากรทจะทดสอบ เพราะชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรวเหลาน ใชโปรตนในการท าชดทดสอบทแตกตางกน

เนองจากงานวจยนเปนการศกษาวจยในเบองตน (Preliminary research) เพอทดสอบความเปนไปไดของวธการทดสอบดงนนงานวจยนสงทตองท าการทบทวนถาจะมการทดสอบตอไปคอ จ านวนประชากร ระยะเวลาในการพบผปวยประเภทน การเกบตวอยางจากผรวมบานผปวย

(Close contact) เพอศกษาระดบภมคมกนวทยา การเกบขอมลในดานการตด เชอในกลม Mycobacterium ตวอนๆ ความแตกตางระหวางชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรวจากบรษททมมากกวาน และการวางแผนการด าเนนการเกบตวอยางทมระยะเวลาเหมาะสม

รายการอางอง

1. สถาบนราชประชาสมาสย กรมควบคมโรค คมอการวนจฉยและการรกษาโร คเรอน 2553; 1-69.

2. สถาบนราชประชาสมาสย กรมควบคมโรค รายงานอบตการณจากงานรกษาและปองกนควบคมโรคเรอน 2557; 24-27.

3. ส านกงานบรหารคนงานตางดาว กรมการจดหางาน กระทรวงแรงงาน เอกสารเผยแผ สถตรายปคนงานตางดาวประจ าป 2557.

4. Ridley DS. Histological classification and the immunological spectrum of leprosy. Bull World Health Organ 1974; 451.

5. Ridley DS, Jopling WH. Classification of leprosy according to immunity. A five-group system. Int J Lepr Other Mycobact 1966; 34: 255–273.

6. Monot MO. The origin of leprosy. Science 2005 ; 308: 1040 .

7. Malcom S.D. Use Protein Antigens for Early Serological Diagnosis of Leprosy: CVI. ASM; 2007; 11 1400-1408.

8. Hunglia E.M .Seroreactivity to new Mycobacterium leprae protein antigens in different leprosy-endemic regions in Brazil, Mem Inst Oswaldo Cruz 2012: 107.

9. สถาบนราชประชาสมาสย กรมควบคมโรคคมอการตรวจเชอโรคเรอนโดยวธกรดผวหนง (Slit-skin smear) พมพครงท 1 พ.ศ. 2547.

10. Thomas D. Armadillo exposure among Mexican – born patients with lepromatous leprosy. .J infect .1987; 156:990.

11. Truman R. Leprosy in wild armadillos. Lepr Rev 2005; 76: 198.

12. Shepard CC, McRae DH. A method for counting acid-fast bacteria. Int J Lepr Other Mycobact 1968; 36:78–82.

13. Meeker HC, Schuller-Levis G, Fusco F, Giardina-Becket MA, Sersen E, Levis WR. Sequential monitoring of leprosy patients with serum antibody levels to

phenolic glycolipid-I, a synthetic analog of phenolic glycolipid-I, and mycobacterial lipoarabinomannan. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 1990; 58:503–511.

14. Brennan PJ, Barrow WW. Evidence for species-specific lipid antigens in Mycobacterium leprae .Int J Lepr Other Mycobact Dis 1980; 48:382–387.

15. Woods SA, Cole ST. A rapid method for the detection of potentially viable Mycobacterium leprae in human biopsies: a novel application of PCR. FEMS Microbial Lett. 1989; 53:305–309.

16. Roselino AM. Biology molecular application dermatology. DBD. 2008; 83:187–203.

17. Roche PW, Theuvenet WJ, Britton WJ.Risk factors for type-1 reactions in borderline leprosy patients. Lancet.1991; 338:654–657.

18. Contin LA, Alves CJ, Fogagnolo L, Nassif PW, Barreto JA, Lauris JR, et al. Use do test ML-Flow a treatment hanseníase. ABD.2011; 86:91–95.

19. Meeker HC, Schuller-Levis G, Fusco F, Giardina-Becket MA, Sersen E, Levis WR. Sequential monitoring of leprosy patients with serum antibody levels to phenolic glycolipid-I, a synthetic analog of phenolic glycolipid-I, and mycobacterial lipoarabinomannan. Int J Lepr Other Mycobact Dis 1990; 58:503–511.

20. Yan Wen, Whole-blood nested-PCR amplification of M. leprae-Specific DNA for early diagnosis of leprosy, A J Trop Med Hyg. 2013; 88: 918–922.

21. Malcom SD. Rapid Quantitative Serological Test for Detection of Infection with Mycobacterium leprae, the Causative Agent of Leprosy,JCM. 2014; 52: 613–619.

22. Malcom SD. Use of Protein Antigens for Early Serological Diagnosis of Leprosy: CVI, ASM .2007; 14 : 1400-1408.

23. Nirmala L, Quantitative real-time PCR analysis of Mycobacterium leprae DNA and mRNA in humanbiopsy material from leprosy and reactional cases, JMM 2009; 58,753–759

24. Alejandra NM. PCR-based techniques for leprosy diagnosis: From the Laboratory to the clinic, PLoS Negl Trop Dis 2014; 8: e2655.

25. Ravindra PT. Comparative evaluation of PCR amplification of RFLP, 16SrRNA, rpoT and Sod A gene targets for detection of M.leprae DNA .JMM 2015; 54-59

สออเลกทรอนกส

1. Scollard DM. The Continuing Challenges of Leprosy; CMR.Apr.2006 , 344

2. Prasad C. Negative staining of mycobacteria - A clue to the diagnosis in cytological aspirates: Two case reports, ATMPH.Year: 2011; 4: 110-112

ภาคผนวก

ภาคผนวก ก

หนงสอแสดงความยนยอมเขารวมการวจยของอาสาสมครวจย

Informed Consent Form

ท าท.....................................................................

วนท............. เดอน....................... พ.ศ. ..............

เลขท อาสาสมครวจย…...................……

ขาพเจา ซงไดลงนามทายหนงสอน ขอแสดงความยนยอมเขารวมโครงการวจย

ชอโครงการวจย การประเมนการตรวจการตดเชอ Mycobacterium leprae ในผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย โดยชดทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรว

ผวจยนาย สทธศกด งามวชราพร ทอยทตดตอ สถาบนราชประชาสมาสย ต .พระประแดง อ.เมอง จ.สมทรปราการ

โดยขาพเจาไดรบฟงค าอธบายและเขาใจเปนอยางดเกยวกบการเปนอาสาสมครในโครงการวจยดงกลาวและไดทราบถงรายละเอยดโครงการประกอบดวย

- วตถประสงคและทมาของงานวจย รายละเอยดของการปฏบตขนตอนการเกบตวอยาง

- ประโยชนทจะไดจากการศกษาวจยในโครงการ

- ผลขางเคยงหรอความเสยงทอาจเกดขนแกขาพเจา

ขาพเจาจงสมครใจเขารวมในโครงการวจยน ตามทระบไวในเอกสารชแจงอาสาสมครวจยโดยขาพเจายนยอมใหใชเลอดและสงสงตรวจทเหลอจากการทดสอบในงานตรวจรกษาปกต เมอเสรจสนการวจยแลวเลอดและสงสงตรวจทเหลอของขาพเจา รวมถงขอมลทเกยวของกบอาสาสมครวจย จะถกท าลาย

ขาพเจามสทธถอนตวออกจากการวจยเมอใดกไดตามความประสงค โดยไมตองแจงเหตผลซงการถอนตวออกจากการวจยนน จะไมมผลกระทบในการรกษา ตอขาพเจาทงสน

ขาพเจาไดรบค ารบรองวา ผวจยจะปฏบตตอขาพเจาตามขอมลทระบไวในเอกสารชแจงอาสาสมครวจยและขอมลใดๆ ทเกยวของกบขาพเจา ผวจยจะเกบรกษาเปนความลบ โดยจะน าเสนอขอมลการวจยเปนภาพรวมเทานน ไมมขอมลใดในการรายงานทจะน าไปสการระบตวขาพเจา

หากขาพเจาไมไดรบการปฏบตตรงตามทไดระบไวในเอกสารชแจงอาสาสมครวจย ขาพเจาสามารถรองเรยนไดท: คณะอนกรรมการจรยธรรมการวจยในคน มหาวทยาลยธรรมศาสตร ชดท 3อาคารราชสดา ชน 1 ภายในศนยสงเสรมสขภาพ คณะพยาบาลศาสตร มหาวทยาลยธรรมศาสตร ศนยรงสต โทรศพท 02-986-9213 ตอ 7373โทรสาร 02-5165381

ขาพเจาไดลงลายมอชอไวเปนส าคญ ตอหนาพยาน ทงนขาพเจาไดรบส าเนาเอกสารขอมลส าหรบอาสาสมครวจย และส าเนาหนงสอแสดงความยนยอมเขารวมการวจยของอาสาสมครวจยไวแลว

ลงชอ.............................................................

(............................................. ...............)

ผวจยหลก

ลงชอ.........................................................

(.......................................................)

อาสาสมครวจย

วนท……..…/……….……./………… วนท……..…/……….……./…………

ลงชอ.........................................................

(........................................................)

พยาน

วนท……..…/……….……./…………

ภาคผนวก ข

ขอมลส าหรบอาสาสมครวจย

(Participant Information Sheet)

โครงการวจยท 005/2559

ชอเรอง การประเมนการตรวจการตดเชอ Mycobacteriun leprae ในผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอยโดยชดการทดสอบทางภมคมกนวทยาชนดรวดเรว

ชอเรอง (องกฤษ) Evaluation of infection Mycobacterium leprae in paucibacillary leprosy by Rapid Serological test

ชอผวจย นายสทธศกด งามวชราพร ต าแหนง นกเทคนคการแพทยช านาญการ

สถานทตดตอผวจย

(ทท างาน) งานเทคนคการแพทย กลมสนบสนนการรกษา สถาบนราชประชาสมาสย

(ทบาน) 69/117 ม.5 ต าบลเสมด อเมอง จ.ชลบร

โทรศพท (ทท างาน) 02-3868153 ตอ 244,245. โทรศพททบาน 038-385155

โทรศพทมอถอ 0917732193 E-mail: sutthisaklab@hotmail.com

ขอมลส าหรบอาสาสมครวจย

การเชญทานเขารวมในการวจยกอนททานจะตดสนใจเขารวมในการวจย มความจ าเปนททานควรท าความเขาใจวางานวจยนท าเพราะการวจยนจะใชสงสงตรวจ (เลอดและชนเนอ) ทเหลอจากการทดสอบในการตรวจปกตตามขนตอนการรกษาของแพทย กรณาใชเวลาในการอานขอมลตอไปนอยางละเอยดรอบคอบ และสอบถามขอมลเพมเตมหรอขอมลทไมชดเจนไดตลอดเวลา 1. เหตผลและความจ าเปนทเชญทานเขารวมการวจย

ปจจบนการตรวจวนจฉยโรคเรอนในหองปฏบตการในโรงพยาบาลจะใชวธการกรดผวหนงบรเวณตงหทงสองขางและบรเวณผนวง ดางขาวทไมมอาการชา หรอเปนบรเวณทรอยดางขาวไมมเหงอออกเปนหลก ผปวยทไดรบการวนจฉยวาเปนผปวยโรคเรอนประเภทเชอนอย โอกาสทจะพบเชอบรเวณรอยโรคของผปวยประเภทนมนอยเพราะจ านวนเชอโรคเรอนนอยตามปรมาณทเชออาศยทผวหนงและเสนประสาทสวนปลาย ปจจ บนมวธทดสอบภมคมกนวทยาอยางรวดเรวทพฒนา

มาจากชดทดสอบเดมสามารถชวยตรวจวนจฉยไดแมนย ายงขน โดยใชเลอดมาท าการทดสอบเหมอนการตรวจทางภมคมกนทวไป ประโยชนของการตรวจวธนคอผปวยจะลดความกลวการกรดผวหนง เพราะการเจาะเลอดเปนวธการเ กบตวอยางทสะดวกกวา ดงนนวตถประสงคของการวจยเมองานวจยส าเรจลลวงคอจะไดทราบความแมนย าและความไวของชดทดสอบใหม เพอมาใชประกอบการตรวจวนจฉยโรคเรอนในหองปฏบตการ ประโยชนของผลการวจยนจะมประโยชนตอสงคมโดยรวมในการตรวจวนจฉยโรคเรอนประเภทเชอนอยตอไป 2. รายละเอยดของอาสาสมครวจย

ลกษณะของอาสาสมครจะเปนผปวยทแพทยรวมวจยวนจฉยวาเปนผปวยประเภทเชอนอย โดยมการคดเลอกดงน

2.1 ไมจ ากดเพศ แตตองมอายมากกวา 18 ปขนไป

2.2 เปนผมสญชาตไทย

2.3 จ านวนของอาสาสมครจ านวน 10 ราย

3.กระบวนการการวจยทกระท าตออาสาสมครวจย

3.1 แพทยผเขารวมโครงการวจย คอ พ .ญ.กลประภสสร ไปรยา ยตากล ตรวจวนจฉยแลววาอาสาสมครเปนผปวยโรคเรอนชนดเชอนอย และเมออาสาสมครเขาใจถงวตถประสงคงานวจย จะสงตอมาหองปฏบตการเพอเกบสงสงตรวจเหมอนผปวยโรคเรอนทวไป

3.2 การเกบเลอดเพอตรวจจะใชเลอดจากทเหลอในงานประจ า ไมมการเจาะเพมโดยเดดขาด รวมถงการกรดผวหนงจะไมกรดเกนมาตรฐานก าหนดส าหรบผปวยประเภทเชอนอยคอ 3 ต าแหนงและจะไมใชประโยชนนอกเหนอจากงานวจยน

3.3 ความเสยงทอาจจะเกดขนไดในขนตอนการเกบตวอยางประกอบดวยการกรดผวหนงและการเจาะเลอด

การกรดผวหนง ขนตอนปกตจะกรดทผวหนง ความยาว 5 มลลเมตร และความลก 2 มลลเมตร และเกบสงสงตรวจมายอมสเพอตรวจหาเชอโรคเรอนโดยตรง โดยโอกาสทจะมเลอดออกมาไดหลงการกรด โดยปกตเลอดจะหยดภายใน 5 นาท ดงนนอาสาสมครงานวจยตองไมเอาส าลออกกอนทเลอดหยดไหล กรณเลอดยงไหลอยเกน 5 นาทใหอาสาสมคร ตดตอหองปฏบตการเพ อท าการแกไข

การเจาะเลอด ผปวยทเจาะเลอด อาจจะมความเสยงในการทเลอดออกใตผวหนง เนองจากการเจาะเลอดทปลายเขมทะลเลยเสนเลอด ดงนนจะท าใหบรเวณรอบรอยเจาะเลอดจะมสเขยวคล า ภายใน 24 ชวโมงแรกแนะน าใหอาสาสมครประคบดวยความเยน และรอยเขยวค ล าจะลดลงอาจจะใชเวลาเปนสปดาห

3.4 การขอขอมลผปวยจะขอ อาย เพศ และจ านวนผรวมบานเทานนเมอเสรจสนการวจยแลวขอมลทงหมดทเกยวของกบอาสาสมครวจยจะถกท าลาย

3.5 อาสาสมครทเขาโครงการวจยนจะไมไดรบคาตอบแทน เปนลกษณะการท าประโยชน เพอสงคม

4. กระบวนการใหขอมลแกอาสาสมครวจย

4.1 ก าหนดใหนกเทคนคการแพทยใหขอมลส าหรบอาสาสมครวจย

4.2 ถาอาสาสมครวจย อานไมออก เขยนไมได นกเทคนคการแพทยตองอานและอธบายตามรายขอ

5 งานวจยนการขอขอมลจากเวชระเบยน ตองไดรบการอนมตจาก ผอ านวยการโรงพยาบาลเทานน

6. การเขารวมในการวจยของทานเปนโดยสมครใจ และสามารถปฏเสธทจะเขารวมหรอถอนตว จากการวจยไดทกขณะ โดยไมตองใหเหตผลและไมสญเสยประโยชนทพงไดรบ

7. หากทานมขอสงสยใหสอบถามเพมเตมไดโดยสามารถตดตอผ วจยไดตลอดเวลา และหากผวจยมขอมลเพมเตมทเปนประโยชนหรอโทษเกยวกบการวจย ผวจยจะแจงใหทานทราบอยางรวดเรวเพอใหอาสาสมครวจย ทบทวนวายงสมครใจจะอยในงานวจยตอไปหรอไม

8.ขอมลทเกยวของกบทานจะเกบเปน ความลบ หากมการเสนอผลการวจยจะเสนอเปนภาพรวม ขอมลใดท สามารถระบถงตวทานไดจะไมปรากฏในรายงาน

และหากทานไมไดรบการปฏบตตามขอมลดงกลาวสามารถรองเรยนไดท : คณะอนกรรมการจรยธรรมการวจยในคน มหาวทยาลยธรรมศาสตร ชดท 3 อาคารราชสดา ชน 1

ภายในศนยสงเสรมสขภาพ คณะพยาบาลศาสตร มหาวทยาลยธรรมศาสตร ศนยรงสต โทรศพท 02-986-9213 ตอ 7373 โทรสาร 02-5165381

ประวตผเขยน

ชอ นายสทธศกด งามวชราพร

วนเดอนปเกด

วฒการศกษา

17 มนาคม พ.ศ. 2515

วทยาศาสตรบณฑต (เทคนคการแพทย)

ต าแหนง

ทนการศกษา

ผลงานวชาการ

นกเทคนคการแพทยช านาญการ

ทนสนบสนนการวจยจากเงนทนกองทนวจย

มหาวทยาลยธรรมศาสตร ประจ าปงบประมาณ 2559

การตรวจการตดเชอซฟลสดวยชดทดสอบ determine anti –TP เปรยบเทยบกบวธ RPR ในซรม ทสถาบนราช

ประชาสมาสย . 2555

การเปรยบเทยบการตรวจกลโคสดวยเครองตรวจวเคราะหกงอตโนมต Liasys กบ A15 biosystem,2554

ประสบการณการท างาน 2536-2540 หองปฏบตการแบคทเรย

โรงพยาบาลศนยชลบร

2541-2554 หองปฏบตการโรคตดตอทาง

เพศสมพนธ

ส านกงานปองกนควบคมโรคท 3 ชลบร

2555- ปจจบน หองปฏบตการงานเทคนคการแพทย

สถาบนราชประชาสมาสย