พันธุ โมเลกุศาสตรลเบื้ (258444) องต...

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุล ิ

1

บทที่ 6 กระบวนการแปลรหัสของเอ็มอารเอ็นเอ

(Translation of mRNA)

คํานํา กระบวนการแปลรหัสหรือกระบวนการสังเคราะหโปรตีน (protein synthesis หรือ translation) คือการแปลขอมูลหรือรหัสพันธุกรรม (genetic code หรือ codon) ตางๆ ที่อยูบนโมเลกุลเอ็มอารเอ็นเอ (mRNA) ใหเปนโปรตีนชนิดตางๆ รหัสพันธุกรรมเหลานี้ก็คือลําดับไรโบนิวคลีโอโทดที่อยูภายในโมเลกุล mRNA ที่มีการจัดเรียงตัวกันอยางเปนระบบ เพื่อทําหนาที่กําหนดลําดับและชนิดของ กรดอะมิโนภายในสายโพลีเปปไทดในขณะที่เกิดการแปลรหัส โปรตีนที่เปนผลผลิตจากยีนนั้นถูกกําหนดใหสังเคราะหโดยลําดับนิวคลีโอไทดบนดีเอ็นเอตรงตําแหนงของยีนที่มีการแสดงออก ซ่ึงช้ีใหเห็นวาลําดับนิวคลีโอไทดภายในยีนมีความสัมพันธโดยตรงกับการจัดลําดับของกรดอะมิโนภายในสายไพลีเปปไทด เรียกความสัมพันธนี้วา colinearity จากการศึกษาแผนที่ยีนของโปรคารีโอตพบวายีนและผลผลิตของยีนมีความสัมพันธกับแบบ colinearity แตในยูคารีโอตความสัมพันธแบบ colinearity ถูกขัดขวางโดย intron ที่อยูภายในยีน ซ่ึงจะถูกขจัดออกไปในขั้นตอน post-transcription รหัสพันธุกรรม 1 รหัส คือกลุมของลําดับเบส 3 ลําดับ ที่เรียงติดตอกนัภายในโมเลกุล mRNA ซ่ึงอาจเรียกรหัสพันธุกรรมวา codon หรือ triplet code โดยแตละรหัสพันธุกรรมจะเฉพาะเจาะจงกับกรดอะมิโนแตละชนิดภายในโมเลกุลของโปรตีน เนื่องจากภายในโมเลกุล mRNA ประกอบดวยเบส 4 ชนิด คือ อะดีนีน (A) , ยูราซีล (U) , กัวนนี (G) และไซโตซีน (C) และในแตละรหัสพันธกุรรมประกอบดวยเบส 3 ลําดับ ดังนั้นจํานวนของรหัสพนัธุกรรมทั้งหมดมีเทากับ 43 หรือ 64 รหัสพันธุกรรม แตมีเพียง 61 codons เทานัน้ที่สามารถแปลรหัสใหเปนกรดอะมิโน 20 ชนิด เรียกรหัสเหลานี้วา sense codon สวนอีก 3 codons เปนรหัสหยุด หรือ nonsense codon ซ่ึงรหัสเหลานี้ชวยใหเกิดการสิ้นสุดการสังเคราะหโปรตีน (ตารางที่ 6.1) ตามหลักสากลไดมีการกําหนดอักษรยอแทนกรดอะมิโน (amino acid abbreviation) และใชภาษาอังกฤษตวัใหญแทนกรดอะมิโน (assigned english letters) ทั้ง 20 ชนิด ซ่ึงสามารถแสดงไดดัง ตารางที่ 6.2


2

ตารางที่ 6.1 แสดงรหัสพันธุกรรม

(ที่มา : http://bcs.whfreeman.com/thelifewire/content/chp12/f12005.gif)

ตารางที่ 6.2 แสดงอักษรยอ รหัสพันธุกรรม และชื่อยอ ของกรดอะมิโนทั้ง 20 ชนิด

(ที่มา : http://www.woodrow.org/teachers/bi/1994/rna_codes_table.gif)


3

คุณสมบัติของรหัสพันธกุรรม

1. รหัสพันธุกรรม (triplet หรือ codon) 1 รหัส ประกอบดวยลําดับเบส 3 ตัว เรียงติดตอกันบนสายเอ็มอารเอ็นเอ

2. ไมมีการเวน (commaless) ไรโบโซม (ribosome) จะอานรหัสพันธุกรรมอยางตอเนื่องครัง้ละ 3 นิวคลีโอไทด โดยไมมกีารเวน (commaless) หรือขามนิวคลีโอไทดระหวางรหสั

3. รหัสพันธุกรรมไมมีการเหลื่อมซอนกัน (non overlapping) ในกระบวนแปลรหสั พบวารหัสพันธุกรรมจะถูกอานเรยีงตอกนัอยางเปนลําดับๆ ละ 3 เบส นับตั้งแตจุดเริ่มตนโดยไมมกีารอานการเหลื่อมซอนกันของเบสที่อยูตางรหัสพันธุกรรมกัน เชน ลําดับ 5/ AAG AAG AAG 3/ ของ mRNA จะถูกแปลรหสัออกมาเปนกรดอะมิโน lysine-lysine-lysine 3 โมเลกุล ติดตอกัน

4. เปน degenerate code มีรหัสพันธุกรรมมากกวา 1 รหัส ที่กําหนดกรดอะมิโนชนิดเดยีวกนั เรียกรหัสเหลานี้วา degenerate code หรืออาจจะเรยีกวา synonyme code เชน กรดอะมิโน leucine มีรหัสพันธุกรรม 6 รหัส ไดแก CUU, CUC, CUA, CUG, UUA และ UUG

5. รหัสหยุดการสังเคราะหโปรตีน (stop codon) รหัสพันธุกรรม 3 รหัส คือ UAA (ochre), UAG (amber) และ UGA (opal) เปนรหัสหยุดการสังเคราะหโปรตีน (stop codon หรือ nonsense codon หรือ termination codon) ซ่ึงรหัสเหลานี้ชวยใหเกิดการสิ้นสุดการสังเคราะหโปรตีน คือไมสามารถถอดรหัสออกมาเปนกรดอะมิโนได

6. รหัสพันธุกรรมสวนใหญเปนสากล (universal codon) พบวารหัสพนัธุกรรมของสิ่งมีชีวิตเกือบทั้งหมดจะเหมือนกัน ยกเวนรหสัพันธุกรรมทีพ่บในไมโตคอนเดรยีของสิ่งมีชีวิตชัน้สูงบางชนิด ตัวอยางเชนภายในนวิเคลยีสรหัสพนัธุกรรม UGA เปนรหัสหยุด แตภายในไมโตคอนเดรยีของมนษุยจะเปนรหัสของกรดอะมิโนทรปิโตเฟน (tryptophane) สวนรหัส AUA และ AGA ภายในนวิเคลยีสจะเปนรหัสของกรดอะมิโนอะจนิีน (arginin) แตภายในไมโตคอนเดรยีจะใชเปนรหัสหยดุ หรือรหัส AUA ภายในนวิเคลียสจะเปนรหัสของกรดอะมิโนไอโซลวิซีน (isoleucine) แตภายในไมโตคอนเดรียจะเปนรหัสของกรดอะมิโนเมทไทโอนิน (methioine)

7. เปน ambigunous code คือรหัสพันธุกรรม 1 รหัสสามารถกําหนดใหเปนกรดอะมิโนไดมากกวา 1 ชนิด เรียก ambigunous code โดยความจริงแลวยังไมสามารถบงชี้ไดแนชัด เพราะรหัสดังกลาวมีการแสดงออกที่คลุมเครือ เชน รหัส AUG เปนรหัสเริ่มตนบนสาย mRNA ถูกกําหนดใหเปนรหัสของกรดอะมิโน N-formylmethionine แตถาเปนรหัส AUG ที่อยูภายในสาย mRNA จะถูกกําหนดใหเปนรหัสของกรดอะมิโนเมทไทโอนีน (methionine) ปกต ิ


4

การเขาคูกันระหวาง codon กับ anticodon โดยปกติการเขาคูกันระหวาง tRNA anticodon กับ codon ที่อยูภายในโมเลกุล mRNA จะมีความสัมพันธกันแบบ antiparallel relationship (ภาพที่ 6.1) แตเพื่อเปนการชดเชยใหกับความเปน degeneracy ของรหัสพันธุกรรม จึงมีโมเลกุล tRNA บางชนิดสามารถเขาคูกับ codon ภายในโมเลกุล mRNA ไดมากกวา 1 รหัส ซ่ึงถือวาเปนวิธีการทดแทนที่ไดเปรียบมาก เพราะมิฉะนั้นแลวโมเลกุล tRNA ที่แตกตางกันจะตองถูกสรางขึ้นอยางมากมายเพื่อใหเฉพาะเจาะจงกับรหัสพันธุกรรมแตละรหัส สาเหตุที่ทําใหเกิดการ degeneracy ของรหัสพันธุกรรมไดคือ 1) เบส 2 ลําดับแรกของ codon และเบส 2 ลําดับสุดทายของ anticodon จะเขาคูกนัไดอยางปกติ เชน G เขาคูกับ C และ A เขาคูกับ U 2) การเขาคูกนัของเบสลําดับที่ 3 ของ anticodon มีความเฉพาะเจาะจงนอยมาก ดวยเหตนุี้จึงยอมใหโมเลกลุ tRNA บางชนิดเขาคูกับ codon ไดมากกวา 1 รหัส

ภาพที่ 6.1 ทิศทางการเขาคูกันระหวาง codon กับ anticodon (ที่มา : http://opbs.okstate.edu/~petracek/Chapter%2027%20Figures/Fig%2027-08a.GIF )

Wobble hypothesis

Crick (1966) ตั้งสมมติฐานที่เรียกวา Wobble hypothesis เพื่ออธิบายถึงเหตุผลที่วามีรหัสพันธุกรรมหลายรหัสที่กําหนดกรดอะมิโนชนิดเดียวกัน (degeneracy) ซ่ึงมีสาเหตุมาจากการเปลี่ยนแปลงการเขาคูที่ผิดปกติของเบสตําแหนงที่ 3 ของ codon บน mRNA กับเบสตําแหนงที่ 1 ของ anticodon บน tRNA ซ่ึงการเขาคูกันของเบสที่ผิดปกตินี้ทําใหเบสเขาคูกันบางสวนเทานั้น เพราะวาลําดับเบสที่เปน anticodon ถูกบรรจุอยูภายในหวงของ anticodon (anticodon loop) ของโมเลกุล tRNA


5

มีความยืดหยุนสูงมาก และเปนสวนของ single-strand RNA loop ทําใหการเขาคูกันระหวางเบสของ anticodon กับ codon จึงไมจําเปนตองมีโครงสรางเหมือนกับ double-helix ในดีเอ็นเอ ดังนั้น Crick จึงไดเสนอเกณฑการเขาคูกันของเบสตําแหนงที่ 3 ของ codon หรือตําแหนงที่ 1 ของ anticodon หรือเรียกวาตําแหนง วอบเบิล (wobble position) ไวดังนี้คือ (ภาพที่ 6.2 และตารางที่ 6.3) 1. เมื่อเบสตําแหนงที ่ 1 ใน anticodon เปนเบส C หรือ A จะเขาคูกนักับเบสลําดบัที่ 3 ของ codon ไดตามปกติ คือเบส G หรือ U ตามลําดับ (ภาพท่ี 6.3) 2. เมื่อเบสตัวแรกใน anticodon เปนเบส U พบวาสามารถเขาคูกับเบสลําดับที่ 3 ของ codon ชนิดใดก็ไดทีอ่ยูในกลุมของพิวรีน(purine) คือ A หรือ G (ภาพที่ 6.3) 3. เมื่อเบสลําดับแรกของ anticodon เปนเบส G แลว เบสลําดับที่ 3 ของ codon สามารถที่จะเขาคูกับเบสไพรมิิดีน (pyrimidine) คือ U หรือ C ชนิดใดกไ็ด (ตารางที่ 6.3) 4. เมื่อเบสลําดับแรกใน anticodon เปนเบส inosine (I) สามารถเขาคูกับเบสลําดับที่ 3 ของ codon ที่เบสชนิดใดก็ได เชน เบส A, C หรือ U (ภาพที่ 6.3)

ตารางที่ 6.3 สรุปการเขาคูกันระหวางเบสที่อยูในตําแหนง Wobble (จาก Russell, 1996)

เบสท่ีปลาย 5/PO4 ของ anticodon (หรือเบสตําแนงท่ี 1 ของ tRNA)

เบสท่ีปลาย 3/OH ของ Codon (หรือเบสตําแนงท่ี 3 ของ mRNA)

G can pair with U or C C can pair with G A can pair with U U can pair with A or G

I (inosine) can pair with A, U, or C


6

รูปท่ี 6.2 ตําแหนง Wobble ของเบส U บน anticodon (ที่มา : http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/Lodish/Lod4-32.jpg)

ภาพที่ 6.3 แสดงการเขาคูกนัระหวางเบส inosine (I) กับเบส C, U, A และ G (ที่มา : http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/Stryer/Stryer_F34-16.jpg)


7

ขั้นตอนของกระบวนการแปลรหัส โมเลกุลของอารเอ็นเอที่สังเคราะหมาจากดีเอ็นเอโดยผานกระบวนการลอกรหัส สามารถแบง

ออกเปน 3 ชนิด ไดแก ribosomal RNA (rRNA), transfer RNA (tRNA) และ messenger RNA (mRNA) ซ่ึง rRNA และ tRNA นั้นเปนผลผลิตสุดทายในการแสดงออกของยีน (final product of gene expression) สวน mRNA ตองผานกระบวนการแปลรหัสเพื่อสังเคราะหโปรตีนหรือสายโพลีเปปไทดซ่ึงเปนผลผลิตสุดทายในการแสดงออกของยีน ถึงแมโมเลกุลของ rRNA และ tRNA ไมไดถูกแปลรหัสออกมาเปนโปรตีน แตทั้ง rRNA และ tRNA ก็มีสวนเกี่ยวของกับกระบวนการสังเคราะหโปรตีน โดยตรง ซ่ึงกระบวนการสังเคราะหโปรตีนของโปรคารีโอตไดถูกใชเปนตนแบบสําหรับอธิบายถึงกระบวนการสังเคราะหโปรตีนของสิ่งมีชีวิตทั้งหมด โดยมีขั้นตอนของกระบวนการแปลรหัสดังนี้ 1. การกระตุนใหกรดอะมิโนมาเชื่อมตอทีป่ลาย 3/ tRNA (The amino acid activation) 2. การเริ่มตนการสังเคราะหสายโพลีเปปไทด (Initiation of polypeptide chain) 3. การขยายยาวของสายสายโพลีเปปไทด (Elongation of polypeptide chain)

4. การสิ้นสุดการสังเคราะหสายโพลีเปปไทด (Termination of polypeptide chain)

การกระตุนกรดอะมิโนใหเชื่อมตอกับโมเลกุล tRNA (Activation of amino acid) การกระตุนใหกรดอะมิโนมาเชื่อมตอกับโมเลกุลของ tRNA เพื่อใหเกดิเปน adaptor molecule

หรือ aminoacylated tRNA หรืออาจเรียกวา charged tRNA ซ่ึง tRNA แตละโมเลกุลจะมีความเฉพาะเจาะจงกับกรดอะมิโนแตละชนดิ กรดอะมิโนจะใชพันธะโควาเลนทเขาจับกับ tRNA ที่ปลาย 3/OH ที่ตําแหนงเบส A โดยอาศัยเอนไซม aminoacyl-tRNA synthetase เปนตัวเรงปฏิกิริยา ดังสมการ ซ่ึงขั้นตอนนี้เกิดขึ้น cytoplasm (ของ eukaryote)

Mg2+

Amino acid + tRNA + ATP Amino acyl-tRNA + AMP + PPi amino acyl-tRNA synthetase

ปฏิกิริยานี้แบงเปน 3 ขั้นตอน (ภาพที่ 6.4) คือ 1. การเกิดโครงสราง aminoacyl-adenylic complex หรือ aminoacyl adenylic acid (aminoacyl-AMP) โดยกรดอะมิโนเขาทําปฏิกิริยากับ ATP ที่คารบอนตําแหนง C ที่ 5 ของน้ําตาลไรโบส แลวกรดอะมิโนเขาแทนที่ pyrophosphate (PPi) ) กลายเปน amino acyl adenylic acid ดังสมการ


8

aminoacyl-tRNA ATP + Amino acid Aminoacyl-AMP + PPi

synthetase (หรือ activated amino acid) (หรือ aminoacy –AMP)

2. เกิด aminoacyl-tRNA (ภาพท่ี 6.5) โดย aminoacy group เคล่ือนจาก aminoacyl-AMP ไป

จับกับ tRNA ที่ตําแหนง C ตําแหนงที ่ 3 ของน้ําตาลไรโบสกลายเปน aminoacyl-tRNA หรือ charged tRNA + AMP

aminoacyl-tRNA

synthetase Aminoacyl-AMP + tRNA Aminoacyl-tRNA + AMP

ไดผลรวมของปฏิกิริยาดังนี ้

Amino acid + ATP + tRNA Aminoacyl-tRNA + PPi + AMP 3. PPi ของ ATP ถูกไฮโดรไลซแตกตัวเปนหมูฟอตเฟสอิสระ 2 หมู ทําใหไดพลังงานสูงที่สามารถนําไปใชในการสราง aminoacyl-tRNA ไดเพยีง 1 ตัวเทานั้น อยางไรก็ตามในการเกดิปฏิกริิยาจําเปนตองอาศัย Mg2+ เปนตัวกระตุนใหเกิดการทํางานของเอนไซม aminoacyl-tRNA synthetase ควบคูไปดวยทุกครั้ง

คุณสมบัติเอนไซม aminoacyl-tRNA synthetase (หรือ aminoacyl-tRNA ligase)

1. เอนไซม tRNA synthetase แตละชนดิจะมีความแตกตางกันทั้งน้ําหนักโมเลกุล ปริมาณองคประกอบยอย และองคประกอบของกรดอะมิโน 2. เอนไซม tRNA synthetase แตละชนิดมคีวามเฉพาะเจาะจงตอการนาํกรดอะมิโนแตละชนิดใหเขาจับกับโมเลกุล tRNA แตละโมเลกุล เพื่อทําใหการสังเคราะหโปรตีนเปนไปอยางถูกตอง ส่ิงที่นาสังเกต ก็คือในการสังเคราะหโปรตีน codon ตางๆ ที่อยูภายในโมเลกลุ mRNA จะถูกจดจําโดยโมเลกุล tRNA เทานั้น ยิ่งไปกวานั้น codon ตางๆ ไมไดสัมผัสกับกรดอะมโินเลย ดังนั้นถาเอนไซม tRNA synthetase มิไดมีความเฉพาะเจาะจงสูงมาก ก็อาจทําใหเกิดความผิดพลาดในการสังเคราะหโปรตีนได 3. การจําแนกชนิดกรดอะมโิน (selectivity) เอนไซม tRNA synthetase มีความเฉพาะเจาะจงสูงมาก เนื่องจากเอนไซม tRNA synthetase มีความสามารถในการจําแนกชนิดของกรดอะมิโนได


9

ถูกตอง ซ่ึงถือวาเปนสวนหนึ่งในปฏิกริิยาของเอนไซมเพื่อกระตุนใหกรดอะมโินเขาจับกับโมเลกุล tRNA ใหอยางถูกตอง 4. มีความสามารถในการตรวจสอบชนิดของกรดอะมิโน (proofreading capability) ในกรณีที่เกิดความผดิพลาดเอนไซม tRNA synthetase ไปกระตุนกรดอะมิโนผิดชนิด หรือนํากรดอะะมิโนผิดชนิดเขามาเชื่อมตอกับโมเลกลุ tRNA พบวาเอนไซม tRNA synthetase สามารถที่จะขจัดกรดอะมโินที่ไมถูกตองออกจากโมเลกุล tRNA ไดโดยกระบวนการไฮโดรไลซีส (hydrolysis)

ภาพที่ 6.4 ขั้นตอนการสังเคราะห aminoacyl-tRNA

(ที่มา : http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/MVH/MVH_fi27p10.gif)


10

ภาพที่ 6.5 ขั้นตอนการสังเคราะห Alanyl-tRNA

(ที่มา : http://www.shingu.ac.kr/~dolchoi/lc_bc/382_1.gif)

การสังเคราะหโปรตีนในโปรคารีโอต (Protein synthesis in prokaryote) I. ข้ันตอนการเริ่มตนกระบวนการสังเคราะหโปรตีน (Initiation of polypeptide chain)

การสังเคราะหโปรตีนมีปจจยัที่จําเปนในขัน้ตอนการเริ่มตนการแปลรหัส ดังนี ้ 1. Ribosome ขนาด 70S ประกอบดวย 2 หนวยยอย คือ 50S และ 30S โดย 50S = 5S rRNA +

23S rRNA + 34 proteins สวน 30S = 16 S rRNA + 21 proteins (ภาพท่ี 6.6) โดยปกติไรโบโซมที่อยูภายในเซลลเกอืบทั้งหมดจะรวมตัวกันเปนอนุภาคขนาด 70S ดังนั้นการที่จะทําใหอนุภาคของ 70S แยกออกจําเปนตองอาศัย initiation factor (IF) ชนิด IF-1 และ IF-3 โดยที่ IF-3 เปนตัวปองกนัไมให 30S และ 50S subunit กลับเขามารวมกัน สวน IF-1 เปนตัวกระตุนใหอัตราการเกิดปฏิกิริยาเพิ่มขึน้


11

ภาพที่ 6.6 องคประกอบของไรโบโซมของ E. coli (ที่มา : http://www.riboworld.com/50s/50sbau.jpg)


12

2. mRNA ที่เปนแมแบบในการแปลรหัส ซ่ึงมีทิศทางจาก 5/→3/ โดยท่ีบริเวณปลาย 5/PO4 ของ mRNA มีตําแหนงของ Shine Dalgarno sequence ซ่ึงมีเบสที่เปนคูสมกับสําดับเบสที่ปลาย 3/OH ของ 16S rRNA ที่เปนองคประกอบของไรโบโซมขนาด 30S (ภาพท่ี 6.7)

ภาพที่ 6.7 ลําดับเบสของ ribosome-binding sites/Shine-Dalgarno sequence ที่ปลาย 5/ ของ mRNA (ที่มา : http://opbs.okstate.edu/~petracek/Chapter%2027%20Figures/Fig%2027-23.GIF)

(ที่มา : http://opbs.okstate.edu/~petracek/Chapter%2027%20Figures/Fig%2027-23.GIF) 3. Initiation factor (IF) ชนิดตางๆ ไดแก IF-1, IF-2, IF-3 และ gaunosine triphosphate (GTP)

4. Formylmethionine–tRNA หรือ fmet-tRNAf เปนตัวเริ่มตนในกระบวนการแปลรหัส โดย

fmet-tRNAf ทําหนาที่นํากรดอะมิโน methionin (fmet) ที่ผานการดัดแปลงแลว เขามาภายในโครงสราง

เชิงซอน 30S initiation complex สําหรับโมเลกุล tRNAf จะแตกตางจากโมเลกุล tRNA ปกติที่ทําหนาที่นํากรด methionine เติมเขาไปในสายโพลีเปปไทด แตทวาโมเลกุล tRNA ทั้ง 2 ชนิดนี้จะมีเอนไซม aminoacyl-tRNA synthetase ชนิดเดียวกันทําหนาที่เชื่อมตอกรดอะมิโน methionine เขากับปลาย 3/ adenosine นอกจากนี้ยังมีเอนไซม transformylase ทําหนาที่เติมหมู formyl จาก N10-formyltetrahydrofolat เขาไปใน amino group ของกรดอะมิโน methionine ที่จับอยูกับ tRNA เพื่อให

เกิดเปนโครงสรางของ N-fmet-tRNAf (ภาพที่ 6.8)

6. Aminoacyl-tRNA หรือ charged tRNA ซ่ึงมีขั้นตอนการสรางเคราะหดังที่ไดกลาวมาแลว

http://opbs.okstate.edu/%7Epetracek/Chapter%2027%20Figures/Fig%2027-23.GIF


13

ภาพที่ 6.8 แสดงขั้นตอนการสราง N-formylmethionine-transfer RNA (N-fmet-tRNAf) (ที่มา : http://138.192.68.68/bio/Courses/biochem2/ProteinSynthesis/ProteinSynthesisResources/ProteinSynthesisDirection.gif)

ขั้นตอนการเริ่มตนการแปลรหัส มีดังนี้ (ภาพที่ 6.9)

1. IF-1 ทําหนาที่แยก 70S ribosome ใหเปน 50S และ 30S subunits 2. IF-3 เขาเกาะกับ 30S subunit เพื่อปองกนัไมให 50S เขามารวมเปน 70S ribosome 3. IF-1 และ IF-2 ใชพลังงานจากการสลาย GTP (hydrolysis) เขารวมกับ 30S subunit กลายเปน initiation complex = 30S + IF-3 + (IF-1+IF-2+GTP) จากนั้น initiation complex จะเขาจับกับสาย เอ็มอารเอ็นเอ โดยใชสวนของ 30S subunit เขาจับกับปลาย 5/ mRNA ซ่ึงเปนตําแหนงที่มีลําเบสเปน purine rich หรือเรียกวา Shine-Dalgarno sequence (5/ AGGAGGU 3/) ลําดับเบสเหลานี้สามารถเขาคูกับลําดับเบสไพริมิดีนที่อยูดานปลาย 3/OH ของ 16S rRNA ซ่ึงเปนองคประกอบของ 30S subunit โดยทั่วไป Shine-Dalgano sequence จะเรียงอยูทางดาน upstream ของรหัสเริ่มตน AUG หรือ GUG ประมาณ 10 นิวคลีโอไทด ซ่ึงเชื่อวาเปนตําแหนงที่เหมาะสมเพื่อให 30S subunit เขาจับกับ


14

โมเลกุล mRNA และทําให fmet-tRNAf เขาจับกับรหัสเริ่มตนไดอยางถูกตอง ถึงแมวารหัสเริ่มตนจะถกูเปลี่ยนเปน GUG ซ่ึงเปนรหัสของกรดอะมิโน varine ก็ตาม และเพื่อใหการเกิดโครงสรางเชิงซอนของ

30S initiation complex เปนไปอยางสมบูรณ IF-2 ที่จับอยูกับ GTP จะเปนตัวนํา fmet-tRNAf เขาไป

จับกับอนุภาค 30S ตรงบริเวณที่เหมาะสม ในขณะที่ fmet-tRNAf ถูกนําเขามาภายในอนุภาค 30S จากนั้นจะปลดปลอย IF-3 ออกจากโครงสรางของ 30S initiator 4. mRNA ที่มี initiation codon คือ AUG หรือ GUG ซ่ึงเปน codon ที่ IF-2 และ 30S

ribosomal subunit จดจําวาเปน initiation codon ซ่ึงจะมีการนํา N-formylmethionine (Met-tRNAfMet

หรือ tRNAfMet) เขารวมกับ initiation complex

หมายเหต ุ ถาไมใชตําแหนงเริ่มตน (initiation codon) พบวา (1) AUG codon มี tRNA นํา

กรดอะมิโนชนิด methionine (met–tRNAf หรือ tRNAMet) (2) GUG codon มี tRNA นํากรดอะมโินชนิด valine ( val–tRNA หรือ tRNAVal)

5. จากนัน้มีการปลดปลอย IF-3 ออกจาก 30S initiation complex เพื่อให 50S subunit เขามาจับกับโครงสรางเชิงซอนของ 30S initiation complex เพื่อใหเกดิเปนโครงสรางเชิงซอนของ 70S initiotion complex จากนั้น IF-1, IF-2, IF-3, GDP และ Pi จะถูกปลดปลอยออกมาจากโครงสรางเชิงซอนของ 70S initiation complex โดยใชพลังงานจากการไฮโดรไลซีส GTP ได GDP+Pi

50S ที่เปนองคประกอบของโครงสรางเชิงซอนของ 70S initiation complex ประกอบดวย 2 บริเวณ (site) คือ (1) P-site (peptidyl site) เปนตําแหนงทีม่ีการสรางพันธะเบปไทด (peptide bond) และ (2) A-site (aminoacyl site) เปนตําแหนงที่ทําหนาที่รับ aminoacyl-tRNA ซ่ึงในขั้นตอนเริ่มตนนี้ตรง

ตําแหนง P site จะถูกเขาจับโดย fmet-tRNAf (ภาพที่ 6.9)) ขณะเดยีวกนั 50S subunit ก็เขารวมกับ 30S

subunit กลายเปน 70S ribosome โดย fmet-tRNAf อยูที่ตาํแหนง P-site ของ 50S subunit (ภาพที่ 6.9)

6. ได 70S initiation complex (= mRNA + 70S + met–tRNAf) ที่พรอมเริ่มตนสําหรับกระบวนการขยายยาวของสายโพลีเปปไทด (elongation) ตอไป


15

ภาพที่ 6.9 ขัน้ตอนการเริ่มตนกระบวนการแปรรหัสในโปรคารีโอต (ที่มา : http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/MVH/MVH_fi27p20.gif)


16

II. ขั้นตอนการขยายยาวของสายโพลีเปปไทด (Elongation of polypeptide chain) เมื่อ met–tRNAf มาเขาคู mRNA ที่ตําแหนงที่ 1 หรือ P-site ซ่ึงมี codon AUG จากนั้นตําแหนงที่ 2 ถัดจากรหัสเริ่มตน จะนํา aminoacyl tRNA ตัวใหมเขามาในตําแหนง A site ซ่ึงวางอยู จากนั้นกรดอะมิโนทั้งสองจะเชื่อมตอกันดวยพันธะเปปไทด (peptide bond) ซ่ึงถือวาเปนการเริ่มตนขั้นตอนการขยายยาวของสายโพลีเปปไทด ในขั้นตอนนี้จําเปนตองอาศัยปจจัย (elongation factor; EF) ที่สําคัญ 3 ชนิด คือ EF-Tu, EF-Ts และ EF-G ซ่ึงเปนโปรตีนที่พบประมาณ 5-10% ของโปรตีนทั้งหมดที่อยูในเซลล โดย elongation factor ตางๆ ที่กลาวถึงนี้มีบทบาทที่สําคัญตอการนํา aminoacyl tRNA เขามาในตําแหนง A site ของไรโบโซม ขั้นตอนการขยายยาวของสายโพลีเปปไทดสามารถสรุปไดดังนี้ (ภาพที่ 6.10) 1. นํา aminoacyl tRNA เขาจับท่ี A-site

หลังจาก fmet-tRNAf เขาเกาะกับ codon AUG ที่ตําแหนง P-site ของไรโบโซม ทําให EF-Tu ใชพลังงานจากการไฮโดรไลซีส GTP เพื่อนํา aminoacyl-tRNA ตัวใหมเขามาเกาะที่ตําแหนง A-site ดังนั้นในไรโบโซมขณะนี้จะมีกรดอะมิโนอยู 2 ตวั ในสภาวะปกติ EF จะอยูในรูป EF-Tu-Ts complex ซ่ึงมีหนาที่ดังนี้ 1) EF-Tu จะรวมตัวกับ GTP เปลี่ยนเปนโครงสรางเชิงซอน EF-Tu-GTP complex ทําหนาที่นํา aminoacyl tRNA เขาไปจับกับ codon ที่ตําแหนง A site ของไรโบโซมที่วางอยู ในขณะเดียวกัน EF-Tu-GTP complex จะถูกไฮโดรไลซ ใหเปน EF-Tu-GDP กับ Pi แลวถูกปลดปลอยออกจากไรโบโซมทั้งหมด แต GDP ยังคงจับอยูกับ EF-Tu ตอไป จนกวาจะมี EF-Ts เขามาเปนตัวแยกให EF-Tu แยกออกจาก GDP (ภาพท่ี 6.11) 2) EF-Ts เขารวมตัวกับ EF-Tu เปนสารประกอบเชิงซอน ซ่ึงจะถูกทาํใหแยกออกจากกันไดโดยการเขาจับ GTP ตัวอ่ืน เพื่อกลับมาเปนโครงสรางเชิงซอนของ EF-Tu-GTP complex อีกครั้ง ซ่ึง EF-Tu-GTP complex จะทําหนาที่สง aminoacyl-tRNA ทุกชนิดเขาไปที่ตําแหนง A site ยกเวน fmet-

tRNA f (ภาพที่ 6.11)

2. กรดอะมิโน 2 ตัวแรกมีการเชื่อตอกันดวยพันธะเปปไทด

มีการยาย fMet จาก fmet-tRNAf ที่ตําแหนง P-site โดยใชหมูคารบอกซิล (carboxy group)ไปเชื่อมตอกับหมูอะมิโน (amino group) ของ aminoacyl-tRNA ที่ตําแหนง A-site ดวยพันธะเปปไทดโดยอาศัยการทํางานของ peptidyl transferase (ภาพที่ 6.12) ซ่ึงเปนโปรตีนที่เปนองคประกอบในสวนของไรโบโซมขนาด 50S ผลของการเกิดปฏกิิริยาทําใหตําแหนง A-site มีกรดอะมิโน 2 ตัว ตออยูกับ


17

tRNA (dipeptidyl-tRNA) สวน tRNA ที่ตําแหนง P-site จะไมมีกรดอะมิโนเกาะอยู เรียกวา empty tRNA หรือ uncharged tRNA ทําให tRNA หลุดออกไปจากตําแหนง P-site (ภาพที่ 6.12) 3. การเคล่ือนท่ีของไรโบโซม (ribosome translocation) หลังจากพนัธะเปปไทดพันธะแรกไดถูกสรางขึ้นอยางสมบูรณ หรือหลังจากเหตุการณที ่empty tRNA ที่ตําแหนง P-site หลุดออกไป จากนั้น EF-G จะเขาทํางานเพื่อใหไรโบโซมเคลื่อนที่ไป

อีก 3 นิวคลีโอไทด หรือ 1 codon (จากปลาย 5/→3/ mRNA) หรือ mRNA เคล่ือนที่ไปทางซายหรือทางปลาย 5/ ของ mRNA ทําให dipeptidyl-tRNA ที่เดิมอยูที่ตําแหนง A-site เปลี่ยนไปอยูที่ตําแหนง P-site ผลคือตําแหนง A-site ใหมวาง จึงสามารถรับ aminoacyl-tRNA ตัวที่สามที่มีเบส anticodon บนสาย tRNA เปนคูสมกับ codon บน mRNA ได จากนั้นมกีารยายเฉพาะ dipeptides ที่อยูตําแหนง P-site ไปตอกับ aminoacyl-tRNA ที่ตําแหนง A-site ทําใหตาํแหนง P-site มี empty tRNA แลวถูกปลอยใหหลุดออกไป P-site ก็จะวาง ขณะที่ A-site มีกรดอะมิโน 3 ตัว จากนัน้ EF-G จึงใชพลังงานจากการไฮโดรไลซีส GTP เพื่อชวยในการเคลื่อนยายไรโบโซม หรือเคลื่อนยาย mRNA สงผลทําให A-site วาง เนื่องจากกรดอะมิโนทัง้ 3 ตัวยายมาอยูที่ตําแหนง P-site ซ่ึงกระบวนการก็เปนเชนนี้ไปเรื่อยๆ จนไดสายโพลีเปปไทดที่ยาวขึ้นเรื่อยๆ

การเคลื่อนที่ของไรโบโซมจะเกิดขึน้ไดจําเปนตองอาศัยการกระตุนจาก EF-G ในขณะที่เกิดการเคลื่อน EF-G จะรวมตัวกับ GTP เปนโครงสรางเชิงซอนของ EF-G-GTP complex เขาจับกับไรโบโซม แลวจึงเกิดการไฮโดรไลซปลดปลอย GDP และ Pi ออกมา การเคลื่อนที่ของไรโบโซมทําใหเกิดผลดังนี้ คอื 1) เกิดการปลดปลอย uncharged tRNA ออกจากตําแหนง P site 2) ทําให dipeptidyl-tRNA หรือ polypeptidyl-tRNA เปลี่ยนตําแหนงจาก A site ไปเปน P site จึงทําใหตําแหนง A site วางลงอีกครั้ง


18

ภาพที่ 6.10 กระบวนการสงัเคราะหสายโพลีเปปไทด

(ที่มา : http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/MVH/MVH_fi27p22.gif)


19

ภาพที่ 6.11 ขั้นตอนการเกดิ EF-Tu-Ts complex

(ที่มา : http://138.192.68.68/bio/Courses/biochem2/ProteinSynthesis/ProteinSynthesisResources/ProteinSynthesisDirection.gif)


20

ภาพที่ 6.12 การทํางานของ peptidyl transferase เพื่อสรางพันธะเปปไทด ที่ตําแหนง A-site

(ที่มา : http://opbs.okstate.edu/~petracek/Chapter%2027%20Figures/Fig%2027-26.GIF)

http://opbs.okstate.edu/%7Epetracek/Chapter%2027%20Figures/Fig%2027-26.GIF


21

III. ขั้นตอนการสิ้นสุดการสังเคราะหสายโพลีเปปไทด ขั้นตอนการสิ้นสุดการแปรรหัสหรือการสิ้นสุดการสังเคราะหโปรตีนตองอาศัยปจจยั 2 อยาง

คือ (1) รหัสหยุด (termination codon หรือ stop codon หรือ nonsense codon คือ UAA (ochre), UAG (amber) และ UGA (opal) codon ที่ตําแหนง A site และ (2) คือ release factor ไดแก RF-1, RF-2 และ RF-3 ซ่ึงสามารถสรุปขั้นตอนการสิ้นสุดการสังเคราะหโปรตีนได (ภาพท่ี 6.13) ดังนี้ 1. เมื่อไรโบโซมเคลื่อนตัวมาเรื่อยๆ จนถึงตําแหนง A site ที่รหัสหยุด คือ UAA, UAG และ UGA ซ่ึงไมมีโมเลกุล aminoacyl-tRNA ชนิดใดเลยที่สามารถเขาคูกับเบสรหัสหยุดบน mRNA ได

2. มีการกระตุนให release factor ไดแก RF-1, RF-2 และ RF-3 เขาเกาะกับตําแหนง stop codon ที่ตําแหนง A-site โดย RF-1 มีหนาที่จดจําและเขาจับรหัส UAA และ UAG สวน RF-2 มีหนาที่จดจําและเขาจบักับรหัส UAA และ UGA ขณะที่ RF-3 มีหนาที่เขารวมตัวกับ GTP เพื่อสงเสริมใหเกิดการสิ้นสุดการสังเคราะหโปรตีน การเขาจับของ release factor ตรงตําแหนงรหสัหยุดจะเปนการกระตุนใหเอนไซม peptidyl transferase ปลดปลอยสายโพลีเปปไทดใหหลุดจากโมเลกุล tRNA ที่อยูในตําแหนง P site โดยกระบวนการไฮโดรไลซีส

3. ในขณะเดยีวกันโมเลกุล tRNA ก็จะหลุดออกจากตําแหนง P site ดวยเชนกนั 4. หลังจากนัน้หนวยยอยของไรโบโซม 30S, 50S และ mRNA ก็ถูกปลดปลอยใหเปนอิสระ

โดยกระบวนการไฮโดรไลซีสของ GTP เพื่อใหหมูคารบอกซิลที่ปลาย 3/OH ของสายโพลีเปปไทด จะทําปฏิกิริยากับน้ํา แลวเกดิเปนหมูคารบอกซิลที่ปลายสายโพลีเปปไทด (ภาพท่ี 6.13)

แตบางครั้งหนวยยอย 30S subunit อาจเคลื่อนตัวตอไปตามความของโมเลกุล mRNA จนกระทั่งไปพบกับ Shine-Dargano sequence ของยีนที่อยูถัดไป เพื่อเร่ิมตนกระบวนการแปลรหัสตอไปใหม หรืออาจจะหลุดออกจากโมเลกลุ mRNA อยางสมบูรณเลยกไ็ด


22

ภาพที่ 6.13 ขั้นตอนการสิ้นสุดการสังเคราะหโปรตีน ในโปรคารีโอต (ที่มา : http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/MVH/MVH_fi27p26.gif)


23

พลังงานที่ตองการในการสงัเคราะหโปรตนี ในการสังเคราะหโปรตีนของสิ่งมีชีวิตจําเปนตองใชพลังงานดวยเสมอ เนื่องจากการสรางพันธะเปปไทด 1 พันธะ ตองการการแตกตัวของพันธะฟอสเฟตของสารพลังงานสูงอยางนอย 4 พันธะ และการสังเคราะหโปรตีนในแตละขั้นตอนตองการพลังงานไมเทากัน เชน 1. ขั้นตอนการเกิด aminoacylation ของโมเลกุล tRNA ทุกครั้ง จําเปนตองเกิดการแตกตวัของ ATP ใหเปน AMP และฟอสเฟต (Pi) 2 โมเลกุล สําหรับการนํากรดอะมิโน 1 โมเลกุล เขามาจับกับ tRNA 1 โมเลกุล

2. การนํา met-tRNAf เขาจับตรงตําแหนง P site ทุกครั้ง ในขั้นตอนการเริ่มตนสังเคราะหสายโพลีเปปไทด จําเปนตองเกิดการไฮโดรไลซของ GTP 1 โมเลกุล ใหเปน GDP และ Pi เสมอ 3. สําหรับทุกๆ โมเลกุลของ aminoacyl-tRNA ที่เขาจับกับตําแหนง A site จําเปนตองเกิดการไฮโดรไลซของ GTP 1 โมเลกุล ใหเปน GMP และ PPi เสมอ 4. ในขั้นตอนการเคลื่อนที่ของไรโบโซมจําเปนตองเกิดการไฮโดรไลซของ GTP 1 โมเลกุล ใหเปน GDP และ Pi เสมอ 5. ในขั้นตอนการสิ้นสุดการสังเคราะหโปรตีน ทุกครั้งที่สังเคราะหสายโพลีเปปไทดมาถึงรหสัหยุดจําเปนตองเกิดการไฮโดรไลซของ GTP 1 โมเลกุล ใหเปน GDP และ Pi เสมอ

บทบาทและหนาท่ีของพลังงานสูงในขณะเกิดการแปลรหสั ทุกขั้นตอนของการแปลรหัสจําเปนตองเกิดปฏิกิริยาไฮโดรไลซีสของสารพลังงานสูง เชน ATP และ GTP เสมอ เพื่อปลดปลอยพลังงานสูงออกมาใชในการแปลรหัส ดังนั้นจึงเชื่อวาพลังงานสูงที่ถูกปลดปลอยออกมานาจะเกี่ยวของโดยตรงกับการแปลรหัส คือ 1. การทําใหการแปลรหัสเปนไปอยางถูกตอง (High fidelity of translation) การสังเคราะหโปรตีนใน E. coli พบวามีความถี่ของความผิดพลาดต่ํามาก คือ 1 คร้ังตอการนํากรดอะมิโนเขามาจับ 2,000 โมเลกุล อาจเนื่องจากการนํากรดอะมิโนเขาจับโมเลกุล tRNA ไดอยาง ถูกตองจําเปนตองอาศัยพลังงานสูงที่เกิดจากการแตกตัวของพันธะฟอสเฟต 2 พันธะ จาก ATP นอกจากนี้แลวการที่ codon และ anticodon จับกันไดอยางถูกตอง ซ่ึงแสดงใหเห็นวากระบวนการไฮโดรไลซีสของ GTP ที่เกิดขึ้นควบคูไปพรอมกับทําหนาที่ proof reading หรือ editing ตองการพลังงานสูงเพื่อตรวจสอบความผิดพลาดระหวาง codon กับ aniticodon


24

2. เพิ่มอัตราความเร็วของการแปรรหัส (High rate of translation) การสังเคราะหโปรตีนเกิดขึ้นอยางรวดเรว็ จึงจําเปนตองใชพลังงาน เชนใน E. coli การสังเคราะหโปรตีนพบวาไรโบโซม 1 โมเลกุล สามารถนํากรดอะมิโนมาเชื่อมตอกนัไดในอัตราเร็ว 15 โมเลกุลตอวินาที นอกจากนี้ยังพบวา ตั้งแตเร่ิมตนกระบวนการสังเคราะหโปรตีนในขณะทีไ่รโบโซมเคล่ือนตัวไปตามความยาวโมเลกุล mRNA จะไมมกีระบวนการใดๆ มายับยั้งเพื่อไมใหไรโบโซมโมเลกุลอ่ืนๆ เขาจับกับโมเลกุล mRNA เพื่อเร่ิมตนการสังเคราะหโปรตีน เนื่องจากภายในเซลลมไีรโบโซมที่พรอมจะสังเคราะหโปรตีนอยูมากมาย จงึทําใหไรโบโซมเหลานัน้สามารถเขาจับกับโมเลกุล mRNA เดยีวกันไดและ mRNA 1 โมเลกุล ที่มีไรโบโซมเขาจับหลายๆ โมเลกลุ จะถูกเรยีกวา polyribosome หรือ polysomes (ภาพที่ 6.14) จึงทําใหอัตราการสังเคราะหโปรตีนสูงขึ้น

ภาพที่ 6.14 ลักษณะ Polysomes ของโปรคารีโอต

(ที่มา : http://www.modares.ac.ir/elearning/mnaderi/Genetic%20Engineering%20course%20II/images/prod0110.gif)

การสังเคราะหโปรตีนในยูคารีโอต (Protein synthesis in eukaryote) กลไกการสังเคราะหโปรตีนในยูคารีโอตคลายคลึงกับของโปรคารีโอต แตก็มีความแตกตางกันบาง เนื่องจากความซับซอนของกลุมเซลลที่รวมตัวกันของเซลลยูคารีโอต อยางไรก็ตามกระบวนการสังเคราะหโปรตีนในยูคารีโอตก็ยังคงแบงออกเปน 4 ขั้นตอน คือ (1) การกระตุนกรดอะมิโนใหเชื่อมตอกับโมเลกุล tRNA (2) ขั้นตอนเริ่มตนการสังเคราะหสายโพลีเปปไทด (3) ขั้นตอนการขยายยาวของสายโพลีเปปไทด และ (4) ขั้นตอนสิ้นสุดการสังเคราะหสายโพลีเปปไทด ซ่ึงกระบวนการสังเคราะหโปรตีนจําเปนตองอาศัยปจจัยที่สําคัญหลายอยาง ไดแก


25

1. โมเลกุล mRNA ตองเปน mature mRNA ที่ผานกระบวนการดัดแปลงหลังจากผานกระบวนการลอกรหัส โดย mature mRNA มีลักษณะเปน monocistronic mRNA (หมายถึง 1 โมเลกุลของ ดีเอ็นเอประกอบดวย 1 ยีน หรือสังเคราะหโปรตีนได 1 ชนิด) โมเลกุล mRNA ของยูคารีโอตมี รหัสเริ่มตนเพียงรหัสเดียวเทานั้นคือ AUG และไมมี Shine-Dalgarno sequence อยูภายใน แตมี 7-methylguanylate cap อยูดานปลาย 5/ mRNA ซ่ึงทําหนาที่สําคัญ คือใหหนวยยอยขนาดเล็กของไรโบโซม (40S) เขาจับในขั้นตอนการเริ่มตนการแปลรหัส

2. มีปจจัยเร่ิมตน หรือ initiation factor หรือ eIF อยางนอย 10 ชนิด 3. ไรโบโซมของยูคารีโอตมีขนาด 80S ซ่ึงประกอบดวยหนวยยอย 2 หนวย คือ 40S และ 60S

ในขั้นตอนการเริ่มตนหนวยยอยขนาด 40S จะเขาจับกบั eIF-4 C ซ่ึงเชื่อวาอาจมีบทบาทสําคัญตอการชวยใหเกิดการรวมตัวกนัของ 40S และ 60S ไรโบโซม แตในขณะที่ 2 หนวยของไรโบโซมแยกออกจากกันเปนอิสระหนวยยอยขนาด 60S ของไรโบโซมจะถูกเขาจับโดย eIF 6 เพื่อปองกันไมใหหนวยยอย 40 S ของไรโบโซมเขาจับ

4. met-tRNAi เปน charged tRNA โมเลกุลแรกของยูคารีโอตที่นํากรดอะมิโน methionin ที่ไมผานการดัดแปลงเขาไปสูโครงสรางเชิงซอน 40S initiation complex ซ่ึงภายในเซลลยูคารีโอตจะมีโมเลกุล tRNA 2 ชนิด ที่มีโครงสรางแตกตางกัน เพื่อเอาไวจดจํารหัส AUG โดยปกติ AUG ที่เปนรหัส

เร่ิมตนจะถูกจดจําโดย tRNAi สวนรหัส AUG ที่อยูภายในโมเลกุล mRNA จะถูกจดจําโดย tRNAiii ซ่ึง

รหัส AUG เหลานี้ตางก็เปนรหัสของกรดอะมิโน methionin เหมือนกัน ยิ่งไปกวานั้น ทั้ง tRNAi และ

tRNAiii จะมีเอนไซม methionyl-tRNA synthase ที่เหมือนกันเพื่อทําหนาที่รับผิดชอบในการนํา

กรดอะมิโน methionine เขามาจับกับโมเลกุล tRNA ทั้ง 2 ชนิดนี้ 5. พลังงานในขั้นตอนการเริ่มตนของการสังเคราะหโปรตีนของยูคารีโอต นั้นจําเปนตองใช

พลังงานจากสารพลังงานสูง ไดแก ATP และ GTP แตสําหรับในโปรคารีโอตตองการเพียง GTP เทานั้น

I. ขั้นตอนการเริ่มตนการสังเคราะหสายโพลีเปปไทดในยูคารีโอต (ภาพที่ 6.15 และ

ภาพที่ 6.16) ขั้นตอนการเริม่ตนสังเคราะหโปรตีนในยคูารีโอตมีความคลายคลึงกับโปรคารีโอต แตมีบาง

เหตุการณที่ซับซอนมากกวา เชน (1) ในขั้นตอนการเริ่มตนการสังเคราะหโปรตีนของยูคารีโอต จําเปนตองใช initiation factor หลายชนดิ คือ eIF-3, eIF-4A, eIF-4B, eIF-4C และ eIF-4F ซ่ึงทั้งหมดนี้จะเขาทําหนาที่ในขณะที่ preinitiation complex เขาจับกับโมเลกุล mRNA (2) eIF-4A มีโครงสรางที่


26

ซับซอนมากเพราะตองอยูรวมกับหนวยยอยตางๆ อีกหลายหนวยยอย ซ่ึงทําหนาที่เหมือนกับ cap-binding protein หรือ CBP เพื่อเขาทําปฏิกิริยากับโครงสราง 5/ Cap แลวเขาจับกับโมเลกุล mRNA จึงช้ีใหเห็นวาโครงสรางของ cap นั้นสําคัญมาก นอกจากนี้แลว CBP ยังเปนตวัการสงเสริมให eIF-4A และ eIF-4B เขาจับกับโมเลกุล mRNA (3) เมื่อ ATP ถูกไฮโดรไลซ และถูกเขาจับโดย eIF-4A ผลของการเกิดปฏิกิริยา ทําใหโครงสรางระดับสอง (secondary structure) เกิดการคลายเกลียว (unwinding) ตรงบริเวณ 5/ untranslated region ของโมเลกุล mRNA เกิดเปนโครงสรางเชิงซอนที่สมบูรณของ 40S initiation complex อยางไรก็ตามขั้นตอนการแปลรหัสสามารถสรุปไดดังนี ้

1. เกิดโครงสราง preinitiation complex โดย eIF-3 เขารวมตัวกับ 40S subunit ไดเปน 40 SN

ซ่ึงเปนตําแหนงที่ให aminoacyl-tRNA เขาเกาะ จากนั้น eIF-2 กระตุนให met-tRNAi เกิดปฏิกิริยารวมกับ 40SN กลายเปน 43S complex หรือ preinitiation complex

2. จากนัน้ eIF-4 กระตุนและชวยให mRNA เขารวมกบั 43S complex เพื่อเกดิเปนโครงสรางเปน 48S complex ซ่ึง eIF-4 มีหลายชนิด ไดแก eIF-4F , eIF-4A , eIF-4B และ protein cp220 ชนิดอ่ืนๆ โดย eIF-4F ประกอบดวย eIF-4E ซ่ึงเปนโปรตีนที่มีตําแหนงจดจําตําแหนง 5/ cap-sites ของ eukaryotic mRNAs กลาวคือที่ปลาย 5/mRNA ของยูคารีโอตจะไมมีตําแหนงของ Shine-Dalgarno sequence เหมอืนกับในโปรคารีโอต แตจะมีตําแหนงของ 5/ cap แทน (ภาพที่ 6.15) 3. eIF-5 ทําหนาที่ชวยให 60S ribosome เขารวมกับ 48S complex ไดผลผลิตเปน 80S complex ซ่ึงพรอมที่จะเริ่มตนกระบวนการแปลรหสั การเกิดโครงสรางของ 80S initiation complex โดยการเขาจับกันของหนวยยอยขนาด 60S กับ 48S initiation complex จําเปนตองอาศัยการเกดิปฏิกิริยาของ eIF-5 และ eIF-4C อยางไรก็ตามกอนที่หนวยยอยขนาด 60S จะเขาจับกับ 48S iniation complex จําเปนตองปลดปลอย eIF-2-GDP และ eIF-2-eIF-3 ออกจาก 48S initiation complex ในขั้นตอนนี้จําเปนตองอาศยั eIF-5 เขาชวย และหลังจากที่ eIF-2-GDP ถูกปลดปลอยออกมาแลว จะถูกเปลี่ยนกลับไปเปน eIF-2GTP โดยปฏิกิริยาของ eIF-2B และเมื่อโครงสรางของ 80S initiation เกิดขึ้นอยางสมบูรณ initiation factor ทั้งหมดจะถูกปลดปลอยออกมา 4. การจดจํารหัสเริ่มตนของไรโบโซม พบวาที่บริเวณ 5/ untranslated ของโมเลกุล mRNA จะมีความยาวไมแนนอน โดยทั่วไปจะมีความยาวอยูระหวาง 40-80 นิวคลีโอไทด ซ่ึงหนวยยอยขนาด 40S ของไรโบโซมก็ยังสามารถจดจํารหัสเริ่มตนไดถึงแมวาจะไมมี Shine-Dalgano sequence เหมือนในโปรคารีโอต จากการศึกษาพบวาโมเลกุล mRNA ของยูคารีโอตมากกวา 90 เปอรเซ็นต จะมีลําดับเบสที่จําเพาะเพื่อใหรูวาลําดับเบสเหลานี้เกี่ยวของกับรหัสเริ่มตน โดยปกติรหัส AUG รหัสแรกที่อานพบจะถูกใชเปนรหัสเริ่มตนและบริเวณรอบๆ รหัสเริ่มตนรหัสแรกสวนใหญจะมีลําดับคลายกับลําดับ


27

5/ AXXAUGGG 3/ (X คือลําดับเบสใดๆ ก็ได) แตถารหัส AUG รหัสแรกนี้ไมถูกใชเปนรหัสเริ่มตนก็จะใชรหัส AUG รหัสตอไปที่ปรากฏอยูในลําดับเบส 5/ YXXAUGY 3/ (Y คือเบสไพริมีดีน อาจจะเปน U หรือ C) ดังนั้นจึงไดมีการเสนอสมมุติฐานเอาไววา เมื่อหนวยยอยขนาด 40S ของไรโบโซมจะเขาจับกับโมเลกุล mRNA ตรงดานปลาย 5/ cap แลว จากนั้นจะทําการคนหารหัสเริ่มตนโดยการเคลื่อนตัวไป

ตามความยาวโมเลกุล mRNA จากปลาย 5/→3/ จนกระทั่งไปพบรหัสเริ่มตน AUG รหัสแรก เพื่อเร่ิมตนการสังเคราะหโปรตีน แตถารหัส AUG รหัสแรกไมถูกใชเปนรหัสเริ่มตน หนวยยอยขนาด 40S ของไรโบโซมก็จะเคลื่อนที่ผานไปใชรหัส AUG ตัวตอไปเปนรหัสเริ่มตน ซ่ึงพบนอยมาก

หมายเหต ุ AUG codon เปนรหัสเริ่มตนทั้งโปรคารีโอต และยูคารีโอต โดยในโปรคารีโอตใช

tRNAfMet สําหรับการเริ่มตนการแปลรหัส แตยูคารีโอตใช tRNAi

Met (unmodified methionine)

ภาพที่ 6.15 การเขาเกาะของ initiation factors (eIF) ที่ตําแหนง 5/ cap-sites ของ eukaryotic mRNAs


28

ภาพที่ 6.16 ขั้นตอนการเริม่ตนการแปรหัสในยูคารีโอต


29

II. ขั้นตอนการขยายยาวของสายโพลีเปปไทดในยูคารีโอต มีขั้นตอนคลายคลึงกับโปรคารีโอตมาก คือ เมื่อ tRNA นํา aminoacylated tRNA มาเขาคู mRNA ที่ตําแหนงที ่ 1 หรือ P-site ซ่ึงมี codon AUG จากนัน้ตาํแหนงที ่ 2 ถัดจากรหัสเริม่ตน aminoacyl tRNA ตัวใหมเขามาในตําแหนง A site ซ่ึงวางอยู จากนัน้กรดอะมิโนจะเชื่อมตอกนัดวยพันธะเปปไทด ซ่ึงถือวาเปนการเริ่มตนขั้นตอนการขยายยาวของสายโพลีเปปไทด ในขั้นตอนนี้จําเปนตองอาศัยปจจยั (elongation factor; EF) ที่สําคัญ 3 ชนิด คือ eEF-1α และ eEF-1β และ eEF-2 โดย elongation factor ตางๆ ที่กลาวถึงนี้มีบทบาทที่สําคัญตอการนํา aminoacyl tRNA เขามาในตําแหนง A site ของไรโบโซม โดยข้ันตอนการขยายยาวของสายโพลีเปปไทด สามารถสรุปได ดังนี้ 1. มีไรโบโซมขนาด 80S (คือ 40S และ 60S subunit)

2. มี eEF-1α และ eEF-1β ของยูคารีโอต ที่มีคุณสมบัติเหมือน EF-Tu และ EF-Ts ของโปรคารีโอต ตามลําดับ โดย eEF-1α ทําหนาที่นํา aminoacyl-tRNA เขามาสงใหกบั mRNA สวน eEF-1β จะทําหนาที่กระตุน GTP–eEF-1α ใหเปลี่ยนกลับไปเปน GTP-eEF-1α เพื่อไปนํา aminoacyl-tRNA ตัวอ่ืนๆ เขามาจับกับ codon บน mRNA ตอไป 3. eEF-2 ที่มีคุณสมบัติเหมือน EF-G คือเกี่ยวของกับการเคลื่อนที่ของไรโบโซมบนสาย mRNA

4. การสรางพันธะเปปไทดมีกลไกเหมือนกันทั้งในโปรคารีโอตและยูคารีโอต โดยอาศัยการทํางานเอนไซม peptidyl tranferase เปนตันกระตุนใหเกิดปฏิกิริยา

5. การเคลื่อนที่ หรือการเปลี่ยนตําแหนงของไรโบโซม ตองอาศัยปจจัยอ่ืนและพลังงานเขารวม คือ eEF-2-GTP complex โดยที่ GTP จะถูกไฮโดรไลซใหเปน GDP และปลดปลอยพลังงานออก เพื่อใชในการเคลื่อนที่ของไรโบโซม มีลักษณะคลายกบัการเคลื่อนที่ของโปรคารีโอตที่ตองมี EF-G-GTP complex

III. การสิ้นสุดการสังเคราะหสายโพลีเปปไทดในยูคารีโอต ทั้งโปรคารีโอตและยูคารีโอต มีกลไกการสิ้นสุดการสังเคราะหโปรตีนคลายคลึงกัน คือตองใช release factor (RF) ซ่ึงในยรูาคีโอตมี RF เพียง 1 ชนิดเทานั้นที่จับอยูกับ GTP และสามารถจดจํารหัสหยุด (stop codon หรือ nonsense codon) ไดทั้ง 3 รหัส คือ UAA (ochre), UAG (amber) และ UGA (opal) codon ที่ตําแหนง A site การสิ้นสุดการสังเคราะหโปรตีนจะเกดิขึ้นเมื่อ RF เขาจับกับไรโบโซม แลวไปมีผลตอการเกิดปฏิกริิยาของเอนไซม peptidyl transferase ทําใหเกดิการปลดปลอยสาย โพลีเปปไทดออกจากไรโบโซม จากนัน้จึงเกดิปฏิกิริยาการไฮโดรไลซีสของ GTP เพื่อทําใหหนวยยอยของไรโบโซมแยกออกจากกัน


30

อยางไรก็ตามในยูคารีโอตพบวามีการเพิ่มอัตราความเร็วของการแปรรหัส (High rate of translation) หรือเพิ่มอัตราการสังเคราะหโปรตีนใหเกิดขึน้อยางรวดเร็ว ไดเชนเดียวกบัในโปรคารีโอตโดยมีไรโบโซมหลายๆ โมเลกุล (polyribosome หรือ polysomes) เขาจบักับโมเลกุล mRNA 1 โมเลกุล ซ่ึงไรโบโซม 1 โมเลกุล สามารถสังเคราะหโปรตนีได 1 โมเลกุล ทําใหไดโปรตนีจํานวนมากเพียงพอตอความตองการของเซลล (ภาพท่ี 6.17)

ภาพที่ 6.17 ลักษณะ Polysomes ของยูคารีโอต

(ที่มา : http://www.unc.edu/courses/2003ss1/biol/050/001/polysome.jpg)


31

การดัดแปลงสายโพลีเปปไทดหลังกระบวนการแปลรหัส (Post translational processing of polypeptide chain) สายโพลีเปปไทดทีไดจากการกระบวนการแปรรหัส ตองมีการดัดแปลงกอนที่จะไปทําหนาที่ตอไป คือ

1. ขจัด N-formyl group ของ N-formyl methionine ที่เปนกรดอะมิโนตัวเร่ิมตนของสาย โพลีเปปไทดในการแปรรหสั ออกจากสายโพลีเปปไทด เมื่อสังเคราะหเปนโปรตีนเสร็จเรียบรอย

2. กรดอะมิโน methionine ที่เปนตัวแรกของสายโพลีเปปไทดก็อาจจะถกูกําจัดออกไปจากสายโพลีเปปไทดได อาทิ ในโปรตีนบางชนิด เชน coat protein ของ TMV จะมีการเติม acetyl group เขากับ amino group ทางดานปลาย NH2-terminal end (ปลาย 5/ ของสายโพลีเปปไทด) 3. ภายในสายโพลีเปปไทดเดียวกันก็จะมกีารเชื่อมกันดวย disulfide bond เกิดการมวนตวัของสายโพลีเปปไทด เพื่อเกดิเปนโครงสรางของโปรตีนระดับตางๆ เชน การเกิดพนัธะ disulfide ในโมเลกุลของโปรตีนอินซูลิน (ภาพที่ 6.18)

ภาพที่ 6.18 การเกิด disulfide bond ภายในสายโพลีเปปไทดของอินซูลิน (ที่มา : http://www.mun.ca/biology/scarr/Insulin_processing.gif)

พันธุ โมเลกุศาสตรลเบื้ (258444) องต...

Documents

Transcript of พันธุ โมเลกุศาสตรลเบื้ (258444) องต...