เทคนิคการโคลยืชี นพ (Plant Gene Cloning...

เทคนิคการโคลยีนพืช (Plant Gene Cloning Technique)

คํานํา พันธุวิศวกรรม หมายถึง กระบวนการเปลี่ยนแปลงหรอืดัดแปลงสารพันธุกรรม (genetic

material; DNA) ของสิ่งมีชีวิต โดยการถายทอดยนีที่ตองการจากสิ่งมีชีวิตหนึ่ง เขาสูอีกสิ่งมีชีวิตหนึ่ง เพื่อสรางสิ่งมีชีวิตชนิดใหมที่มีลักษณะตามตองการ

พันธุวิศวกรรมอาจตรงกับภาษาอังกฤษวา genetic engineering หรือ recombinant DNA technology หรือ genetic manipulation ซ่ึงขั้นตอนการทําพันธุวิศวกรรมอาจเรียกวา gene cloning คือ การเพิ่มปริมาณกลุมของเซลลที่มีลักษณะทางพนัธุกรรมเหมือนกันซึ่งมียนีทีต่องการอยูในเซลลใหไดจํานวนยีนและจาํนวนเซลลในปริมาณมากพอที่จะนําไปใชประโยชนตอไป

ขั้นตอนการทํา Gene cloning

1. การเตรียมช้ินสวนของ DNA ที่ตองการ (Preparing DNA) 2. การใชเอนไซมตัดจําเพาะในการโคลนยีน (Restriction enzyme for gene cloning) 3. การเลือกใชพาหะหรือเวคเตอร (Vector)

4. การถายไฮบริดเวคเตอรเขาสูเซลลเจาบาน เพื่อทํา Gene cloning (Transformation) 5. การตรวจสอบ clone ที่ตองการ (Screening hybrid vector) 6. การประยกุตใชเทคนิคพนัธุวิศวกรรม (Application)

I. การเตรียมชิ้นสวนของ DNA ที่ตองการ

การเตรียมชิ้นสวนของ DNA ที่ตองการนั้นเปนขั้นตอนแรกของการทาํ Gene cloning ซ่ึง DNA ที่ตองการนั้นสามารถเตรียมได 4 วธีิ คือ (1) genomic DNA หรือ chromosomal DNA (2) cDNA (complementary DNA) (3) PCR (polymerase chain reaction) และ (4) การสังเคราะหดีเอ็นเอโดยวิธีทางเคมี (DNA synthesis from chemical method) 1. Genomic DNA หรือ Chromosomal DNA ทําไดโดยสกดั DNA ที่มีทั้งหมดออกจากเซลลของสิ่งมีชีวิตที่ตองการ ซ่ึง genomic DNA ที่ไดสามารถนํามาใชทําเปน gene bank หรือ genomic DNA library เพื่อเปนแหลงเก็บรวบรวมยนีทั้งหมดของสิ่งมีชีวิตนั้น หรือเฉพาะบางยนีที่ตองการของสิ่งมีชีวิตไวในหลอดทดลอง

2 เอกสารประกอบการสอนรายวิชา 102401/48

หลักการสกัดดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอที่อยูในเซลลของสิ่งมีชีวิต โดยทัว่ไปจะไมไดอยูเปนดเีอ็นเอเกลียวคูอิสระ แตจะรวมตัวอยูกับโปรตีนฮีสโตนและโปรตีนทีไ่มใชฮีสโตน เกิดเปนโครงสรางเชิงซอนของโครมาติน นอกจากนี้ภายในเซลลของสิ่งมีชีวิตยังประกอบดวย คารโบไฮเดรต โปรตีน และอารเอ็นเอ (nascent RNA) ดังนั้นในการสกัดดีเอ็นเอออกจากสิ่งมีชีวติตองอาศัยหลักการดังนี้ 1) ทําลายผนงัเซลล (cell wall lysis) โดยใชสาร lysozyme (นิยมใชในโปรคาริโอต) หรือใชสาร detergent (นิยมใชในยูคาริโอต) อาทิ sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium lauroyl sarcosinate 2) การยอยโปรตีน และอารเอ็นเอ โดยใช protease และ RNase ตามลําดับ จากนั้นตกตะกอนโปรตีนดวย phenol/chloroform (บางครั้งอาจเติมเกลือเชน sodium chloride หรือ sodium acetate เพื่อชวยเพิ่มประสิทธิภาพในการตกตะกอนโปรตีน) 3) ตกตะกอนดีเอ็นเอ โดยใช cool absolute ethanol (อาจเติมเกลือ sodium acetate ดวย) โดยเกดิ dehydrate water ออกจากสายดีเอ็นเอ จากนั้นละลายดีเอ็นเอดวยน้ําหรือ TE buffer เก็บที่ –20 0C หมายเหต ุ บางครั้งเติมสาร CTAB ( ) เพื่อชวยในการตะตอน polysaccaride, เติม EDTA เพื่อยับยั้งการทํางานของ DNase (โดย EDTA จะเขาไปจับกับ Mg2+ ซ่ึงเปนตัวเรงปฏิกิริยาของเอ็นไซมตางๆ) การตรวจสอบคุณภาพของดเีอ็นเอ และอารเอ็นเอ สามารถทําได 2 วิธี คือ

1) การวัดคาการดูดกลืนแสง (Absorbance) ที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตร และ 280 นาโนเมตร โดยดเีอ็นเอสามารถดูดกลืนแสงไดมากที่สุดที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตร สวนโปรตีนดูดกลืนแสงไดดีที่สุดที่ความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร จากนั้นนําผลที่ไดมาคํานวณหาความเขมขนของสารละลายดีเอ็นเอ จากสูตร

ความเขมขนของดีเอ็นเอ (μg/ml) = A260 x 50 x dilution factor ถาคา A260 ที่วัดไดมีคาเทากบั 1 แสดงวามคีวามเขมขนของดีเอ็นเอสายคู (double-stranded

DNA; ds-DNA) เทากับ 50 μg/ml ถาคา A260 ที่วัดไดมีคาเทากับ 1 แสดงวามีความเขมขนของดีเอ็นเอสายเดี่ยว (single-

stranded DNA; ss-DNA) เทากับ 33 μg/ml ถาคา A260 ที่วัดไดมีคาเทากับ 1 แสดงวา มีความเขมขนของอารเอ็นเอสายเดีย่ว (single-

stranded RNA) เทากับ 40 μg/ml ถาคา A260 ที่วัดไดมีคาเทากับ 1 แสดงวา มีความเขมขนของโอลิโกนิวคลีโอไทด

(oligonucleotide) เทากับ 20 μg/ml


ถา A260 / A280 อยูในชวง 1.65-1.85 แสดงวาดีเอ็นเอที่สกัดไดบริสุทธิห์รือมีคุณภาพดี ต่ํากวา 1.65 แสดงวามีโปรตีนและฟนอลปะปนอยูในสารละลาย มากกวา 1.85 แสดงวามีอารเอ็นเอปนอยูในสารละลาย 2) วิธีอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส (gel electrophorsis) วิธีการนี้สามารถวิเคราะหดเีอ็นเอที่มีปริมาณนอยในระดับนาโนกรัม (ng) ได โดยใชหลักการที่โมเลกุลของเอธิเดียมโบรไมดจะเขาไปแทรกอยูในเกลียวคูของดีเอ็นเอ เมื่อนําไปสองดวยแสงอุลตราไวโอเลต จะเกดิการเรืองแสง โดยความเขมของแสง เปนสัดสวนโดยตรงกับปรมิาณของ (รูปท่ี 1)

รูปท่ี 1 แถบของจีโนมิกดีเอ็นเอ ที่ไดจากการ run gel electrophoresis 2. cDNA (Complementary DNA)

คือการเตรียมชิ้นดีเอ็นเอที่ตองการจาก mRNA โดยใช reverse transcriptase ซ่ึงเปนผลผลิตของยีนที่มีการแสดงออกเฉพาะบางเซลลหรือบางเนื้อเยื่อในชวงเวลาหนึ่งๆ เทานั้น โดย mRNA นั้นจะมีแตสวนของ exon (single copy DNA) เทานั้น จึงสามารถถายเขาไปใน plasmid ของ Prokaryote เพื่อประโยชนในการ Cloning ได และเพื่อการศึกษา Gene expression ได

หลักการการสกัดอารเอ็นเอ 1) ทําใหเซลลแตกและตกตะกอนโปรตนี โดย detergent และ phenol/chloroform ตามลําดับ 2) ตกตะกอนแยกอารเอน็เอออกจากดเีอ็นเอ โดยใช LiCl หมายเหต ุ ในการสกัดเอ็นเอควรเติม DEPC (diethyl pyrocarbonate) เพื่อยับยั้งการทํางานของ Rnase หรืออาจเตรียมอารเอ็นเอบริสุทธ์ิโดยใช oligo-T matrix หรือชุดสําเร็จรูป (รูปท่ี 2)


การตรวจสอบคุณภาพของอารเอ็น

คลายกับดีเอ็นเอ โดยถา A260/A280 อยูในชวง 1.7-2.0 แสดงวาอารเออ็นเอที่สกัดไดบริสุทธิ์หรือมีคุณภาพด ี

รูปท่ี 2 ขั้นตอนการเตรียมอารเอ็นเอของยูคารีโอต


การสังเคราะห cDNA อาจทําไดหลายวิธี อาทิ 1) การเตรียม cDNA โดยใช primer ที่เปน Oligo dT ใช S1 nuclease (รูปท่ี 3) หลักการคือ

- สกัด eukaryotic mRNA ซ่ึงมี poly A tail ที่ปลาย 3/ ไดแลว - เร่ิมทําการสังเคราะห cDNA โดยใชดีเอ็นเอไพรเมอรที่เปน oligo dT (หมายถึงมีเบส T

หลายๆ เบสตอกัน) โดยไพรเมอรจะเขาไปเกาะที่ปลาย 3/ mRNA แลวใช mRNA เปนแมแบบ เพือ่

เร่ิมทําการสังเคราะหสายดีเอนเอ single strand DNA (ssDNA) ในทิศทาง 5/ → 3/ โดยการทํางานของ reverse transcriptase จากไวรัส

- เมื่อทําการสังเคราะห ss cDNA มาถึงปลาย 5/ mRNA template พบวา reverse transcriptase ยังคงสังเคราะหสายดีเอนเอ ที่ปลาย 3/ ยาวออกไปอกีหลายเบส (ซ่ึงเบสสวนปลายที่เกินมานีจ้ะเกดิโครงสรางเปนตะขอ (loop หรือ hook)

- ยอย mRNA template ดวยดาง (NaOH)

- ใช DNA polymerase I ทําหนาที่สังเคราะหสาย cDNA อีก 1 สายขึ้นมาในทิศทาง 5/ → 3/ โดยใช ss cDNA ที่สังเคราะหไวแลวเปนแมแบบ ที่มบีริเวณปลาย 3/ มีโครงสรางคลายตะขอ ซ่ึงทําหนาที่เปนเสมือนไพเมอร สุดทายไดดเีอนเอสายคู (ds cDNA)

- ทําการตัดดเีอนเอสายเดยีว (บริเวณตะขอ) โดยใช S1 nuclease


รูปท่ี 3 การเตรียม cDNA โดย ใช S1 nuclease (ที่มา : http://www.bch.bris.ac.uk/staff/pfdg/teaching/images/cdna.gif)

2) การเตรียม cDNA โดยใช primer ที่เปน Oligo dT โดยไมใช S1 nuclease (รูปท่ี 4) มีหลักการคลายกับวิธีแรก ตางกันตรงคุณสมบัติของ reverse transcriptase ซ่ึงไมสามารถ

สังเคราะหสาย ss cDNA ใหเกิดปลาย 3/ มีโครงสรางคลายตะขอได ดังนั้น จึงทําใหไมมีไพรเมอรในขั้นตอนการทํางานของ DNA polymerase I ซ่ึงวิธีการนี้แกไขโดยใช Rnase H ทําหนาที่ยอยสาย mRNA ใหไดเปน fragment (มีหลายนวิคลีโอไทด) จํานวนมาก และแตละ mRNA fragment ก็ทําหนาที่เปนไพรเมอรในการสังเคราะห cDNA สายใหมขึน้มา

ss

http://www.bch.bris.ac.uk/staff/pfdg/teaching/images/cdna.gif


Second strand cDNA

synthesis by use mRNA

fragment primers and DNA

polymerase I

cDNA

รูปท่ี 4 การเตรียม cDNA โดย ไมใช S1 nuclease

(ที่มา : http://www.gifu-u.ac.jp/~bfg3244/Lecture98/Total_Plan/cdna-synth.gif)

3) วิธีของ Land และคณะ (1981) มีหลักการเหมือนกันวิธีแรก แตมีการเติม poly C ที่

ตําแหนง 3/OH ของนิวคลีโอไทดใน cDNA สายแรก โดยอาศัยการทํางานของ terminal transferase (สามารถเติมนิวคลีโอไทดเขาที่ปลาย 3/ ไดโดยไมตองมีดเีอนเอแมแบบ) เพื่อใหเกิด Over hanging poly C 3/OH จากนั้นใช primer ที่เปน Oligo dG (รูปท่ี 5)

http://www.bch.bris.ac.uk/staff/pfdg/teaching/images/cdna.gif


รูปท่ี 5 การเตรียม cDNA cloning in bacteriophage λ

3. การเตรียม DNA ท่ีตองการจากปฏิกิริยา PCR ถาทราบลําดับบางสวนของนิวคลีโอไทดที่อยูบริเวณสวนปลายของชิ้นสวนดเีอ็นเอหรือ

ยีนที่ตองการ เราก็สามารถ design primer 2 ชนิด (25-35 nucleotides) มาใชในปฏิกิริยา PCR ก็จะ


สามารถเพิ่มจํานวนชิน้สวนของดีเอ็นที่ตองการไดในเวลาอันรวดเรว็ ซ่ึงมีจํานวน copy = [2n - (n + 1) ] เมื่อ n คือจํานวนรอบของการทํา PCR ขั้นตอนการทํา PCR มีดังนี้ (รูปท่ี 6) 1) Denature คือ แยก double strand DNA ใหเปน single strand DNA โดยใช อุณหภูมิสูง (90-95 องศาเซลเซียส) 2) Annealing คือ primer ทั้ง 2 ชนิดเขาเกาะกับ single strand DNA โดยใชอุณหภูมิต่าํ 50-55 องศาเซลเซียส [พิจารณาจากคา Tm (melting temperature)] แตใน RAPD อาจใชอุณหภูมิต่าํตั้งแต 30-50 องศาเซลเซียส ทั้งนี้ขึ้นอยูกับจํานวนนวิคลีโอไทด (mer) ใน primer 3) Primer extension กระบวนการสังเคราะห DNA สายใหม โดยการทํางานของ DNA polymerase ใช อุณหภูมิประมาณ 70-73 องศาเซลเซียส (เปนอุณหภูมทิี่เหมาะสมตอการทํางานของ Tag polymerase)

4. การสังเคราะหโดยวิธีทางเคมี โดยใชเครื่องสังเคราะห DNA อัตโนมัติ (automate DNA synthesizer) ซ่ึงปจจุบันสามารถสังเคราะหสาย DNA ที่มีขนาดยาว 50 นิวคลีโอไทด แตถาตองการสังเคราะหสาย DNA ที่มีขนาดยาวมากๆ ก็สามารถทําไดโดยสงเคราะหเปน DNA ขนาดสั้นๆ หลายๆ สาย แลวมาตอกันโดยใช DNA ligase


รูปท่ี 6 ขั้นตอนการเพื่อปริมาณชิ้นดีเอนเอหรือยนี โดยเทคนิค PCR (ที่มา : http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/dna/pcr.gif)

II. เอนไซมตัดจําเพาะในการโคลนยีน ในการโคลนยีนตองใชเอมไซมตัดจําเพาะในการตัดสายดีเอ็นเอที่ตองการ จากนั้นนําไปเชื่อมตอกับพาหะ (Vector) แลวจึงพาหะถายเขาสูเซลลเจาบาน (Host cell) ซ่ึงเอมไซมตัดจําเพาะสามารถแบงตามระบบการปองกันตัวเองของแบคทีเรียจากผูบุกรุกของดีเอ็นแปลกปลอมไดเปน 3 แบบ โดยแบบที่ 2 (Type II) เปนเอมไซมตัดจําเพาะที่นิยมใชกันมากในการตัดตอยีน เนื่องจากโมเลกุลไมซับซอน คือ ประกอบดวยสายโพลีเปบไทดเพียง 1 ชนิด มีการตัดที่ตําแหนงจําเพาะ


บริเวณตําแหนงจดจําบนดีเอ็นเอทําใหไดขนาดที่แนนอน และใชเพียง Mg++ เปนตัวเรงปฏิกิริยา นอกจากนี้ในการเติมหมูเมธิลใหกับเบสของดีเอนเอนั้นตองอาศัยเอนไซมอีกชนิดหนึ่ง ปจจุบันเอมไซมตัดจําเพาะทีส่กัดไดจากแบคทีเรียชนิดตางๆ มีจํานวนมากวา 400 ชนิด ซ่ึงการเรียกชื่อใชระบบอักษรภาษาอังกฤษ 3 ตัว และพิมพตัวเอน โดยอักษรตัวที่ 1 คือ อักษรตัวแรกของชื่อ Genus ใชเปนตัวพิมพใหญ อักษรตัวที่ 2 และ 3 เปนอักษร 2 ตัวแรกของชื่อ Species ใชตัวพิมพเล็ก ถามีรหัสของสายพันธุกใ็หใสหลังอักษร 3 ตัวแรก และสุดทายเปนเลขโรมันซึ่งบอกถงึลําดับของเอนไซมที่สกัดไดจากแบคทีเรีย เชน EcoRI สกัดมาจาก Escherichia coli RY13 แยกไดเปนชนดิแรก HindIII สกัดมาจาก Haemophilus influenzae แยกไดเปนชนิดที่ 3 ตําแหนงจดจําของเอนไซม คือตําแหนงของ Palindrom sequence (Highly repeatitve DNA; DNA class I) ซ่ึงบริเวณจดจําของเอนไซมอาจประกอบดวย 4 หรือ 6 หรือมากวา 6 เบส (รูปท่ี 7 และตารางที่ 1) เมื่อเอนไซมตดัเสนดีเอ็นเอขาดออกจากกนัแลว ช้ินดีเอ็นเอที่ไดนัน้ที่มีปลายทั้งสองยาวเทากัน เรียกวา ปลายทู (Blunt end หรือ Flush end) หรือไดแลว ช้ินดีเอ็นเอที่ไดนัน้ที่มีปลายทั้งสองยาวไมเทากัน เรียกวาปลายเหนียว (Sticky end หรือ Cohesive end) (รูปท่ี 8)

รูปท่ี 7 แสดงตําแหนงจดจําของเอมไซมตัดจําเพาะบางชนิด


ตารางที่ 1 แสดงตําแหนงจดจําของเอมไซมตัดจําเพาะบางชนิด


รูปท่ี 8 การเกดิปลายเหนี่ยวของชิ้นดีเอ็นเอที่ถูกตัดดวยเอมไซมตัดจําเพาะ


III. การเลือกใชพาหะ (Vector) และการทํา Gene cloning

พาหะ (Vector) คือ ดีเอ็นเอพาหะทีใ่ชในการเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอน็ทีต่องการใหไดปริมาณมากๆ โดยนาํชิ้นดีเอ็นเอที่ตองการดังกลาวมาเชื่อตอเขาไปกับ DNA vector ไดดเีอ็นเอสายผสม (rcombinant DNA; rDNA) จากนั้นจึงนาํ rDNA ถายเขาสูเซลลเจาบาน (Host cell) โดยวิธีการ Transformation เพื่อเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอที่ตองการ แลวทําการคัดเลือกเซลลที่ตองการตอไป ปจจุบันมีเวคเตอรตางๆ มากมายที่ใชสําหรับ Gene cloning ซ่ึงการเลือกใชเวคเตอรนั้นขึ้นอยูกับวัตถุประสงคของการใชงาน เชนถาตองการโคลนยีนในแบคทีเรีย อาจเลือกใชเวคเตอรที่เปน พลาสมิด (Plasmid) ฟาจ (Phage) และ คอสมิด (Cosmid) หรือถาตองการโคลนยีนในเซลลสัตวอาจใชเวคเตอรที่เปนไวรัส SV40 ขณะที่ในเซลลพืชไวรัสพวก Cauliflower mosaic virus (CMV) และ Ti plasmid อยางไรก็ตามไดมกีารพัฒนาเวคเตอรที่สามารถจําลองตัวเองไดในเซลลเจาบานมากวา 1 ชนิด ที่เรียกวา Shuttle vector เชน ใน E. coli และ Yeast เปนตน

พลาสมิด (Plasmid) เปน Coning vector ที่ใชสําหรับใน E. coli ซ่ึงมีคุณสมบัติดงันี ้ 1. มีการจําลองตัวแบบ relaxed vector 2. มีจุด ori 3. มียีนเครื่องหมาย (Marker gene) ที่สามารถตรวจสอบได (บางครั้งอาจมี Reporter gene ดวย) โดยพิจารณาจากกิจกรรมของยีนที่เรียกวา Insertional inactivation

4.มีตําแหนงจดจําหรือตําแหนงที่ตัดไดของเอนไซมตัดจาํเพาะชนดิใดชนิดหนึง่เพยีงหนึ่ง ตําแหนง (Unique site)

ตัวอยางของเวคเตอรแสดงดงัรูปท่ี 9, รูปท่ี 10 และ รูปท่ี 11

รูปท่ี 9 พลาสมิด pBR322


Insertional inactivation ถาใสช้ินสวนของดีเอ็นเอที่ตองการ ที่ตําแหนง Pst I พบวา

1. ถาพลาสมิดไมไดรับชิ้นสวนดีเอน็เอแทรกอยู จะตานทานตอ แอมพซิลิน และเตตระไซคลิน 2. ถาพลาสมิดไมไดรับชิ้นสวนดีเอน็เอแทรกอยู จะตานทานตอเตตระไซคลิน แตไมตานทานตอแอมพิซิลิน

expression of a GUS reporter gene

in a transformed tobacco seedling.

รูปท่ี 10 พลาสมิด pUC18/pUC19 แสดงลําดับ polycloning site หรือ multiple cloning site

(lacZ gene ทําหนาที่ผลิต β-galactosidase ซ่ึงสามารถยอยสาร X-gal เกิดเปนสารสฟีา)


รูปท่ี 11 พลาสมิด PCRTMII ใชสําหรับ clone ช้ินดีเอ็นเอที่ไดจากการทํา PCR

(ช้ินดีเอนเอที่ไดจากปฏกิิริยา PCR จะมีเบส A 1 ตัว ที่ปลาย 3/)


ขอดีและขอเสียของพลาสมดิ

ขอดี ขอเสีย 1. มีใหเลือกหลายแบบ สะดวกในการใชงาน 1. ไมสามารถโคลนชิ้นดีเอน็เอที่มีขนาใหญได 2. สามารถดัดแปลงเปน Shuttle vector

ฟาจแลมบดา (Lambda phage) จีโนมของฟาจแลมบดาเปนดเีอ็นเอเกลียวคูมีขนาดประมาณ 50 kb โดยมีตําหนงที่สําคัญคือ

1. Left arm มีขนาดประมาณ 20 kb เปนบริเวณที่ประกอบดวยยนีที่เกี่ยวของกับการสราง phage progeny

2. Right arm มีขนาดประมาณ 8-10 kb เปนบริเวณทีป่ระกอบดวยยนีที่เกี่ยวของกบัการดํารงชีพแบบ Lytic pathway หมายเหต ุ บริเวณสวนปลายของ Left arm และ Right arm จะมีสวนของ cos site ที่มีปลาย 5/ overhanging ประมาณ 12 bp 3. Central stuffer มีขนาดประมาณ 14 kb มียีนที่เกยีวของกับการดํารงชีวิตแบบ lytic pathway และ lysogenic pathway 3.1 Lytic pathway คือฟาจหลังจากบกุรุกเซลลเจาบานแลว จะเริ่มกระบวนการเปด-ปดการทํางานของยีนที่เกี่ยวของกับกระบวนการทําลายเซลลเจาบานหรือแบทเรีย

1) ยีน N และ Cro เปดการทาํงาน โดย N ทําหนาที่เปนตวัยับยั้งการทํางายของ rho protein 2) ผลผลิตจากยีน Q จะควบคุมการทํางานของยีนกลุมที่เกี่ยวของกับการสังเคราะห สวน

หัว และสวนหางของฟาจ 3) เกิดกระบวนการ DNA replication 2 แบบ โดยชวงแรกของการบุกรุกจะมีการจําลองดี

เอ็นเอแบบ Theta model หลังจากนัน้เปนแบบ Sigma model ซ่ึงโมเลกุลของดีเอ็นเอที่ไดจากการจําลองนั้นจะตอกันเปนสายยาว โดยหนึ่งสายจะประกอบดวยดีเอ็นเอหลายโมเลกุลที่เรียกวา Contamer หรือ cetenated DNA

4) Contamer จะถูกตัด ทีต่ําแหนง cos site แลวบรรจุเขาไปทางสวนหางของฟาจที่ถูกสังเคราะหขึ้น ทําใหเซลลเจาบานแตก แลวปลอย phage assembly ออกมามากมาย 3.2 Lysogenic pathway หลังจากที่ฟาจบกุรุกเซลลเจาบาน ดีเอ็นของฟาจจะเขาไปรวมอยูกับดีเอ็นเอของเซลลเจาบาน ดังขั้นตอนตอไปนี ้

1) มีการแสดงออกของยีน cI เพื่อทําหนาทีย่ับยั้งการทํางานของยีนในกลุม lytic gene


2) มีการแสดงออกของยีน int (integrase) เพื่อทําหนาที่ทําใหดีเอน็เอของฟาจรวมกับดีเอ็นเอของแบคทีเรีย โดยดีเอน็เอของฟาจมีตําแหนง att (attachment site) ที่เปนตําแหนงจดจําและเขาเกาะกับตําแหนงจําเพาะของดีเอ็นเอของแบคทีเรีย

คุณสมบัตขิองฟาจแลมบดาที่ใชเปนแวคเตอร (รูปท่ี 12) มีดังนี ้1. บริเวณ central stuffer จะถูกตัดออกไป เหลือไวเพียงบริเวณ left arm และ right arm หมายเหต ุ บริเวณ central stuffer ไมยนีจําเปนสําหรับการโคลนยีน แตถาสวนนี้หายไปจะ

ทําใหฟาจสูญเสียการบุกรุกเซลลเจาบาน 2. มีตําแหนงจุดตัดของเอ็นไซมตัดจําเพาะอยูระหวาง left arm กับ central stuffer และ

right arm กับ central stuffer ซ่ึงเปนตําแหนงที่จะใสช้ินดีเอ็นเอที่ตองการลงไป 3. มียีนเครื่องหมาย เพื่อใชในการคัดเลือก และการตรวจสอบดีเอ็นเอสายผสมที่ตองการ ตัวอยางของแลมปดาฟาจที่ใชเปนเวคเตอร (การคัดเลือกพิจารณาจากกจิกรรมของยีนที่เรียกวา Insertional inactivation)

1. λgt10 ขนาด 4..3 kb ใชยีนเครื่องหมาย คือ cl+ และ cl- คัดเลือกลักษณะโดยดูจากฟโนไทปของลักษณะ phaque

2. λgt11 ขนาด 43.7 kb ใชยีนเครื่องหมาย คือ lacZ คัดเลือกลักษณะโดยดจูากปฏิกิริยาการเกิดสีของการยอย X-gal

ขอดีและขอเสีย ขอดี ขอเสีย

1. สามารถโคลนชิ้นดีเอ็นเอเปาหมายที่มีความยาว 10 –20 kb

2. λ ZAP มีคุณสมบัติพิเศษคือรวมเอาพลาสมิด

ไวบน λ แลว ดังนั้นในการศึกษาคุณสมบตัิของดีเอ็นเอเปาหมายจึงไมตองยายชิ้นสวนดีเอน็เอ

เปาหมายออกจาก λ มาใสในพลาสมิด ที่เรียกวา subcloning (กรณทีี่ดีเอ็นเอเปาหมายมีขนาดใหญการทํา subcloning อาจทําใหดีเอ็นเอแตกหกัได ) 3. การนําดีเอน็เอสายผสมเขาสูเซลลเจาบานโดยวิธี transduction มีประสิทธิภาพมากกวา transformation 100 เทา 4. เหมาะกับการทํา DNA library

1. วิธีการยุงยากกวาพลาสมิด เชน - การเชื่อมตอระหวางดีเอ็นเอเปาหมายกับ

เวคเตอรตองขจัดหมูฟอสเฟตโดยใช alkaline phasphatase

- ตองนําดีเอ็นเอสายผสมเขามาบรรจุในหลอดทดลอง เพื่อใหเปนฟาจที่สมบูรณ


รูปท่ี 12 การใสช้ินดีเอนเอทีต่องการเขาที่ตําแหนง Left arm และ Right arm ของ Lamda vector

คอสมิด (Cosmid)

คอสมิดเปนเวคเตอรที่เกิดจากการรวมเอาขอดีของพลาสมิดและ λ เขาดวยกัน โดยตัด

ตําแหนง cos site จาก λ เขามาเชื่อมตอกับพลาสมิด ทําใหคอสมิดมีขอดี คือ (1) สามารถเชื่อมตอดีเอ็นเอเปาหมายที่มีขนาดใหญประมาณ 35-45 kb (2) สามารถนําดีเอ็นเอสายผสมบรรจุในโปรตีนหอหุมของฟาจ (3) นําเขาสูเซลลเจาบานโดยวิธี transduction และ (4) ดีเอ็นเอสายผสมจะมกีารจําลองดีเอ็นเอและการคัดเลือกมีลักษณะเชนเดียวกับพลาสมิด


ตัวอยางคอสมดิ

1. pJB8 (5.4 kb) 2. pWE15 (8.2 kb) ซ่ึงมีตําแหนงของยีนที่สําคัญดังรูปท่ี 13

รูปท่ี 13 ตําแนงตัดจําเพาะของเอมไซมตัดจําเพาะและยนีตางๆ ในคอสมิด pWE15 Col E1 ori คือ จุดจําลองตัวเองของคอสมิด ในแบคทีเรีย SV40 ori คือ จุดจําลองตัวเองของไวรัส SV40 Ampr คือ ยีนตานทานแอมพิซิลิน Neor คือ ยีนตานทานนีโอมัยซิน ซ่ึงทํางานในเซลลของสัตวเล้ียงลูกดวยนมเทานั้น T3 and T7 promoter คือ โปรโมเตอรจากฝาจ T3 และ T7 ตามลําดับ ตัวอยางการนาํชิ้นดีเอนเอเปาหมายเขาสูคอสมิด จากนั้นนําคอสมิดลูกผสมเขาสูเซลลเจาบานโดยวิธี transduction และการคัดเลือกเซลลมีมีคอสมิดลูกผสมได ซ่ึงสามารถแสดงขั้นตอนไดดังรูปท่ี 14 และ รูปท่ี 15)


รูปท่ี 14 การโคลนยีนโดยใช cosmid


รูปท่ี 15 การโคลนยีนโดยใช cosmid


ฟาจที่มีดีเอ็นเอเปนวงแหวนสายเดี่ยว (single stranded DNA phage) ไดแก ฟาจ f1, fd และ M13 ดีเอ็นเอมีลักษณะเปนดีเอน็เอเสนตรงสายเดี่ยวขนาดประมาณ 6,407 bp การจําลองโมเลกุลของฟาจในกลุมนี้มี 3 ขั้นตอน คือ 1. ดีเอ็นเอสายเดียวจําลองตัวเองเปนดีเอน็เอสายคู (เมื่อบกุรุกเขาสูเซลลเจาบาน) 2. ดีเอ็นเอสายคูจําลองตัวเองเปนดีเอ็นเอสายคู (จําลองตัวเองแบบ theta model จนมีดเีอ็นเอประมาณ 100-200 โมเลกุล) 3. ดีเอ็นเอสายคูจําลองตัวเองเปนดีเอ็นเอสายเดีย่ว (จําลองตัวเองแบบ sigma model โดยใชฟาจสาย + เทานั้น เปนแมแบบในการจําลองดีเอ็นเอสายใหม โดยโปรตนีจากยีน V จะเขาไปเกาะที่ดีเอ็นเอสายเดยีว +) ยีนท่ีเก่ียวของกับการจําลองดีเอ็นเอของ M13 คือ 1. ยีนที่เกี่ยวของใน M13 มีจาํนวน 10 ตัว (แทนดวยตวัเลขโรมัน) 2. จุด Intergenic region (IG) อยูระหวางยนี II กับ V โดย IG เปนตําแหนงเริ่มตนในการจําลองดีเอ็นเอ 3. โปรตีนจากยีน II จะทําลายพันธะฟอสฟอรไดเอสเทอรทําใหเกดิ nick ที่ตําแหนง IG ของ + strand จากนั้นมกีารจาํลองดีเอ็นเอแบบ sigma mode โดยใช– strand เปนแมแบบ เมื่อจําลองดีเอ็นเอจนครบรอบ จะไดดเีอ็นเอ + สายใหม จากนัน้โปรตีนจากยีน II จะตัดสาย + ใหกลายเปน replication form (RF) (บริเวณตรงปลายทั้งสองของดีเอ็นเอ + สายใหมจะมาเชื่อมตอกันเปนดีเอน็เอวงแหวน แลวจําลองเปนดเีอ็นเอวงแหวนสายคู) 4. เมื่อจํานวนดีเอ็นเอสายคูมีจํานวนมาก โปรตีนจากยนี V จะเขาจับกับสาย + ทําใหไมสามารถจําลองดีเอ็นเอตอไปได จึงไดดีเอน็เอสายเดยีว หมายเหต ุ การจําลองดีเอ็นเอจะเกิดบริเวณใกลกับเซลลเมนเบรนของแบคทีเรีย ดงันั้นดีเอ็นเอที่ไดจากการจําลองมาบรรจุในโปรตีนหอหุม ทําใหฟาจ M13 (ที่มีดีเอ็นเอสายเดีย่ว) สามารถหลุดออกจากเซลลไดโดยไมทําใหเซลลเจาบานแตก ตัวอยางการใช M13 เปนเวคเตอร เวคเตอรที่ใชจะเปนดีเอ็นเอสายคู และมีจุดเชือ่มตอดีเอ็นเอเปาหมายอยูที่บริเวณ IG ori คือ จุดเริ่มตนการจําลองดีเอน็เอ lac Z คือ ยีนสังเคราะหเปปไทดอัลฟา lacI คือ ยีนสังเราะห lac repressor


IV. การเชื่อชิ้นดีเอ็นเอเขากับเวคเตอร หรือ Gene cloning Gene cloning หมายถึง การนํายีนที่ตองการหรือยีนทีส่นใจมาเพิ่มปริมาณใหไดเพยีงพอ

เพื่อใชในการศึกษา อาท ิ การแสดงออกของยีน การผลิตโปรตีนหรือเอนไซม การถายยีน การหาลําดับเบสของยีน เปนตน ซ่ึงหลักการทํา Gene cloning ก็คือ หลังจากได rDNA (recombinant DNA) แลวกน็ําไปถายลงในเซลลเจาบานเพื่อเพิ่มปริมาณ ซ่ึงการทํา rDNA นั้นสามารถทําไดหลายวิธี ดังนี ้ 1. การสราง DNA library คือ การนํา Genomic DNA ของสิ่งมีชีวิตมาตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ แลวนํามาเชือ่มตอเขากับเวคเตอรซ่ึงถูกตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะชนดิเดยีวกัน จากนัน้จึงนําไปถายในเซลลเจาบานเพื่อขยายปริมาณชิ้นดีเอน็เอ แลวเก็บเซลลเจาบาน หรือเก็บเวคเตอรไวที่ –80 องศาเซลเซียสเพื่อใชประโยชนตอไป ตัวอยางการสราง DNA library ในแบคทีเรีย และไวรัสสามารถแสดงไดดัง รูปท่ี 16 และ 17


รูปท่ี 16 การสราง DNA library ของ chromosomal DNA ของ E. coli


รูปท่ี 17 การสราง DNA library ของ chromosomal DNA ของ virus

2. การเชื่อมตอชิ้นดีเอ็นเอที่ตองการเขากบัเวคเตอร

สามารถแบงไดเปน 3 วิธี ดังนี้ 1) การเชื่อมตอดีเอ็นเอปลายเหนียว การเชื่อมตอดีเอ็นเอปลายเหนียวทีเ่กิดจากการตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะเขากับเวคเตอรที่ถูกตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะชนิดเดียวกนั (รูปท่ี 18)

บอยครั้งที่พบวาดีเอ็นเอปลายเหนียวของเวคเตอรที่เกิดจากการตัดดวยเอนไซมตดัจําเพาะนั้นเกดิ Self ligation หรือ Vector dimer ซ่ึงสามารถแกปญหาไดโดยใช Alkaline phosphatase เปลี่ยนหมู P ที่ปลาย 5/ ใหเปนหมู OH ดังนั้น Ligase จึงไมสามารถสราง Phosphodiester bond ได


รูปท่ี 18 การเชื่อมตอดีเอ็นเอปลายเหนีย่วที่เกิดจากการตัดดวย EcoRI

2) การเชื่อมตอดีเอ็นเอปลายทู

การเชื่อมตอดีเอ็นเอปลายทูทีเ่กิดจากการตัดดวยเอนไซมตดัจําเพาะเขากบัเวคเตอรที่ถูกตัดดวยเอนไซมตดัจําเพาะชนิดเดียวกัน ซ่ึงทําไดยากกวาการเชื่อมตอดีเอ็นเอปลายเหนยีว ดังนัน้จึงอาจนดีเอ็นเอปลายทูมาเชื่อมตอกับ DNA linker (8-10 nucleotides) ที่มีตําแหนงจดจําของเอนไซมตัดจําเพาะซึ่งจะตดัไดปลายเหนีย่ว หรืออาจแกปญหาปลายทูโดยใช Adapter molecule ที่เปนปลายเหนี่ยวมาเชื่อมตอเขากับดีเอ็นเอที่ตองการ (รูปท่ี 19)


รูปท่ี 19 การเชื่อมตอดีเอ็นเอโดยใช EcoRI linker


V. การตรวจสอบ clone ที่ตองการ

หลังจากใส ช้ินดี เอ็นที่ ตองการลงไปในเวคเตอร แลวนํ า เวคเตอรดั งกล าวมา Transformation เขาสู Host cell ในขั้นตอนนี้จําเปนมีวิธีการตรวจหาโคลนที่ตองการจากประชากรทั้งหมดของเซลลเจาบาน แลวคัดเลือกโคลนที่ตองการนั้นออกมา เพื่อเพิ่มจํานวนตอไป ซ่ึงวิธีการตรวจสอบมีหลายวิธีดังนี้ 1. การคัดเลือกจากฟโนไทป (Phenotypic selection) วิธีนี้เหมาะสําหรับยีนที่ใสเขาไปในเวคเตอรนั้นเปนยีนที่สามารถแสดงออกไดในเซลลเจาบานไดและเซลลเจาบานจะตองไมมียีนนั้นอยู เชน ใส kanR และ trp A gene (รูปท่ี 20) ลงไปใน Auxotroph host cell

รูปท่ี 20 การคัดเลือกยีนที่ตองการโดยการตรวจสอบโดยตรงจากฟโนไทป


2. การตรวจสอบโดยวิธีทางอัมมูโนเคมี (Immunochemical screening)

เปนวิธีที่คลายกับวิธีแรกแตกรณีโปรตีน (Gene product) ไมแสดงฟโนไทปที่ชัดเจนทําใหไมสามารถตรวจสอบโดยตรงได ดังนั้นจึงตองใช Antibody ที่จะเขาไปเกาะกับ Antigen ซ่ึงโปรตีนที่ไดจากยีนที่ใสเขาไปในเวคเตอร

บางครั้ง Antibody ถาไมไดติดฉลากโดยตรง อาจใชโปรตีน A (ที่ติดฉลากดวย 125-I protein A) เขาไปเกาะกับ Antibody (สามารถเขาเกาะกับ IgG ของสัตวเล้ียงลูกดวยนมทุกชนิด) แลวตรวจสอบผลจากการทํา Autoradiograph (รูปท่ี 21)

หรืออาจใช Horseraddish peroxidase หรือ alkaline phosphatase ที่เรียกวาเทคนิค ELISA

รูปท่ี 21 การตรวจสอบโคลนที่มียีนที่สนในโดยวิธีทางอิมมูโนเคมี


3. การตรวจสอบโดย Nucleic acid hybridization

การตรวจสอบยีนที่ตองการใน recombinant vector ที่อยูใน host cell โดยใชหลักการคือ ทําใหเซลลเจาบานแตก แลวทําใหดีเอนเอสายคูอยูในสภาพสายเดี่ยว จากนั้นใช DNA probe หรือ RNA probe หรือ Oligo nucleotide ที่อยูในสภาพสายเดี่ยว และติดฉลากดวย 32P ทํามาเกาะจับ (hybridization) กับยีนที่ตองการ (รูปท่ี 19.22)

รูปท่ี 22 การตรวจสอบโคลนที่มียีนที่ตองการโดย Nucleic acid hybridization (ที่มา : http://www.fhcrc.org/education/courses/cancer_course/basic/img/screening.gif)


การประยุกตใชเทคนิคพันธุวิศวกรรม เมื่อสามารถคนหายีนหรือช้ินดีเอ็นเอที่ตองการไดแลว จากนั้นจึงมาทําการเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอที่ตองการใหมีปริมาณมาก เพื่อนํามาใชประโยชนทั้งทางดาน การเกษตร ทางอุตสาหกรรม และทางการรักษา นอกจากนี้เทคนิคทางพันธุวิศวกรรมยังถูกนํามาใชประโยชนในดานตางๆ อีกดวย ซ่ึงพอสรุปไดดังนี้

1. การถายยีนเขาสูพืช 1.1 aro A gene 1.2 Bt gene (หรือ cry gene) 1.3 polygalaturonase gene 2. การตรวจสอบโรคพืชโดยเทคนิค PCR 3. การตรวจสอบกลายยีนและศึกษา Linkage โดยเทคนิค RFLP และ เทคนิค Southern blot hybridization 4. การศึกษาวิวัฒนาการ ความสัมพันธ การจําแนกสายพันธุ และการตรวจสอบสายพันธุพืชโดยใชเทคนิค RAPD 5. การศึกษาลําดับของชิ้นดีเอ็นที่สนใจโดยเทคนิค DNA sequencing 6. การตรวจสอบโรคพืชที่เกิดจากเชื้อไวรัสโดยเทคนิค RT-PCR

การถายยีนเขาสูพืชเพื่อสราง Trangenic plant

Trangenic plant คือ พืชที่เกิดจากกระบวนการทางพนัธุวิศวกรร โดยทําใหเซลลพืชนั้นไดรับยีนหนึ่งหรือมากกวาเขาไป โดยวิธีการตางๆ ซ่ึงยีนเหลานั้นสามารถแสดงออกในลักษณะที่มันควบคุมได

เทคนิคในการถายยีนเขาสูพืช (Plant transformation) โดยทั่วไปมี 2 วิธี คือ 1. การถายยีนโดยตรงโดยไมตองใชพาหะ (Direct gene transfer; Vecterless) 2.การถายยีนโดยใช Agrobacterium (Agrobacterium-mediated gene trasfer)

การถายยีนโดยตรงโดยไมตองใชพาหะ (Direct gene transfer; Vecterless) เปนวิธีที่งาย สะดวก และสามารถใชไดทั้งพืชไปเลี้ยงคูและพืชใบเลี้ยงเดี่ยว นอกจากนี้ยัง

สามารถใชไดกับทุกชิ้นสวนของพืชที่ไดจากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช แตมักพบปญหาการเกิด silencing gene (คือ การที่ยีนที่ถายเขาไปนั้นไมแสดงเนื่องจากใน 1 เสนของดีเอ็นเอ มียีนนั้นมากกวา 1 copy)


การถายยีนโดยตรงโดยไมตองใชพาหะมีหลายวิธีดังนี้

1) Electroporation จะใช Discharge ของตัวเก็บกระแสไฟฟา (Capacitor) โดยกระแสไฟฟาที่ปลอยออกมาจะถูกปลอยออกมาในระยะเวลาที่ส้ันมาก (millisecond) และใชความตางศักดิ์ประมาณ 500-700 Voltage/cm ทําใหเกิดรูขึ้นที่ผนังเซลลเมมเบรน ซ่ึงทําให DNA fragment ผานเขาไปได (รูปท่ี 23)

รูปท่ี 19.23 การถายยีนโดยเทคนิค Electroporation

2) Particle bombardment (Biolistic; Particle gun) (รูปท่ี 24) ซ่ึงมีหลักการคือ - นําดีเอ็นเอ (ที่อยูกับ vector) มาเคลือบกับอนุภาคของทอง หรือ ทังสเทน (เสนผาน

ศูนยกลาง 0.2-2.0 ไมครอน) - ใชแรงอัดของกาซ Helium ที่ปลอยจากทอ ขับเคลื่อนใหอนุภาคของ DNA ที่ถูกเคลือบ

อยูบนอนุภาคของโลหะทะลุผานเขาไปในเนื้อเยื่อพืช ซ่ึงชิ้นดีเอ็นจะเขา Integrate กับ genomic DNA ของพืชได

รูปท่ี 24 การถายยีน โดยวิธี Particle bombardment


3) Laser microbeam tecnique

ใช UV microbeam ฉายไปที่เซลลของพืช โดยเซลลตองอยูในสภาพ Hypertonic solution (เกิด Plasmolysis) เพื่อใหเกิดรอยรั่ว แลวปลอยให DNA เขาไปในเซลลพืชได

4) Microinjection (รูปท่ี 25) ใช Holding capillary ทําหนาที่ตรึง Protoplast ใหอยูกับที่ แลวใชเขม (Injection capillary)

ที่มีสารลาย DNA ฉีดเขาไป (การตรึงเซลล อาจใช Agarose, sodium alginate หรือ poly-L-lysine)

รูปท่ี 25 การถายยีน โดยวิธี Microinjection

การถายยีนโดยใช Agrobacterium (Agrobacterium-mediated gene transfer) Agrobacterium เปนแบคทีเรียแกรมลบที่อยูในดิน สามารถบุกรุก (Infect) เขาสูตนพืชไดบริเวณที่มีบาดแผล ทําใหพืชเกิดปุมปม (Tumor) ทีเรียกวา Crown gall disease เนื่องจากมีการสราง Opine (เชน Octopine และ Nopaline) ขึ้น โดยยีนที่อยูบน Ti plasmid (Tumor inducing plasmid) ที่มีขนาดประมาณ 140-235 kb ซ่ึงในสวนของ Ti plasmid จะมีสวนของ T-DNA (Transfer DNA) ขนาด 20 kb ที่สามารถถายทอดหรือแทรกเขาไปในจีโนมิกดีเอ็นเอของพืชได ซ่ึงสวนของ Ti plasmid ประกอบดวยยีนตางๆ ขั้นตอนการถาย T-DNA เขาสูเซลลพืชพอสรุปดังนี้ 1) Plant signal molecule attract the Agrobacterium and activate the T-DNA transfer process


คือบริเวณบาดแผลจะมีสารประกอบพวก Phenolic compound ไดแกสาร acetosyringone, hydroxyacetosyringone, vanillin, sinapinic acid, guaiacol, etc (รูปท่ี 26) 2) Binding of Agrobacterium to target plant cells พืชจะสรางสาร Plant vitronectin-like protein represent receptors ที่มีผลตอการเขาเกาะของ Agrobacterium โดยใชตําแหนง attract ซ่ึงเกี่ยวของกับยีน chvA, chvB, pscA, exoC, และ att gene ซ่ึงมีตําแหนงอยูบน Chromosomal DNA (รูปท่ี 26) 3) The T-DNA transfer into plant cell ยีนตางๆ บน Chromosomal DNA และ Phenolic compound จะทําให vir operon ทั้ง 7 vir gene เปด (รูปท่ี 27) ทําใหมีการถายชิ้นสวนของ T-DNA ดังมีขั้นตอน (รูปท่ี 28) ตอไปนี้ 3.1) The virA ทําหนาที่เปนตัวจดจําสาร Phenolic compound ที่พืชผลิตขึ้น จากนั้น virA จะสราง effector เพื่อกระตุนการเปด virG operon 3.2) virG operon โดย สราง receiver-effector ที่อยูในสภาพ inactive เมื่อมี effector จาก นั้น virA เขาเกาะก็จะเปลี่ยนเปนสภาพ active แลวเขาไปเกาะกับ Operator ของ vir ยีนตางๆ เพื่อเปด operon 3.3) virD1 และ virD2 operon ถูกเปด เพื่อสราง Endronucleolytic cleavage ซ่ึงมีตําแหนงจดจําอยูที่เบสตําแหนงที่ 3 และ 4 ของสายลางของดีเอ็นของ T-DNA ที่ตําแหนง LB และ RB โดยจะตัดพันธะ phosphodiester bond (nick) ทําใหเกิด T-DNA สายเดี่ยวหลุดออกมา (ในเวลาเดียวกัน ก็มีการสังเคราะห DNA สายใหมขึ้นมาทดแทนสายที่ขาดหายไป) 3.4) virC หนาที่ยังไมทราบแนชัด แตคาดวาเกี่ยวของกับกระบวนการ T-DNA processing (กระบวนการตัดและตอช้ินดีเอ็นเอ) โดย virC ทําหนาที่ผลิตโปรตีนแลวเขาเกาะกับบริเวณ Enhancer ที่อยูใกลกับ RB 3.5) virE ทําหนาที่สรางโปรตีน (Single strand DNA binding protein) เพื่อเขาเกาะกับ T-DNA สายเดี่ยวที่ถูกตัดออกมา ทําให T-DNA สายเดี่ยวนั้นมีความมันคงในระหวางการสงถายยีน 3.6) virB ทําหนาที่สรางโปรตีน แลวเขาไปเกาะกับเยื่อหุมเมมเบรนของพืช ทําใหเกิดรู เพื่อสงถาย T-DNA เขาสูเซลลพืช (virE ทําหนาทีคลายกับ tra gene) 4) Integration of T-strand in plant cell DNA 4.1) ปลาย 3/ OH ของ single strand T-DNA จะเขาไป synapsis กับสวนของ small homologies ของ plant cell DNA 4.2) เกิดจุดแตกหักบนสายหนึ่งของ plant cell DNA (สายลาง) 4.3) ปลาย 5/ P ของ single strand T-DNA เขาไปเชื่อมตอกับ plant cell DNA ที่เกิดจุดแตกหัก ซ่ึงมีรายงานวา virD อาจมีสวนชวยในกระบวนการนี้


4.4) DNA repair nick and gap มีการเชื่อมตอบริเวณ nick และ gap โดยการทํางานของ virD คลายกับการทํางานของ Ligase

การแทรกชิ้น single strand T-DNA จะมีสภาพเหมือนกับกระบวนการ Duplication ซ่ึงจะเห็นเปน Loop เกิดขึ้น โดย Loop ดังกลาวจะหายไปเมื่อมีการแบงเซลลแบบ mitosis

รูปท่ี 26 กลไกการถายชิ้นสวน T-DNA ของ A. tumefaciens เขาสูเซลลพืช เมื่อไดรับ Phenolic compound signal จากบาดแผลพืช

รูปท่ี 27 การทํางานของ vir gene opern ใน T-DNA ของ A. tumefaciens


รูปท่ี 28 กลไกการทํางานของ vir operon ในการถาย T-DNA เขาสูบาดแผลของเซลลพืช

สวนของ T-DNA นั้นจะเหมือนกับยีนที่อยูในพืช แตไมมีการแสดงออกใน

Agrobacterium ดังนั้นในการถายยีนเขาสูพืชนั้นก็อาจทําไดโดยการสรางเวคเตอรที่มีการตัดสวนของ T-DNA ออกไปจาก Ti plasmid แลวใสช้ินดีเอ็นเอที่ตองการลงไป ขณะเดี่ยวกันก็มีการดัดแปลงยีนอื่นเพื่องายตอการถายยีน ซ่ึงสามารถแบงไดเปน 2 แบบ คือ


1) Binary vector

เปนเวคเตอรที่แยกเอาสวนของ LB และ RB มาใสไวใน Plasmid ขนาดเล็ก ประมาณ 10 kb สวน vir gene ยังคงอยูใน Ti plasmid ของ Agrobacterium (รูปท่ี 29) (โดยมีการตัดสวน T-DNA ออกจาก Ti plasmid)

อยางไรก็ตามโดยทั่วไปแลว Agrobacterium สามารถ transfer ยีนไดเฉพาะในพืชใบเลี้ยงคูเทานั้น ดังนั้นในปจจุบันจึงมีการใชเทคนิคทางพันธุวิศวกรรมสราง Agrobacterium ที่เปน Super-binary vector

รูปท่ี 29 ตําแหนงตางๆ ของยีนใน Binary vector

2) Cointegration vector (รูปท่ี 30)

vector ของ Ti plasmid มาดัดแปลงโดยตัวสวนของยีนท่ํากหนาที่สรางฮอรโมนพืชและสารโอปนบางสวนออกจาก T-DNA แลวแทนที่ดวยดีเอ็นเอที่มาจาก plasmid ของ E. coli เชน Marker gene (AmpR) จุดประสงคเพื่อใชเปนสวน Homologos กับ DNA ของ E. coli

vector ที่ใชโคลนยีนใน E. coli เปน plasmid ขนาดเล็ก ประกอบดวย Marker gene (ที่ใชคัดเลือกในพืชและแบคทีเรีย), Target gene และ ori gene ของ E. coli จุดประสงคเพื่อถายยีนที่ตองการแลวนําไปโคลนใน E. coli


รูปท่ี 30 ตําแหนงตางๆ ของยีนใน Cointegration vector

การถายยีนเขาสูเซลลพืชโดยใช Agrobacterium ทําได 4 วิธี คือ 1) Co-cultivation with plant root culture (รูปท่ี 31) 2) Plant cell co-culture method (รูปท่ี 32)

รูปท่ี 31 การถายยีนเขาสู เซลลรากของพืช โดย co-culture technique


รูปท่ี 32 การถายยีนเขาสู เซลลพืช


ตัวอยางการสราง Transgenic plant

1) Herbicide resistance gene - Mode of action of Glyphosate (รูปท่ี 33)

aro A หนาที่สังเคราะห 5-enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate (EPSP) synthase ซ่ึงทําหนาที่สังเคราะหสาร EPSP ซ่ึงเปนสารตั้งตนในกระบวนการ biosynthesis pathway เพื่อสราง aromatic amino acid เชน Phenylalanine, tyrosis และ tryptophane เปนตน

EPSP synthase จะถูกยับยั้งการทํางานโดยสาร Glyphosate

รูปท่ี 33 กลไกการทํางานของ Glyphosate ในธรรมชาติพบวา มี aro A mutant จาก Salmonella typhimurium ทีมีสังเคราะห EPSP

synthase mutant โดยมี Prorine เขาไปแทนที่ Serine ทําให Glyphosate ไมสามารถเขาทําปฏิกิริยากับ EPSP synthase mutant ได ดังนั้นกเ็กิด EPSP ได เนื่องจาก EPSP synthase mutant มีหนาที่การทํางานเหมือนกับ EPSP synthase (เกิด Same sense mutation)

หรือใน Petunia hybrida ซึ่งมียีน CP4 EPSPS gene ทําหนาที่เกี่ยวกับการสังเคราะห EPSP synthase mutant โดยมีกรดอะมิโน Alanine เขาไปแทนที่กรดอะมิโน Glycine

เวคเตอรที่ใชสําหรับการถายยีน aro A mutant และ CP4 EPSPS gene แสดงดังรูปท่ี 34


รูปท่ี 34 เวคเตอรที่ใชสําหรับการถายยีน aro A mutant


2) Insect resistance gene

ถาย Bt gene หรือ cry gene หรือ delta endotoxin gene จาก Bacillus thuringiensis เขาสูพืช โดยใชเวคเตอร pGV2260:pTFD16 และ Agrobaterium vector ซ่ึงมีโครงสรางดังรูปท่ี 35

รูปท่ี 35 Gene construct bearing the Bt gene that confers insect resistance and a plant selectable marker (KmR) flanked by the borders (RB and LB) of the transferred DNA.


- Mode of action of Bt gene (รูปท่ี 36)

(เมื่อหนอนหรือแมลงกิน Bt (parasporal crytal หรือ delta endotoxin หรือ protoxin) เขาไป พบวา ใน midgut ของแมลงหรือหนอน (ซ่ึงมีสภาพเปนดาง และมี protease) จะยอย protoxin (130 kDa) ได active toxin (65 kDa) คือเปนผลึกรูปเข็ม (Crystal) ซ่ึงจะเขาไปแทงในสวนของ Membrane of the gut epithelial ทําใหเกิด รูร่ัว เกิดการแลกเปลี่ยนไอออน รบกวนการเกิดความสมดุลยของแรงดันออสโมติก สูญเสีย ATP ล ดกระบวนการ Metabolism หยุดกินอาหารและตายในที่สุด

รูปท่ี 36 การเกิด Active toxin protein ผลของ Active toxin protein


3) การใชเทคนิค Antisense RNA ในการยับยั้งการสุกของผลไม

- ใช ACC synthase gene จากสิ่งมีชีวิตทั่วๆ ไป - Mode of action of ACC synthase gene (รูปท่ี 37)

- Mechanism for inhibit gene expression โดยใชเทคนิค Antisense RNA (รูปท่ี 38)

ACC synthase

รูปท่ี 37 กระบวนการการสังเคราะหเอธิลีน


รูปท่ี 38 การยับยั้งการสังเคราะหเอธิลิน โดยใชเทคนิค Antisense RNA

การศึกษาวิวัฒนาการโดยเทคนิค การจําแนกสายพันธุ และการตรวจสอบสายพันธพืชโดย

ใชเทคนิค RAPD (รูปท่ี 39) ขั้นตอนการ RAPD คลายกับการทํา PCR แตมีขอแตกตางดังนี้ 1. primer ที่ใชใน RAPD มีจํานวนนิวคลีโอไทดนอยกวา primer ใน PCR (10-12 mers)

โดยอาจเรียก primer นี้วา universal primer 2. primer ที่ใชใน RAPD มีเพียงชนิดเดียว แต primer ที่ใชใน PCR มี 2 ชนิด 3. primer เหลานี้ไมจําเพาะเจาจงกับยีนใดยีนหนึ่ง ดังนั้น ช้ินดีเอ็นเอที่ไดจากปฏิกิริยา

PCR จึงมีหลายชิ้นที่มีขนาดตางกัน


RAPD Reaction #1: พืชชนิดท่ี A

RAPD Reaction #2: พืชชนิดท่ี B

รูปท่ี 39 การจําแนกสายพนัธุพืช 2 ชนิดโดยการวิเคราะห RAPD


การตรวจสอบกลายยีนและศึกษา Linkage โดยเทคนิค RFLP

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) หมายถึง ความแตกตางของชิ้นดีเอ็นเอตางๆ ที่ไดจากการตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ ซ่ึง RFLP มีประโยชนอยางมากในการจําแนกพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต การศึกษาวิวัฒนาการของสิ่งมีชีวิต การตรวจสอบความสัมพันธทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต (รูปท่ี 40) และการศึกษาการกลายพันธุในสิ่งมีชีวิต (รูปท่ี 41) จะไดช้ินสวนดีเอ็นเอที่มีขนาดตางๆ ซ่ึงอาจนํามาใชประโยชนในการทําแผนที่ดีเอ็นเโดยใชเอมไซมตัดจําเพาะ ดังรูปท่ี 42

รูปท่ี 40 โพลีมอรฟซึมของพืชโดยใชเทคนิ RFLP


รูปท่ี 41 การศึกษาการกลายพันธุของพืช โดยใชเทคนิ RFLP

รูปท่ี 42 การทําแผนที่ดีเอ็นเอโดยใชเอมไซมตัดจําเพาะใชเอมไซม 1 ชนิด


การตรวจสอบกลายยีนและศึกษา Linkage โดยเทคนิค Southern blot hybridization

อยางไรก็ตามในกรณีที่มีการใชเอมไซมตัดจําเพาะตัดดีเอ็นเอของยูคารีโอต เชนดีเอ็นเอของขาวโพด (มีขนาดประมาณ 4 x 105 กิโลเบส) เมื่อตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะที่มีตําแหนงจดจํา 6 คูเบส จะตัดไดช้ินดีเอ็นเอประมาณ 100,000 ช้ิน เมื่อนําชิ้นดีเอ็นเอที่ไดมาแยกโดยวิธิอิเล็คโทรโฟรีซิสและยอมดวยเอธิเดียยมโบรไมด จะปรากฏเปนแถบรอยยาวเห็นเปนเปอน (smear) ซ่ึงไมสามารถแยกเปนแถบดีเอ็นเอได เนื่องจากชิ้นดีเอ็นเอมีขนาดตางๆ กัน ดังนั้นในการตรวจสอบช้ินสวนดีเอ็นเอที่มียีนตองการหรือยีนที่สนใจ จึงจําเปนตองใช DNA หรือ RNA probe ที่ติดฉลากดวยสารกัมมันตรังสีหรือสารเคมี โดยโพรบนั้นตองสามารถเขาเกาะ (hybridize) กับบางสวนของช้ินสวนดีเอ็นเอที่ตองการ โดยใชเทคนิค Southern blot technique (รูปท่ี 43)

รูปท่ี 43 เทคนิคการทํา Southern blot hybridization


เทคนิค RFLP สามารถนํามาประยุกตใชในการพิสูจนหลักฐานหาผูกระทําผิดในทางนิติวิทยาศาสตรได เชนดังตัวอยางในรูปท่ี 44

รูปท่ี 44 เทคนิคการทํา Southern blot hybridization

การศึกษาลําดับของชิ้นดีเอ็นท่ีสนใจโดยเทคนิค DNA sequencing (รูปท่ี 45 และ รูปท่ี 46) การหาลําดับเบสอาจทําได 2 วิธี คือ วิธีทางเคมี และวิธีใชเอมไซม ซ่ึงในที่นี่จะกลาวถึง

การหาลําดับเบสโดยวิธี ใชเอมไซม DNA polymerase I (ซ่ึงสังเคราะหจาก T7) ทําหนาที่สังเคราะหสายดีเอ็นเอสายใหมที่มีเบสคูสมกับดีเอ็นเอแมแบบ การทํางานของเอมไซมนี้ตองการ primer ในการเริ่มตน จากนั้นจะนํานิวคลีโอไทดเขาตอที่ปลาย 3/ OH ของ primer (ทิศทางการ

สังเคราะห คือ 5/ → 3/) ซ่ึงการสังเคราะหจะสิ้นสุดเมื่อมีการนํา 2,3 dideoxy nucleotide tiphophate (dd NTP) เขาตอที่ปลาย 3 / OH ของ primer [บางครั้งอาจใชเอมไซม Klenow fragment

(คือเอมไซม DNA polymerase I ที่ตัดคุณสมบัติ 5/ → 3/ exonuclease) แทน DNA polymerase I ] ขั้นตอนการทํา DNA sequencing มีดังนี้ 1. กรณีที่ดีเอ็นเอที่ตองการหาลําดับเปนดีเอ็นเอสายคู (ซ่ึงไดจากการโคลนจากเวคเตอร

หรือจากจีโนมิกดีเอ็นเอ) ตองเตรียมดีเอ็นเอที่ตองการหาลําดับเบสใหอยูในรูป single strand DNA


เชน ใชความรอนแยกสายคูใหเปนสายเดียว แตถาดีเอ็นเอที่เตรียมจากการโคลนชิ้นดีเอ็นเอในเวคเตอร M13 phage ดีเอ็นเอที่ไดจะอยูใจสภาพ single strand DNA

2. ใช oligonucleotide primer ที่มีลําดับเบสเปนคูสมกับสวนของดีเอ็นเอแมแบบที่ตองการหาลําดับ (บางครั้งอาจติดฉลากดวย P32 ที่ปลาย 5/) สวนมากprimer จะมี 2 ชนิดคือ reverse and forward primer

3. แบงดีเอ็นเอที่เตรียมไดเปน 4 reactions ซ่ึงแตละ reaction เติม ddNTP และ dNTP ตางกัน ดังนี้

1) เติม ddATP และ dNTP + primer + enzyme 2) เติม ddCTP และ dNTP + primer + enzyme 3) เติม ddTTP และ dNTP + primer + enzyme 4) เติม ddGTP และ dNTP + primer + enzyme

4. นําแตละ reaction ไปเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอโดยเทคนิค PCR จากนั้นนํา PCR product ที่ไดมา run บน acrilamide gel (อาจทําโดยวิธี manual หรือ automate DNA sequencing)

5. อานลําดับเบสของดีเอ็นเอ ในทิศทาง 5/ -- 3/


รูปท่ี 45 การศึกษาลําดับของชิ้นดีเอ็นที่สนใจโดยเทคนิค DNA sequencing แบบใชเอมไซม


รูปท่ี 46 การหารลําดับเบส โดย Automate DNA sequencing


VII. Genetically Modified Organisms; GMOs GMOs หมายถึงส่ิงมีชีวิตทีถู่กตัดตอพันธกุรรมหรือดัดแปลงพันธุกรรม โดยเรียกสิ่ง

เหลานี้วา ส่ิงมชีีวิตแปลงพันธุ (transgenic organism) ปจจุบันไดมีการสรางสิ่งมีชีวิตแปลงพันธุ หลายชนิดทั้งใน แบคทีเรีย ยีนส พืช และสัตว ในป ค.ศ. 1999 พบวามีพืชแปลงพันธุ (transgenic plant) จํานวน 52 ชนิด (species) ไดแก ธัญพืช พืชเสนใย พืชตระกูลถ่ัว พืชน้ํามัน พืชผัก ไมผล ไมปายืนตน และพืชอาหารสัตว โดยพืชหลายชนิดเหลานี้ไดถูกนาํมาใชในเชิงการคา ทั้งแบบบริโภคสด และผานกระบวนการแปรรูป การทดลองทางพันธุวิศวกรรมหรือเทคโนโลยีดีเอ็นเอสายผสมนั้น จําเปนตองเกีย่วของกับการใชแบคทีเรียและสารเคมีหลายชนิด ซ่ึงนักวจิัยจงึจําเปนตองตระหนกัถึงอันตรายที่อาจเกดิขึ้นได ดังนั้นจึงมีมาตรการควบคุมความปลอดภัยทั้งของผูทดลองและผูที่เกี่ยวของ ในประเทศไทยมีหนวยงานที่ทาํหนาที่รับผิดชอบควบคุมดแูล และใหคําแนะนําเกีย่วกบัการวิจยัและการใชส่ิงมีชีวติแปลงพันธุหลายระดับ ดังนี ้ 1. ระดับหองปฏิบตัิการ ตองเปนหองที่อยูในระบบปด ซ่ึงสามารถควบคุมความปลอดภายตอบุคลากรที่ทํางานอยูและสิ่งแวดลอมภายในหองทดลอง โดยตองจัดสถานที่ อุปกรณ และเครื่องมือใหเหมาะสม รวมทั้งตองจัดอบรมบุลากรที่เกี่ยวของใหมีความรู ความเขาใจและระมัดระวังในการทดลอง เพื่อปองกันการแพรกระจายของสิ่งมีชีวิตแปลงพันธุหรือสารเคมีที่เปนอันตราย สูผูทดลองและสูสภาพแวดลอมภายนอก 2. ระดับภาคสนาม เมื่อตองการนําส่ิงมีชีวิตแปลงพันธุออกมาทดสอบในสภาพแวดลอมหรือแปลงปลูก (environmental release) ตองไดรับใบอนุญาตและทดสอบภายใตการควบคุมดูแลของหนวยงานที่เกี่ยวของ ตองมีขอมูลอธิบายรายละเอยีดของสิ่งมีชีวิต ลักษณะหรือยีนที่ถายฝาก ความเสี่ยงที่อาจเกิดขึน้ตอสภาพแวดลอม และวิธีทดสอบผลในดานตางๆ อยางละเอียด เชน ตองพิจารณาถึง การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของพชื ระบบการสืบพันธุ ระบบการขยายพนัธุ โอกาสที่จะผสมขามกับพันธุพืชอ่ืน ผลกระทบตอการปลูกพืชปกติ ผลกระทบตอจุลิทรียดิน รวมทั้งผลกระทบตอแมลงและสิ่งมีชีวิตชนิดอื่นๆ 3. ระดับการผลิตเปนการคา หลังจากผานการทดสอบภาคสนามแลว ถาผลการตรวจสอบไมพบผลเสียหรือเปนอันตราย ส่ิงมีชีวิตแปลงพนัธุนั้นก็อาจไดรับอนุญาตใหผลิตเปนการคาได (โดยตองผานขั้นตอนการพจิารณาจากหนวยงานที่เกีย่วของอีกหลายหนวยงาน) ประโยชนและความเสี่ยงของพืชแปลงพันธุ

ปจจุบันมีพบวานักวจิัยและประชาชน มีทั้งที่สนับสนุนและคัดคาน เนือ่งจากมีความคิด มีเหตุผล และมมีุมมองที่แตกตางกัน ซ่ึงพอสรุปไดดังนี ้


ประโยชนของพืชแปลงพนัธุ มีดังนี ้1. ลดการใชสารกําจัดวัชพชื โรคและแมลงศัตรูพืช 1.1 พืชดัดแปลงพันธุกรรมท่ีทําใหลดปริมาณการใชสารปราบวัชพืช ไดแก พืชแปลงพันธุ

ที่ทนทานตอสารปราบวัชพืชไกลโฟเสต (glyphosate) โดยมีการใชสารในระหวางการปูลกพืชแปลงพันธุเพียง 1-2 ครั้งเทานั้น (ปกติตองใชปริมาณมาก เพื่อกําจัดวัชพืชกอนทําการปลูกพืชหลัก)

1.2 พืชดัดแปลงพันธุกรรมท่ีทําใหลดปริมาณการใชสารกําจัดแมลง คือการสรางพืชที่ตานทานตอแมลง (Insect resistance gene) โดยการถาย Bt gene หรือ cry gene หรือ delta endotoxin gene จาก Bacillus thuringiensis เขาสูพืช

2. เพิ่มคุณคาทางอาหาร เชน พืชที่มีปริมาณของกรดอะมิโนสูง ขาวมีเบตาแคโรทีน และธาตุเหล็กสูงขึ้น เรพสีดมีไขมันไมอ่ิมตัวที่ดีในปริมาณสูง กลวยหรือแอบเปลมีสารที่ชวยกระตุนการสรางภูมิคุมกันหรือมีอินซูลิน พืชท่ีทนตอสภาพแวดลอมที่ไมเหมาะสม (เชน ทนน้ําทวม และทนเค็ม) และ ไมดอกไมประดับทีมีสีและรูปทรงแปลกตา (เชน มีการใสยีนเรืองแสงจากหิ้งหอย)

3. ยืดอายุการเก็บเก่ียวของผักและผลไม เชน การชะลอการสุกแกของมะเขือเทศ (ถายฝาก AAC gene)

ความเสี่ยงของพืชแปลงพันธุ

แมวาพืชแปลงพันธุที่นํามาใชเปนการคานัน้จะผานการทดสอบและประเมินผลทั้งในระดับหองปฏิบัติการและระดับภาคสนามมาแลวก็ตาม อาจยังไมปรากฏผลเสียใหเหน็ในระยะเวลาอันสั้น แตในระยะยาวอาจเกิดผลเสียก็ได ซ่ึงผลที่คาดวาอาจเกิดได มดีังนี ้

1. ผลตอสภาพแวดลอม 1.1 ทําลายพืช แมลง นก และสิ่งมีชีวิตในดนิ (หรือทําใหสมดุลธรรมชาติเสียไป) เชน (1) การปลูกพืชตานทานสารปราบวชัพืช อาจทําใหวัชพชืสูญพันธุ (2) การปลูกพืชท่ีตานทานแมลง อาจทําใหแมลงบางชนิดสูญพันธุ ทําใหสูญเสียหวงโซ

อาหารในธรรมชาติ 1.2 มีการเคล่ือนยายยนีเขาสูพืชอ่ืน อาจมีการถายทอดยีนจากพืชแปลงพันธุกรรม ไปสูพืช

ปกติหรือวัชพชื โดยการผสมขามระหวางชนิดหรือระหวางสกุล เชน เรพสีด (Brassica napus) สามารถผสมขามกับ wild turnip (Brassica rapa) ได

1.3 เกิดความตานทานและการรวมตัวใหมของยีน (gene recombination) แมลง และจุลินทรีย อาจมีการรวมตัวของยีนใหมหรือมีการปรับตัวใหสามารถเขาทําลายพืชปกติและพืชดัดแปลงพันธุได


1.4 สูญเสียความหลากหลายทางชีวภาพ เนื่องจากเกษตรกรจะหนัมาปลูกเฉพาะพืชดัดแปลพันธุทีด่ี แทนพืชดังเดิม

2. ผลตอสุขภาพคน ถึงแมวายังไมมีรายงานวาการบริโภคอาหารที่มีสวนของพืชแปลงพันธุหรือผลิตภัณฑที่

แปรรูปมาจากพืชแปลงพันธุ แลวทําใหเกดิตอคน แตก็มีความวิตกกังวลในดานตางๆ 2.1 อาจสารใหมท่ีเกิดขึ้น ยีนที่ถายเขาไปอาจมีผลทําใหเกิดการสังเคราะหสารใหม หรือ

เกิดการเปลีย่นแปลงสารอาหาร หรือผลผลิตจากยีนนัน้เขาไปทําปฏิกิริยากับสารบางอยางในพืช เชน โปรตีน คารโบไฮเดรท กรดไขมัน หรือสารอื่น (เชนฮอรโมน และสารสื่อประสาท) ทําใหเกิดอันตรายตอผูบริโภคได

2.2 อาจเกิดอาการภูมิแพ เชนการถายฝากยีนที่สังเคราะหโปรตีนบางชนิดจาก Brazil nut เขาสูถ่ัวเหลือง พบวาคนที่เคยมีอาการแพ Brazil nut จะเกดิภูมแิพดวยเมื่อกินถ่ัวเหลืองดัดแปลงพันธุ

2.3 อาจเกิดการถายทอดยีนเครื่องหมาย (marker gene) เขาไปสูจุลินทรียที่ทําใหเกดิโรค สวนมากยีนเครื่องหมายที่ใชคัดเลือกพืชแปลงพันธุนิยมใชยีนที่ทําใหเกิดการตานทานตอยาปฏิชีวนะ ดังนั้นจึงตองแนในวายีนเครื่องหมายนีไ้มสามารถถายทอดไปสูจุลินทรียที่ทําใหเกิดโรคได (เพราะจะทําใหจุลินทรยีตานทาน ดังนั้นเมื่อคนไดรับเชื้อจุลินทรียที่ทําใหเกิดโรคดังกลาว กจ็ะทํารักษาโดยใชยาปฏิชีวนะไมไดผล ทําใหการรักษายากขึ้น) นอกจากนั้นควรคํานึงดวยวา เอนไซมที่ทําหนาที่ยอยทําลายยาปฏชีิวนะทีม่ีในพชืแปลงพันธุ ควรหมดหรือลดประสิทธิภาพลงเมื่อมีการบริโภคสด หรือผานการปรุงอาหาร

2.4 คุณภาพทางอาหารอาจลดลง เชน มะเขือเทศแปลงพันธุที่สามารถชะลอการสุก ทําใหเก็บไดนาน ดงันั้นผูบริโภคอาจเขาใจผิดวามะเขือเทศนัน้ยังสดอยู ทัง้ๆ ที่ผานการเก็บมานานแลว และคุณคาทางอาหารบางอยางลดลงหรือสลายไปแลว

3. ผลทางเศรษฐกิจ เนือ่งจากเทคโนโลยีทางพันธุวศิวกรรมมีคาใชจายสูงและมคีวามซับซอน ดังนั้นประเทศทีก่ําลังพัฒนาซึ่งมีขีดความสามารถต่ําวา จําเปนตองซื้อเทคโนโลยีจากประเทศที่พัฒนาแลวในราคาแพง เนื่องจากมีการจดสิทธิบัตรของพืชแปลงพันธุ

วิธีการตรวจสอบพืชแปลงพันธุ สามารถทําได 2 วิธี คือ

1. การตรวจหาโปรตนี โดยใชวิธี ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) เปนการตรวจหาโปรตีนที่เปนผลผลิตของยีนใหมที่ฝากถายเขาสูพืช (target gene product) โดยมีหลักการ คือทําการสกัดโปรตีน (antigen) แลวนําไปเกาะตดิอยูกบัจานหลุมพลาสติก จากนั้น


เติมแอนติบอดี (antibody) ที่จําเพาะกับโปรตีนดังกลาว โดยบนโมเลกุลของแอนติบอดีมีเอนไซมชนิดหนึ่งเกาะอยู เมื่อเติมซับสเตรต (substrate) ของเอนไซมลงไปจะเกิดผลผลิต (product) ที่มีสี ซ่ึงแสดงถึงผลการตรวจสอบเปนบวก (positive) 2. การตรวจหาดีเอ็นเอ โดยเทคนิค PCR (Polymersase Chain Reaction)

เปนวิธีที่มีความถูกตองมากกวาวิธีแรก เนื่องจากดีเอ็นเอเปนโมเลกุลที่คงตัวมากกวาโปรตีน การตรวจหาทาํไดโดยตรวจหาที่ยีนที่ถูกถายฝากเขาสูพชื เชนสวนของโปรโมเตอร (promoter) สวนของยนีเปาหมาย (target gene) สวนของเทอรมิเนเตอร (terminator) หรือสวนของยีนเครื่องหมาย (marker gene) หลักการทํา PCR

คือ ถาทราบลําดับบางสวนของนิวคลีโอไทดที่อยูบริเวณสวนปลายของชิ้นสวนดีเอน็เอหรือยีนที่ตองการ การสามารถ design primer 2 ชนิด (25-35 nucleotides) มาใชในปฏิกิริยา PCR ก็จะสามารถเพิม่จํานวนชิ้นสวนของดีเอน็ทีต่องการไดในเวลาอันรวดเร็ว

เทคนิคการโคลยืชี นพ (Plant Gene Cloning...

Documents

Transcript of เทคนิคการโคลยืชี นพ (Plant Gene Cloning...