ป ที่ 9 ฉบับที่ 1 · สัตวแพทย์มหานครสาร...

ปท 9 ฉบบท 1ปท 9 ฉบบท 1มกราคม - มถนายน 2557มกราคม - มถนายน 2557

Volume 9 Number 1Volume 9 Number 1January - June 2014January - June 2014

www.vet.mut.ac.th/journal_jmvm

สตวแพทยมหานครสารสตวแพทยมหานครสาร JJoouurrnnaall ooff MMaahhaannaakkoorrnn VVeetteerriinnaarryy MMeeddiicciinnee

ปทปท 9 ฉฉบบบทบท 1 มกรมกราาคมคม – มมถนายนถนายน 22555577

VVoolluummee 99 NNoo.. 11 JJaannuuaarryy –– JJuunnee 22001144 IISSSSNN:: 11990055--77557711

wwwwww..vveett..mmuutt..aacc..tthh//jjoouurrnnaall__jjmmvvmm

คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร ไดจดทาวารสารทางวชาการขนดวย วตถประสงคเพอเผยแพรผลงานคนควาวจยทางวชาการ รวมถงกจกรรมตางๆ ทเกยวของกบสาขาสตวแพทย ศาสตร สตวบาล และสาขาทเกยวของ สงเสรมความสมพนธอนดระหวางนกวชาการทเกยวของกบวชาชพ สตวแพทย สตวบาล และเพอเผยแพรเกยรตคณของคณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร สานกงาน: คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร 140 ถนนเชอมสมพนธ เขตหนองจอก กรงเทพมหานคร 10530 โทร: 0-2988-3655 โทรสาร: 0-2988-4040

กาหนดตพมพ: ปละ 2 ฉบบ ฉบบท 1 เดอน มกราคม – มถนายน ฉบบท 2 เดอน กรกฎาคม – ธนวาคม คาสมาชก: 1 ป 140 บาท 2 ป 280 บาท 3 ป 420 บาท ตลอดชพ 1,000 บาท ราคาฉบบละ 70 บาท

สตวแพทยมหานครสารสตวแพทยมหานครสาร JJoouurrnnaall ooff MMaahhaannaakkoorrnn VVeetteerriinnaarryy MMeeddiicciinnee

คณะทปคณะทปรรกษากษา // AAddvviissoorryy CCoommmmiitttteeee

อธการบดมหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร President of Mahanakorn University of Technology คณบดคณะสตวแพทยศาสตร Dean of Faculty of Veterinary Medicine รองคณบดคณะสตวแพทยศาสตร Associate Dean of Faculty of Veterinary Medicine

บรรณาบรรณาธธการการ // EEddiittoorr

น.สพ.ดร.จาลอง มตรชาวไทย Dr.Jamlong Mitchaothai คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

ผชวยบรรณาธการ ผชวยบรรณาธการ / / AAssssiissttaanntt EEddiittoorr

ผศ.รชกฤช เลศภทรโกมล Assist.Prof.Rachakris Lertpatarakomol คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

กองบรรณากองบรรณาธธการการ // EEddiittoorriiaall BBooaarrdd

ผศ.สพ.ญ.ดร.จตรบรรจง เวยงเจรญ Assist.Prof.Dr.Jitbanjong Wiengcharoen คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

น.สพ.ธนากร พจนประสาท Thanakorn Pojprasath คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

สพ.ญ.ภควด คาพลงาม Pakawadee Kumpolngam คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

น.สพ.อนสรณ จาแสนชน Anusorn Jasancheun คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

น.สพ.เกยรตชย โรจนมงคล Kiatchai Rojanamongkol คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

รศ.สพ.ญ.ดร.นนทรกา ชนซอ Assoc.Prof.Dr.Nantarika Chansue คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine จฬาลงกรณมหาวทยาลย Chulalongkorn University

ผศ.น.สพ.อดศร ยะวงศา Assist.Prof.Adisorn Yawongsa คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน Kasetsart University, Kamphaengsaen campus

ผศ.น.สพ.ดร.สรรเพชญ องกตตระกล Assist.Prof.Dr.Sunpetch Angkittitrakul คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยขอนแกน Khon Kaen University

น.สพ.ดร.วรพงศ ตงจตเจรญ Dr.Weerapongse Tangjitjaroen คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเชยงใหม Chiangmai University

ผศ.ดร.เฉลมพล เยองกลาง Assist.Prof.Dr.Chalermpon Yuangklang คณะทรพยากรธรรมชาต Faculty of Natural Resources มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลอสาน Rajamangala University of Technology Isan, วทยาเขตสกลนคร Sakon Nakhon Campus

Prof.Dr.Kazuyoshi Taya Prof.Dr.Kazuaki Takehara Faculty of Agriculture, Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology Tokyo University of Agriculture and Technology

Prof.Dr.Kazuyuki Taniguchi Assoc.Prof.Dr.Kazumi Taniguchi Faculty of Agriculture, School of Veterinary Medicine, Iwate University Kitasato University

Prof.Dr.Anton C. Beynen Faculty of Natural Resources, Rajamangala University of Technology-Isan, Sakon Nakhon campus

ฝายทะเบยนวารสารฝายทะเบยนวารสาร // JJMMVVMM MMeemmbbeerr RReeggiissttrraattiioonn

จฬาภา สอนกลน Chulabha Sonklein คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

สพ.ญ.จตรา สนสรวงษ Jitra Sanisuriwong คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

ฝายฝายจจดการเวบไซตดการเวบไซต // JJMMVVMM WWeebbssiittee AAddmmiinniissttrraattoorr ฟารส ชนภกด Faris Cheunpakdee

คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology

ผทรงคณวฒประจาฉบบผทรงคณวฒประจาฉบบ // IIssssuuee RReevviieewweerrss ผศ.น.สพ.ดร.ทนงศกด มะมม

สพ.ญ.ดร.พงษศวะ โสตถพนธ

ดร.พงศธร คงมน

น,สพ.ดร.มงคล ชวณช สพ.ญ.ดร.ดานย แสงทอง

ผศ.สพ.ญ.ดร.จตรบรรจง เวยงเจรญ

สพ.ญ.ดร.สกญญา ผลตกล

น.สพ.ดร.วษณ วรรณแสวง ผศ.น.สพ.ดร.สมชย สจจาพทกษ

รศ.น.สพ.ประพฤกษ ตงมนคง

ผศ.น.สพ.ชนาธป ธรรมการ

บทบรรณาธการบทบรรณาธการ สวสดผอานทกทานสวสดผอานทกทาน

วารสารสตวแพทยมหานครสาร ฉบบนเปนปท 9 ฉบบท 1 ซงหากทานผอานสงเกตจะพบวาวารสารมการพฒนาขนเรอยๆ อยางตอเนอง กลาวคอ วารสารไดรบการบรรจอยในฐานขอมลวารสารของศนยดชนการอางองวารสารไทย (TCI Center) โดยมคาผลกระทบการอางอง (TCI impact factor) ในทศทางทเพมมากขน และไดการจดกลมวารสารในลาดบทดขน (เปลยนจากกลมท 2 เปน กลมท 1) จากศนยดชนการอางองวารสารไทย นอกจากนยงไดรบการบรรจในฐานขอมลของ ThaiLIS และ CAB international (CABI) ดงนนจะเหนไดวาวารสารมการพฒนาเขาสมาตรฐานทสงขนตามลาดบ

วารสารฉบบนมบทความทนาสนใจหลายเรอง ซงทางกระผมและกองบรรณาธการของวารสารหวงเปนอยางยงวา ทานผอานทกทานจะไดรบความรทนาไปใชประโยชนตอไปได

สดทายนกระผมและกองบรรณาธการ ขออาราธนาคณพระศรรตนตรยอานวยพรใหทานผอานทกทาน จงประสบแตความสข ความเจรญ ความกาวหนาในหนาทการงาน มสขภาพกายและใจแขงแรง และมครอบครวทอบอน

จาลอง จาลอง มตรชาวไทยมตรชาวไทย บรรณาธการบรรณาธการ

สตวแพทสตวแพทยยมหานครสารมหานครสาร ปท ปท 99 ฉบบท ฉบบท 11 มกรามกราคม คม –– มมถนายนถนายน 25525577 IISSSSNN:: 11990055 –– 77557711 wwwwww..vveett..mmuutt..aacc..tthh//jjoouurrnnaall__jjmmvvmm

สารบญสารบญ

บทความวจยบทความวจย การปนเปอนสารพษอะฟลาทอกซนและออกคราทอกซน เอ ในอาหารสตวเลยงในประเทศไทย

ณฐสทธ ตนสกล กมลชย ตรงวานชนาม ปารยา อดมกศลศร และศศธร ลมสวรรณ ...................................................... 1

การตรวจสอบแอนไทบอดทจาเพาะตอโรคนวคาสเซลในนกกระจอกเทศโดยวธทดสอบทางซรมวทยา ศกดชย เรอนเพชร และ Kazuaki Takehara ............................................................................................................... 11

ผลของการใชหญามลาโต 2 และถวฮามาตา ในรปแบบสดและหมกตอการกนได กระบวนการหมกในกระเพาะรเมน และองคประกอบของกรดไขมนในของเหลวจากกระเพาะรเมนของแพะเนอ

อจฉรา ลกขณานกล ปราโมทย แพงคา เสมอใจ บรนอก Yasuhiro Kawamoto และจาลอง มตรชาวไทย ................ 23

ประสทธภาพของวคซน Mastivac® สาหรบปองกนโรคเตานมอกเสบในแมโคนม จตพร กระจายศร อนสรณ จาแสนชน จาลอง มตรชาวไทย และชนาธป ธรรมการ ..................................................... 37

บทความวชาการบทความวชาการ การใชวธทางอณชวโมเลกลตรวจหาเชอ Trypanosoma evansi ในเลอดโคและกระบอ

ไพทล แกวหอม. .......................................................................................................................................................... 49

การใชสสกดจากพชในการยอมสเนอเยอ อารยา สบขาเพชร และณฐกาญจน นายมอญ .............................................................................................................. 63

บทความปกณกะบทความปกณกะ ปรศนาสตวปวย

สวรน ภาวสทธไพศฐ ..................................................................................................................................................... 79

JJoouurrnnaall ooff MMaahhaannaakkoorrnn VVeetteerriinnaarryy MMeeddiicciinnee

VVoolluummee 99 NNoo.. 11 JJaannuuaarryy –– JJuunnee 22001144 IISSSSNN:: 11990055 –– 77557711 wwwwww..vveett..mmuutt..aacc..tthh//jjoouurrnnaall__jjmmvvmm

CCoonntteennttss

RReesseeaarrcchh aarrttiiccllee A Survey of Aflatoxins and Ochratoxin A Contamination in Pet Food in Thailand

Natthasit Tansakul, Kamolchai Trongvanichnam, Pareeya Udomkusonsri and Sasithorn Limsuwan ..... 1

Detection of Newcastle Disease Virus-specific Antibodies in Ostrich Sera by Various Serological Methods

Sakchai Ruenphet and Kazuaki Takehara ........................................................................................................... 11

Effect of Fresh and Silages of Mulato II Grass and Verano Stylo on Intake, Rumen Fermentation and Fatty Acid Profile in Rumen Fluid of Meat Goats

Achara Lukkananukool, Pramote Paengkoum, Samerjai. Bureenok, Yasuhiro Kawamoto and

Jamlong Mitchaothai ............................................................................................................................................... 23

The Efficiency of Mastivac® Vaccine for Preventive Mastitis in Dairy Cow Jatuporn Kajaysri, Anusorn Jasanchuen, Jamlong Mitchaothai and Chanathip Thammakarn ................ 37

RReevviieeww aarrttiiccllee Molecular Detection of Trypanosoma evansi among Cattle and Buffaloes Blood

Paitoon Kaewhom. ................................................................................................................................................... 49

Using Dye Plant Extract for Histological Staining Araya Suebkhampet and Nattakarn Naimon ...................................................................................................... 63

MMiisscceellllaannyy aarrttiiccllee What’s your cytological diagnosis?

Suvarin Pavasutthipaisit ......................................................................................................................................... 79

ขอแนะนาสาหรบผเขยนขอแนะนาสาหรบผเขยน วตถประสงคและขอบเขตของเนอหา วตถประสงคและขอบเขตของเนอหา ((AAiimm aanndd SSccooppee))

สตวแพทยมหานครสารเปนวารสารทางวชาการของคณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร จดทาขนเพอเผยแพรผลงานการคนควาวจยทางวชาการทเกยวของกบสตวแพทยศาสตร สตวศาสตร และวทยาศาสตรทเกยวของกบการผลตสตว โดยเนอหาจะครอบคลมตงแตระดบโมเลกลและเซลล วทยาศาสตรพนฐาน ชววทยาของสตว พฤตกรรมสตว พชอาหารสตว วทยาศาสตรการผลตสตว วทยาศาสตรการสตวแพทย (พนฐาน พรคลนก และคลนก) ระบาดวทยาในสตว สตวแพทยสาธารณสข และวทยาศาสตรเนอสตว ตลอดจนวทยาศาสตรและเทคโนโลยแขนงอนๆ ทมโอกาสในการพฒนาและ/หรอประยกตใชในวทยาศาสตรทเกยวของกบสตวได

คาแนะนาสาหรบการเตรยมบทความคาแนะนาสาหรบการเตรยมบทความ กองบรรณาธการวารสาร สตวแพทยมหานคร

สาร ยนดรบเรองจากทกทานทใหความสนใจ และกรณาสงมาเพอเผยแพร ดงนนเพอความสะดวกในการพจารณา กองบรรณาธการมขอเสนอแนะดงน

11.. เรองทจะนาสงลงตพมพเรองทจะนาสงลงตพมพ

1.1 บทความวจย (Research article หรอ Original article) เปนงานคนควาทดลอง หรองานวจยทางวชาการทเกยวกบสตวหรอพชอาหารสตว ทงททาในประเทศและ/หรอตางประเทศ

1.2 บทความวจยขนาดสน (Short communication) เปนรายงานผลการวจย หรอผลงานทดลองทางดานวทยาศาสตรทเ กยวของกบสตว เพอการเผยแพร

โดยสงเขป หรอเพอการนาเสนอประเดนทคนพบใหมโดยเผยแพรเฉพาะสวนสาคญอยางกระชบ

1.3 รายงานสตวปวย (Case report) เปนรายงานทไมเคยตพมพมากอนและเกยวของกบโรคหรอปญหาทพบในสตว ซงทางกองบรรณาธการพจารณาเหนประโยชนตอทางวชาการสตวแพทย

1.4 บทความวชาการ (Review article) เปนบทความหรอยอเอกสารท เ ปนประโยชน และเกยวของกบวชาการทางสตวแพทย สตวบาล และสาขาทเกยวของทกสาขา โดยการรวบรวมและเรยบเรยงจากเอกสารทางวชาการ

1.5 บทความปกณกะ (Miscellany article) เปนบทความทเกยวกบการใหขอมลทางวชาการสาหรบผปฏบตงานทเกยวของกบสตว เชน ปรศนาสตวปวย ปรศนาเซลลวทยาวนจฉย

22.. ตนฉบบตนฉบบ 2.1 ตนฉบบทจะสงมาลงพมพตองไมเปนเรองท

เคยตพมพ หรอกาลงอยระหวางพจารณาเพอลงในหนงสอหรอวารสารอน

2.2 ต น ฉ บ บ พ ม พ เ ป น ภ า ษ า ไ ท ย ห ร อภาษาองกฤษ จานวน 2 ชด ดวยอกษร Browallia new 16 บนกระดาษขาวเอ 4 โดยพมพหนาเดยว เวนขอบกระดาษดานซาย และดานบน 1.5 นว ดานขวาลาง และดานลาง 1 นว โดยความยาวของเรองพรอมตารางและภาพประกอบรวมแลวไมเกน 12 หนา และใหใสหมายเลขหนาตามลาดบ โดยพมพดวยโปรแกรม Microsoft Word (Window 98 หรอเวอรชนทสงกวา) แลวจงจดสงตนฉบบอเลกทรอนกส (Electronic file) บนแผนซดขอมล (PC formatted

CD) พรอมสาเนาทพมพลงบนกระดาษขาวเอ 4 จานวน 2 ชด

2.3 หากตนฉบบทจะสงมรปภาพประกอบดวย ใหแทรกรปภาพดงกลาวในตาแหนงทเหมาะสมในตนฉบบ และ Save ไฟลตนฉบบของรปภาพทมความละเอยดสงลงในแผนซดขอมลแยกจากไฟลตนฉบบ โดยตงชอไฟลของรปภาพใหสามารถสอบทวนไดวาเปนรปภาพใดในตนฉบบ

2.4 ไมมการสงคนตนฉบบ ในกรณทไมผานการพจารณาแตจะแจงใหทราบ

33.. การลาดบเรองควรเรยงดงนการลาดบเรองควรเรยงดงน 3.1 ชอเรอง (Title) ควรตงชอใหสอดคลอง สอ

ความหมายไดดกบเนอหาในเรอง 3.2 ชอผเขยนและผรวมเขยน (Author and Co-

authors) เขยนชอนามสกลเตมท งภาษาไทยและภาษาองกฤษใตชอเรอง พรอมทงสถานททางานทตดตอไดสะดวก และกรณาบอกหมายเลขโทรศพทหรอโทรสาร และ E-mail ของผรบผดชอบ (Corresponding author) เพอความรวดเรวในการตดตอ โดยใหระบอยใตคาสาคญ

3.3 บทคด ยอ (Abstract) เ ขยนสนๆ ใ ห ไ ดเ นอความครอบคลมท งหมด ในกรณท ตนฉบบภาษาไทยจะตองม ชอ เ รองและบทคดยอเ ปนภาษาองกฤษ และตนฉบบภาษาองกฤษตองมชอเรองและบทคดยอเปนภาษาไทย บทคดยอใหเขยนไวหนาสดทายของเรองเปนหนาหนงตางหาก

3.4 คาสาคญ (Keywords) เปนคาหรอขอความสนๆ ทมความหมายแสดงถงความเปนไปของการทดลองนนๆ รวมกนแลวไมเกน 5 คา ระบอยใตบทคดยอ (ขนบรรทดใหม ) ท งภาษาไทยและภาษาองกฤษ

3.5 บท น า ( Introduction) บรรย ายคว ามเปนมา และควรมการตรวจเอกสาร (Literature review) ประกอบดวย รวมทงอธบายถงจดประสงคของการทดลอง

3.6 อปกรณและวธการ (Materials and Methods) ในกรณท เปนการคดคนขนใหมควรอธบายอยางละเอยด ถาเปนวธการททราบกนอยแลวและเคยมผตพมพแลว ไมตองบรรยายซาควรเขยนในลกษณะอางอง และอธบายเฉพาะสวนทดดแปลงหรอเพมเตม พรอมทงวธวเคราะหผลการทดลองทางสถตดวย

3.7 ผลการทดลอง (Results) การรายงานผลการทดลองเปนคาบรรยายควรใหละเอยดและเขาใจงาย หากเปนไปไดควรเสนอผลในรปตาราง รปภาพ หรอกราฟ ไมควรแสดงถงผลทเหมอนกน ถาเปนตารางควรใหชดเจนและขนาดพอเหมาะกบขนาดของหนาหนงสอ ตารางควรมความหมายในตวเอง และตองมคาอธบายเหนอตารางดวย ในกรณท เปนรปภาพ (Figures) ควรเปนภาพขาวดาหรอสไลด หากตองการใหตพมพภาพส ทางคณะผจดทาจะพจารณาถงความเหมาะสมและคาใชจาย หากมหลายรปตองเรยงลาดบกอนหลงพรอมทงมเครองหมายกาหนดบอกดานบนของรปดวยดนสอ และอธบายรายละเอยดไวใตรป คาอธบายประกอบรปภาพและตาราง รวมทงองค ประกอบในตารางและร ปภาพใ ห ใ ช เ ปนภาษาองกฤษทงหมด โดยรวบรวมและเรยงตามลาดบใหสอดคลองกบหมายเลขของรปภาพและตารางทนาเสนอ ควรระบความหมายของสญลกษณทใช ในกรณทกาหนดเครองหมายแสดงความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต ใหกากบ P-value ทใชในการวเคราะหผลการทดลอง ทงนการกลาวถงคา P-value ในเนอหาของบทความใหใชอกษรภาษาองกฤษตวพ

ตวใหญเอยง เชน P-value, P≤0.05 และ P>0.05

3.8 วจารณ (Discussion) เปนการวจารณผลการทดลอง การประเมนผล และการตคาของผลงาน การวจารณผลควรเปรยบเทยบกบผลงานของผอนทไดกระทามาแลว และควรเนนถงสงทไดคนพบ

3.9 สรป (Conclusion) อาจมหรอไมกได หากเปนบทความ การตรวจเอกสาร หรอเปนการทดลองทมหลายขอ ควรมบทสรปทเขยนใจความสาคญและคณคาของงานเพอผอานจะไดเขาใจมากขน

3.10 กตตกรรมประกาศ (Acknowledgement) ควรมในกรณทไดรบความชวยเหลอหรอความรวมมอในการสนบสนนงานคนควาวจย

3.11 เอกสารอางอง (References)

44.. การเขยนอางองในเนอเรองควรอางองการเขยนอางองในเนอเรองควรอางองดงน ดงน - การอางองให เขยนเปนภาษาองกฤษ

ทงหมด ทงการอางองในเนอหาบทความ และในสวนของเอกสารอางองดานทายบทความ โดยหากเนอหาของเอกสารทนามาใชอางองเขยนเปนภาษาอน ทไมใชภาษาองกฤษ ใหเขยนอางองเปนภาษาองกฤษ พรอมระบภาษาทใชเขยนในบทความนนๆ ไวในวงเลบดานทายสดของรายการเอกสารอางองนนๆ ตวอยางเชน Mitchaothai, J., Wiengchareon, J.,

Chaiworaporn, J., Srenanuan, P. and Yuangklang, C. 2005. Balantidiasis in growing pigs: A case report. KKU. Vet. Journal. Vol.15 No.1: 166-174. (in Thai)

{ ซงเปนตวอยางทอางองมาจากบทความภาษาไทย : จาลอง มตรชาวไทย จตรบรรจง เวยงเจรญ จฑามาศ ชยวร

ภร ไพวลย ศรนานวล และ เฉลมพล เยองกลาง. 2548. ภาวะการตดเชอ Balantidium ในสกรรน:

รายงานสตวปวย. วารสารสตวแพทยศาสตร มข. 15 (1): 166-174. }

- กรณอางองจากการตรวจเอกสารโดยผอนใหใช คาวา อางถงโดย (Cited by)

- ผรายงานเอกสารทงทเปนคนไทยและชาวตางประเทศ เมอเปนประธานของประโยคใหใช Mitchaothai et al. (2005), Tomato and Danny (2006), Taylor et al. (2006) หรอเมอผรายงานอยกลางและทายประโยคใหใช (Mitchaothai et al., 2005), (Tomato and Danny, 2006), (Taylor et al., 2006) ตามลาดบ โดยหากในประโยคหรอสวนของประโยคทมเอกสารอางองมากกวาหนงเอกสารใหคนระหวาเอกสารดวยเครองหมาย “ ; ”)

- อางถงบคคล หรอเรองทไมเคยตพมพมากอน (Personal comm.) ใหอางเฉพาะในเนอเรองเทานน ไมตองนาไปลงในรายชอเอกสารอางอง

- การเขยนเอกสารอางองทายบทความ ใหเขยนเรยงลาดบพยญชนะภาษาองกฤษของชอสกล ตามดวยชอยอของผแตง (หากมผแตงมากกวาหนงคน ใหคนระหวางผแตงดวยเครองหมาย “ , ”) ดงตวอยาง คอ Mitchaothai, J., Everts, H., Yuangklang, C.,

Wittayakun, S., Vasupen, K., Wongsuthavas, S., Srenanul, P., Hovenier, R. and Beynen, A.C. 2008. Digestion and deposition of individual fatty acids in growing-finishing pigs fed diets containing either beef tallow or sunflower oil. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 92 (4): 502-510.

- หากเอกสารอางองเปนตารา ใหระบชอผเขยน ปท พมพ ชอเ รอง ชอตารา คร งท พมพและช อ

บรรณาธการ (หากม) สานกพมพ เมองทพมพ และจานวนหนาทงหมด ดงตวอยาง คอ Mamom, T. 2008. Basic Veterinary

Histopathology and Practice. 1sted. Mahanakorn University of Technology publishing. Bangkok. 227 p.

{ ซงเปนตวอยางทอางองมาจากหนงสอภาษาไทย : ทนงศกด มะมม. 2551. ตาราจลพยาธวทยาขนพนฐานทาง

สตวแพทยและบทปฏบตการ (Basic Veterinary Histopathology and Practice). พมพครงท1. ส าน ก พมพมหา วทยาล ย เทคโนโล ยมหานคร . กรงเทพมหานคร. 227 หนา. }

- หากเอกสารอางองเปนบทความจากการประชมวชาการ (Conference proceedings) ใหระบชอผเขยน ปทพมพ ชอเรอง ชอการประชมวชาการ สถานทจดประชม วน-เดอน-ปทประชม สานกพมพ และเลขทหนาของบทความ ดงตวอยาง คอ Lertpatarakomol, R., Mitchaothai, J.,

Trairatapiwan, T. and Lukkananukool, A. 2010. Preliminary survey on intestinal parasite infestation in natural Thai indigenous beef cattle from Kanchanaburi province at a slaughterhouse. Proceedings of the 14th Asian-Australasian Association of Animal Production Societies (AAAP), Pingtung, Taiwan, ROC, 23-27 August 2010: 468.

- หากเอกสาร อ าง อ ง เ ปนบทความจากอนเตอรเนท (Internet) ใหระบชอผเขยน ปทเผยแพรทางอนเตอรเนท (สบคนขอมลเมอ วน-เดอน-ป) ชอเรอง ชอการประชมวชาการ สถานทจดประชม วน-เดอน-ปทประชม สานกพมพ และเลขทหนาของบทความ ดงตวอยาง คอ Mitchaothai, J., Yuangklang, C., Wittayakun, S.,

Vasupen, K., Wongsuthavas, S., Srenanul, P., and Beynen, A.C. 2005 (cited 21 December 2010). Mathematical modelling between Pork Colour and Pork and Carcass Qualities in commercial finishing pigs. Available from: http:// www.scisoc.or.th/stt/31/ sec_f/paper/stt31_F0043.pdf.

55.. การพจารณาบทความการพจารณาบทความ บทความทกบทความทลงตพมพในวารสารสตว

แพทยมหานครสาร เปนบทความทผานการพจารณาจากผทรงคณวฒทเชยวชาญ (Referees) สาหรบแตละสาขาอยางนอย 2 ทานตอบทความ ยกเวนบทความปกณกะผานการพจารณาจากผทรงคณวฒทเชยวชาญอยางนอย 1 ทาน

66.. สถานทรบตนฉบบสถานทรบตนฉบบ สงถง น.สพ.ดร. จาลอง มตรชาวไทย บรรณาธการ สตวแพทยมหานครสาร คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร 140 ถ. เชอมสมพนธ เขตหนองจอก กรงเทพมหานคร 10530 โทร. 0-2988-3655 ตอ 5102-3 โทรสาร 0-2988-4040 เอกสารทตองสง มดงน

1. ตนฉบบจรงจานวน 2 ชด 2. แผนซดขอมล

หมายเหต

1. ชอทางวทยาศาสตรทงภาษาองกฤษและทบศพทภาษาไทยใหพมพโดยใชตวอกษรเอยง 2. ไมมคาเรองลงพมพและผเขยนตองรบผดชอบคาพมพภาพส หากเปนความตองการของผเขยน และ

ผเขยนผรบผดชอบทกเรองจะไดรบสาเนาพมพ 3. ความคดเหนใดๆ ทลงตพมพในวารสารสตวแพทยมหานครสารในแตละฉบบเปนของผเขยน ไมจาเปน

ทกองบรรณาธการของวารสารฯ และผทรงคณวฒตองเหนดวยเสมอไป

บทความวจย

สตวแพทยสตวแพทยมหานครสารมหานครสาร JJOOUURRNNAALL OOFF MMAAHHAANNAAKKOORRNN VVEETTEERRIINNAARRYY MMEEDDIICCIINNEE Available online: www.vet.mut.ac.th/journal_jmvm

การปนเปอนสารพษอะฟลาทอกซนและออกคราทอกซน เอ ในอาหารสตวเลยงในประเทศไทย

ณฐสทธ ตนสกล1,# กมลชย ตรงวานชนาม1 ปารยา อดมกศลศร1 และศศธร ลมสวรรณ2

1ภาควชาเภสชวทยา คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรงเทพฯ

2บรษท ศนยวทยาศาสตรเบทาโกร จากด คลองหลวง ปทมธาน

บทคดยอ: เปนททราบโดยทวไปวาอาหารสตวมกจะมการปนเปอนสารพษจากเชอราได ซงการไดรบสารพษจากเชอราอาจสงผลกระทบทรายแรงตอสขภาพของสตวได สาหรบในเขตรอนชนนนพบวาสารพษจากเชอราทตรวจพบในอาหารสตวสวนมากมกจะผลตไดจากเชอรากลมหลงการเกบเกยวเชน อะฟลาทอกซน และออคราทอกซน เอ อยางไรกตามโดยทวไปแลวมกมรายงานของสารพษจากเชอราทปนเปอนในอาหารสตวของปศสตวมากกวาในสตวเลยง ดงนนในการศกษาครงนจงมวตถประสงคมงเนนทจะสารวจตรวจวดระดบการปนเปอนสารพษจากเชอราในอาหารเมดของสนขและแมวในประเทศไทย โดยใชวธโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสงดวยการทาอนพนธโบรมนและใชแสงฟลออเรสเซนตในการตรวจวด ซงผลทไดแสดงใหเหนอยางชดเจนวาทกตวอยางของอาหารเมดสนขมการปนเปอนอะฟลาทอกซนแตพบในระดบตา นอกจากนพบวาอาหารสนข 7 ตวอยางและ อาหารแมว 9 ตวอยาง ถกปนเปอนดวย ออคราทอกซน เอ ในชวงคาเฉลยท 2.46-14.04 ไมโครกรม/กโลกรมทงในอาหารเมดของสนขและแมว

คาสาคญ: อะฟลาทอกซน ออกคราทอกซน เอ อาหารสตว อาหารสตวเลยง ประเทศไทย #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2557. 9(1): 1-9. E-mail address: [email protected]

Natthasit Tansakul et al. / J. Mahanakorn Vet. Med. 2014. 9(1): 1-9.

2

A Survey of Aflatoxins and Ochratoxin A Contamination in Pet Food in Thailand

Natthasit Tansakul1,#, Kamolchai Trongvanichnam1, Pareeya Udomkusonsri1 and

Sasithorn Limsuwan2

1Department of Pharmacology, Faculty of Veterinary Medicine, Kasetsart University, Bangkok, THAILAND 2Betagro Science Center Co., Ltd., KlongNueng, KlongLuang, Pathumthani, THAILAND

Abstract: Presence of mycotoxin in feed ingredient is commonly known. Exposure of mycotoxin may generate a serious concern for animal health. In tropical zone, mycotoxin that produced by post harvest fungi such as aflatoxin and ochratoxin A is frequently found in animal feed. In general, mycotoxin contamination in animal feed are mostly report specific on livestock feed rather than pet food. This study was aimed to monitor the mycotoxins contamination in commercial dry dog and cat food in Thailand. The mycotoxins were determined by the HPLC system with post-column bromination and fluorescence detection. As presented, the result clearly showed that there was no sample free from aflatoxin contamination. The total AF level was found at trace level. In addition, 7 samples of dog food and 9 samples of cat food were contaminated with OTA. The mean values of OTA-positive pet food samples were 2.46-14.04 μg/kg for dog and cat food.

Keywords: Aflatoxin, Ochartoxin A, Feed, Pet food, Thailand #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2014. 9(1): 1-9. E-mail address: [email protected]

Introduction

Mycotoxin, secondary fungal metabolite, is naturally and unavoidable toxicant. It has significant impact on human and animal health. Hence, consumers are pay attention to food and feed safety. Mycotoxin contamination in animal feeding stuff is of interested worldwide and has

been well reviewed (Leung et. al., 2006; Tansakul, 2012). In tropical zone, fungal is commonly present in agricultural commodities and thus could be a contaminant in food and feed (Martins et al., 2003). Mycotoxin in which produced by post-harvest fungi such as aflatoxin (AF) and ochratoxin A (OTA) is usually found in


3

foodstuff. Aflatoxin is a carcinogenic and mutagenic metabolite produced by the fungal strains of Aspergillus spp. As known, A. flavus produces aflatoxin B1 (AFB1) and aflatoxin B2 (AFB2), whereas A. parasiticus produces those aflatoxin B serie as well as aflatoxin G1 (AFG1) and aflatoxin G2 (AFG2) (Shephard, 2009).

Aflatoxin is metabolized extensively by the liver where it is the majority of the toxic effects. Exposure can be acute or chronic depend on toxin concentrations and show variable clinical signs such as weakness, diarrhea, alternate liver function and blood chemistry profiles. Dog is one particularly specie sensitive to the aflatoxin effect (Scudamore, et al., 1997). Another interested toxin produced by post-harvest fungi is ochratoxin which has 3 members designated as A, B and C. Among those, OTA is considered to be the most toxic. It has wide range of toxicological effects associated with the inhibition of the protein synthesis due to its competition with phenylalanine. Kidney is the main target of OTA toxicity in mammalian species. Moreover, OTA is classified as a possible carcinogen in category Group 2B. As known, acute or chronic exposure of mycotoxin may generate a serious concern for animal health. Hence, monitoring on feeding stuff is necessary to prevent a cause of animal health hazard.

Contamination of AF and OTA in pet food have been reported worldwide e.g. Austria (Razzazi et al., 2001; Böhm et al., 2010), Turkey (Gunsen et al., 2002), Brazil (Maia et al., 2002; Campos et. al., 2009; Wouters et al., 2013). However, little scientific information is available for prevalence of mycotoxin in pet food in Thailand. Therefore, AF contamination in 30 samples from ten different market brands of dog food was tested. In addition, total of 60 commercial market samples of dog and cat foods were monitored for OTA contamination. The mycotoxins levels were carried out by the HPLC fluorescence detection system couple with post-column bromination.

Materials and Methods

Total of 90 dry pet food samples were collected for 2 separated analysis; AF contamination in dry dog food (n=30) and OTA contamination in dry dog food (n=30) and dry cat food (n=30). All samples were blind sampling taken from Pet shop’s shelf in central region of Thailand during April 2011- February 2012, kept in -80°C and tested within 3 months after collected. Mixed aflatoxin standard (HPLC grade) of AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2 from Supelco® (Bellefonte PA, USA) and OTA standard from Sigma® were used. The method was partially validated. Briefly, the calibration of five


4

standard solutions concentration range from 0.25-10 ng/ml was prepared and duplicate injection daily. The detection limit (LOD) and the limit of quantification (LOQ) were determined at signal-to-noise ratio of 3:1 and signal-to-noise ratio of 10:1, respectively. Repeatability, reproducibility and recovery were conducted in triplicate (n=3) with control spiked with 10 μg/kg of AFs and 5 μg/kg of OTA. Both mycotoxins were carried out by HPLC fluorescence detector with post-column bromination (a signal enhancement of Kobracell) and separated on analytical column (ACE C-18, 150 mm×4.6 mm, 5 μm, ACE, Aberdeen, UK). Analysis functions were obtained by linear regression (R2) of peak areas on standard concentrations.

For AF analysis, HPLC was performed under an excitation and emission wavelengths at 365 and 440 nm, respectively. Extraction and clean-up procedure were modified following Böhm’s method (Böhm et al., 2010).The analysis was run at flow rate of 1 ml/min using mixture of water:methanol:acetonitrile (62:22:16, v/v/v) where 119 mg of potassium bromide (KBr) and 350 μl of 4 M HNO3 were added to 1 L of mobile phase. Sample preparation for AF analysis was done by adding 30 ml of acetonitrile:deionized water (60:40, v/v) into 10 g of each sample and mixed for 30 min. Then, the matrix was filtrated though paper

filters and kept into polypropylene test tube. Thereafter, the immuno-affinity column (IAC; AflaCLEAN™, LCTech GmbH, Germany) was used for clean-up procedure by dilute 3 ml of extracted solution with 30 ml PBS. Then the diluted samples were applied on IAC following the construction. Each eluate was put into glass test tube and allowed to dry under gentle nitrogen stream. The sample was reconstituted with 1 ml mobile phase and kept in an aliquot at -20°C pending injected into the HPLC system.

For OTA analysis, the method was performed following Reiter et al., 2011. The system was done by running with mobile phase consisted of methanol : acetonitrile : 3.3% aqueous solution of glacial acetic acid (35:35:30, v/v/v) at flow rate 0.8 ml/min. OTA was detected by the HPLC with fluorescence detector at an excitation wavelength of 333 nm and an emission wavelength of 467 nm. For extraction and clean-up process, added 100 ml of acetonitrile : deionized water (60:40, v/v)into 25 g of sample then mixed by stirring for 30 min and filtered through a filterpaper. Thereafter, 4 ml of the liquid was diluted with 50 ml PBS containing 0.5%Tween 20 and applied on the IAC (OtaCLEAN™, LCTech GmbH, Germany). Then passed 10 ml distilled water to wash the column and eluted the substance with 2 ml of methanol. After well evaporated, the

sample mobile at -20analysis

A(Figure columndetectioquantifyvalidateand AFGwas 0.0recover30 dry sample contamaflatoxiμg/kg. Aand AF0.70 ± AFG2 w(Table 1 Table 1

Aflana

AAAA

Natth

was recophase and

0°C pendins.

Aflatoxin a1): The an

n brominaon providy AF analoged data, theG2 was 0.0

02-0.08 μg/kry range 72-

dog foodswas

mination. Ann concenAverage (± FG1, respec0.54 and 0

was not d1).

1 Four aflat

latoxin alogues AFB1 AFB2 AFG1 AFG2

hasit Tansak

onstituted d collected ng the c

Results analogues alytical metation and ed high

gues in feede LOD of AF1-0.04 μg/k

kg, respectiv-105%. Thes clearly shfree fro

n average (ntrations w

SD) levels ctively, wer0.05 ± 0.04 detected in

oxin analog

Aflatoxin-(Dog f

kul et al. / J

with 1 minto an aliq

chromatogra

in dog fthod with p

fluorescesensitivity

d. Based onFB1, AFB2, Akg and the vely, with me result of thowed thatom aflato(± SD) of twas 3.17±

of AFB1, Are 2.49 ± μg/kg whe

n any sam

gues contam

Positive samfood; n= 3030/30 28/30 14/30 0/30

J. Mahanako

l of quot aphy

food post-ence

to n the AFG1 LOQ

mean total t no oxins total

±2.43 AFB2 1.97, ereas

mples

Figuaflatsam(low

the 0.20recosamsamfoodrest (<0.0devwerefor d

minated in p

mple 0)

<

orn Vet. Med

ure 1 Typtoxin analo

mple (upperwer-line)

Ochratoxcalculated

0 μg/kg, reovery range

mples were mples of dod were con

contained 06 μg/kg). Tiation of Oe 14.04 ± 9.dog and cat

pet food sam

AfMin0.440.050.02<0.08

d. 2014. 9(1

pical chromogues spikedr-line) and

xin A in peLOD and L

espectively, 89-95%. A t

examinedg food and

ntaminated no detect

The mean vOTA-positive .44 μg/kg anfood, respe

mples.

flatoxin (μgMax7.872.401.30<0.08

1): 1-9.

matogram d 10 μg/kg

standard

et food (FiLOQ were 0 with thetotal of 60 p

d. As a red 9 samplewith OTA

table level values and s

pet food nd 2.46 ± 2.ectively (Tab

g/kg) Average ±

2.49 ± 1.0.70 ± 0.0.05 ± 0.

<0.08

5

of four in blank solution

gure 2): 0.06 and e mean pet food esult, 7 s of cat and the of OTA

standard samples 10 μg/kg

ble 2).

± SD985404

6

Table 2

Dog fCat fo

Figure 2A spikedand bla

Inmycotomost fopet foousually particulmatrix main s(Gonzálbeen contamfeed (So

Asstudy fomean v

Natth

2 The occur

Sample

food (n=30)ood (n=30)

2 Typical chd 5 μg/kg innk sample (

Dn general, oxin contamocused on od (Streit e

contain larly dry pefor fungi g

source of lez et al.,

documenmination in ongsermsaks comparedound total

value of 3.17

hasit Tansak

rrence of OT

O

hromatogramn blank sam(lower-line)

Discussion publication

mination in alivestock fe

et al., 2012high amouet food wrowth, andmycotoxin 1997). In ated thatdry feed h

kul et al., 20d with othof AF at tr

7 μg/kg, low

kul et al. / J

TA detected

OTA-Positiv

7/39/3

m of ochratmple (upper-

ns related animal feedeed rather 2). In pet funts of grhich is a g

d might be contamina

addition, it t mycotohigher than 007). her studies, race level,

wer amount

J. Mahanako

d in pet foo

ve sample

3030

toxin -line)

with d are than food rains, good

the ation

has oxins wet

this with than

deteal., 2002rangYaro(Mar0.5 AFBAFBnot prevanimotheguidthe pet feedat 2the Devaflatμg/kspecreguNevcontleve

orn Vet. Med

od samples

OMin2.770.31

ected in th2001), and2). Recentlyge 1.75-20 oglu, 2002) rtins et al.,μg/kg; Böh1 was detec2, AFG1, refound in

vious studmal feed iser analogudance value

European ffood is lim

d of dairy a20 μg/kg fo

Thai velopment toxin in gekg depend cies. Howeulation on vertheless, ttaminant lel set by DL

d. 2014. 9(1

Ochratoxin AMax44.408.94

e Mexico (5 Brazil (19 y, AF in doμg/kg in Tubut not de

, 2003) andhm et al., cted in all sespectively, any sampleies, AFB1 obviously es (Leung

e of aflatoxinfood safety

mited at 5 μnimals and

or feed matDepartment(DLD) has

eneral animon type o

ever, theremycotox

he present level lowerD.

1): 1-9.

A (μg/kg) Average ±14.04 ± 92.46 ± 2

5 μg/kg; Shμg/kg; Maia

og food waurkey (Gunsetected in d Austria (le2010). As asample followhereas A

e. In coincicontaminapredominaet al., 2

n contaminauthority (

g/kg for comyoung animterials. In Tt of L

set the mal feed atof feed ande is no in in petstudy detecr than pro

± SD9.442.10

harma et a et al., as found sen and Portugal ess than a result, owed by AFG2 did ide with ation in ant than 2006). A ation by (EFSA) in mpound

mals and Thailand, Livestock limit of t 30-100 d animal

specific t food. cted the ohibition


7

OTA is typically found not only in cereal grains but also in animal tissue because of its long half-life and bound tightly with plasma proteins. A former report, Razzazi et al., (2001), detected mean value of OTA residue at 0.85 μg/kg from 16 out of 26 cat kidney. In Korea, it was documented that 3 dogs died from renal failure that feed contaminated with OTA might be involved (Jeong et al., 2006). Moreover, there was evidence in Thailand that 4 out of 50 dogs died from chronic renal failure related to OTA exposure (Pothimongkolkul et al., 2006).

The current results showed incidence of OTA remains in cat food more than in dog food. However, dog food appears to be contaminated with OTA higher level than in cat food. The present study showed lower incidence of OTA contamination in pet food but higher level than that found in previous reports (González et al., 1997; Razzazi et al., 2001). In the EU, the maximum level for OTA in complementary and complete feeding stuffs for pigs is set at 50 μg/kg. So far, no level limit stipulated for OTA in animal feed in Thailand. Unfortunately, the samples did not simultaneously analyze the co-occurrence of both mycotoxins. However, no information concerning the synergistic or chronic effects of low mycotoxin exposure on health hazard for dog and cat (Böhm, 2006). Therefore, detection of aflatoxin and

OTA in pet food and majority organ such as liver and kidney samples should further be investigated. Regarding the fact that mycotoxin is naturally contaminated in agricultural products including pet food, the effectiveness of its control depends on a rigorous monitoring program.

Acknowledgements A study funding was partially

supported by UNOVET NETWORK CO.LTD., Thailand. Chemical agents were kindly provided by the University of Veterinary Vienna, Vienna, Austria. The authors declare no conflict of interest.

References Böhm, J. 2006. Effects of mycotoxins on

domestic pet species. In: Laue, D.K. and Tucker, L.A. (eds). Recent advances in pet nutrition. Nottingham University Press, Nottingham, U.K, 169-192.

Böhm, J., Koinig, L., Razzazi-Fazeli, E., Blajet-Kosicka, A., Twaruzek, M., Grajewski, J. and Lang, C. 2010. Survey and risk assessment of the mycotoxins deoxynivalenol, zearalenone, fumonisins, ochratoxin A, and aflatoxins in commercial dry dog food. Mycotox. Res. 26: 147-153.


8

Campos, S.G., Keller, L.M., Cavaglieri, L.R., Krüger, C., Juri, M.G.F., Dalcero, A.M., Magnoli, C.E. and Rosa, C.A.R. 2009. Aflatoxigenic fungi and aflatoxin B1 in commercial pet food in Brazil. World Mycotox. J. 2(1): 85-90.

Commission regulation (EC) 401/2006. Laying down the methods of sampling and analysis for the official control of the levels of mycotoxins in foodstuffs.

González, H.H.L., Martinez, E.J. and Resnik, S.L. 1997. Fungi associated with sorghum grain from Argentina. Mycopathol. 139: 35-41.

Gunsen, U. and Yaroglu, T. 2002. Aflatoxin in dog and horse feeds in Turkey. Vet. Hum. Toxicol. 44: 113-114.

Jeong, W.I., Do, S.H., Jeong, D.H., Chung, J.Y., Yang, H.J., Yuan, D.W., Hong, I.H., Park, J.K., Goo, M.J. and Jeong, K.S. 2006. Canine renal failure syndrome in three dogs. J. Vet. Sci. 7: 299-301.

Leung, M.C.K., Dı´az, L.G. and Smith, T.K. 2006. Mycotoxins in Pet Food: A Review on Worldwide Prevalence and Preventative Strategies. J. Agric. Food Chem. 54: 9623-9635

Maia, P.P. and Bastos de Siqueira, P. 2002. Occurrence of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in some Brazilian pet foods. Food Addit. Contam. 19(12): 1180-1183.

Martins, M.L., Martins, H.M. and Bernardo, F. 2003. Fungal flora and mycotoxins detection in commercial pet food. Rev. Port. Sci. Vet. 98: 179-183.

Pothimongkolkul, S., Sailasuta, A. and Pattamalai, B. 2006. The Relationship Between Ochratoxin a Residue in Kidneys and Nephropathic Lesions in Canine Chronic Renal Failure. The proceeding of 32nd annual conference of Thai Veterinary Medical Association. 31-32.

Razzazi, E., Böhm, J., Grajewski, J., Szczepaniak, K., Kübber-Heiss, A.J. and Iben, C.H. 2001. Residues of ochratoxin A in pet foods, canine and feline kidneys. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. (Berl). 85(7-8): 212-216.

Reiter, E.V., Cichna-Markl, M., Tansakul, N., Shim, W.B., Chung, D.H., Zentek, J. and Razzazi-Fazeli, E. 2011. Sol-gel immunoaffinity chromatography for the cleanup of ochratoxin A contaminated grains. J. Chromatogr. A. 1218(42): 7627-7633.

Scudamore, K.A., Hetmanski, M.T., Nawaz, S., Naylor, J. and Ainbird, S. 1997. Determination of mycotoxins in pet foods sold for domestic pets and wild birds using linked- column immunoassay clean-up and HPLC. Food Addit. Contam. 14: 175-182.


9

Sharma, M. and Marquez, C. 2001. Determination of aflatoxins in domestic pet foods (dog and cat) using immunoaffinity column and HPLC. Anim. Feed Sci. Technol. 93: 109-114.

Shephard, G.S. 2009. Aflatoxin analysis at the beginning of the twenty-first century. Anal. Bioanal. Chem. 395(5): 1215-1224.

Streit, E., Schatzmayr, G., Tassis, P., Tzika, E., Marin, D., Taranu, I., Tabuc, C., Nicolau, A., Aprodu, I., Puel, O. and Oswald, I.P. 2012. Current situation of mycotoxin contamination and co-occurrence in animal feed--focus on Europe. Toxins. 4(10): 788-809.

Tansakul, N. 2012. A brief communication on mycotoxicosis in livestock. J. Mahanakorn Vet. Med. 7(1): 37-46.

Wouters, A.T.B., Casagrande, R.A., Wouters, F., Watanabe, T.T.N., Boabaid, F.M., Cruz, C.E.F. and Driemeier, D. 2013. An outbreak of aflatoxin poisoning in dogs associated with aflatoxin B1-contaminated maize products. J. Vet. Diagn. Invest. 25(2): 282-287.



การตรวจสอบแอนไทบอดทจาเพาะตอโรคนวคาสเซลในนกกระจอกเทศ

โดยวธทดสอบทางซรมวทยา

ศกดชย เรอนเพชร1,# และ Kazuaki Takehara2

1ภาควชาภมคมกนและไวรสวทยา คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร 2Laboratory of Animal Health, Department of Veterinary Medicine,

Tokyo University of Agriculture and Technology, Japan

บทคดยอ: การตรวจหาระดบของแอนไทบอดทจาเพาะตอโรคนวคาสเซลจากตวอยางซรมนกกระจอกเทศจานวน 70 ตวอยาง โดยวธ virus neutralization (VN) test, haemagglutination inhibition (HI), HI ทใชเมดเลอดแดงไกในการยบยงภมคมกนทไมจาเพาะ (non specific reaction) ในซรมนกกระจอกเทศกอนการทดสอบ (HI treated) และวธ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ผลการศกษาพบวา เมอเปรยบเทยบวธ HI กบ VN test พบวา ความไวของการทดสอบ (sensitivity) เปนรอยละ 22.45 คาความจาเพาะของการทดสอบ (specificity) เปนรอยละ 100 คาพยากรณผลบวก (positive predictive value) เทากบรอยละ 100 และคาพยากรณผลลบ (negative predictive value) เปนรอยละ 35.59 ในขณะทวธ HI treated เปรยบเทยบกบวธ VN test จะไดรอยละ 48.98, 76.19, 82.76 และ 39.02 ตามลาดบ และวธ ELISA เมอเปรยบเทยบกบ VN test จะไดรอยละ 16.67, 28.57, 31.82 และ 14.63 ตามลาดบ นอกจากน การศกษาเปรยบเทยบวธทางซรมวทยาทง 3 วธ (HI, HI treated และ ELISA) เมอเปรยบเทยบกบวธ VN test พบวามคาสมประสทธความสมพนธ (correlation coefficient) เปน 0.782, 0.53 และ -0.48 ตามลาดบ ผลการศกษาพบวา วธการตรวจทางซรมวทยาในการตรวจหาระดบภมคมกนตอโรคนวคาสเซลในนกกระจอกเทศในครงน ใหผลไมสอดคลองกนเหมอนกบในสตวปกชนดอน สาหรบนกกระจอกเทศนน วธ VN test ยงคงใหผลเทยงตรง และเชอถอไดมากกวาวธทงสามในการทดลองน แตมขอเสยคอ ใชเวลานานและใชแรงงานมากเมอเทยบกบวธการอน รวมถงจาเปนตองใชไวรสทมชวตสาหรบการทดสอบโดยวธน คาสาคญ: ไวรสนวคาสเซล นกกระจอกเทศ Haemagglutination inhibition test, Enzyme-linked immunosorbent assay #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2557. 9(1): 11-21. E-mail address: [email protected]

Sakchai Ruenphet and Kazuaki Takehara / J. Mahanakorn Vet. Med. 2014. 9(1): 11-21.

12

Detection of Newcastle Disease Virus-specific Antibodies in Ostrich Sera by Various Serological Methods

Sakchai Ruenphet1,# and Kazuaki Takehara2

1Department of Immunology and Virology, Faculty of Veterinary Medicine, Mahanakorn University of Technology, THAILAND, 2Laboratory of Animal Health, Department of Veterinary Medicine, Tokyo University of Agriculture and

Technology, JAPAN

Abstract: All of seventy ostrich sera were tested by the virus neutralization (VN) test, the haemagglutination inhibition (HI), HI with pre-adsorption by chicken red blood cells (HI treated) and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for specific-antibodies detection against Newcastle disease virus (NDV). The sensitivity, specificity, positive predictive and negative predictive values were shown as 22.45%, 100%, 100% and 35.59% in HI compared with VN test, respectively. The HI treated compared with VN test was 48.98%, 76.19%, 82.76% and 39.02%, respectively. The relative sensitivity of ELISA compared with VN test was 16.67%, 28.57%, 31.82% and 14.63%, respectively. The present study shows that all tests (HI, HI treated and ELISA) have no strong correlation as r = 0.782, 0.53 and -0.48 respectively when compared with VN test. The conflicting results lead to the conclusion that estimation of antibodies to NDV in ostrich sera is not as straightforward as in other poultry. The VN test gave more accurate and reliable than other tests but it is laborious, time consuming and requires live virus.

Keywords: Newcastle disease virus, Ostrich, Haemagglutination inhibition test, Enzyme linked immunosorbent assay #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2014. 9(1): 11-21. E-mail address: [email protected]

Introduction

Newcastle disease (ND) is one of the most important infectious diseases in birds throughout the world. ND virus (NDV) is an avian paramyxovirus serotype 1 (APMV-1)

that belongs to the genus Avulavirus, sub-family Paramyxovirinae, family Paramyxoviridae, order Mononegavirales (Mayo, 2002). NDV infections have been established in at least 241 species of birds


13

representing 27 of the 50 orders of the class (Kaleta and Baldauf, 1988) including ostriches (Struthio camelus var. domesticus). NDV spreads to birds on a farm easily, either by aerosol or fecal-oral route, including feed vehicles and personnel can also act as mechanical carriers introducing the virus into uncontaminated areas (Alexander, 1995). Virulent NDV infections may show clinical signs as per-acute death especially in chickens and raptors, but in infected ducks and geese the virus brings about little or no disease (Alexander, 2000).

In countries which are leading producers and major exporters of ostrich products, such as South Africa, it is important to reduce the risk of NDV transmission by effective vaccination. Because of the severe nature of the disease and the associated consequences, ND is included as an Office International des Epizootics (OIE) listed disease. Because of their size, longevity and rearing methods, problems to be overcome in achieving successful prophylactic vaccination of ostriches are quite different to those associated with vaccinating chickens and other poultry. Little is known of the immune response in ostriches; further, efficacy and potency tests have not been carried out, would be difficult to evaluate and would be extremely expensive (Alexander, 2000).

Serological methods such as the haemagglutination inhibition (HI) test, is the accepted method for detecting NDV-specific antibodies in poultry sera. However, sera from other species often induce non-specific reactions in the HI test and, in order to avoid these reactions, sera will be adsorbed with chicken red blood cells before they are tested (Ruenphet, 2012). Allwright (1996) reported that the HI test gave poor results when ostrich sera were tested, although chicken red blood cells were replaced by ostrich red blood cells.

Several reports described that indirect enzyme-linked immunosorbent assays (I-ELISA) have been developed, evaluated and well correlated to the HI test for serodiagnosis of NDV in poultry (Brown et al., 1990; Cvelic-Caabrilo et al., 1992; Richtzenhain et al., 1993). In spite of their high sensitivity, easy standardization, lack of requirement for serum pretreatment, and possible computerization of the system, these assays have the disadvantage of not being applicable to the testing of ratite sera in a single system unless anti-ratite species conjugates are used in place of an anti-chicken conjugate (Cadman et al., 1997; Williams et al., 1997).

The present study tested and compared the various serological methods for antibody detection against NDV in ostrich serum and virus neutralization (VN) test.


14

Materials and Methods Seventy sera were taken from the

slaughterhouses of Japan Ostrich Council (JOC) which are located at Asahi town in Yamagata prefecture and Abashiri city in Hokkaido, and a commercial ostrich farm in Kanagawa, Japan. The sera were frozen at -30ºC until tested.

Chicken embryo fibroblasts (CEF) were prepared from 10-day-old chicken embryos as described (Takehara et al., 1987; Takehara et al., 1991). Virus neutralization (VN) test for NDV was performed by plaque-reduction method with a constant amount of virus and varying serum dilution. Sera samples and antiserum against NDV strain Ishii (Yachida et al., 1979) were diluted in a serial four-fold with phosphate buffered saline (PBS: 0.14M NaCl, 2 mM KCl, 3 mM Na2HPO4, 1.5 mKH2PO4, pH 7.2), and mixed with equal volumes of NDV strain Sato. The neutralizing antibody titer was calculated at 50% plaque reduction point by Behrens-Kaerber’s method (Matumoto, 1949). The titers equal to or greater than 4 were considered a positive result (Sakai et al., 2006).

The HI test was carried out as described in Council Directive 92/66/EEC, using 8 haemagglutination (HA) units; the sera were tested with and without pre-adsorption with chicken red blood cells (HI treated). Titer of 1/8 or more were regarded as positive (CEC, 1992).

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) plates were prepared by Laboratory of Animal Health, Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology, Japan. Briefly, crude ND virus from infected CEFs, were coated on ELISA 96 well microplates using a carbonate buffer for overnight, then 5% skim milk in PBS (S-PBS) was used for non-specific reaction blocking. Sera were diluted in S-PBS containing 0.05% Tween-20 (S-PBS-T), then inoculated onto coated ELISA plate for 30 minutes. After washing with PBS containing 0.05%Tween-20 (PBS-T) three times, goat anti-bird IgG-heavy and light chain antibody horseradish peroxidase conjugated (Bethyl Laboratories Inc., USA) was added to the wells for 2nd antibody reaction and incubated for a further 30 minutes. The binding of the conjugated was visualized with ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt) at 450 nm wavelenght. The test was performed at room temperature. The wells were washed between the incubation steps three times with PBS-T. Optical density (OD) values were determined with a microtitre plate photometer. The OD values of the serum samples were compared to the NDV-negative and positive samples.

The HI, HI treated or ELISA test were analyzed to determine relative sensitivity,


15

specificity and predictive value compare with VN test. The probability that a test will indicate 'disease' among those with the disease namely sensitivity, was defined as the proportion of VN-positive samples that were correctly identified by the HI, HI treated or ELISA, and the specificity that is the fraction of those without disease who will have a negative test result, was defined as the proportion of correctly identified VN-negative samples. The accuracy was defined as the proportion of 2 tests, both positive and negative, which was corrected. The positive and negative predictive value (PPV and NPV) are the proportions of positive and negative results in statistics and diagnostic tests that are true positive and true negative results (respectively), was defined as the proportion of sera with positive or negative ELISA (or HI, HI treated) and VN results relative to the total number of ELISA (or HI, HI treated)-positive or negative sera, respectively. The sensitivity, specificity and predictive value were calculated using following equation:

Sensitivity = number of true positive/(number of true positive + number of false negative)

Specificity = number of true negative/(number of true negative + number of false positive)

Positive predictive value = number of true positive/(number of true positive + number of false positive)

Negative predictive value = number of true negative/(number of true negative + number of false negative)

Where true positive is positive result from both tests, true negative as negative result from both tests, false positive as other test showed positive but VN test showed negative, and false negative as other test showed negative but VN test showed positive result.

They are expressed in percentages. VN values were linearly regressed on HI titers, HI treated or ELISA. In addition, the correlation coefficient (Pearson’s r) was obtained and defined as below;

0.90 to 1.00 = very high correlation 0.70 to 0.90 = high correlation 0.50 to 0.70 = moderate correlation 0.30 to 0.50 = low correlation 0.00 to 0.30 = very low correlation

Results

The positive and negative result of all tests are showed in Table 1, and the relationship between the VN and HI titer, VN and HI treat, VN and ELISA for NDV are shown in Table 2.

In the comparison between HI and VN titer for all 70 ostrich sera, 11 (15.7%) were positive and 21 (30%) were negative with


16

Table 1 The results of the examination of 70 ostrich sera by virus neutralization, hemagglutination inhibition without and with treated and ELISA tests HI test HI test (treated) ELISA Positive Negative Positive Negative Positive NegativePositive VN test 11 38 24 25 7 35Negative VN test 0 21 5 16 15 6

VN: Virus neutralization HI test: Hemagglutination inhibition test HI test (treated): Hemagglutination inhibition test after treat with pre-adsorption with chicken red blood cells ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay Table 2 Relative sensitivity, specificity and predictive accuracy between HI and VN, HI after treat with pre-adsorption by chicken red blood cells and VN titer, and ELISA and VN test HI to VN HI (treated) to VN ELISA to VNSensitivity (%) 22.45 48.98 16.67Specificity (%) 100.00 76.19 28.57Positive predictive value (%) 100.00 82.76 31.82Negative predictive value (%) 35.59 39.02 14.63

VN: Virus neutralization HI test: Hemagglutination inhibition test HI test (treated): Hemagglutination inhibition test after treat with pre-adsorption by chicken red blood cells ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay both the HI test and VN test. Thirty-eight (54.3%) were positive only with the VN test. The sensitivity, specificity, positive predictive and negative predictive values are shown as 22.45%, 100%. 100% and 35.59% respectively (Table 2). There is high correlation (r = 0.782) between the HI and VN test (Fig. 1).

In the comparison between HI treated and VN titer for all 70 ostrich sera, 24 (34.3%) were positive and 16 (22.9%) were negative with both the HI treated and

VN test. Twenty-five (35.7%) were positive only with the VN test, whereas five (7.1%) were positive only with the HI treated test. The relative sensitivity of HI treated test compared with VN test, the sensitivity, specificity, positive predictive and negative predictive value are shown as 48.98%, 76.19%. 82.76% and 39.02% respectively (Table 2). There is moderate correlation (r = 0.530) between the HI treated and VN test (Fig. 2).


17

Fig. 1 Correlation between serum titer obtained by the VN (log4) and the HI test (log2)

Fig. 2 Correlation between serum titer obtained by the VN and the HI test after treat with

pre-adsorption by chicken red blood cells (HI treated)

Negative Positive

Nega

tive

Posit

ive

Negative Positive

Nega

tive

Posit

ive


18

Fig. 3 Correlation between serum titer obtained by the VN and the ELISA test. The neutralizing antibody

titer by VN test was calculated at 50% plaque reduction point. The optical density (OD) values of ELISA

test equal to or greater than 0.26 were considered as positive results

In the comparison between ELISA and VN titer for 63 ostrich sera, 7 (11.1%) were positive and 6 (9.5%) were negative with both the ELISA and the VN test. Thirty-five (55.5%) were positive only with the VN test, whereas fifteen (2%) were positive only with the ELISA test. The sensitivity, specificity, positive predictive and negative predictive values are shown as 16.67%, 28.57%. 31.82% and 14.63% respectively (Table 2). There is very low correlation (r = -0.480) between the ELISA and VN test (Fig. 3).

Discussion and Summary As the present study shows, all of the

tests there was no strong correlation when compared with VN test. Sakai et al. (2006) reported that the VN test was more accurate and reliable than HI test including heat, kaolin and chicken red blood cell treatment before HI test. Several researchers reported poor results using the HI test for ostrich sera (Alexander, 2000; Ruenphet, 2012). Allwright (1996) considered false negative results to be a serious problem and recommended a microneutralization test or a standard enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Nega

tive

Posit

ive

Negative Positive


19

test. In contrast, Williams et al., (1997) showed the high incidence of false positive results and felt than the heat and kaolin treatment they used to remove “non-specific agglutination reaction” reduced the sensitivity of the HI test that is not consistent with this study.

Several researchers developed the ELISA for specific-antibodies against NDV in ostrich sera, such as, Cadman et al (1994) developed the indirect ELISA test using a peroxidase-labelled goat anti-ostrich IgG serum and Allwright (1996) used biotinylated rabbit anti-ostrich-immunoglobulin IgG antiserum for standard ELISA. Jorgensen et al., (1988) described unusual results in ostrich and emu flocks in which NDV had been isolated from birds dying during quarantine. At the end of the 95-day quarantine period, all sera were negative in HI and virus neutralization (VN) tests, but by a commercial blocking ELISA test, 35% of the birds were clearly positive and 35% gave borderline results. These results are unusual and difficult to explain. In this study, the secondary antibody of ELISA was the goat anti-bird IgG-heavy and light chain antibody horseradish peroxidase conjugate that might not be specific to immunoglobulin G in ostrich serum, so the values of sensitivity, specificity, positive and negative predictive and accuracy were very low.

The conflict resulting in this study lead to the conclusion that estimation of antibodies to NDV in ostrich sera is not as straightforward as in other poultry. Usually the VN test has been more accurate and reliable than HI test but it is laborious, time consuming and require live virus. Czifra et al. (1996) reported that the blocking enzyme-linked immunosorbent assay (b-ELISA), which relies on blocking the binding of a monoclonal antibody against NDV, has the advantage of being suitable for use with sera from various different species in poultry and does not require an anti-ostrich conjugated serum.

References

Alexander, D.J. 1995. The epidemiology and

control of avian influenza and

Newcastle disease. Comp. Pathol. 112:

105-126.

Alexander, D.J. 2000. Newcastle disease in

ostriches (Struthio camelus) - a review.

Avian pathol. 29: 95-100.

Allwright, D. 1996. Viruses encountered in

intensively reared ostriches in southern

Africa. Proceeding of Improving our

Understanding of Ratites in a Farming

Environment, Oxford, UK. 27-33.

Brown, J., Resurreccion, R.S. and Dickson,

T.G. 1990. The relationship between


20

the hemagglutination-inhibition test

and the enzyme-linked immune-

sorbent assay for the detection of

antibody to Newcastle disease. Avian

Dis. 34: 585-587.

Cadman, H.F., Kelly, P.J., Angelis, N.D. De.,

Rohde, C., Collins, N. and Zulu, T.

1997. Comparison of enzyme-linked

immunosorbent assay and

haemagglutination inhibition test for

the detection of antibodies against

Newcastle disease virus in ostriches

(Struthio camelus). Avian Pathol. 26:

357-363.

CEC, 1992. Council Directive 92/66/EEC on

introducing community measures for

the control of Newcastle disease.

Official Journal of the European

Communities. L260: 1-20.

Cvelic-Cabrilo, V., Mazija, H., Bidin, Z. and

Ragland, W.L. 1992. Correlation of

hemagglutination inhibition and

enzyme-linked immunosorbent assays

for antibodies to Newcastle disease

virus. Avian Pathol. 21: 509–512.

Czifra, G., Nilsson, M., Alexander, D.J.

Manvell, R., Kecskem´eti, S. and

Engstrom, B. 1996. Detection of PMV-1

specific antibodies with a monoclonal

antibody blocking enzyme-linked

immunosorbent assay. Avian Pathol.

25: 691–704.

Jorgensen, P.H., Lommiczi, B., Manvell. R.J.,

Holm, E. and Alexander, D.J. 1998.

Isolation of avian paramyxovirus type 1

(Newcastle disease) viruses from a

flock of ostriches (Struthio camelus)

and emus (Dromaius novaehollandiae)

in Europe with inconsistent serology.

Avian Pathol. 27: 352-358.

Kaleta, E.F. and Baldauf, C. 1988. Newcastle

disease in free-living and pet birds. pp.

197-246. In D.J. Alexander (Ed),

Newcastle Disease. Kluwer Academic

Publishers. Boston, MA.

Matumoto, M. 1949. A note on some points

of calculation method of LD50 by

Reed and Muench. Jpn. J. Exp. Med.

20: 175-179.

Mayo, M.A. 2002. A summary of taxonomic

changes recently approved by ICTV.

Arch. Virol. 147: 1655-1663.

Richtzenhain, L.J., Paulillo, A.C., Pinto, A. and

Kronca, S.N. 1993. Relation between

the hemagglutination inhibition test

and the indirect ELISA in the serologic

monitoring of laying hens submitted to

different systems of vaccination against


21

Newcastle disease. Rev. Microbiol. 24:

187-191.

Ruenphet S. 2012. Newcastle disease in

Ostriches (Struthio camelus):

epidemiology and immunologic

examination. J. Mahanakorn Vet. Med.

7(2): 99-108.

Sakai, K., Yada, K., Sakabe, G., Tani, O., Miyaji,

K. Nakamura, M. and Takehara, K. 2006.

Serological and virological studies of

Newcastle disease and avian influenza

in slaughter-age ostriches (Struthio

camelus) in Japan. J. Vet. Med. Sci. 68:

491-494.

Samberg, Y., Hadash, D. U., Perelman, B. and

Meroz, M. 1989. Newcastle disease in

ostrich (Struthio camelus): field case

and experimental infection. Avian

Pathol. 18: 221-226.

Takehara, K., Kiuchi, H., Kuwahara, M.,

Yanagisawa, F., Mizukami, M., Matsuda,

H. and Yoshimura, M. 1991.

Identification and characterization of a

plaque forming avian rotavirus isolated

from a wild bird in Japan. J. Vet. Med.

Sci. 53: 479-486.

Takehara, K., Shinomiya, T., Kobayashi, H.,

Azuma, Y., Yamagami, T. and

Yoshimura, M. 1987. Characterzation of

Newcastle disease viruses isolated

from field cases in Japan. Avian Dis. 31:

125-129.

Williams, R., Boshoff, C.H., Verwoerd, D.,

Schoemann, M., van Wyk, A., Gerdes,

T.H. and Roos, K. 1997. Detection of

antibodies to Newcastle disease virus.

In ostriches (Struthio camelus) by an

indirect ELISA. Avian Dis. 41: 864-869.

Yachida, S., Iritani, Y., and Katagiri, K. 1979. Three substrains with different hemagglutinating patterns isolated from a Japanese lentogenic strain of Newcastle disease virus. Avian Dis. 24: 979-98.



ผลของการใชหญามลาโต 2 และถวฮามาตา ในรปแบบสดและหมกตอการกนได กระบวนการ

หมกในกระเพาะรเมน และองคประกอบของกรดไขมนในของเหลวจากกระเพาะรเมนของแพะเนอ

อจฉรา ลกขณานกล1,2,# ปราโมทย แพงคา1 เสมอใจ บรนอก3 Yasuhiro Kawamoto4 และจาลอง มตรชาวไทย5

1สาขาวชาเทคโนโลยการผลตสตว สานกวชาเทคโนโลยการเกษตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร, 2คณะเทคโนโลยการเกษตร มหาวทยาลยบรพา วทยาเขตสระแกว, 3คณะวทยาศาสตรและศลปะศาสตร มหาวทยาลย

เทคโนโลยราชมงคลอสาน, 4Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus, 5คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร

บทคดยอ: การศกษาครงนมวตถประสงคเพอศกษาผลของการใชหญามลาโต 2 (หญารซ Brachiaria × B. brizantha × B. decumbens) และถวฮามาตา (Stylosanthes hamata) ในรปแบบสดและหมกตอการกนได กระบวนการหมกในกระเพาะรเมน และองคประกอบของกรดไขมนในของเหลวจากกระเพาะรเมนของแพะเนอ การทาพชอาหารสตวหมกทงสองชนด ใชนาพชหมก (Fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria, FJLB) เตมลงไป แลวหมกนาน 80 วน ทอณหภมหอง ในการทดลองนใชแพะลกผสมบอร × แพะแองโกลนเบยน เพศผ จานวน 8 ตว (นาหนกเฉลย 22.8±2.3 กโลกรม) ใชแผนการทดลองแบบ 2 × 2 factorial arrangements in a 4 × 4 replicated Latin square โดยแพะไดรบอาหารทดลอง คอ 1) หญามลาโต 2 สด, 2) ถวฮามาตาสด, 3) หญามลาโต 2 หมก และ 4) ถวฮามาตาหมก การทดลองมทงหมด 4 ชวงการทดลอง ซงในแตละชวงการทดลองใชเวลา 28 วน (รวมระยะปรบตวนาน 7 วนดวย) แพะทดลองทงหมดไดรบอาหารขนระดบรอยละ 1 ของนาหนกตว ผลการศกษาพบวา การกนไดของอาหารหยาบและการกนไดของอาหารทงหมดของแพะในกลมทไดรบหญามลาโต 2 หมก มคาสงทสด (P<0.05) กระบวนการหมกในกระเพาะรเมนมการเปลยนแปลงของความเปนกรด-ดาง แอมโมเนยไนโตรเจน กรดไขมนทระเหยไดงาย และกรดไขมน ภายหลงการใหอาหาร โดยเฉพาะอยางยงท 2 ชวโมงแรกหลงจากใหอาหาร ในขณะทไมมความแตกตางของกระบวนการหมกในกระเพาะรเมนระหวางกลมทดลอง สาหรบสดสวนของกรดไขมนของของเหลวจากกระเพาะรเมน พบวาไมมความแตกตางกนระหวางกลมทดลอง (P>0.05) แตพบวาสดสวนของ C18:0 เพมขนอยางมาก ในขณะทสดสวนของ C18:2n6 และ C18:3n3 มสดสวนทลดลงมาก การทาหญามลาโต 2 หมก และ ถวฮามาตาหมก โดยใชนาพชหมก (FJLB) ไมสงผลกระทบตอการกนได กระบวนการหมกในกระเพาะรเมน และองคประกอบของกรดไขมนในจองเหลวจากกระเพาะรเมนของแพะเนอ เมอเทยบกบการใหหญามลาโต 2 และถวฮามาตาในรปแบบสด ดงนนหญามลาโต 2 หมก และถว ฮามาตาหมก ซงหมกโดยนาพชหมก (FJLB) ชวยรกษาคณภาพของพชอาหาร และสามารถนาไปใชเลยงแพะเนอได คาสาคญ: หญามลาโต 2 ถวฮามาตา กระบวนการหมกในกระเพาะรเมน องคประกอบกรดไขมน แพะเนอ #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2557. 9(1): 23-36. E-mail address: [email protected]

Achara Lukkananukool et al. / J. Mahanakorn Vet. Med. 2014. 9(1): 23-36.

24

Effect of Fresh and Silages of Mulato II Grass and Verano Stylo on Intake, Rumen Fermentation and Fatty Acid Profile in Rumen Fluid of Meat Goats

Achara Lukkananukool1,2,#, Pramote Paengkoum1, Samerjai Bureenok3,

Yasuhiro Kawamoto4 and Jamlong Mitchaothai5

1School of Animal Production Technology, Institute of Agricultural Technology, Suranaree University of Technology, 2Faculty of Agriculture Technology, Burapha University, Sakaeo Campus, 3Faculty of Sciences

and Liberal Art, Rajamangala University of Technology Isan, 4Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus, 5Faculty of Veterinary Medicine, Mahanakorn University of Technology

Abstract: The current study was conducted to study effect of fresh forages and forage silages of Mulato II Grass (Brachiaria ruziziensis × B. brizantha × B. decumbens) and Verano Stylo (Stylosanthes hamata) on intake, rumen fermentation and fatty acid profile in rumen fluid of meat goats. Two forages sources for this study were Mulato II grass and Verano stylo and two formations of forage (fresh and silage prepared by adding fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria; FJLB). The silage making was prepared and allowed to be fermented for 80 days at room temperature. Eight male ruminally fistulated crossbred Boer

× Anglo-Nubian goats (approximately 22.8±2.3 kg average body weights) were used as randomly assigned as 2 × 2 factorial arrangements in a 4 × 4 replicated Latin square design to receive four dietary treatments; 1) Fresh Mulato II grass, 2) Fresh Verano stylo, 3) Mulato II grass silage and 4) Verano stylo silage. There were totally 4 periods in the current study and each period was lasting for 28 days including the first 7 d used as adaptation period. All studied goats were offered the concentrate at 1% of body weight. The results showed that the goats fed on the Mulato II grass silage had highest (P<0.05) intake of roughage and total intake. The rumen fermentation was changed with higher time post feeding, especially at the first 2 hours post feeding. There were no effects of dietary treatments on rumen fermentation. There were no differences (P>0.05) of fatty acid profiles of rumen fluid among dietary treatments, but fatty acid profiles in the rumen have been changed by extremely increasing proportion of C18:0 and greatly lowering proportion of C18:2n6 and C18:3n3. Mulato II grass and Verano stylo ensilage with FJLB as an additive had no effect on feed intake, rumen fermentation and fatty acid pattern in rumen fluid of meat goats when compared with fresh forages. Therefore, silage making from Mulato II grass and Verano stylo with adding FJLB would preserve quality of the forages and could be applied for meat goats.

Keywords: Mulato II grass, Verano stylo, Rumen fermentation, Fatty acid profile, Meat goats #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2014. 9(1): 23-36. E-mail address: [email protected]


25

Introduction In tropical area, there is constraint in

roughage production during dry season. Silage making is an alternative to preserve quality of roughages for feeding the ruminants. However, fermentation process during ensilage might affect the proportion of chemical and fatty acid composition in forage silage. The n-6 and n-3 fatty acid containing in dietary fats are rapidly hydrolyzed by rumen microorganisms and hydrogenated to mainly stearic acid (C18:0) which is saturated fatty acid (SFA). Small amounts of unsaturated fatty acid (USFA) taken up by the microbes will escape hydrogenation in the fore-stomachs. However, numerous studies with ruminants show that feeding forages to ruminants increases the n-3 polyunsaturate fatty acids (PUFA) content in milk and meat (Dewhurst et al., 2003; Dewhurst et al., 2006; Paengkoum et al., 2013) as they are natural rich sources of C18:3 n-3. Nutritional treatments can be used to manipulate the fatty acid (FA) content of muscle to improve the nutritional balance in ruminants with the challenge to increase the PUFA/SFA value (Atti et al., 2006). The forage sources and ensiling were hypothesized that they could be affected to the production of meat goats and rumen ecology. Thus, the current study was aimed investigate the effect of forage source and ensilage of Mulato II grass and

Verano stylo on growth performance and rumen ecology of meat goats.

Materials and methods

Plant materials: The grass and legume used in the current study were Mulato II grass (Brachiaria ruziziensis × B. brizantha × B. decumbens) and Verano Stylo (Stylosanthes hamata). The 10 plots were allocated into two groups equally; 5 plots for sowing Mulato II grass and the other 5 plots for sowing Verano stylo. There was no fertilizer applied and the forages were sown on June 2010 at Institute of Agricultural Technology, Suranaree University of Technology, Nakhon Ratchasima. Silage making: After forage harvesting at 45 days after regrowth, the experimental forages were immediately chopped into 1-2 cm-length pieces. Then fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria (FJLB) added at 1% of fresh matter as a silage additive. Approximate 80 kg of grass and legume compressed in plastic bulk and allowed to be fermented for 80 days at room temperature. Fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria (FJLB) preparation: The FJLB was prepared from Mulato II grass or Verano stylo before harvesting; 200 g of fresh grass was macerated with 600 ml of distilled


26

water using a blender. The macerate was filtered and 50 ml of the filtrate was put into each flask. These filtrates in the flask were treated with glucose at 2% of volume, then covered with screwed cap and incubated at 30 °C for 2 days. Feed and Animals: Eight male ruminally fistulated crossbred Boer × Anglo-Nubian

goats (approximately 22.8±2.3 kg average body weights) were used as randomly assigned as 2 × 2 factorial arrangements in 4 × 4 replicated Latin square design to receive four dietary treatments. Dietary treatments were two species of forage (grass and legume) and two formation of roughage (fresh and silage). Each period length was 28 day of which the first 7 day for adaptation period to the experimental diets. During each period, animals were received concentrate at 1.5% of BW and ad libitum roughage. Additionally, all goats were housed individually in well ventilation and shed having individual feeding and watering arrangements. They were dewormed at the beginning by Ivermectin injection, treated against intestinal nematodes, and intramuscular injected with vitamin AD3E. The experimental treatments are follows as: 1) Fresh Mulato II grass, 2) Fresh Verano stylo, 3) Mulato II grass silage and 4) Verano stylo silage. The goats were weighed every 28 days at the end of each experimental

period. Individual daily DM intake was recorded. All experimental goats were offered the concentrate at 1% of body weight. Metabolism trial: The metabolism trial of six days collection was conducted for nutrient utilization in goats. The metabolic cages were specially designed with a facility for separate collection of feces and urine. The animals were kept in metabolic cages for 3 days, prior to actual collection of 7 days to acclimatize the animals to the new surroundings. The appropriate aliquots of feed offered, residue left, feces were preserved animal wise for the day for chemical analysis. Body weight of the animals was recorded before and after the metabolism trials. Measurement data of feed offer and residue were obtained. For further analysis, about 10% of feces (fresh weight) from each goat was taken daily and kept in a deep freezer at -20 °C until the end of the experiment. Feces from the 7 days were thoroughly mixed and then samples were taken and dried at 60 °C for 72 hours. Dried samples were ground, the determination of dry matter (DM) was done by drying at 105 °C for 24 h, ash content was assayed by incinerating samples at 550 °C, and organic matter (OM) could therefore be obtained. Nitrogen (N) was determined by the Macro Kjeldahl technique (AOAC, 1985)


27

and crude protein calculated as N × 6.25. Neutral detergent fiber (NDF) and acid detergent fiber (ADF) were analyzed followed the procedure described by Goering and Van Soest (1970). Rumen fermentation: Rumen fluid samples from all goats were collected through ruminal fistula at 0, 2 and 4 hours post-feeding at the end of each period. It was strained through 4 layers of cheese cloth and pH measured immediately using a glass electrode pH meter. The rumen fluid was then acidified with H2SO4 (10%, v/v) and stored at -20 °C for subsequently quantifying NH3-N and volatile fatty acids (VFAs) concentration. The NH3-N concentrations were determined using distillation method according to the Kjeldahl method. The acetic acid, propionic acid, butyric acid and total VFAs were determined by high performance liquid chromatography (HPLC, Shim-pack SCR-102H, 300 mm × 8.0 mm i.d.;

column temperature, 40°C; flow rate, 0.8 ml/min, Shimadzu Co. Ltd., Kyoto, Japan). Fatty acid methyl ester of oil samples: The samples of fresh forages, forage silages and fresh rumen fluid were immediately frozen at -20 °C until analysis. All samples were prepared for fatty acid analysis by gas chromatography (GC) of fatty acid methyl ester (FAME). The lipid was extracted from

the sample using the chloroform/methanol (2/1) method procedure of Folch et al. (1957) and Methylation of samples by the procedure described by Metcalfe (1966) was used. Statistical analysis: Data were statistically analyzed according to 2 × 2 factorial arrangements in 4 × 4 replicated Latin square design using the PROC GLM procedure (SAS, 1990) for grass and legume. Significant differences (P<0.05) among treatments were determined using Duncan’s News Multiple Range Test according to Steel and Torrie (1980).

Results

Chemical and fatty acid composition of experimental diets

The chemical composition (DM, OM, CP, NDF, ADF, EE and Ash) and fatty acid pattern of the experimental treatments are demonstrated in the Table 1. The fatty acid profile of the experimental diets mainly contained C16:0, C18:0, C18:1n9, C18:2n6 and C18:3n3. The grouped fatty acids in the experimental diets were mainly PUFA and SFA while monounsaturated fatty acids was the lowest content of total fat. Growth performance and feed intake

In Table 2, there was no effect (P>0.05) of both forage species, form of


28

Table 1 Chemical composition and fatty aid profile (g/ 100 g total fat, % on dry matter basis) of experimental treatments

Item Mulato II grass Verano stylo Fresh Silage Fresh Silage

-------------------------------------------------- % DM --------------------------------------------------

DM 23.78 29.73 33.10 32.02

OM 83.08 89.19 82.00 86.48

CP 8.55 6.22 9.76 10.17

NDF 65.50 63.06 64.42 56.86

ADF 45.02 35.64 35.54 28.57

EE 1.90 3.56 2.83 4.10

Ash 19.69 13.57 12.95 10.81

Fatty acid profile, % of total fat

C12:0 0.07 0.06 0.08 0.07

C14:0 1.29 1.21 0.94 0.03

C15:0 1.14 1.41 0.22 0.00

C16:0 18.18 20.3 24.75 16.76

C16:1 0.04 0.82 1.22 1.41

C17:0 0.17 0.14 0.28 0.74

C18:0 3.24 3.55 6.44 5.89

C18:1n9 16.86 5.49 9.79 3.31

C18:2n6 14.33 16.42 8.58 16.82

C18:3n3 40.58 47.96 43.1 51.84

C20:0 0.05 0.04 0.05 0.27

C22:0 0.04 0.04 0.1 0.07

C24:0 0.28 0.39 0.29 0.14

SFA 24.46 27.14 33.15 23.97

MUFA 16.90 6.31 11.01 4.72

PUFA 54.91 64.38 51.68 68.66

PUFA/SFA 2.24 2.37 1.56 2.86SFA: saturated fatty acid = C12:0 + C14:0 + C15:0 + C16:0 + C17:0 + C18:0 + C20:0 + C22:0 + C24:0, MUFA: monounsaturated fatty acid = C16:1 + C18:1n9 and PUFA: polyunsaturated fatty acid = C18:2n6 + C18:3n3.

forage and their interactions on body weight change and DM intake of concentration, whereas there were different effect of forage

(P<0.05) for DM intake of roughage and also total feed intake with the presence of interaction of forage species and form. When


29

species effect was considered, the DM roughage intake as %BW (P<0.01), g/day (P<0.05) and g/BW0.75 (P<0.05) were highest for the goats fed on Mulato II grass silage among all experimental diets. Additionally, the effect of forage form (P<0.05) and interaction of species and from (P<0.01) were also presented. For total intake, there was also highest DM total intake for the goats fed on Mulato II grass silage among all experimental diets, which were similar effects to the intake of roughages as mentioned earlier.

Rumen fermentation The effects of dietary treatments on

rumen fermentation have been shown in the Table 3. There were no effect of experimental treatments on rumen fermentation (P>0.05) for values of pH, NH3-N and VFAs, except for the level of acetic acid (P<0.05 for interaction effect) and propionic acid (P<0.05 for forage form effect) at 4 hours and 2 hours, respectively, after feeding the experimental diets.

Table 2 Effect of dietary treatments on BW and feed intake of the experimental goats

Item Mulato II grass Verano stylo SEM Sβ Fγ S × F

Fresh Silage Fresh SilageInitial weight, kg 22.33 23.5 23.17 22.1 0.482 ns ns nsFinal weight, kg 24.25 24.58 24.67 23.1 0.445 ns ns nsBody weight change, kg 1.92 1.08 1.5 1 0.23 ns ns nsDry matter intake Concentrate g/day 362.8 339.4 362.8 360 6.343 ns ns ns%kg BW 1.5 1.5 1.5 1.5g/kg BW0.75 33.19 32.69 33.24 33.16 0.154 ns ns nsRoughage g/day 218.8 B 382.6 A 246.3 B 217.4 B 13.24 * * **%kg BW 0.9 B 1.65 A 1.03 B 0.89 B 0.048 ** * ***g/kg BW0.75 19.95 B 36.2 A 22.71 B 19.7 B 1.094 * * ***Total g/day 580.1 B 729.7 A 609.2 B 589.9 B 15.38 * * **%kg BW 2.4 B 3.15 A 2.39 B 2.53 B 0.048 ** * ***g/kg BW0.75 53.08 B 69.09 A 55.95 B 53.16 B 1.113 * * ***

A,B,CMeans followed by a different letter within the same row are significant different (P<0.05), ns: not significant different

(P>0.05), *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, SEM: standard error of mean, Sβ = effect of forage species (Mulato II grass and

Verano stylo) Fγ = effect of forage form (Fresh and Silage)


30

Table 3 Effect of dietary treatments on rumen characteristics and blood urea nitrogen in plasma of the experimental goats.

Item Hourδ Mulato II grass Verano stylo

SEM Sβ Fγ S × F Fresh Silage Fresh Silage

pH 0 7.1 6.94 7.09 6.96 0.04 ns ns ns

2 5.94 6.09 6.21 5.87 0.04 ns ns ns

4 6.54 6.31 6.39 6.34 0.1 ns ns ns

NH3-N, mg/dl 0 5.86 6.83 8.15 5.74 0.42 ns ns ns

2 15.8 12.98 13.2 12.9 0.98 ns ns ns

4 11.1 8.03 9.31 9.74 0.57 ns ns ns

Acetic acid, %Molar 0 71.1 74.73 75.4 74.6 1.12 ns ns ns

2 69.3 66.5 71.8 69.2 2.62 ns ns ns

4 67.3 B 68.35 A 68.9 A 66.5 AB 1.8 ns ns *

Propionic acid, %Molar 0 20.4 16.28 16.2 15.9 0.29 ns ns ns

2 21.6 B 25.48 A 20.1 B 22.4 AB 1.25 ns * ns

4 23.3 24.13 22.3 23.9 0.95 ns ns ns

Butyric acid, %Molar 0 8.48 8.99 8.39 9.56 0.19 ns ns ns

2 9.13 8.02 8.16 8.36 0.41 ns ns ns

4 9.4 7.52 8.9 9.55 0.52 ns ns ns

Total VFA, mmol/L 0 42.4 31.74 34.1 36.2 1.89 ns ns ns

2 86.3 103.9 87.6 92.8 2.83 ns ns ns

4 76.1 88.02 90.5 82.5 2.79 ns ns ns A,B,CMeans followed by a different letter within the same row are significant different (P<0.05), ns: not significant different

(P>0.05), *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, SEM: standard error of mean, δHour (s) after feeding experimental diet, Sβ = effect

of forage species (Mulato II grass and Verano stylo) Fγ = effect of forage form (Fresh and Silage) Fatty acid composition of rumen fluid

The fatty acid composition of rumen fluid collected from the experimental goats has been shown in the Table 4. The high proportions of fatty acid in the rumen fluid of the goats were C16:0, C18:0 and C18:1n9. The significant studied effects were found in

some fatty acids contained at low concentration (less than 5%). The main fatty acid contents (C16:0 and C18:0), SFA, PUFA and PUFA/SFA ration were not significant differences (P>0.05) at all studied hours post feeding, however the proportion of C18:1n9 at all studied hours post feeding (P<0.05)


31

and MUFA at the start of feeding trial (P<0.05) in the rumen fluid of the goats fed

on the fresh Mulato II grass was highest value.

Table 4 Effect of dietary treatments on fatty acid profile of rumen fluid of the experimental goats



C12:0 0 3.39 4.08 4 4.09 0.26 ns ns ns2 6.37 7.68 8.39 7.18 0.32 ns ns ns4 6.95 6.31 7.9 6.47 0.44 ns ns ns

C14:0 0 3.07 B 4.56 AB 5.49 A 3.02 B 0.23 ns ns *2 3.87 4.52 4.88 4.63 0.3 ns ns ns4 6.95 6.31 7.9 6.47 0.44 ns ns ns

C14:1 0 4.36 4.39 5.23 4.39 0.26 ns ns ns2 3.77 3.22 4.51 3.65 0.28 ns ns ns4 2.97 B 3.74 AB 4.71 A 4.73 A 0.22 * ns ns

C15:0 0 1.51 1.67 1.4 1.69 0.05 ns ns ns2 0.97 0.84 0.89 0.83 0.05 ns ns ns4 0.93 0.82 0.89 0.82 0.08 ns ns ns

C16:0 0 28.4 28.8 28.7 29.9 0.47 ns ns ns2 24.4 27 26.5 26.3 0.4 ns ns ns4 26.3 26.8 26.7 26.5 0.31 ns ns ns

C17:0 0 1.32 A 1.14 A 0.77 B 0.77 B 0.1 * ns ns2 0.74 0.53 0.48 0.46 0.04 ns ns ns4 0.59 0.52 0.48 0.41 0.03 ns ns ns

C18:0 0 44.3 43.2 40 40.2 0.85 ns ns ns2 32.5 34.1 32.6 32.3 1.09 ns ns ns4 32.1 35.5 33.7 36.4 1.31 ns ns ns

C18:1n9 0 15 A 8.36 B 10.8 AB 10.3 AB 0.92 ns * ns2 20.8 A 13.8 B 13.4 B 15.2 AB 0.97 ns ns *4 18 A 12.5 B 14.6 AB 13.2 AB 0.74 ns * ns

C18:2n6 0 0.9 1.08 1.08 1.08 0.09 ns ns ns2 2.36 AB 1.28 B 2.79 AB 3.33 A 0.31 * ns ns4 1.29 1.06 1.68 1.49 0.23 ns ns ns

C18:3n3 0 0.17 AB 0.04 C 0.1 BC 0.22 A 0.02 ns ns **2 0.17 0.21 0.12 0.15 0.02 ns ns ns4 0.11 0.1 0.12 0.1 0.02 ns ns ns

C18:3n6 0 0.52 A 0.1 B 0.1 B 0.09 B 0.06 ns * ns


32



2 0.05 0.07 0.06 0.05 0.01 ns ns ns4 0.06 0.09 0.09 0.07 0.01 ns ns ns

C20:1 0 1.2 1.21 1.09 1.53 0.08 ns ns ns2 1.94 AB 1.39 B 1.21 B 2.38 A 0.15 ns ns *4 1.73 1.1 1.09 1.85 0.18 ns ns ns

C24:0 0 0.43 0.58 0.4 0.46 0.03 ns ns ns2 0.48 0.51 0.39 0.52 0.03 ns ns ns4 0.49 0.67 0.38 0.46 0.06 ns ns ns

SFA 0 82.8 83.2 79.3 80.2 0.74 ns ns ns2 69.4 74.8 73.6 72.2 1.42 ns ns ns4 72.6 73.6 74.3 75.1 1.22 ns ns ns

MUFA 0 16.2 A 9.86 B 12 AB 11.9 AB 0.89 ns * ns2 24.5 18.4 18.4 21.2 1.08 ns ns ns4 21 17.3 19.6 19.9 0.74 ns ns ns

PUFA 0 1.64 1.15 1.33 1.41 0.14 ns ns ns2 2.6 1.64 2.99 2.88 0.28 ns ns ns4 1.16 1.48 1.5 1.71 0.26 ns ns ns

PUFA/SFA 0 0.02 0.01 0.02 0.02 0 ns ns ns2 0.04 0.02 0.05 0.04 0.01 ns ns ns

4 0.02 0.02 0.02 0.03 0 ns ns nsA,B,CMeans followed by a different letter within the same row are significantly different (P<0.05), ns: not significant different

(P>0.05), *P<0.05, SEM: standard error of mean, δHour (s) after feeding experimental diet, Sβ = effect of forage species

(Mulato II grass and Verano stylo) Fγ = effect of forage form (Fresh and Silage), SFA: saturated fatty acid = C12:0 + C14:0 + C15:0 + C16:0 + C17:0 + C18:0 + C20:0 + C22:0 + C24:0, MUFA: monounsaturated fatty acid = C16:1 + C18:1n9 and PUFA: polyunsaturated fatty acid = C18:2n6 + C18:3n3.

Discussion The proportions of chemical

composition (DM, NDF, ADF, EE and ash) of the fresh Mulato II grass were closed to those of the other grasses in different area in Turkey (Demirkus and Budag, 2010). However, the CP contents in the fresh Verano stylo and Mulato II grass were relatively low, when compared with report earlier (Hare et al.,

2007). This discrepancy would be by the fact that both Mulato II grass and Verano stylo were harvested in dry season, which the Verno stylo was less resistance to dry season when compared with the Mulato II grass (Hare et al., 2003). When silages of Mulato II grass and Verano stylo were prepared with adding FJLB, the nutrient profile of the silages was improved by lowering %NDF and %ADF,


33

indicating higher quality of silage (Kaiser et al., 2004). The hydrolysis of NDF-bound N (Huisden et al., 2009) during fermentation might be explained by the reduction of %NDF observed in the studied silages. The decrease of NDF and ADF proportion would consequently result in changed proportion of CP, EE and ash. About concentration of PUFA was predominant proportion in both fresh and silage forms of studied forage. The C18:2n6 and C18:3n3 was the main proportion of PUFA in both fresh and silage forms of the two types of experimental forages. The increase of the contents of C18:2n6 after fermentation for forage ensilage would be partly the results of conjugated linoleic acid (CLA) synthesis by lactic acid bacteria (Ogawa et al., 2005), which CLA did not be measured in the current study. The ratios of PUFA/SFA in silages were 2.37 and 2.86 for the Mulato II and Verano Stylo ensilage, respectively. This might be the fact that bacteria in silage fermentation tried to balance the proportion of fatty acids, consequently the changed proportion of predominant fatty acids (C16:0, C18:1n9, C18:2n6 and C18:3n3) after ensilaging. Generally, making silage with FJLB additive would preserve quality of studied forages.

The total intake per day of the goats was highest for the Mulato II grass silage, which influenced by the highest intake of roughage (Mulato II silage) as no difference

for concentrate intake among treatments. The total intake of CP per day of the goats receiving the Mulato II grass silage was highest value while the apparent digestibility of CP of these goats had the lowest value. These might be partly explained the results of low growth rate of the goats, which were fistulated and already reached adult rate. The other factors (such as palatability, oxidation of fatty acid) affecting silage intake are hardly to identified by the present study.

The rumen fermentation of the goats receiving the experimental diets was changed at 2 and 4 h post feeding, but there were a few different measured parameters. Rumen pH of all goats was dramatically depressed at 2 h post feeding and then gradually increased at 4 h after feeding. The concentrations of NH3-N, acetic acid, propionic acid, butyric acid and total VFA were increased at 2 h post feeding and subsequently were decreased or a bit increased at 4 h after feeding. There was small difference between fresh and silage forms for acetic acid concentration at 2 h post feeding, which would be the results of more contents and longer fiber in Mulato II when compared with Verano Stylo. On overview, the pattern changes of these results are in agreement with the reports earlier (Anbarasu et al., 2002; Chanjula et al., 2007). The highest concentration of acetic acid at 4 h after feeding and propionic acid


34

at 2 h post feeding for the goats fed on the Mulato II grass silage might be the results of highest total feed intake.

The fatty acid composition of rumen fluid was dramatically changed, when compared with the fatty acids contained in the experimental diets. The proportion of C18:2n6 and C18:3n3 were extremely reduced while the proportion of C18:0 was greatly augmented at 2 and 4 h post feeding. The proportions of C16:0 and C18:1n9 were increased when compared with those in the diet. When compared the fatty acid composition between before and after feeding the studied diet, the fatty acid profile of rumen fluid was largely changed at 2 h post feeding and then the fatty acid pattern was tended to be balanced to the proportion at the start. These results would explained by the microbial hydrogenation in the rumen of the goats, leading to the conversion of C18:2n6 and C18:3n3 into C18:0 due to the high toxicity of PUFA to some rumen microorganisms as reported by several research work (Arvidsson et al., 2009; Boufaïed et al., 2003; Buccioni et al., 2012; Chilliard et al., 2001; Chilliard et al., 2007; Lourenço et al., 2010; Woods and Fearon, 2009). From these results in this study, it implies that microbial hydrogenation in rumen (biohydrogenation) of goats was found after receiving PUFAs. There were also illustrated that dietary PUFA contents had

no effect on fatty acid profile of rumen fluid of goats, because the microorganism in rumen of the goats did hydrogenation to balance appropriate fatty acid proportion. Thus, suitable quantity of dietary PUFA supplementation should be given awareness and further investigated. The current study could not demonstrate the effect of dietary fatty acids on metabolism and deposition of fatty acids after feeding, but it could confirm that PUFAs were hydrogenated in the rumen of goats.

Conclusion

Mulato II grass and Verano stylo ensilage with fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria (FJLB); as an additive had no effect on feed intake, rumen fermentation and fatty acid pattern in rumen fluid of meat goats when compared with fresh form of the forages. Silage making from Mulato II grass and Verano stylo with adding FJLB would preserve quality of the forages and could be applied for meat goats.

References

Anbarasu, C., Dutta, N., Sharma, K. and Naulia, U. 2002. Blood biochemical profile and rumen fermentation pattern of goats fed leaf meal mixture or conventional cakes as dietary protein supplements. Asian-Aust J. Anim. Sci. 15: 665-670.


35

AOAC. 1985. Official methods of analysis association of official chemists. Washington, D.C.

Arvidsson, K., Gustavsson, A.M. and Martinsson, K. 2009. Effects of conservation method on fatty acid composition of silage. Anim. Feed Sci. Technol. 148: 241-252.

Atti, N., Mahouachi, M. and Rouissi, H. 2006. The effect of spineless cactus (Opuntia ficus-indica f. inermis) supplementation on growth, carcass, meat quality and fatty acid composition of male goat kids. Meat Sci. 73: 229-235.

Boufaïed, H., Chouinard, P.Y., Tremblay, G.F., Petit, H.V., Michaud, R. and Bélanger, G. 2003. Fatty acids in forages. II. In vitro ruminal biohydrogenation of linolenic and linoleic acids from timothy. Can. J. Anim. Sci. 83: 513-522.

Buccioni, A., Decandia, M., Minieri, S., Molle, G. and Cabiddu, A. 2012. Lipid metabolism in the rumen: New insights on lipolysis and biohydrogenation with an emphasis on the role of endogenous plant factors. Anim. Feed Sci. Technol. 174: 1-25.

Chanjula, P., Ngampongsai, W. and Wanapat, M. 2007. Effects of replacing ground corn with cassava chip in concentrate on feed intake, nutrient utilization, rumen fermentation characteristics and microbial populations in goats. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 20: 1557-1566.

Chilliard, Y., Ferlay, A. and Doreau, M. 2001. Effect of different types of forages, animal fat or marine oils in cow’s diet on milk fat secretion and composition, especially conjugated linoleic acid (CLA) and polyunsaturated fatty acids. Lives. Prod. Sci. 70: 31-48.

Chilliard, Y., Glasser, F., Ferlay, A., Bernard, L., Rouel, J. and Doreau, M. 2007. Diet, rumen biohydrogenation and nutritional quality of cow and goat milk fat. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 109: 828-855.

Demirkus, T. and Budag, C. 2010. An investigation on nutrient and selenium content of grass from different areas. J. Anim. Vet. Adv. 9: 216-211.

Dewhurst, R.J., Fisher, W.J., Tweed, J.K.S. and Wilkins, R.J. 2003. Comparison of grass and legume silages for milk production: 1. Production responses with different levels of concentrate. J. Dairy Sci. 86: 2612-2621.

Dewhurst, R.J., Shingfield, K.J., Lee, M.R.F. and Scollan, N.D. 2006. Increasing the concentrations of beneficial poly-unsaturated fatty acids in milk produced by dairy cows in high-forage systems. Anim. Feed Sci. Technol. 131: 168-206.

Folch, J., Lees, M. and Sloane-Stanley, G.H.S. 1957) A simple method for the isolation and purification of total lipids


36

from animal tissues. J. Biol. Chem. 226: 497−509.

Goering, H.K. and Van Soest, P.J. 1970. Forage Fiber Analysis (apparatus, reagent, procedures and some application). Agric: New Mexico State University, Washington. D.C.

Hare, M.D., Kaewkunya, C., Tatsapong, P. and Saengkham, M. 2003. Evaluation of forage legumes and grasses on seasonally waterlogged sites in North-East Thailand. Trop. Grass. 37: 20-32.

Hare, M.D., Tatsapong, P., Phengphet, S. and Lunpha, A. 2007. Stylosanthes species in North-east Thailand: dry matter yields and seed production. Trop. Grass. 41: 253-259.

Huisden, C.M., Adesogan, A.T., Kim, S.C. and Ososanya, T. 2009. Effect of applying molasses or inoculants containing homofermentative or heterofermentative bacteria at two rates on the fermentation and aerobic stability of corn silage. J. Dairy Sci. 92: 690-697.

Kaiser, A.G., Piltz, J.W., Burns, H.M. and Griffiths, N.W. 2004. Successful Silage. 2nd ed. Diary Australia and New South Wales Department of Primary Industries, New South Wales. 418.

Lourenço, M., Ramos-Morales, E. and Wallace, R.J. 2010. The role of microbes in rumen lipolysis and

biohydrogenation and their mani-pulation. Animal. 4: 1008-1023.

Metcalfe, L.D., Schmitz, A.A. and Pelka, J.R. 1966. Analysis Chemistry. 38: 514.

Ogawa, J., Kishino, S., Ando, A., Sugimoto, S., Mihara, K. and Shimizu, S. 2005. Review: Production of conjugated fatty acids by lactic acid bacteria. J. Biosci. Bioeng. 4: 355-364.

Paengkoum, P., Lukkananukool, A., Bureenok, S., Kawamoto, Y., Imura, Y., Mitchaothai, J., Paengkoum, S. and Traiyakun, S. 2013. Effect of feeding systems on meat goat CLA. Int. J. Biol. Life Sci. Eng. 7(9): 170-172.

SAS., 1990. SAS User’s guide: statistics. Version 6 14th Ed Carry, NC: SAS Inst.

Steel, R.G.D. and Torrie, J.N. 1980. Principles and Procedures of Statistics 2nd ed. McGraw-Hill. Book C, New York.

Woods, V.B. and Fearon, A.M. 2009. Dietary sources of unsaturated fatty acids for animals and their transfer into meat, milk and eggs: A review. Livest. Sci. 126: 1-20.



ประสทธภาพของวคซน Mastivac® สาหรบปองกนโรคเตานมอกเสบในแมโคนม

จตพร กระจายศร1,# อนสรณ จาแสนชน2 จาลอง มตรชาวไทย3 และชนาธป ธรรมการ4

1คลนกสาหรบสตศาสตร ไกเนวทยา แอนโดรวทยา และการผสมเทยมของสตวเลยง, 2คลกสาหรบสตวเคยวเออง, 3คลนกสาหรบสกร คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร หนองจอก กรงเทพมหานคร 10530

4สาขาวชาเทคโนโลยการผลตสตวและประมง คณะเทคโนโลยการเกษตร สถาบนเทคโนโลยพระจอมเกลาเจาคณทหารลาดกระบง 10520

บทคดยอ: จดประสงคในการศกษาครงน เพอทดสอบประสทธภาพของวคซน Mastivac® สาหรบปองกนโรคเตานมอกเสบของโคนมในประเทศไทย โดยคดเลอกแมโคนมพนธลกผสมโฮลสไตนฟรเชยนในชวงการใหนม (lactation) ท 2 ถง 4 จานวน 14 ตว ทอยระหวางการตงทองและเขาสระยะหยดรดนม (dry period) แบงแมโคออกเปน 2 กลม เทาๆกน กลมท 1 (กลมควบคม) แมโคไมไดรบการฉดวคซนปองกนโรคเตานมอกเสบ และกลมท 2 (กลมทดลอง) แมโคไดรบวคซนรวมปองกนโรคเตานมอกเสบชนดเชอตาย (Mastivac®) ปรมาณ 5 ซซ เขาใตผวหนง จานวน 2 ครง หางกน 15 วน โดยเรมฉดวคซนครงแรกประมาณ 1 เดอนกอนคลอด เกบตวอยางนานม (10 มลลลตร/เตา) จากเตานมทกเตา ของแมโคทกตว ท 7, 15, 30, 60 และ 90 วน หลงคลอดลก เพอหาคาจานวนเซลลโซมาตก และจานวนเชอแบคทเรยทงหมดในนานม จากนนแปลงคาดงกลาวเปนคาลอการทม (Log 10) ผลการทดลองพบวา แมโคกลมควบคมมคาเฉลยลอการทมของจานวนเซลลโซมาตก ท 7, 15, และ 30 วน หลงคลอดลกสงกวากลมของแมโคในกลมทไดรบวคซน อยางมนยสาคญ (P≤0.05) ในขณะทคาดงกลาวของแมโคกลมควบคมมแนวโนมสงกวาท 60 และ 90 วน หลงคลอด สาหรบคาเฉลย Log 10 ของจานวนเชอแบคทเรยทงหมด ของแมโคกลมควบคมในชวง 7 วนหลงคลอดสงกวา (P≤0.05) แตท 15, 30, 60 และ 90 วนหลงคลอดลก มแนวโนมสงกวาของแมโคในกลมทไดรบวคซน นอกจากนมแมโคในกลมควบคมตวหนง มเตานม 1 เตา เปนเตานมอกเสบแบบแสดงอาการท 60 วนหลงคลอด และแมโคในกลมควบคมพบสดสวนโรคเตานมอกเสบแบบไมแสดงอาการ 7.41-64.29% ในขณะทแมโคในกลมรบวคซน พบสดสวนดงกลาวเพยง 3.57-7.14% ตลอดระยะเวลาการทดลอง จากผลการทดลองสรปไดวาการใชวคซน Mastivac® ฉดใหกบแมโคนม มประสทธภาพดมากในการปองกนการเกดโรคเตานมอกเสบ ของแมโคนม โดยวคซนสามารถ ปองกนไมใหเกดเตานมอกเสบแบบแสดงอาการ ลดจานวนเซลลโซมาตก และจานวนแบคทเรยทอาจกอโรคเตานมอกเสบ ในนานม ทาใหไดนานมทมคณภาพด และยงสามารถลดการเกดโรคเตานมอกเสบแบบไมแสดงอาการไดดอกดวย คาสาคญ: แมโคนม โรคเตานมอกเสบ วคซนปองกนโรคเตานมอกเสบ Mastivac® #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2557. 9(1): 37-48. E-mail address: [email protected]

จตพร กระจายศร และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2557. 9(1): 37-48.

38

The Efficiency of Mastivac® Vaccine for Preventive Mastitis in Dairy Cow

Jatuporn Kajaysri1,#, Anusorn Jasanchuen2, Jamlong Mitchaothai3 and Chanathip Thammakarn4

1Clinic for Obstetrics Gynecology Andrology and Artificial Insemination of Domestic Animals, 2Clinic for

Ruminant, 3Clinic for Swine, Faculty of Veterinary Medicine, Mahanakorn University of Technology, Nong-chok, Bangkok, 10530, 4Department of Animal Production Technology and Fisheries, Faculty of

Agricultural Technology, King Mongkut’s Institute of Technology Ladkrabang, Ladkrabang, Bangkok, 10520

Abstract: The objective of study that was to test the efficiency of Mastivac® vaccine for preventive mastitis of dairy cow in Thailand. The fourteen crossbreed pregnant dairy cows in dry period were selected and divided into 2 equal groups. The cows in first group (control group) were not vaccinated. Each cow in second group (treatment group) was 2 times vaccinated with inactivated mastitis vaccines dose 5 ml/cow by intramuscular injection. The first injection was done about 1 month before calving and the second injection was conducted at 15 days after the first injection. After that milk samples of all cows in both groups were collected (10 ml/udder) at 7, 15, 30, 60 and 90 days after calving from all udders of cows. The somatic cell counts and total bacterial counts were analyzed from all collected milk samples. These somatic cell counts and total bacterial counts were converted to logarithm numbers (Log10) for further statistical analysis. The results showed, cows in control group had the averages of Log10 of somatic cell counts at 7, 15, 30 days after calving, were higher than of cows in treatment group (P≤0.05). While these Log10 of somatic cell counts at 60 and 90 days after calving of cows in control group were trendy higher than of cows in treatment group. For the Log10 of total bacterial counts at 7 days after calving of cows in control group was higher than (P≤0.05) of cows in treatment group but this parameter of the control group at 15, 30, 60 and 90 days after calving were also trendy higher than of the treatment group. Moreover, this study found 1 cow from control group which it had 1 udder with clinical mastitis at 60 days after calving. The cows in control group presented, the rations of subclinical mastitis were 7.41-64.29%. They were higher than the rations of subclinical mastitis from cows in treatment group (3.57-7.14%) in all period of experiment. The results concluded that the use of Mastivac® vaccines were the good efficiency in dairy cows. They could prevent clinical mastitis, reduce somatic cell count and total bacterial counts in milks, provide good milk qualities and control subclinical mastitis to be low incidences.

Keywords: Dairy cow, Mastitis, Mastitis vaccine, Mastivac® #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2014. 9(1): 37-48. E-mail address: [email protected]


39

บทนา โรคเตานมอกเสบ (mastitis) หมายถง โรคท

เกดจากการอกเสบของเนอเยอเตานม ทาใหเตานม และหรอนานมเกดการเปลยนแปลงผดไปจากปกต ซงจดเปนปญหาทสาคญกบเกษตรกรผเลยงโคนม เนองจากแมโคทปวยเปนโรคเตานมอกเสบ จะใหผลผลตและคณภาพของนานมลดลง ทาใหเกษตรกรไมสามารถจาหนายนานมได จงเกดการสญเสยรายได และเกษตรกรเองยงตองเสยคาใชจายเปนคายา และคาดแลรกษาโคทเปนโรคเตานมอกเสบอกดวย นอกจากนเตานมทเคยเกดการอกเสบและหายแลว มกจะกลบมาผลตนานมไดนอยกวาเดม ซงคดเปนสวนสาคญททาใหตนทนในการผลตนานมดบสงขน ซงทาใหมโอกาสขาดทนสง (จตพร, 2549)

การเกดเตานมอกเสบ สามารถแบงออกได 2 แบบ ตามอาการอกเสบทแสดงออกมาคอ เตานมอกเสบแบบไมแสดงอาการ (subclinical mastitis) และ เ ตานมอกเสบแบบแสดงอาการ (clinical mastitis) โดยการเกดเตานมอกเสบของแมโคนม สวนใหญเปนแบบไมแสดงอาการ ซงเปนการอกเสบของเตานมในระยะเรมตน แตยงไมถงขนแสดงอาการอกเสบออกมา โคจะไมแสดงอาการเจบปวยใดๆ ใหเหน ทงอาการผดปกตทเตานม นานม และทรางกาย จดเปนการอกเสบแบบท เกดมากทสด ซงเราไมสามารถเหนอาการอกเสบไดดวยตาเปลา ทาใหไมไดรบความสนใจในการรกษา เมอเวลาผานไปหลายๆ ชวโมง การอกเสบจะมากขนทาใหเนอเยอเตานมเสยหายไปมาก แตถาเราสามารถตรวจพบเตานมอกเสบกอนตงแตยงไมแสดงอาการ การรกษากจะงายกวา และเนอเยอเตานมกสามารถกลบมาเหมอนเดมไดเกอบๆ รอยเปอรเซนต ซงเราสามารถตรวจสอบเตานมอกเสบแบบไมแสดงอาการได โดยการตรวจหาหรอนบจานวนเซลลในนานม โดยพบวาเตานมทเกด

การอกเสบจะมจานวนเซลลในนานมเพมขนมากกวาปกต เซลลเหลานสวนใหญจะเปนเซลลเมดเลอดขาวทอยในเตานม และปนกบนานมออกมา เซลลเมดเลอดขาวเหลานมหนาทกาจดเชอโรคในเตานมโดยการจบกน ซงเปนการปองกนตวเองตามธรรมชาตของเตานม เพอไมใหเกดการตดเชอโรคเขาไป ซงถาหากมเชอโรคเลดลอดเขาเตานมในปรมาณทมาก รางกายโคกจะสรางเมดเลอดขาวสงมาทเตานมในปรมาณทมากขนเชนกน ทาใหในนานมมจานวนเซลลมากขนเราเรยกเซลล เหลา น วา เซลล โซมาตก (Somatic Cell, SCC) (จตพร, 2549; Philpot and Nickerson, 1991) ดงนนจานวนเซลลในนานม จงเปนตวบงบอกไดวาเตานมมการตดเชอโรคหรอไม ถามจานวนเซลลในนานมมากกวาปกต แสดงวาเตานมมการตดเชอ การตรวจวนจฉยโรคเตานบอกเสบแบบไมแสดงอาการจงตองอาศยการนบจานวนเซลลในนานม ซงการนบจานวนเซลลในนานม ถาจานวนเซลลนอยกวา 250,000 เซลลตอปรมาณนานม 1 มลลลตร ถอวาปกต แตถาจานวนเซลลในนานมมากกวา 500,000 เซลลตอนานม 1 มล ถอวาเตานมเกดการอกเสบตดเชอ (Barkema et al., 1998a, b) การตรวจหาคาเซลลโซมาตก นวามากหรอนอยขนกบระดบของการตดเชอในเตานมวารนแรงแคไหน และยงสามารถบงบอกถงคณภาพของนานมไดดวย

สาเหตการเกดโรคเตานมอกเสบสวนใหญ พบวาเกดจากการตดเชอแบคทเรยเขาไปในเตานม ซ ง เ ชอจลนทร ยทท าให เ กดโรคเตานมอกเสบ สามารถแบงแยกไดเปน 3 กลม คอ

1. เชอแบคทเรยทตดตอจากเตานมสเตานม (contagious bacteria) เชอแบคทเรยในกลมนทพบบอยทสด ไดแก Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus แหลงแพรเชอทสาคญของเชอพวกนคอเตานมทตดเชอ เ นองจากเชอ


40

สามารถปรบตว และเจรญไดดในเตานม ทาใหเกดเตานมอกเสบแบบไมแสดงอาการอยนาน เ ชอสามารถปนออกมากบนานม และตดตอไปสเตานมแมโคตวอนๆ ในขณะรดนม โดยพาหะของเชอคอ เครองรดนม ผาเชดเตานม และมอของผรดนม

2. เชอแบคทเรยทอยตามสงแวดลอม (environmental bacteria) ทสาคญและพบไดบอย ไดแก Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae แล ะ แบคท เ ร ย ก ล ม โ ค ล ฟ อ ร ม (coliform bacteria) ไดแก Escherichia coli (E. coli), Klebsiella spp. and Enterobacter spp. เชอเหลานจะอยในสงแวดลอมรอบๆ ตวโค เชน คอก โรงเรอน พน ในอจจาระโค ในดน ในพชอาหารสตว และสามารถตดตอเขาส เ ตานมทาใหเกดเตานมอกเสบ จงเปนการยากทจะกาจดเชอเหลานใหหมดไป ซงเชอเหลานถาตดเขาสเตานมแลว จะมโอกาสตดตอจากเตานมสเตานมไดดวย ดงนนการปองกนเตานมอกเสบจากการตดเชอกลมน จงควรทจะรกษาความสะอาดของคอก โรงเรอน พน และมการเชดลางทาความสะอาดเตานม และหวนมกอนการรดนมทกครง

3. เชอแบคทเรยทนานๆ จะพบสกครง (rare cause bacteria) เชอกลมนนานๆ ครงจงจะพบวาเปนสาเหตททาใหเกดโรคเตานมอกเสบ แตจะทาใหเกดการอกเสบทรนแรง ซงไดแก Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium pyogenes, Nocardia spp., Mycoplasma spp., รา และยสต (จตพร, 2549; Philpot and Nickerson, 1991)

จากทกลาวมาทงหมดขางตน จะเหนไดวาปญหาการเกดโรคเตานมอกเสบนน สรางความสญเสยทางเศรษฐกจมากทสดกบเกษตรกรผเลยงโคนม ดงนนปจจบนในประเทศไทยจงมผสนใจเกยวกบแนวคดในการปองกนการเกดโรคเตานมอกเสบขน

ดวยการใชวคซนปองกน ซงวคซนปองกนโรคเตานมอกเสบนนไดมการพฒนาตอเนองมาเปนเวลาหลายปใน อเมรกา และยโรป เชนมการทาวคซนจากเชอ Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis และ Streptococcus agalactiae ซงพบวาสามารถชวยลดอบตการณการเกดเตานมอกเสบจากเชอกลมนได (Giraudo et al., 1997) นอกจากนยงมการทดลองใช E. coli J5 bacterin เพอเปนวคซนปองกนโรคเตานมอกเสบ พบวาสามารถลดอตราการเกดเตานมอกเสบชนดทแสดงอาการจากการตดเชอ E. coli ได (Hogan et al., 1992a, b; Hogan et al., 1999) นอกจากนพบวาโคทไดรบ E. coli J5 bacterin จะม IgG ตอ E. coli J5 ในซรม และในนานมสงกวากลมทไมไดรบวคซน และยงชวยลดจานวนเซลลโซมาตกในนานมอกดวย (Hogan et al., 1992a, b) แตการใหวคซนปองกนโรคเตานมอกเสบ ทผลตจากเชอแบคทเรยเพยงชนดเดยวนน ไมอาจควบคมปองกนโรคเตานมอกเสบไดดเทาทควร เนองจากโรคเตานมอกเสบสามารถเกดจากการตดเชอหลายชนด และในบางครงพบวาอาจเกดจากการตดเชอมากกวาหนงชนดกได (สณรตน, 2544)

สาหรบในประเทศไทยนนไดมการสารวจหาคาจานวนเซลลโซมาตก ของโคในหลายๆ พนทของประเทศไทย พบวามคาเฉลย 293,000–511,820 เซลล/มลลลตร (เกรยงศกด และสรจต, 2548; เดนพงษ และคณะ, 2554; ชมพล และคณะ, 2552; อามนา และศกร, 2550) ซงถอวาอยในระดบสงมาก แสดงวาการตดเชอเตานมอกเสบในภาพรวมของแมโคในประเทศไทยมระดบทสง นานมทผลตไดจงมคณภาพตาและสงผลใหผบรโภคภายในประเทศบรโภคนานมทมคณภาพตาตามไปดวย และทนาเสยดายกคอไมเคยมการนาวคซนปองกนโรคเตานมอกเสบมาสงเสรมใหเกษตรใช จากการสารวจใน


41

หลายๆ พนทพบวาเกษตรไมรจกและไมทราบวามการผลตและใชวคซนดงกลาว ทาใหเกษตรในประเทศไทยเสยโอกาสในการผลตนานมทมคณภาพอนมผลตอรายไดเกษตรกรโดยตรง

Mastivac® (Laboratorios Ovejero S.A., Spain) เปนวคซนปองกนโรคเตานมอกเสบชนดเชอต า ย ท ป ร ะ ก อ บ ด ว ย เ ช อ Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus. pyogenes, Staphylococcus aureus, Arcanobacterium pyogenes, E. coli strain Bov-10, Bov-14, Bov-15, Suis-21 และ J5 ซงเปนวคซนทมชอเสยงเปนทยอมรบในยโรป โดยมผลชวยลดอบตการณของโรคเตานมอกเสบ หรอชวยลดความรนแรงของเตานมอกเสบ และชวยลดคาจานวนเซลลโซมาตกในนานมทาใหนานมมคณภาพดขน (Kucuk and Alacam, 2003) นอกจากนการใชวคซน Mastivac® ไมมอนตรายใดๆ ตอแมโคนมทกาลงตงทอง (ชนาธป และคณะ, 2553ก) และการใชวคซน Mastivac® สามารถชวยลดปรมาณเซลลโซมาตก ในชวง 1 เดอนแรกหลงคลอดไดอยางมนยสาคญ (ชนาธป และคณะ, 2553ข)

ดงนนจดประสงคในการศกษาครง น เ พอทดสอบประสทธภาพของวคซน Mastivac® ในการปองกนโรคเตานมอกเสบของโคนมในประเทศไทย เพอประโยชนในการควบคมและปองกนโรคเตานมอกเสบทมประสทธภาพมากขน สามารถผลตนานมดบทมคณภาพสงสผบรโภคในสภาพการเลยงโคนมในประเทศไทยทมคาเฉลยเซลลโซมาตกทมระดบทสงมากดงทมการสารวจหาคาจานวนเซลลโซมาตกของโคในหลายๆ พนทของประเทศไทย และยงสงผลใหเกษตรกรผเลยงโคนมมรายไดสงขน

อปกรณและวธการ สตวทดลอง

คดเลอกแมโคนมพนธลกผสมโฮลสไตนฟรเชยนชวงการใหนม (lactation) ท 2 ถง 4 จานวน 14 ตว ทอยในระหวางการตงทองและเขาสระยะหยดรดนม (dry period) โดยแมโคนมดงกลาวไมพบประวตการเปนโรคเตานมอกเสบแบบแสดงอาการ ในชวง 1 เดอนกอนทแมโคจะเขาสระยะหยดรดนานม ซงพจารณาจากผลการตรวจทเปนลบ ดวยวธการใชนายา California mastitis test (CMT) ทาปฏกรยากบนานม จานวน 4 ครง (อาทตยละครง) โดยโคทงหมดถกเลยงอยในฟารมเดยวกน ไดรบ อาหารขนโปรตนรอยละ 20 อาหารหยาบจากตนขาวโพดสด ตนขาวโพดหมก และหญาสด และมนากบแรธาตกอนใหกนตลอดเวลา นอกจากนโคทกตวยงไดรบการฉดวคซนปองกนโรคปากเทาเปอย และถายพยาธปละ 2 ครง ขนตอนการทดลอง

แบงแมโคออกเปน 2 กลม กลมท 1 จานวน 7 ตว (กลมควบคม) ไมไดรบการฉดวคซนปองกนโรคเตานมอกเสบ และกลมท 2 จานวน 7 ตว (กลมทดลอง) ไดรบวคซนรวมปองกนโรคเตานมอกเสบชนดเชอตาย (Mastivac®; Laboratorios Ovejero S.A., Spain) ปรมาณ 5 ซซ เขาใตผวหนงบรเวณคอ จานวน 2 ครง หางกน 15 วน โดยเรมฉดวคซนครงแรกทระยะเวลาประมาณ 1 เดอนกอนคลอด ซง 1 โดส ของวคซน (5 ml) ประกอบดวย

Streptococcus agalactiae (2.25 × 109 microorganisms), Streptococcus dysgalactiae

(7.5 × 108 microorganisms), Streptococcus

uberis (7.5 × 108 microorganisms),


42

Streptococcus pyogenes (7.5 × 108 microorganisms), Staphylococcus aureus (4

× 109 microorganisms), Arcanobacterium

pyogenes (3 × 109 microorganisms), E. coli

strain Bov–10 (1.125 × 109 microorganisms),

E. coli strain Bov-14 (1.125 × 109 microorganisms), E. coli strain Bov-15 (1.125

× 109 microorganisms), E. coli strain Suis-21

(1.125 × 109 microorganisms), E. coli strain

J5 (1.125 × 109 microorganisms) จาก นนท า ก า ร เ ก บ ต วอ ย า ง น านม (10

มลลลตร/เตา (จากเตานมแมโคทกตว ของทง 2 กลม ทระยะเวลา 7, 15, 30, 60 และ 90 วน หลงจากแมโคคลอดลก เพอหาคาจานวนเซลลโซมาตก ดวยเครอง Fossomatic cell count ) Fossomatic® FC, Hilleroed, Denmark) และนาตวอยางนานมนบางสวนมาทาการเพาะเ ชอเ พอหาจานวนเ ชอแบคทเรยทงหมดในนานม (Total bacterial count, TBC) ดวยวธ Standard plate count โดยตวอยางน านม ท งหมด นถ กส ง เ พ อท าการ ว เ คราะห ทห อ ง ป ฏ บ ต ก า ร ค ณ ะ ส ต ว แ พ ท ย ศ า ส ต ร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กาแพงแสน จ .นครปฐม การวเคราะหคาทางสถต

นาคาจานวนเซลลโซมาตก และจานวนเชอแบคทเรยทงหมด มาแสดงเปน คาลอการทม (Log10) หาคาเฉลยของคาลอการทมดงกลาว แลววเคราะหเปรยบเทยบหาความแตกตางทางสถตระหวางกลมควบคมและกลมทดลอง ในทกชวงเวลาหลงคลอดทมการเกบเกบตวอยางนานม โดยวธ Independent Student’s t – test นอกจากนหาคาสดสวนของจานวนเตานมทให นานมมจานวนเซลลโซมาตก

ระหวางตงแต 500,000-5,000,000 เซลล/มลลลตร ตอจานวนเตานมทงหมดททาการศกษา จากนนนามาวเคราะหเปรยบเทยบหาความแตกตางทางสถตของสดสวนดงกลาวฯ ระหวางทงสองกลม ในทกชวงเวลาหลงคลอดทมการเกบตวอยางนานม โดยวธ Chi-square

ผลการทดลอง

จากผลการทดลองพบวาแมโคกลมควบคมมคาเฉลย ทแสดงเปนลอการทม (Log10) ของจานวนเซลลโซมาตกในนานม 1 มลลลตร ท 7, 15, 30 วนหลงคลอด สงกวาของแมโคในกลมทไดรบวคซน (กลมทดลอง) อยางมนยสาคญ (P≤0.05) ในขณะทคาดงกลาวของแมโคกลมควบคมมแนวโนมสงกวาท 60 และ 90 วนหลงคลอด (ตารางท 1 และรปท 1) สวนคาเฉลยจานวนเซลลโซมาตกของแมโคกลมควบคมในชวง 7 และ 90 วนหลงคลอด คอ 729,589 และ 216,296 เซลล/มลลลตร ตามลาดบ ในขณะทของแมโคกลมรบวคซนในชวงเดยวกนมคา 306,768 และ 94,768 เซลล/มลลลตร ตามลาดบ

สาหรบคาเฉลย Log10 ของจานวนเชอแบคทเรยทงหมดในนานม 1 มลลลตร ของแมโคกลมควบคมในวนท 7 วนหลงคลอด สงกวาของแมโคในกลมทไดรบวคซน แตวนท 15, 30, 60 และ 90 วนหลงคลอด คาดงกลาวของแม โคกลมควบคมมแนวโนมสงกวาของแมโคกลมทไดรบวคซน (ตารางท 2 และรปท 2) สวนคาเฉลยจานวนเชอแบคทเรยทงหมดในนานม 1 มลลลตร ของแมโคกลมควบคม ในชวง 7 วนหลงคลอด มคา 1,168 CFU (Colony-forming unit) และมคาลดลงเรอยๆ ตามเวลาหลงคลอดจนมคาตาสด 664 CFU ท 90 วนหลงคลอด ซงสงกวาของแมโคกลมทไดรบวคซนในชวงเดยวกนทมคา 678 CFU ท 7 วนหลงคลอด และมคาลดลง


43

เรอยๆ ตามเวลาหลงคลอดจนมคาตาสดเปน 130 CFU ท 90 วนหลงคลอด

นอกจากนยงพบวามแมโคในกลมควบคมตวหนง มเตานม 1 เตา (เตาหนาขางซาย) เปนเตานมอกเสบแบบแสดงอาการท 60 วนหลงคลอด ในขณะทไมพบแมโคในกลมทไดรบวคซนแสดงอาการเตานมอกเสบ ดงนนตวอยางของนานมทมาจากแมโคในกลมควบคมของวนท 90 หลงคลอดลก จงถกลดลงเหลอ 27 ตวอยาง เพราะเตานมทแสดงอาการอกเสบดงกลาวนน ถกทาการรกษาดวยยาปฏชวนะจากการตดสนใจของเจาของแมโคนม จงไมสามารถใชนานมจากเตานมทเกดการอกเสบนเปนตวอยางในการทดลองตอไปได ทาใหตองตดตวอยางนานมจากเตานมนออกจากการทดลอง จากผลการทดลองพบอกวา แมโคในกลมควบคม มจานวนเตานมทใหนานมมจ านวนเซลล โซมาตกระหวาง ต งแ ต 500,000-5,000,000 เซลล/มลลตร ท 7 และ 15 วน หลงคลอด มสดสวนทมากกวาเตานมของแมโคในกลมทไดรบวคซน ในชวงเวลาเดยวกน และแมโคในกลมควบคมในชวง 30, 60 และ 90 วน หลงคลอด เตานมทใหนานมมจานวนเซลลโซมาตกระหวางตงแต 500,000-5,000,000 เซลล/มลลตร มแนวโนมของสดสวนของเตานมทมากกวาเตานมของแมโคในกลมทไดรบวคซน ในชวงเวลาเดยวกน (ตารางท 3)

วจารณผลการทดลอง จากผลการทดลองแสดงใหเหนวา แมโคสอง

กลมทถกเลยงอยในสภาพการจดการเดยวกน แมโคกลมทไดรบวคซนปองกนโรคเตานมอกเสบชนดเชอตาย (Mastivac®) มคาเฉลยลอการทมของจานวนเซลลโซมาตกในนานม นอยกวาของแมโคในกลมทไมไดรบวคซนในชวง 30 วน หลงคลอด และมแนวโนมวาคาดงกลาวของแมโคในกลมรบวคซน จะ

นอยกวา ของแมโคในกลมไมไดรบวคซน ท 60 และ 90 วน หลงคลอด ดวย นอกจากนยงไมพบแมโคกลมรบวคซน ทมปญหาเตานมอกเสบแบบแสดงอาการ (clinical mastitis) ตลอดชวงระยะเวลาของการทดลอง ในขณะทพบแมโค 1 ตว จากกลมทไมไดฉดวคซน มเตานม 1 เตา ทแสดงอาการอกเสบ ซงตรวจพบไดท 60 วนหลงคลอดลก แสดงวาการฉดวคซนปองกนโรคเตานมอกเสบ Mastivac® สามารถลดจานวนเซลลโซมาตกในนานมลงได และชวยปองกนโรคเ ตานมอกเสบแบบแสดงอาการไ ดอยางมประสทธภาพดมากอกดวย ซงสอดคลองกบการทดลองกอนหนาน (Kucuk and Alacam, 2003) ทพบวาการใชวคซนปองกนโรคเตานมอกเสบชนดเชอรวม (Polyvalent) ซงเปนวคซนเชอตาย (Mastivac®) มผลในการชวยลดคาเซลลโซมาตก และชวยลดความรนแรงของเตานมอกเสบเมอวดดวยการทาปฏกรยากบนายา CMT

สาหรบคาเฉลยจานวนเซลลโซมาตกของแมโคในกลมทไดรบวคซน มคาอยในระดบตา ถง ปานกลาง (94,768-306,768 เซลล/มลลลตร) นนแสดงใหเหนวานานมทไดจากแมโคในกลมนมคณภาพตงแต ดมาก จนถง ปกต ซงตางจากแมโคกลมทไมไดรบวคซน ทมคาเฉลยจานวนเซลลโซมาตกอยในระดบปานกลาง ถง สงมาก (216,296-729,589 เซลล/มลลลตร) แสดงวานานมทไดจากแมโคกลมทไมดรบวคซนมคณภาพตงแต ปกต จนถง แยมาก ซงสอดคลองกบรายงานของ Barkema et al. (1998a, b) ทระบวาจานวนเซลลโซมาตกในนานมมากกวา 500,000 เซลล/มลลลตร ถอวาเปนนานมจากเตานมทเกดการอกเสบตดเชอ และสงผลใหนานมนนมคณภาพตา ดงนนอาจกลาวไดวา การฉดวคซนปองกนโรคเ ตานมอกเสบ Mastivac® สามารถควบคมใหจานวนเซลลโซมาตกในนานมของแมโค ม


44

ตารางท 1 แสดงคาเฉลยลอการทมของจานวนเซลลโซมาตก ของแมโคในระยะตางๆ หลงคลอด (n=28)

กลมการทดลอง

คาเฉลย Log10 ของจานวนเซลลโซมาตกในนานม 1 มลลลตร 7 วนหลงคลอด

15 วนหลงคลอด




กลมควบคม 5.54±0.79a 5.22±0.93a 4.87±0.84a 4.70±0.79a 4.59±0.81a*กลมทดลอง P value

4.92±0.61b 0.0020

4.48±0.72b

0.0017 4.41±0.71b

0.0311 4.44±0.62a

0.1763 4.32±0.65a

0.1911 a,b อกษรยกทแตกตางกนในคอลมนเดยวกนมความแตกตางทางสถต (P≤0.05), *n=27 ตารางท 2 แสดงคาเฉลยลอการทมของจานวนเชอแบคทเรยทงหมด ของแมโคในระยะตางๆ หลงคลอด (n=28)

กลมการทดลอง คาเฉลย Log10 ของจานวนเชอแบคทเรยทงหมด ในนานม 1 มลลลตร 7 วนหลงคลอด





กลมควบคม 2.78±0.54a 2.45±0.87a 2.30±0.76a 1.86±0.89a 1.80±0.83a*กลมทดลอง P value

2.39±0.80b 0.0345

2.19±0.73a

0.2366 1.94±0.73a

0.0749 1.86±0.72a

0.9982 1.53±0.59a

0.1658 a,bอกษรยกทแตกตางกนในคอลมนเดยวกนมความแตกตางทางสถต (P≤0.05), *n=27 ตารางท 3 แสดงจานวนเตานมทใหนานมมจานวนเซลลโซมาตกจานวนมาก ของแมโคในระยะตางๆ หลงคลอด (n=28)

กลมการทดลอง

จานวนเตานมทใหนานมมเซลลโซมาตกระหวาง 500,000-5,000,000 เซลล/มลลตร7 วนหลงคลอด





กลมควบคม 18/28 (64.29%)a

11/28 (39.29%)a

6/28 (21.43%)a

2/27 (7.41%)a*

3/27 (11.11%)a*

กลมทดลอง P value

2/28 (7.14%)b 0.0000

2/28(7.14%)b 0.0092

2/28(7.14%)a 0.2519

1/28 (3.57%)a 0.6040

2/28(7.14%)a 0.9660

a,bอกษรยกทแตกตางกนในคอลมนเดยวกนมความแตกตางทางสถต (P≤0.05), *n=27 คาอยในระดบตา ถง ปานกลาง สงผลใหไดนานมทมคณภาพด ถง ดมาก จากแมโคทไดรบการฉดวคซนดงกลาว

นอกจากนยงพบอกวามแมโคจานวนหลายตวในกลมทไมไดรบวคซน มปญหาโรคเตานมอกเสบแบบไมแสดงอาการแฝงอยอกดวย เนองจากพบวา


45

คาเฉลย Log10 ของจานวนเซลลโซมาตก

รปท 1 แสดงคาเฉลย Log10 ของจานวนเซลลโซมาตกในนานม 1 มลลลตร ทระยะตางๆ ภายหลงคลอดลก โดยอกษร a, b ทแตกตางกนในชวงเวลาเดยวกนมความแตกตางทางสถต (P≤0.05)

คาเฉลย Log10 ของจานวนเชอแบคทเรยทงหมด

รปท 2 แสดงคาเฉลย Log10 ของจานวนเชอแบคทเรยทงหมดในนานม 1 มลลลตร ทระยะตางๆ ภายหลงคลอดลก โดยอกษร a, b ทแตกตางกนในชวงเวลาเดยวกนมความแตกตางทางสถต (P≤0.05) แมโคกลมนมเตานมทใหนานมมจานวนเซลลโซมาตกอยระหวาง 500,000-5,000,000 เซลล/มลลลตร จานวนมาก คดเปนรอยละ 11.11 ถง 64.29 ตลอดระยะเวลาการทดลอง ในขณะทแมโคในกลมรบ

วคซน ซงมเตานมทใหนานมมเซลลโซมาตกในจานวนดงกลาว คดเปนเพยงรอยละ 3.57 ถง 7.14 ตลอดระยะเวลาการทดลอง ซ งสอดคลองกบ จตพร (2549) ทระบวา นานมทมคาเซลลโซมาตกตงแต

a aa a ab

b b a a

0

1

2

3

4

5

6

7 วน 15 วน 30 วน 60 วน 90 วน หลงคลอด

กลมควบคม กลมรบวคซน

aa a

a a

ba

a aa

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

7 วน 15 วน 30 วน 60 วน 90 วน หลงคลอดลก

กลมควบคม กลมรบวคซน


46

5,000,000 เซลล/มลลลตร ขนไป ถอวาเปนนานมทมาจากเตานมทเกดการอกเสบแบบแสดงอาการ ดงนนการการฉดวคซนปองกนโรคเตานมอกเสบ Mastivac® จงสามารถชวยควบคมภาวะการเกดปญหาโรคเตานมอกเสบแบบไมแสดงอาการไดดวย ซงจากการทดลองนพบวา แมโคทไดรบการฉดวคซนจะพบสดสวนของเตานมทเกดโรคเตานมอกเสบแบบไมแสดงอาการอยในระดบทตามาก (3.57-7.14%) ในขณะทพบสดสวนของเตานมท เกดโรคเตานมอกเสบแบบไมแสดงอาการมคาสง (11.11-64.29%) ในแมโคทไมไดรบการฉดวคซน

ส วนค า เฉ ลยลอการทมของจ านวนเ ชอแบคทเรยทงหมดในนานม กมแนวโนมไปในทศทางเดยวกนกบคาเฉลยลอการทมของจานวนเซลลโซมาตกในนานม กลาวคอ คานในแมโคกลมทไดรบวคซนมแนวโนมตากวาในแมโคท ไมไดรบวคซน ตลอดชวงระยะเวลาของการทดลอง แสดงวาวคซนเชอตายชนด Mastivac® สามารถลดปรมาณการตดเชอแบคทเรยทอาจเปนสาเหตของการเกดปญหาโรคเตานมอกเสบ เขาสเตานมของแมโคทไดรบวคซนไดดดวย ซงสอดคลองกบรายงานของ Kucuk and Alacam (2003) ททาการตรวจแยกเชอแบคทเรยจ า ก น า น ม โ ด ย ร า ย ง า น ว า ป ร ม า ณ เ ช อ Staphylococcus aureus ในนานมมคาลดลง จากแมโคทไดรบวคซนปองกนโรคเตานมอกเสบชนด Mastivac®

จากการทดลองนไมมการตรวจแยกเ ชอแบคทเรยจากนานม จงทาใหไมสามารถบอกไดวาจานวนเชอแบคทเรยทลดลงนนเปนแบคทเรยชนดใดบาง และจากททราบกนดอยแลววา สาเหตของโรคเตานมอกเสบนน สามารถเกดจากการตดเชอแบคทเรยไดหลายชนด และในบางครงพบวาอาจเกดจากการตดเชอมากกวาหนงชนดกได (สณรตน ,

2544) ดงนนจงมโอกาสทจะสามารถพบแบคทเรยทไมไดเปนเชอแบคทเ รยทถกนามาทาเปนวคซน Mastivac® ตดเขาสเตานมของแมโคได จงอาจเปนสาเหตททาใหจานวนเชอแบคทเรยทงหมดทพบในนานมของแมโคทงจากกลมทไดรบและไมไดรบวคซนมคาดงกลาวนแตกตางกนอยางไมชดเจน

สาหรบการลดลงของ คาเฉลยลอการทมของจานวนเซลลโซมาตก คาเฉลยลอการทมของจานวนเชอแบคทเรยทงหมด และสดสวนของจานวนเตานมทใหนานมมจานวนเซลลโซมาตกอยระหวาง 500,000-5,000,000 เซลล/มลลลตร เทยบกบจานวนเตานมทงหมดททาการศกษา ของแมโคในกลมทไมไดรบวคซน ตงแต 7 จนถง 90 วนหลงคลอด อาจเปนผลมาจากการใสใจในขนตอนการรดนมทถกตอง และความสะอาดในระหวางการรดนมในทกขนตอนของผรดนม การทาความสะอาดโรงเรอนรดนมอยางสมาเสมอ ตรวจสอบความสะอาดและความสมบรณของเครองรดนม อปกรณเครองใชตางๆ กอนและหลงการใชงาน การจดการดานสงแวดลอม การจดการในเรองการใหอาหารทถกตอง ตามภาวะโภชนะความตองการของโคในแตละระยะการใหนม ซงนาจะสงผลใหแมโคมสขภาพทแขงแรงและสามารถตานทานตอเชอไดด นอกจากน เชดชาย และคณะ (2556) รายงานวา ปรมาณการกนไดและพลงงานทโคนมไดรบจากอาหารมผลตอปรมาณผลผลตนานมของโคนม ถาแมโคนมไดรบพลงงานจากอาหารเพยงพอกบความตองการ แมโคนมนนกจะใหผลผลตนานมมากขน และมคณภาพด ซงปจจยดานการจดการทดเหลานอาจเปนผลใหคาทง 3 ดงกลาวขางตนของแมโคในกลมทไมไดรบวคซนลดลงได แตอยางไรกตามการลดลงของคาตางๆ เหลานของแมโคในกลมทไมไดรบวคซน กยงมแนวโนมของการลดลงนอยกวาคาทไดจากแมโคทไดรบวคซน ดงนนการจดการทดรวมกบการไดรบ


47

วคซน Mastivac® ปองกนโรคเตานมอกเสบดวย กจะยงทาใหไดผลในการปองกนโรคเตานมอกเสบไดอยางมประสทธภาพมากขน

จากผลการทดลองครงน สรปไดวาการใชวคซน Mastivac® ฉดใหกบแมโคนม สามารถชวยปอง กนการเ กดโรคเ ตานมอกเสบไ ดอ ยาง ดมประสทธภาพ โดยสามารถปองกนไมใหเกดเตานมอกเสบแบบแสดงอาการ สามารถลดจานวนเซลลโซมาตก และจานวนแบคทเรยทอาจกอโรคเตานมอกเสบ ในนานมใหอยในระดบปกตจนถงตามาก ทาใหไดนานมทมคณภาพดมากขน และยงสามารถลดการเกดโรคเตานมอกเสบแบบไมแสดงอาการได

กตตกรรมประกาศ

ขอขอบคณบรษท ยเนยน อกรฟาร จากด ซงเปนผนาเขา และจดทะเบยนวคซนดงกลาว ทไดสนบสนนงบประมาณในการจดทางานวจยนเปนอยางด ขอขอบคณเจาหนาทหองปฏบตการ คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กาแพงแสน จ .นครปฐม ในการชวยตรวจตวอยางนานม และขอขอบคณทานเจาของฟารมโคนมในจงหวดราชบร ทอนญาตใหมการใชแมโคในการทดลอง

เอกสารอางอง เกรยงศกด พมพงาม และ สรจต วชชวรรณ. 2548.

การศกษาสวนประกอบและจานวนเซลล โซมาตกในนานมดบถงนมรวมของจงหวดเชยงรายระหวางเดอนตลาคม 2543-มนาคม 2545. วารสารวชาการปศสตวเขต 5. 7 (3): 1-9.

จตพร กระจายศร. 2549. การสรางนานมและโรคเตานมอกเสบในแมโคนม. สตศาสตร เธนเวชวทยาในโคเพศเมย. สานกพมพมหาวทยาลย

เทคโนโลยมหานคร กรงเทพมหานคร. หนา 385.

ชนาธป ธรรมการ พฒนพงศ พงศวทยเวคน และ จาลอง มตรชาวไทย. 2553ก. การใชวคซนชนดเชอตายแบบเชอรวม (Mastivac®) ตอการปองกนโรคเตานมอกเสบของโคในประเทศไทย. การศกษาเบองตน. ใน: เอกสารการประชมวชาการทางสตวแพทย มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร ครงท 4 ประจาป 2553, 2 6 พ ฤ ศ จ ก า ย น 2 5 5 3 . ค ณ ะ ส ต วแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร กรงเทพมหานคร. 85-89.

ชนาธป ธรรมการ พฒนพงศ พงศวทยเวคน และ จาลอง มตรชาวไทย. 2553ข. ประสทธภาพของวคซนเชอตายแบบเชอรวม (Mastivac®) ตอการปองการโรคเตานมอกเสบในโคนมหลงคลอด. ใน: เอกสารประชมวชาการ 3rd SUT Graduate Conference 2010, 21-23 ธนวาคม 2553. มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร นครราชสมา. 191-195.

ชมพล นาครนทร นฐฐา ศรเจรญไชย และ คมวฒ ธรรมสาร. 2552. คณภาพนานมดบของฟารมโคนมจงหวดชยภมระหวางป 2550-2552. จดหมายข าวส ขภาพส ต วศ น ย ว จ ยและพฒนาการสตวแพทยภาคตะวนออกเฉยงเหนอตอนลาง. 6 (พเศษ): 2-12.

เชดชาย โยธารนทร ฉลอง วชราภากร เฉลมพล เยองกลาง ณพงศพจน สภาพ และ จนทรา วงศเณร. 2556. ผลของการเสรมกรดอะมโนในสตรอาหารผสมสาเ รจทมการใ ชกากมนสาปะหลงแหงตอปรมาณการกนได การยอยได ผลผลตนานม และองคประกอบนานมในโคใหนม. สตวแพทยมหานครสาร. 8 (2): 53-69.


48

เดนพงษ สาฆอง นฐฐา ศรเจรญไชย ยภา โอภากาศ และ อดม เจอจนทร. 2554. ความสมพนธร ะ ห ว า ง ฤ ด ก า ล เ ซ ล ล โ ซ ม า ต ก แ ล ะองคประกอบ นานม ดบในเขต พนท ภาคตะวนออกเฉยงเหนอตอนลางของประเทศไทยระหวางป พ.ศ. 2544-2552. จดหมายขาวศน ย วจ ยและพฒนาการสตวแพทยภาคตะวนออกเฉยงเหนอตอนลาง. 8 (8): 1-10.

สณรตน เอยมละมย. 2544. โรคเตานมอกเสบและสขภาพของเตานมในโค. ใน: สขภาพเตานม คณภาพนานมดบโค โรคเตานมอกเสบและเครองรดนมโค. คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน ขอนแกน. 1–20.

อามนา แสงจนทร และ ศกร คณวฒฤทธรณ. 2550. ปจจยทมอทธพลและความสมพนธระหวางราคารบซอ ไขมนนม ระดบการปนเปอนแบคทเรยและจานวนโซมาตกเซลลในนานมดบทผลตโดยสมาชกของสหกรณโคนมแหงหนงในเขตภาคกลางของประเทศไทย. ใน: การประชมทางวชาการของมหาวทยาลยเกษตรศาสตร ครงท 45. 30 ม.ค.-2 ก.พ. 2550. มหาวทยาลย เกษตรศาสตร กรงเทพมหานคร. 146-154.

Barkema, H.W., Schukken, Y.H., Lam, T.J.G.M., Beiboer, M.L., Benedictus, G. and Brand, A. 1998a. Management practices associated with low, medium, and high somatic cell counts in bulk milk. J. Dairy Sci. 81: 1917–1927.

Barkema, H.W., Schukken, Y.H., Lam, T.J.G.M., Beiboer, M.L., Wilmink, H., Benedictus, G. and Brand, A. 1998b. Incidence of clinical mastitis in dairy herds grouped in three categories by bulk milk

somatic cell counts. J. Dairy Sci. 81: 411-419.

Giraudo, J.A., Calzolari, A., Rampone, H., Rampone, A., Giraudo, A.T., Bogni, C., Larriestra, A. and Nagel, R. 1997. Field Trials of a Vaccine Against Bovine Mastitis. 1. Evaluation in Heifers. J. Dairy Sci. 80: 845–853.

Hogan, J.S., Bogacz, V.L., Aslam, M. and Smith, K.L. 1999. Efficacy of an Escherichia coli J5 Bacterin Administered to Primigravid Heifers. J. Dairy Sci. 82: 939–943.

Hogan, J.S., Smith, K.L., Todhunter, D.A. and Schoenberger, P.S. 1992a. Field Trial to Determine Efficacy of an Escherichia coli J5 Mastitis Vaccine. J. Dairy Sci. 75: 78–84.

Hogan, J.S, Weiss, W.P., Todhunter, D.A. and Smith, K.L. 1992b. Efficacy of an Eschericia coli J5 Mastitis Vaccine in an Experimental Challenge Trial. J. Dairy Sci. 75: 415–422.

Kucuk, S. and Alacam, E. 2003. The Efect of Udder and Milking Hygiene on Systemic Immunization Approaches in Dairy Herds. Ankara. Univ .Vet. Fak. Derg. 50: 33–37.

Philpot, W.N. and Nickerson, S.C. 1991. Mastitis: Counter Attack. Babson Bros. Co. Ltd. Illinois. USA. 150 p.

บทความวชาการ


การใชวธทางอณชวโมเลกลตรวจหาเชอ Trypanosoma evansi ในเลอดโคและกระบอ

ไพทล แกวหอม1,#

1คณะเทคโนโลยการเกษตร มหาวทยาลยบรพา วทยาเขตสระแกว สระแกว 27160

บทคดยอ: เชอ Trypanosoma evansi เปนปรสตในเลอดของโคและกระบอทเปนสาเหตทาใหเกดโรค trypanosomiasis หรอโรคเซอรา (surra) ซงทาใหเกดการแทงในโคและกระบอ การตรวจวนจฉยดวยเทคนค PCR เปนเทคนคทนยมนามาตรวจหาเชอ T. evansi เนองจากใหผลทจาเพาะเจาะจง (specificity) และมความไวตอเชอ (sensitivity) มากกวาวธการตรวจเชอดวยกลองจลทรรศน นกวจยไดมการพฒนาไพรเมอรมากมายเพอเพมประสทธภาพของเทคนค PCR โดยชนดของไพรเมอรทนยมใชคอ TBR1 และ TBR2 ซงได PCR product เทากบ164 คเบส และสามารถตรวจวนจฉย DNA ของเชอ T. evansi ไดตาสดท 0.01- 0.001 พโคกรม และตรวจเชอในกระแสเลอดไดถง 1 ตวปรสตตอมลลลตร วธการทางอณชวโมเลกลนนยมนามาใชเพอการจาแนกเชอ การตรวจหาเชอ การตรวจหาความชกของเชอ และนามาใชในการตรวจหาความหลากหลายทางชวภาพของเชอ T. evansi จงเปนประโยชนในการเฝาระวง ปองกน ควบคม รวมถงปองกนการเกดโรคอบตใหมหรอการกลายพนธเปนสายพนธใหมของเชอ T. evansi ไดอกทางหนง

คาสาคญ: Trypanosoma evansi, โค กระบอ #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2557. 9(1): 49-61. E-mail address: [email protected]

ไพทล แกวหอม / สตวแพทยมหานครสาร. 2557. 9(1): 49-61.

50

Molecular Detection of Trypanosoma evansi among Cattle and Buffaloes Blood

Paitoon Kaewhom1,#

1Faculty of Agricultural Technology, Burapha University, Sakaeo Campus, Sakaeo 27160 THAILAND

Abstract: Trypanosoma evansi, a protozoon blood parasite in cattle and buffaloes, causes a trypanosomiasis (also known as surra disease) and easily leads to abortion in cattle and buffaloes. Polymerase chain reaction (PCR) technique has been widely used for detecting T. evansi due to higher specificity and sensitivity compared with microscopic examination. Various primers have been developed and published for increasing the efficiency of PCR technique. To date, the set of TBR1 and TBR2 primer is recommended to use for PCR amplification of 164 bp DNA fragment. These primers can detect 0.01-0.001 pg of purified DNA and parasitaemia 1 trypanosome/ml in animal blood. PCR based molecular technique was used for identification, detection, prevalence and genetic diversity of T. evansi in cattle and buffaloes. Molecular detection is necessary method for surveillance, prevention, control, and diagnostic of this disease. Additionally, it could be applicable for prevention of emerging diseases or mutation to a new strain of T. evansi.

Keywords: Trypanosoma evansi, Cattle, Buffaloes #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2014. 9(1): 49-61. E-mail address: [email protected]

บทนา

โรคปรสตในเลอด (Blood parasites) เปนโรคทมความสาคญตอการทาปศสตวในประเทศไทย และสงผลกระทบตอสขภาพสตวโดยตรง ปรสตในเลอดมขนาดเลกไมสามารถมองเหนดวยตาเปลา สามารถตดตอโดยพาหะนาโรคทสาคญไดแก เหบ และแมลงดดเลอด เชน เหลอบและแมลงวนคอก เปนตน โรคทเกดจากปรสตในเลอดของสตวเคยวเออง หรอทมกเรยกวาไขเหบโค (tick fever) โรคใน

กลมนประกอบดวยโรค Anaplasmosis, Babesiosis แ ล ะ Theileriosis แ ล ะ เ ซ อ ร า ห ร อ โ ร ค Trypanosomiasis (surra) ทมสาเหตมาจากเชอ Trypanosoma evansi ซงกอใหเกดความสญเสยทางเศรษฐกจคอนขางสงเพราะสามารถแพรกระจายไดงายและรวดเรว สงผลกระทบทาใหผลผลตตา เสยคาใชจายในการรกษา สตวบางตวอาจปวยโดยแสดงอาการหรอไมแสดงอาการ กได (Hunngerford, 1990; Blezinger, 1998) สตวทไมแสดงอาการ


51

อาการปวยจะเปนรงโรค (reservoir) และสามารถแพรกระจายโรคไปยงโคและสตวอนบางชนดได การแพรกระจายของโรคปรสตในเลอดมชนดและความรนแรงแตกตางกนขนอยกบสายพนธและความไวตอโรคในสตวแตละตว ปรมาณของปรสต และอายของสตว (Morter, 2006) นอกจากนยงขนอยกบความเหมาะสมของสภาพแวดลอมในแตละพนทดวย โดยการระบาดของโรคพบมากในชวงฤดฝนถงปลายฤดหนาว เนองจากเปนชวงทมเหลอบ แมลงวนคอก และเหบท เ ปนพาหะนาโรคชกชม (Vetcouncil, 2011) ซงเชอ T. evansi เปนปรสตในสตว ซงจะทาใหโคแสดงอาการไขสง เบออาหาร กลามเนอสน เดนขาแขง ไมมแรงหรอเปนอมพาต บางตวมอาการทางประสาท เชน เดนวน เปนตน สาหรบในกระบอแสดงอาการไขสง หายใจดง เดนลาบาก หลงและขาแขง คอบด นอกจากนยงพบวา เชอ T. evansi นยงเปนสาเหตสาคญททาใหสตวเกดการแทงลกระยะทายของการตงทอง (6-7 เดอน) ลกตายแรกคลอด (neonatal death) หรอทาใหลกออนแออกดวย โดยการแพรกระจายของเชอดงกลาวมแมลงดดเลอด เชน เหลอบ แมลงวนคอก เปนพาหะนาโรค ซงปจจบนมวธการตรวจวนจฉยเชอ T. evansi นนมอยดวยกนหลายวธ แตละวธกมความแตกตางกนไป วธการตรวจทางอณชวโมเลกล ดวยเทคนค PCR เปนวธการห น งท ม ก าร พฒนาข นมา ใ ชส าห รบการตรวจวนจฉยโรค trypanosomiasis ของโคและกระบอ โรคทรพพาโนโซมเอซส (Trypanosomiasis) สาเหตและการตดตอ: เกดจากเชอโปรโตซว ชนดทพบในกระแสโลหตของสตว คอ เชอทรพพาโนโซมา อแวนซย (Trypanosoma evansi) ทาใหเกดโรค ทรพพาโนโซมเอซส (Trypanosomiasis) หรอโรคเซอรา (Surra) ในสตวเลยงลกดวยนานมหลายชนด

รวมทงโคและกระบอ เชอนจะพบอยนอกเมดเลอดแดง ซงลกษณะเปนโปรโตซวทมรปรางยาวเรยว ขนาดยาวประมาณ 24 ไมครอน ดานหนามแส (flagellum) 1 เสน (รปท 1) การตดโรคมแมลงดดเลอด ไดแก เหลอบ แมลงวนคอก หรอยง เปนพาหะ และจะปลอยเชอเขาสกระแสโลหตโดยเปนการตดเชอแบบเชงกล (Mechanical transmission) (Thavenan, 2004)

รปท 1 เชอทรพพาโนโซมา อแวนซย (Trypanosoma evansi) ทมา: Thavenan (2004)

อาการทางคลนก: โคเปนโฮสตทคอนขางทนทาน แตความเสยหายมกเกยวของกบทางดานเศรษฐกจ โดยโคมกจะแทงในชวงทายๆ ของการตงทอง อาการทวไปทพบ ไดแกมไขขนๆ ลงๆ เบออาหาร ผอมโซ บวมนา โดยเฉพาะบรเวณสวนลางของรางกาย เชน คาง คอ หรอทอง โลหตจาง อาจพบอาการดซานดวย (Thavenan, 2004) สาหรบโคนมไมคอยแสดงอาการใหเหนเดนชดนอกจากซดและผอม แตในรายทเปนรนแรงจะมไข ตาอกเสบหรอขน ขาแขง หลงแขง คอบด โลหตจาง อาจตายอยางเฉยบพลนได ในโคทองจะแทงลกในชวงตงแต 4 เดอนขนไป หรออาจ


52

คลอดกอนกาหนด นาหนกลกแรกคลอดตา รกคางในโครดนมนานมลด สวนในโคทองวางจะไมแสดงอาการเปนสดและอาจมอาการทางประสาท เชน เดน ตนตระหนก กระโดด ดร าย ซม เ ปน อมพาต (Chompoochan et al., 1996) การรกษา: มยาหลายชนดทใชรกษาแลวไดผลด และทมจาหนายในประเทศ คอ Diminazine aceturate (Berenil®) ใชขนาด 3.5-7 มลลกรม /นาหนกตวสตว 1 กโลกรม มทงทเปนเมดแกรนลในซอง ตองผสมนากลน และเปนของเหลวบรรจขวด พรอมฉดเขากลามเนอ การควบคมและปองกน: การควบคมคอนขางยาก เนองจากแมลงดดเลอดทมอย ทวไปในประเทศ โดยเฉพาะเหลอบทง 3 ชนด ไดแก Tabanus spp. Chrysops spp. และ Haematopota spp. รวมทง แมลงวนคอกดวย ซงเปนพาหะทสาคญ อยางไรกด ในชวงทมการระบาดของโรคมาก โดยเฉพาะในหนาฝน ควรมการฉดพนยาฆาแมลงบนตวสตวหรอตามแหลงแพรพนธของแมลงดดเลอด หรอ อกวธหนงคอฉดยาซาโมรน (Samorin®) ใหโคเพอปองกนกอนถงฤ ดฝนและ เม อหมดฤดฝน ในขนาด 0 .5 -1 .0 มลลกรม/นาหนกตวสตว 1 กโลกรม สามารถปองกนโรคไดนาน 3-4 เดอน (Thavenan, 2004)

วธการตรวจวนจฉย การตรวจวนจฉยเพอจาแนกเชอ (Identification of the agent) 1. การตรวจเชอโดยตรงดวยกลองจลทรรศน (Direct microscopic examination)

การตดเชอ T. evansi โดยทวไปจะไมสามารถบงชลกษณะเฉพาะของการเกดโรคได แตถาในกรณท

ตดเชอและแสดงอาการเฉยบพลน (acute cases) มเชอปรสตในเลอดสง นยมใชวธ การตรวจเลอดสด (wet blood films) โดยการเจาะเลอดใสสารกนเลอดแขงตว หยดเลอดบนสไลด ปดดวย cover glass ตรวจหาเชอดวยกลองจลทรรศน การทาฟลมเลอดบางๆ บนแผนสไลด (Strained thin blood smear) ยอมดวยสยมซา แลวตรวจดเชอดวยกลองจลทรรศน และวธตรวจ biopsies ของตอมนาเหลอง (Lymph node) หรอ Oedema fluid แตสาหรบกรณทแสดงอาการเรอรง (Chronic cases) มเชอปรสตในเลอดตา นยมใชวธ การทาฟลมเลอดหนาบนแผนสไลด (Strained thick blood smear) (OIE, 2012) 2. การตรวจเชอโดยทาใหเชอมความเขมขนมากขน (Concentration method)

ถงแมวาจะมเชอ T. evansi ในเลอดปรมาณตา เชอนกสามารถทาใหสตว (Host) มอาการออนแอได เชอ T. evansi ทาใหสตว ดงนนการทาใหเชอมความเขมขนมากขน จงเปนวธหนงทนามาใชในการตรวจวนจฉย เพอเพม sensitivity ในการตรวจวนจฉยดวยกลองจลทรรศน คอวธ Haematocrit capillary tube technique (HCT) หรอ Woo’s technique และวธ Murray’s technique (OIE, 2012) 3. การตรวจเชอโดยวธ Animal inoculation

การตรวจเชอดวยวธ Animal inoculation กอใหเกดขอกงวลมากขนในการใชสตวเพอการตรวจวนจฉยเชอ T. evansi ทาใหมขอจากดปฏบต ซงในกรณทมการใชจะตองมควบคมอยางด และคานงถงจรยธรรมในการใชสตวทดลองดวย วธการนสามารถใชในกรณทสตวมการตดเชอแบบไมแสดงอาการ (Subclinical) โดยการฉดเชอในหนขนาดเลก นยมใชหน rat และหน mice โดยนาเลอดสตวมาฉดเขาชอง


53

ทองหน หลงจากนน 3-5 วน ตดหางหน หยดเลอดบนสไลด ปดดวย cover glass ตรวจดเชอดวยกลองจลทรรศน แตวธการฉดเชอเขาไปในหนกไมไดผลแมนยาทง 100 เปอรเซนต แตกสามารตรวจเชอ ไดท 1.25 T. evansi ตอมลลลตร (Monzon et al., 1990) 4. การตรวจเชอโดยวธตรวจสารพนธกรรม (Detection of trypanosomal DNA)

การตร วจสอบสาร พน ธ ก ร รมขอ ง เ ช อ Trypanosoma spp. สามารถจาแนกสตวทตดเชอได เนองจากสารพนธกรรมของเชอจะอยในเลอดสตวได 24-48 ชวโมงเทานน หลงจากทเชอตาย ดงนนการตรวจวนจฉยในสตวดวยวธนจงเปนวธทสามารถตรวจพบเชอทมอยจรง (Active infections) หรอเชอทตายไมเกน 24-48 ชวโมง เทคนคทใชตรวจหาสารพนธกรรม คอ DNA probes และ Polymerase chain reaction (PCR) แตเทคนคทนยมใชหรอใชต ร ว จ โ ด ย ท ว ไ ป ใ น ห อ ง ป ฏ บ ต ก า ร ค อ PCR technique 5. การตรวจเชอโดยวธ Antigen detection

การตรวจว นจฉย เ ชอท ม อ ยจร ง (Active infections) สามารถตรวจจากแอนตเจน (antigen) ในกระแสเลอดหรอซรมกได แตวธการดงกลาวกยงไมถงระดบท นาพอใจทจะแนะนาใหใชสาหรบการวนจฉยโดยทวไปในหองปฏบตการ การตรวจวนจฉยทางซรมวทยา (Serological tests)

สตวทตดเชอ T. evansi จะมการสรางแอนตบอด (antibody) ขนมาตอบสนองตอเชอ มการคดคนวธการตางๆ มากมายทจะตรวจสอบแอนตบอด เพอทจะนามาตรวจวนจฉยเชอ T. evansi ทงในหองปฏบตการและการตรวจวนจฉย

ภาคสนาม บางวธการมการนามาใชแลว แตตองรอการประเมนในภาพรวมและความเปนมาตรฐาน ซงวธการการตรวจทางซรมวทยาทตรงเปาหมายมากทสดคอ วธ immunofluorescence antibody test (IFAT) วธ enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) และวธ card agglutination test (CATT/T. evansi) ซงวธ CATT สามารถนามาปรบใชเพอตรวจวนจฉยภาคสนามได แตสาหรบวธ ELISA เปนวธทใชตรวจสอบ IgG ในซรมของสตว ทสามารถจาแนกสตวทไมตดเชอจรงได วธการนจงจะเหมาะสาหรบการตรวจสอบสถานะการปลอดโรค กอนทจะมการเคลอนยายสตวหรออยในระหวางการกกกนสตว (OIE, 2012) การตรวจสอบดวยวธ CATT แลวตามดวยวธ ELISA เพอเปนการตรวจสอบอกครงหนง กสามารถประกาศสถานะการปลอดโรคได แตอยางไรกตาม แนะนาใหการตรวจสอบดวยเทคนค PCR เพอยนยนผลจะทาใหไดสถานะการปลอดโรคทสมบรณมากกวา เชอ Trypanosoma spp. กบการกอโรคสตวสคน (zoonoses) และโรค surra

โรคสตวสคน (zoonoses) มบทบาทสาคญตอคนและสตวเปนอยางยง ซงโรคปรสตในเลอดของโคและกระบอกเปนโรคในสตวชนดหนงทสามารถตดตอสคนได ตวอยางโรคทสาคญทเกดจากปรสตในเลอดของโคและกระบอคอ โรค Trypanosomiasis ซงเกดจากเชอ Trypanosoma spp. (Webster and MacDonald, 1995) โดยชนดของเชอ Trypanosome ทมรายงานวาสามารถตดตอจากสตวสคนไดคอ เชอ T. lewisi ในหน rat ทจงหวดเชยงใหม (Natheewattana et al.,1978) และ T. melophagium จาก nasal swab ของแกะนาเขาจากประเทศอนเดย (Phonpak et al., 1989)


54

นอกจากนยงพบวา มการตดเชอ Trypanosome ในคน พบบอยในแถบอฟรกา ซ ง เ กดจากเช อ T. gambiense ทาใหเกดโรคเหงาหลบ (sleeping sickness) จะม tsetse fly เปนพาหะนาโรคเทานนและในอเมรกาใต จากเชอ T. cruzi (Chagas’ disease) โดยมมวน kissing bug เปนพาหะนาโรคทสาคญ (WHO, 2010)

สาหรบเชอ T. evansi กอใหเกดโรค surra ในโคและกระบอ และพบการรายงานในสตวเลยงชนดอน เชน มา (Boonyawong et al., 1975) ควาย (Matthias and Muangyai, 1980) โคเนอ (Tuntasuvan et al., 1997) โคนม (Trisanarom et al., 1987) ชาง (Rodtian et al., 2004) กวาง (Indrakamhang et al., 1996; Tuntasuvan et al., 2000) ซงสามารถทาอนตรายรนแรงถงตาย มกระบาดในชวงฤดฝนจนถงปลายฤดหนาว (ระหวางเดอนกนยายนถงกมภาพนธ) ซงสามารถตดตอไดโดยม เหลอบ แมลงวนคอก ยง และเหบ เปนพาหะนาโรค โดยอาการในมามกเปนแบบเฉยบพลน แตในบางภมภาคอาจเปนแบบเรอรงได อาการทมกพบคอ สตวจะมไขสง ผอมแหง บวมนาบรเวณคอ สวาบ หนาอก หรอขา ในตวผมกพบหนงหมอวยวะสบพนธและอณฑะบวม หรออาจพบวงผนลมพษเลกๆ ตามลาตว ซงอาจจะเปนๆ หายๆ ตลอดเวลาของการเปนโรค สตวจะมไขสงเปนระยะๆ โลหตจาง สตวออนเพลยมาก เบออาหาร อาจมเยอตาอกเสบและขนรวง หลงจากเรมแสดงอาการของโรค กลามเนอออนแอ ไมอยากเดน อาการไขจะผนแปรตามจานวนปรสตในเลอด ระยะทายของการเปนโรคจะมตาอกเสบแบบมหนอง มาเมอเปนโรคนถาไมรกษา อาจตายภายใน 1 สปดาหถง 6 เดอน การควบคมโรคนคอนขางยาก ( Intharakamhaeng, 2008) สวนอาการในโคมกแสดงอาการไขสง เบออาหาร กลามเนอสน เดนขา

แขง ไมมแรงหรอเปนอมพาต บางตวมอาการทางประสาท เชน เดนวน เปนตน สาหรบในกระบอแสดงอาการไขสง หายใจดง เดนลาบาก หลงและขาแขง คอบด นอกจากนยงพบวา เชอ T. evansi เปนสาเหตททาใหสตวเกดการแทงลกระยะทายของการตงทอง (6-7 เดอน) ลกตายแรกคลอด (neonatal death) หรอทาใหลกออนแออกดวย (Chopjit et al., 2006) ถงแมวาเชอ T. evansi จะไมสามารถกอใหเกดโรคสตวสคน แตในประเทศแถบเอเชยเคยมรายงานการตรวจพบเชอ T. evansi ในชายอนเดยวย 40 ป (Joshi et al., 2005) สาหรบประเทศไทยไดพบเชอ Trypanosome ในเดกทารกเพศชายอาย 45 วนและถอวาเปนรายงานแรกในประเทศไทยอกดวย (Giawganka et al., 2005)

เทคนค PCR กบการตรวจวนจฉยเชอ T. evansi

เ น อ ง จ า ก เ ท ค น ค ก า ร เ พ ม จ า น ว น (amplification techniques) มอยดวยกนหลายวธ เชน target amplification techniques, probe amplification techniques และ signal amplification techniques เปนตน แตวธทนยมใชเพอเพมจานวนปรมาณ DNA เปาหมายในตวอยางทตองการตรวจสอบคอ เทคนคการเพมปรมาณ DNA เปาหมายโดยปฏกรยาเอนไซมทเกดขนตอเนองกนหลายๆ รอบ (Polymerase Chain Reaction; PCR) ซงจดอยในกลม target amplification techniques ในปจจบนนยมนาเทคนคนมาใชในงานดานการตรวจวนจฉยโรค เชน โรคตดเชอไวรสและแบคทเรย โรคตดเ ชอปรสตในเลอด โรคทางพนธกรรมตางๆ โรคมะเ รง รวมถ งการประยก ต ใ ช ในงานด านวทยาศาสตร เปนตน นอกจากนยงสามารถนามาใชในการจดจาแนกเชอไดอกดวย เทคนค PCR เปนเทคนคทมความจาเพาะตอ DNA เปาหมายและมวธ

ตารางท ชนดของไTBR TEPAN pMURTe ESAG TRYP1 TRYP4

ทมา: ดด

ทาทสะดปจจบน ประยกตเพราะใชใหมควาจาเปนต

1 แสดงชนดไพรเมอร ลา

TTTT

c ppESESTTTT

ดแปลงจาก Pr

รปท 2 แสดง

ดวกไมยงยากทเนองจากมปร

ตใชมากกวาวธชหลกการเพมามไวส ง ไมองใชสารกมม

ไพทล แกวห

ของไพรเมอราดบเบสของไพBR1: 5’ GAATBR2 : 5’CCATEPAN1: 5’ AGEPAN2 : 5’ GAMURTec F : 5MURTec R : 5SAG6 : 5’ ACASAG7 : 5’ CACRYP1S : 5’ AARYP1R : 5’ GCRYP4S : 5’ CGRYP4R : 5’ GG

ruvot et al.,

งขนาด PCR p

ทาใหมการใชระสทธภาพแลธ nucleic acจานวน DNAจา เ ปนตองมนตภาพรงส

หอม / สตวแพ

ร ลาดบเบส แพรเมอร TATTAAACAATTTTATTAGCTTGTCACATGCATAGAAGGCGTT5’ TGCAGACG5’ CTCCTAGAAATTCCAGCAGCGTGAATCCTAGTTCACCGATCTGCGTTCTTCGTCCCTGCCATGAAGCCAAGT

, (2010)

product (คเบ

อยางแพรหลละศกยภาพในcid hybridizaA เปาหมาย จตดฉลากแลสในการตรวจ

พทยมหานคร

และขนาดของ

TGCGCAG 3’ TTGTTGC 3’TTGGTGGCA 3TACCCAATCA ACCTGACGTAAGCTTCGGTGGAGTTGGAG

TCAATTTTGT 3TATTG 3’CAACGAA 3’TTTGTACACA

TCATCCATCG

บส) และลาด

ายในนการation จงทาละไมจสอบ

(Lulตรวจไพรเแตสประไดเป

รสาร. 2557. 9

PCR produข

3’3’

ACT 3’GTCCT 3’3’3’

AC 3’3’

บนวคลโอไทป

itanon, 199จวนจฉย subเมอร NRP แสาหรบไพรเมอสทธภาพ ดงรปรยบเทยบกา

9(1): 49-61.

ct ขนาดของ PCR

ปของเชอ Try

97) และเปนวbgenus ของและ TBR (Maอรอนกไดมการายงานของ Pารใชไพรเมอร

R product (เบ164

122

227

237

545

476

ypanosoma

วธมาตรฐานทง trypanozoasiga et alารวจยเพอเปรPruvot et aร 6 ชนด ดงต

55

บสแพร)

evansi

ทใชในการoon ซงใชl., 1992) รยบเทยบl. (2010) ตารางท 1


56

เพอตรวจวนจฉย T. evansi ในเลอดหนและเลอดโคและกระบอของไทยดวยเทคนค PCR พบวา การใชไพรเมอร TBR 1/2 ใหผลท sensitivity และ specificity สงกวาไพรเมอร TEPAN pMURTec ESAG TRYP1 และ TRYP4 โดยไมมการเกดปฏกรยาขาม (cross reaction) กบเชอทกอโรคตวอนๆ สามารถตรวจวนจฉย DNA ของเชอไดท 0.01 พโคกรม และตรวจภาวะการตดเชอในกระแสเลอดไดถง 1 ตวปรสตตอมลลลตรในเลอดของหน สอดคลองกบการทดลองของ Fernandez et al. (2009) ซงเปรยบเทยบการใชเทคนค PCR (ใช TBR primer) กบวธการตรวจดวยกลองจลทรรศนตรวจหาเชอ T. evansi ในหนทตดเชอ พบวาการตรวจดวยเทคนค PCR ใหผลทดกวาและการใชไพรเมอร TBR สามารถตรวจวนจฉย DNA ของเชอไดท 0.000001 นาโนกรม สาหรบไพรเมอรทใชในการวนจฉยในปจจบนซงเปนทนยมและม sensitivity ทสงคอ ไพรเมอร TBR1 และ TBR2 เมอใชเพอเพมจานวน DNA จะได PCR product เทากบ164 คเบส และเมอนามาโคลนเพอหาลาดบนวคลโอไทปแลวพบวามความยาวของ นวคลโอไทป เทากบ164 คเบส ทงในโคและกระบอ ดงรปท 2

สาหรบการเปรยบเทยบวธการตรวจวนจฉยระหวางการใชเทคนค PCR โดยใชไพรเมอร TBR กบวธการตรวจดวยกลองจลทรรศน (microscopic examination) Muieed et al. (2008) รายงานวาประสทธภาพการตรวจวนจฉย T. evansi ในเลอดมา ทตรวจดวยเทคนค PCR สงกวา 3 เทา กบการตรวจดวยกลองจลทรรศน โดยใชเทคนคการทาแผนฟลมเลอดบนสไลด (Stained blood smear) ซงมคา percent efficacy เทากบ 16 และ 5 เปอรเซนต ตามลาดบ สอดคลองกบรายงานของ Ijaz et al. (1998) ทไดเปรยบเทยบ sensitivity ของเทคนค

PCR กบวธการตรวจดวยกลองจลทรรศน ในการตรวจวนจฉย T. evansi ในหนททาใหตดเชอ ผลการทดลองพบวา การใชเทคนค PCR สามารถตรวจพบเชอ T. evansi ในหนททาใหตดเชอไดในวนท 3 แตการตรวจดวยกลองจลทรรศนสามารถตรวจพบเชอไดในวนท 5 หลงจากการทาใหตดเชอ (ตารางท 2)

การเตรยม DNA จากตวอยางทตองการตรวจ มความสาคญตอการตรวจและ sensitivity ของเทคนค PCR ซงสามารถเตรยมไดจากเลอดปกต หรอใชชน buffy coat มาสกด DNA กจะสามารถเพม sensitivity ได (Desquesnes and Davila, 2002; Majiwa et al., 1994) อยางไรกตาม เทคนค PCR กเปนเทคนคทมความไวตอเชอมากทสดสาหรบตรวจวนจฉยการตดเชอ T. evansi ของโคและกระบอ

ในปจจบนมการนาเทคนคการตรวจทางอณชวโมเลกลมาใชประโยชนในการจาแนกเชอหรอการตรวจหาเชอ ใชตรวจหาความชกของเชอ T. evansi (Desquesnes et al., 2001; Njiru et al., 2005; Baticados et al., 2011; Berlin et al., 2012; Ashour et al., 2013) และนามาใชในการหาความหลากหลายทางชวภาพของเชอ T. evansi (Areekit et al., 2008; Amer et al., 2011; Tian et al., 2011; Villareal et al., 2013)

สรป เชอ Trypanosoma evansi เปนสาเหตของ

โรค trypanosomiasis หรอโรคเซอรา (surra) ทาใหโคและกระบอมอาการไขสง เบออาหาร กลามเนอสน เดนขาแขง ไมมแรงหรอเปนอมพาต บางตวมอาการทางประสาท นอกจากนยงทาใหสตวเกดการแทงลกระยะทายของการตงทอง (6-7 เดอน) ลกตายแรกคลอดหรอทาใหลกออนแอ วธการตรวจวนฉยเชอ


57

ตารางท 2 แสดงการเปรยบเทยบวธการตรวจวนจฉยระหวางการใชเทคนค PCR โดยใชไพรเมอร TBR กบวธการตรวจดวยกลองจลทรรศน ระยะเวลาหลงจากทาใหหนตดเชอ (ชวโมง) การตรวจดวยกลองจลทรรศน

(จานวน parasites/ High Power Field: HPF) การตรวจดวย

PCR 0 - - 4 - + 8 - + 12 - + 24 (1 วน) - + 36 - + 48 (2 วน) - + 72 (3 วน) - + 120 (5 วน) + (50-100) + 240 (10 วน) + (100-200) + 360 (15 วน) + (100-200) + 720 (30 วน) - +

ทมา: ดดแปลงจาก Ijaz et al., (1998)

T. evansi ประกอบไปดวย การตรวจวนจฉยเพอจาแนกเชอ เชน การตรวจเชอโดยตรงดวยกลองจลทรรศน การตรวจเชอโดยทาใหเชอมความเขมขนมากขน การตรวจเชอโดยวธ Animal inoculation การตรวจเชอโดยวธตรวจสารพนธกรรม และการตรวจเชอโดยวธ Antigen detection เปนตน และก า ร ต ร ว จ ว น จ ฉ ย ท า ง ซ ร ม ว ท ย า เ ช น ว ธ immunofluorescence antibody test (IFAT), วธ enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) และวธ card agglutination test (CATT/T. evansi) เปนตน สาหรบการตรวจวนจฉยเชอ T. evansi นนมอยดวยกนหลายวธ แตวธทนยมใชในปจจบน คอ การตรวจวนจฉยดวยเทคนค PCR จะใหผลทจาเพาะ (specificity) และมความไวตอเชอ (sensitivity) มากกวาวธการตรวจเชอดวยกลองจลทรรศน ซงการ

ตรวจวนจฉยดวยเทคนค PCR มการใช primer ทแตกตางกนไป และชนดของ primer ทนยมใชมากคอ TBR primer เมอใชเพอเพมจานวน DNA ของเชอจะได PCR product เทากบ164 คเบส ซงสามารถตรวจวนจฉย DNA ของเชอไดตาสดท 0.01- 0.001 พโคกรม และตรวจภาวะการตดเชอในกระแสเลอดไดถง 1 ตวปรสตตอมลลลตร โดยเทคนคดงกลาวนยมนามาใชกนมากในการจาแนกเชอหรอการตรวจหาเชอ ใชตรวจหาความชกของเชอ และนามาใชในการหาความหลากหลายทางชวภาพของเชอ T. evansi

กตตกรรมประกาศ ผเขยนขอขอบพระคณ รศ.น.สพ.ดร.สถาพร

จตตปาลพงศ ภาควชาปรสต วทยา คณะสตวแพทยศาสตรมหาวทยาลยเกษตรศาสตร และ ผศ.


58

ดร.กนกรตน ศรกจเกษมวฒน สาขาวชาเทคโนโลยการผลตสตวและประมงคณะเทคโนโลยการเกษตร สถาบนเทคโนโลยพระจอมเกลา เ จาคณทหารลาดกระบง สาหรบคาแนะนาทมคณคายงในการเขยนบทความ

เอกสารอางอง

Amer, S., Ryu, O.R., Tada, C., Fukuda, Y., Inoue, N. and Nakai, Y. 2011. Molecular characterization and phylogenetic analysis of Trypanosoma evansi from dromedary camels (Camelus dromedaries) in Egypt, a pilot study. Acta. Tropica. 117: 39-46.

Areekit, S., Singhaphan, P., Kanjanavas, P., Khuchareontaworn, S., Sriyapai, T., Pakpitcharoen, A. and Chansiri, K. 2008. Genetic diversity of Trypanosoma evansi in beef cattle based on internal transcribed spacer region. Infection, Genetics and Evolution 8: 484-488.

Ashour, A.A., Abou El-Naga, T.R., Barghash, S.M. and Salama, M.S. 2013. Trypanosoma evansi : Detection of Trypanosoma evansi DNA in naturally and experimentally infected animals using TBR1 and TBR2 primers. Experimental Parasitol. 134: 109-114.

Baticados, W.N., Fernandez, C.P. and Baticados, A.M. 2011. Molecular detection of Trypanosoma evansi in cattle from Quirino province, Philippines. Vet. Arhiv. 81(5): 635-646.

Berlin, D., Nasereddin, A., Azmi, K., Ereqat, S., Abdeen, Z., Eyal, O. and Baneth, G. 2012. Prevalence of Trypanosoma evansi in horses in Israel evaluated by serology and reverse dot blot. Res. Vet. Sci. 93: 1225-1230.

Blezinger, S. 1998. (cited 2 March 2011). Management of parasites Part 1. Available from: http://www.Cattle today.com

Boonyawong, T., Chantaraprateep, P. and Muangyai, M. 1975. Surra in Horse. Thai J. Vet. Med. 5: 665-672.

Chompoochan, T., Thammasat, S., Thanachareonwatchara, P., Kongkrong, J. and watthanaplagool A. 1996. Standard Guide for Laboratory Animal Diagnostics. National Institute of Animal Health. Printing Agricultural Cooperative Federation of Thailand. (in Thai)

Chopjit, S., Khiawsri, S., Rodtian, P., Jongchansitto, P. and Niengmek A. 2006. Serra outbreak in cattle – buffaloes at Ban Meunglaung, T. Pongsa, A. Pai, Mae Hong Son Provine. Chiangmai Vet. J. 4(2):127-136. (in Thai)

Desquesnes, M. and Davila, A.M. 2002. Applications of PCR-based tools for detection and identification of animal trypanosomes: a review and perspectives. Vet. Parasitol. 109 (3–4): 213-231.


59

Desquesnes, M., McLaughlin, G., Zoungrana, A. and Davila, A.M.R. 2001. Detection and identification of Trypanosoma of African livestock through a single PCR based on internal transcribed spacer 1 of rDNA. Int. J. Parasitol. 31: 610-614.

Fernandez, D., Gonzalez-Baradat, B., Eleizalde, M., Gonzalez-Marcano, E., Perrone, T. and Mendoza, M. 2009. Trypanosoma evansi: A comparison of PCR and parasitological diagnostic tests in experimentally infected mice. Exp. Parasitol. 121: 1–7.

Giawganka, T., Pasit, A., Vanvohan, V., Vongpagorn M. and Rodtian, P. 2005. Trypanosome infection on film Blood from an infant. Parasitology group. Lampamg Hospital, Lampang Province. (in Thai)

Hunngerford, T.G. 1990. Various effects parasite of diseases of livestock. McGraw-Hill bookcompany. 9 ed. Sydney. Vol 2: 1357.

Ijaz, M.K., Nur-E-Kamalb, M.S.A., Mohameda, A.I.A. and Darc, F.K. 1998. Comparative studies on the sensitivity of polymerase chain reaction and microscopic examination for the detection of Trypanosoma evansi in experimentally infected mice. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 21: 215-223.

Intharakamhaeng, P. 2008. Trypanomiasis. Parasites group. Bureau of disease control and veterinary service. Department of Livestock, Ministry of Agriculture and Cooperatives. (in Thai)

Indrakamhang, P., Mohkaew, K. and Roong-uthai, P. 1996. Preliminary report on Trypanosoma spp. In native Sambar deer and imported Rusa deer raised in a deer farm in Thailand. In: Proceeding of the 15th Annual Livestock Conference, Department of Livestock Development, Thailand, 4-6 Sep. 55-67.

Joshi P.P., Shegokar, V.R., Powar, R.M., Herder, S., Katti, R., Salkar, H.R., Dani, V.S., Bhargava, A., Jannin, J. and Truc, P. 2005. Human Trypanosomiasis caused by Trypanosoma evansi in India: The first case report. Anim. J. Trop. Med. Hyg. 73(3): 491-495.

Lulitanon, V. 1997. Nucleic acid amplification techniques. Modern techniques in chromosomes and genes analysis. Department of Clinical Microbiology. Chiangmai University. (in Thai)

Majiwa, P.A.O., Thatthi, R., Moloo, S.K., Nyyeko, J.P.H., Otieno, L.H. and Maloo, S. 1994. Detection of trypanosome infections in the saliva of tsetse flies and buffy coat samples from antigenaemic but aparasitaemic cattle. Parasitol. 108: 1–10.


60

Masiga, D.K., Smyth, A.J., Hayes, P., Bromidge, T.J. and Dibson, W.C. 1992. Sensitive detection of trypanosomes in tsetse flies by DNA amplification. Int. J. Parasitol. 22: 909–918.

Matthias, E. and Muangyai, M. 1980. Trypanosoma evansi infection in swamp buffalo calf. Thai J. Vet. Med. 10(1): 47-54.

Monzon, C.M., Mancebo, O.A. and Roux, J.P. 1990. Comparison between 6 parasitological methods for diagnosis of Trypanosoma evansi in the subtropical area of Argentina. Vet. Parasitol. 36: 141–146.

Morter, R.L. 2006. Treating for international parasites of cattle. Available from: http://www.ces.purdue.edu/extmedia/VY/VY-51.html

Muieed, M.A., Chaudhary, Z.I. and Shakoori, A.R. 2008. Comparative studies on the sensitivity of polymerase chain reaction (PCR) and microscopic examination for the detection of Trypanosoma evansi in horses. Turk. J. Vet. Anim. Sci. 34(6): 507-512.

Natheewattana, N., Hongsbhanich, L., Khamboonruang, C. and Thitasut, P. 1978. Preliminary study of a Trypanosoma lewesi-like parasite of rats in Chiang Mai, Thailand. Southeast Asian J. Trop. Med. Pub. Hlth. 4 (3): 322-323.

Njiru, Z.K., Constantine, C.C., Crowther, J., Kiragu, J.M., Thompson, R.C.A. and Davila A.M.R. 2005. The use of ITS1 rDNA PCR in detecting pathogenic African trypanosomes. Parasitol. Res. 95: 186-192.

OIE, 2012. (cited 2 December 2013).Trypanosoma evansi infection (SURRA). Available from: http://www. oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_TRYPANO.pdf

Phonpak, S., Phonpak, M. and Wapukpet, S. 1989. Trypanosome infections in the North East of Thailand and important epidemiology. 16th Veterinary Medicine Conference. Veterinary council, 6-8 December 1989. (in Thai)

Pruvota, M., Kamyingkirdb, K., Desquesnesa, M., Sarataphanc, N. and Jittapalapong, S. 2010. A comparison of six primer sets for detection of Trypanosoma evansi by polymerase chain reaction in rodents and Thai livestock. Vet. Parasitol. 171: 185–193.

Rodtian, P., Hin-on, W., Uthaiwan, W., Vitoorakool, P., Trisanarom, A., Chaiyasert, S., Klaihong, S., Sarataphan, N. and Muangyai, M. 2004. A case report: Trypanosoma evansi infection in Timber Elephant at Lampang province (in press).

Thavenan, V. 2004. Important parasites in dairy cow. Parasitology Unit.


61

Department of Pathobiology. Faculty of Veterinary medicine, Khon kaen University. (in Thai)

Tian, Z., Liu, G., Xie, J., Shen, H., Zhang, L., Zhang, P. and Luo, J. 2011. The internal transcribed spacer 1 (ITS-1), a controversial marker for the genetic diversity of Trypanosoma evansi. Exp. Parasitol. 129: 303-306.

Trisanarom, A., markmee, S. and Ped-ugsorn, C. 1987. Trypanosoma evansi infection in Chiangmai dairy cattle. In Proceeding of the 6th Annual Livestock Conference. Department of Livestock Development, Thailand, 18-20 May, 1-12 pp.

Tuntasuvan, D., Mimapun, S., Sarataphan, N., Trongwongsa, L., Intraraksa, R. and Luckins, A.G. 2000. Detection of Trypanosoma evansi in brains of the naturally infected hog deer by streptavidine-biotin immunohisto-chemistry. Vet. Parasitol. 87: 223-230.

Tuntasuvan, D., Sarataphan, N. and Nishikawa, H. 1997. Cerebral trypanomiasis in native cattle. Vet. Parasitol. 73: 357-363.

Veterinary council. 2011. (cited 2 March 2011). Available from: http://www. cce-vet.org. (in Thai)

Villareal, M.V., Mingala, C.N. and Rivera, W.L. 2013. Molecular characterization of Trypanosoma evansi isolates from water buffaloes (Bubalus bubalis) in

the Philippines. Acta. Parasitologica. 58(1): 6-12.

Webster, J.P. and MacDonald, D.W. 1995. Parasites of wild brown rats (Rattus norvegicus) on UK farms. Parasitol. 111: 247–255.

World Health Organization, 2010. (cited 2 March 2011). African trypanosomiasis (sleeping sickness). Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs259/en/

บทความวชาการ


การใชสสกดจากพชในการยอมสเนอเยอ

อารยา สบขาเพชร1,# และณฐกาญจน นายมอญ2

1ภาควชากายวภาคศาสตร คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร กรงเทพฯ 10530

2ภาควชาเทคนคการสตวแพทย คณะเทคนคการสตวแพทย มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรงเทพฯ 10900

บทคดยอ: ปจจบนการศกษาทางจลกายวภาคศาสตรไดมการใชสยอมมากมายหลายชนดเพอยอมเนอเยอตางๆ ซงขนกบวตถประสงคในการศกษา สทใชยอมเนอเยอโดยทวไปมแหลงทมาทงจากแหลงธรรมชาตและจากการสงเคราะห ดวยในปจจบนทวโลกใหความสาคญในการใชสารตางๆ ทไมมผลกระทบตอสขภาพของมนษยและเปนมตรกบสงแวดลอม การใชสธรรมชาตจากพชในการยอมเนอเยอจงไดรบความสนใจมากขน เนองจากสวนตางๆ ของพชนนมสวนประกอบของสอยมากมาย อกทงยงมราคาถกกวาและสามารถใชงานไดอยางยงยนกวาสทไดจากการสงเคราะห รายงานฉบบนไดทวนสรปโดยยอเกยวกบการแบงชนดของสธรรมชาตจากพชในแงของโครงสรางทางเคมของส วธการสกด มอรแดนท และไดยกตวอยางงานวจยทศกษาการใชสสกดจากพชในการยอมเนอเยอชนดตางๆ ซงอาจนามาใชเปนขอมลพนฐานและเปนทางเลอกในการศกษาและพฒนาการยอมสเนอเยอจากสทสกดจากพช

คาสาคญ: สยอมจากพช สยอมจากธรรมชาต การยอม เนอเยอสตว #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2557. 9(1): 63-78. E-mail address: [email protected]

Araya Suebkhampet and Nattakarn Naimon / J. Mahanakorn Vet. Med. 2014. 9(1): 63-78.

64

Using Dye Plant Extract for Histological Staining

Araya Suebkhampet1,# and Nattakarn Naimon2

1Department of Anatomy, Faculty of Veterinary Medicine, Mahanakorn University of Technology, Bangkok 10530, THAILAND

2Department of Veterinary Technology, Faculty of Veterinary Technology, Kasetsart University, Bangkok 10900, THAILAND

Abstract: Nowadays, many and various kinds of dyes are used for histological staining due to the purpose of study. They are generally from both natural and synthetic origins. With the worldwide concern over the use of human health and eco-friendly materials, the use of natural dyes from plants has gain interested since most of them contain plenty of dye from their parts. They are also cheaper and more sustainable than the synthetic dyes. A brief review of plant dye classification based on their chemical structures of major dye pigments, methods of plant dye extraction, mordants and some of its application in diverse tissues are presented in this report. These would be helpful to further study and development of alternative tissue stains from plant natural dyes for tissue staining.

Keywords: Plant dye, Natural dye, Staining, Animal histology #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2014. 9(1): 63-78. E-mail address: [email protected]

Introduction

Histology is the study of cells and tissues by using a light microscope. The ability to visualize or identify histological structures is frequently enhanced through the use of histological stains. They give contrast to the tissue as well as highlighting particular features of interest. There are two types of dyes that classified by their origins, synthetic and natural dyes. The natural dyes

are obtained from natural sources such as plants, insects, animals, clays and minerals (Carleton et al., 1976). Plants and insects known to be used in histological staining for animal tissues are Haematoxylon campechianum (logwood), from which haematoxylin stain is obtained and Dactylopius cacti, from which carmine stain is obtained (Egbujo et al., 2008), respectively. The majority of natural dyes


65

are extracted from plant parts such as roots, barks, leaves, berries and seeds and wood.

The dyeing with natural dyes was one of the oldest techniques practiced by the ancient people such as wall paintings in the caves or textile dyeing. The first use of dye in histology credited to Antonie van Leeuwenhoek, the father of microbiology who worked with saffron, a natural dye extracted from saffron crocus. In the mid 1800s, amateur microscopists first used haematoxylin to stain cellular components (Titford M., 2005). Later scientists developed a wide range of haematoxylin staining techniques. The systemically studied dye for histology started in the second half of the 19th century by Weigert C, J Gerlach, P Ehrlich and H Gierke. By then coloring materials were mostly still natural origin like carmine, cochineal, haematoxylin and indigo. Gradually the use of the natural dyes has decreased due to the introduction of synthetic dyes (aniline dye from extract of coal tar) which first invention by William Henry Perkin in 1856. They widely applied in many fields as food, cosmetic and textile industries (Prabhu and Bhute, 2012). They are rapid stain with vast range of new colors, easy to use and commercially available. From then, the synthetic dyes together with those for histological staining have developed.

Many dyes, techniques and procedures are utilized to stain various types of animal tissues. At present, haematoxylin and eosin stain (H&E) is widely used as a light microscopical stain in histology and histopathology. It is combination of natural haematoxylin stain and the synthetic eosin stain. Haematoxylin stains the cell nuclei dark blue while eosin stains cell cytoplasm, most connective tissue fibers and matrices in varying shades of pink and red. Haematoxylin obtained from logwood tree that is native to the Mexico and northern Central America (Baker & Silverton, 1976), but is now mainly cultivated in the West Indies (Bancrot and Gamble, 2008). Haematoxylin can be prepared in numerous ways and applied to tissues from different sites. It has to be oxidized to haematein before using (Culling, 1974). Haematein can be produced from haematoxylin in two ways: natural oxidation and chemical oxidation. For natural oxidation, haematoxylin is exposed to light and air (Ehrlich’s and Delafield’s haematoxylin solution), and for chemical oxidation, sodium iodate (e.g. Mayer’s haematoxylin) or mercuric oxide (e.g. Harris’s haematoxylin) are used. Natural oxidation of haematoxylin seems to retain its staining ability longer than that of the chemical oxidation. However, it takes much longer time for preparation. Haematoxylin has also been


66

prepared synthetically (Morsingh and Robinson, 1970) but the natural dye is mostly used. Haematein is anionic charge, having a poor affinity for tissues without the presence of mordant. A mordant is a substance used to set dyes on tissue sections. The common mordants for haematoxylin are aluminium, iron and tungsten. The dye-mordant complex possesses a net positive charge and enables to bind to anionic tissue regions including nuclear chromatin. Mordant is regularly included in the dyeing protocols when natural dyes are used in order to fix or intensify the stains in cell or tissue staining. It is mainly a polyvalent metal ion that forms coordination complexes with certain dyes which then attaches to the tissues (Llewellyn, 2005). Different kinds of mordants give a different hue and stability of the dye in the tissues.

The use of natural dyes which are cheaper, eco-friendly and biodegradable has become a matter of significant important due to the increased environmental awareness and in order to avoid some hazardous synthetic dyes to humans and animals (Eom, et al., 2001). Several synthetic dyes (e.g. dyes with azo bonds nitro- or amino-groups) cause allergic-like symptoms or are carcinogenic (Ratna and Padhi, 2012). Therefore, alternative natural dyes have been currently more interested for their

potential use in various purposes. It is interesting that over 2000 dyes are synthesized from various parts of plants, of which only about 150 have been commercially exploited (Gulrajani, 1992). They are used for applying to different substrates such as textiles, paper, leather, wood, hair etc. They are also widely used in cosmetic, food and pharmaceutical industries. A number of them own the pharmaceutical properties and have been used in traditional medicine. Curcumin, the bright yellow dye of turmeric has been used traditionally as a remedy for stomach and liver ailments, as well as topically to heal sores and revitalizes the skin (Chaturvedi, 2009). It has anti-oxidant, anti-inflammatory, anti-cancer and anti-septic properties (Chengaiah et al., 2010). Many other common natural dyes such as lycopene (red dye) in tomatoes or lawsone (varies in color from orange to reddish brown) in henna are reported as antimicrobial agents (Siva, 2007; Habbal et al., 2011).

In last 10 years, natural dyes have been studied for their potential use in various fields including histological staining. The present report describes the basic information about of plant dye classification based on their chemical structures, methods of the dye extraction, mordants and some of its application for tissue staining. These would be useful information to the


67

researchers who are searching for the new natural dyes for tissue staining. Classification of natural dyes from plants

Natural dyes can be classified in different ways such as based on their chemical structure, source, hue and method of application, etc. The plant dye classification described in this review is based on their chemical structures which are divided into 7 major groups (Siva, 2007; Samanta and Konar, 2011; Prabhu and Bhute, 2012) as presented in Table1.

Methods of plant dye extraction Various parts of plants such as roots,

stems, leaves, flowers, fruits and seeds are used for dye extraction. Some plants may have more than one color depending on which part of the plant one uses. The color yield and shade of the color a plant produces vary according to time of the year the plant is picked, how it is grown, soil conditions, etc. Before extraction, the parts of plants are collected and generally shade dried in air or sun dried. Then the grinding is carried out to break down the material into very small pieces or powder using the manual or electric grinding machines. Optimum conditions of extraction are determined by varying extraction parameters such as type of solvents, time of extraction, ratio between plant material and solvent,

temperature and pH which depend on the properties of particular dye components (Prabhu and Bhute, 2012). After extraction, the extracts are generally filtered through various filters such as cheesecloth, cotton wool or paper filter. The filtrates may be freshly used (normally aqueous extract) or further evaporated of solvent, washing and drying to get purified dye. There are mainly four methods used in extraction of natural dyes (Samanta and Konar, 2011). 1) Aqueous extraction

This method is has long been used for natural dye extraction for a certain of time. The dye components in dried plant powder are extracted in water at boil or particular temperature. Then, the extract is cooled down and filtered. The dye solution is carried out under varying conditions as mentioned above in order to get the optimal extraction condition. The optimum condition is determined by studying the optical density value at definite wavelength for the extracted solution using UV-Visible absorbance spectrophotometer (Samanta and Konar, 2011). The filtrate is further applied for dyeing. Here are some studies that used the aqueous extract from plants for animal tissue staining. Natural dyes were extracted from kujarat flowers (Hibiscus sadariffa) in aqueous medium and were used to replace of eosin stain in kidney from

Araya

68

Table

1 Cl

assif

icatio

n of

pla

nt d

yes

a Suebkham

Exam

ple of

plan

ts:

part

used

Indi

gofe

ratin

ctor

ia

Rang

e of

color

Blue

Chem

ical s

tructu

res

Basic

info

rmati

on

Indi

gois

the

olde

stdy

eus

edfo

rtex

tile

dyein

gA

varie

ty

Major

grou

ps

Indi

goid

dyes

mpet and N

Indi

gofe

ra ti

ncto

ria:

leav

es

Indi

gofe

ra

Blue

In

digo

is th

e ol

dest

dye

used

for t

extil

e dy

eing.

A va

riety

of p

lant

s ha

ve p

rovid

ed in

digo

, but

mos

t na

tura

l ind

igo

was

obta

ined

from

tho

se in

the

gen

us In

digo

fera

whi

ch

Indi

goid

dye

s

attakarn Na

suffr

utico

sa: l

eave

s

In

digo

nativ

e in

tro

pica

l ar

eas.

At p

rese

nt,

alm

ost

all

indi

go

prod

uced

is sy

nthe

tic. It

is th

e bl

ue o

f blu

e jea

ns.

aimon / J. M

g

Mahanakorn

Rubi

a tin

ctor

ium

(mad

der):

wood

Red

Anth

raqu

inon

e dy

es a

re fu

sed

thre

e be

nzan

oid

rings

that

poss

ess

conj

ugat

ion

toac

hiev

eco

lor

Thes

edy

esar

e

Anth

raqu

inon

e

dyes

Vet. Med. 2

(mad

der):

woo

d

Rubi

a co

rdifo

li: wo

od

Galiu

m v

erum

(Lad

y's

9,1

0-An

thra

quin

one

poss

ess

conj

ugat

ion

to a

chiev

e co

lor.

Thes

e dy

es a

re

char

acte

rized

by

good

ligh

t fa

stnes

s. Al

mos

t al

l the

red

natu

ral

dyes

are

bas

ed o

n th

e an

thra

quin

oid

struc

ture

.

dyes

2014. 9(1): 6

Beds

traw)

: flo

wers

They

are

mor

dant

dye

s. Th

e co

chin

eal,

an e

xam

ple

of

know

n an

thra

quin

one

dye

from

in

sect

s (D

acty

lopi

us

cocc

us)

isus

edto

prep

are

the

carm

inedy

e

63-78.

cocc

us),

is us

ed to

pre

pare

the

carm

ine d

ye.

Araya

Table

1 Cl

assif

icatio

n of

pla

nt d

yes (

Cont

inue

d)

a Suebkham

Exam

ple of

plan

ts:

part

used

Laws

onia

iner

mis

Rang

e of

color

Oran

ge

Chem

ical s

tructu

res

Basic

info

rmati

on

Laws

one

(hen

na)

the

mos

tpop

ular

dye

ofth

isgro

upis

Major

grou

ps

Alph

ahy

drox

y

mpet and N

Laws

onia

iner

mis

(hen

na):

leav

es

Jugla

ns n

igra

(bla

ck

Oran

ge

Brow

nish

-

blac

k

Laws

one

Laws

one

(hen

na),

the

mos

t pop

ular

dye

of t

his g

roup

, is

used

to

dye

skin

, fin

gern

ails,

hair,

wool

and

lea

ther

.

Henn

a sta

ins a

re o

rang

e af

ter a

pplic

atio

n bu

t dar

ken

over

Alph

a-hy

drox

y-

napt

hoqu

inon

es

attakarn Na

waln

ut):

shel

ls of

waln

ut fr

uits

Laws

one

the

follo

wing

few

day

s to

a r

eddi

sh b

rown

. Jug

lone

is

anot

her e

xam

ple

of th

ese

dyes

that

has

bee

n us

ed a

s a

natu

rald

yefo

rclo

thin

gand

fabr

icsan

das

ink

aimon / J. M

Tage

tess

pecie

sYe

llow

J

l

natu

ral d

ye fo

r clo

thin

g and

fabr

ics a

nd a

s ink

.

Flav

onoi

dsar

epo

lyph

enol

icco

mpo

unds

that

are

Flav

onoi

ds

Mahanakorn

Tage

tes s

pecie

s

(mar

igold

): flo

wers

Term

inal

ia c

hebu

la

Yello

w Fl

avon

oids

ar

e po

lyph

enol

ic co

mpo

unds

th

at

are

abun

dant

in

plan

ts an

d ar

e ca

tego

rized

, ac

cord

ing

to

chem

ical

struc

ture

, int

o fla

vono

ls, f

lavo

nes,

flava

none

s,

Flav

onoi

ds

Vet. Med. 2

(Myr

obal

an):

leav

es

Cotin

us c

oggy

gria:

wood

Fl

avon

e iso

flavo

nes,

cate

chin

s, an

thoc

yani

dins

and

cha

lcone

s.

Mos

t of

the

nat

ural

yel

low

colo

rs ar

e hy

drox

y an

d

met

hoxy

deriv

ative

soff

lavo

nesa

ndiso

flavo

nes

2014. 9(1): 6

wood

met

hoxy

der

ivativ

es o

f fla

vone

s and

isof

lavo

nes.

63-78.

69

Isofla

vone

Araya

70

Table

1 Cl

assif

icatio

n of

pla

nt d

yes (

Cont

inue

d)

a Suebkham

Exam

ple of

plan

ts:

part

used

Haem

atox

ylon

Rang

e of

color

Rang

e

Chem

ical s

tructu

res

Basic

info

rmati

on

Dihy

drop

yran

sar

eclo

sely

rela

ted

inch

emica

lstr

uctu

re

Major

grou

ps

Dihy

drop

yran

s

mpet and N

Haem

atox

ylon

cam

pech

ianu

m

(logw

ood)

: woo

d

Rang

e

from

red

to v

iole

t

Dihy

drop

yran

s ar

e clo

sely

rel

ated

in c

hem

ical

struc

ture

to t

he fl

avon

es. T

he e

xam

ple

of k

nown

dih

ydro

pyra

n is

haem

atein

wh

ich

is an

ox

idize

d de

rivat

ive

of

Dihy

drop

yran

s

attakarn Na

to b

lue

Ha

emat

ine

haem

atox

ylin,

use

in

histo

logic

al s

tain

ing.

Haem

atein

exhi

bits

indi

cato

r-like

pro

perti

es, b

eing

blue

in a

queo

us

alka

line

cond

itions

and

red

inac

idic

cond

itions

They

are

aimon / J. M

Anth

ocya

nin:

Rang

e

al

kalin

e co

nditio

ns, a

nd re

d in

acid

ic co

nditio

ns. T

hey

are

mor

dant

dye

s.

Anth

ocya

nidi

nsar

em

embe

rof

the

flavo

noid

sco

mm

only

Anth

ocya

nani

Mahanakorn

Anth

ocya

nin:

Vacc

iniu

m m

yrtil

lus:

berri

es

Rang

e

from

red

to v

iole

t

Anth

ocya

nidi

ns a

re m

embe

r of

the

fla

vono

ids

com

mon

ly

foun

d in

plan

ts.

They

ar

e gly

cosid

es

of

2-

phen

ylch

rom

enyl

ium

salts

wh

ich

are

wate

r so

lubl

e

Anth

ocya

nani

dins

:

Vet. Med. 2

Cara

jurin

:

-Bign

onia

chica

:

to b

lue

2-

Phen

ylch

rom

eniu

m

mol

ecul

es. T

he v

ariat

ion

in th

e co

lors

is at

tribu

ted

to se

vera

l

fact

ors

as t

he n

umbe

r of

hyd

roxy

l gro

ups,

the

degre

e of

met

hoxy

latio

n an

d th

e nu

mbe

r of

m

onos

acch

arid

es

2014. 9(1): 6

Bign

onia

chic

a:

leav

es

atta

ched

to th

e ca

tion.

The

ir co

lor c

hang

es w

ith p

H, p

ink

or

red

in a

cidic

solu

tions

, pur

ple

in n

eutra

l sol

utio

ns, b

lue

to

green

ish-y

ello

win

alka

line

solu

tions

The

mem

ber

of

63-78.

An

thoc

yani

n gre

enish

yello

w in

al

kalin

e so

lutio

ns.

The

mem

ber

of

anth

ocya

nidi

nes

inclu

des

anth

ocya

nins

(ant

hocy

anid

ins

with

suga

r), c

araju

rin a

nd d

elph

inid

ine.


72

albino mice (Hashim, 2006). Suebkhumpet and Sotthibandhu (2012) used aqueous extract of butterfly pea flowers (Clitoria ternatea) to stain animal peripheral blood smears. 2) Extraction by non-aqueous and other solvent assisted system

The solvents generally used for plant dye extraction are ethanol, methanol, acetone, chloroform, ether, clove oil, etc. The dried material powder is weighed and soaked in solvent in different percentages and time durations. The crude dye extract can be used for tissue staining after extraction or can be further applied for solvent evaporation in order to concentrate the dye solution before staining. Alternatively, the dried plant powder is soaked in solvent to allow effective percolation, then the soaked powder is extracted in the solvent using Soxhlet Extractor (Steam Heated Extractor). The extract is then concentrated using rotary evaporator and may further drying in the drying oven (Okolie. 2008). Finally, the extract is obtained in powdered form which will be dissolved in the solvent or buffer at the desire concentrations before tissue staining.

Supercritical fluid extraction (SFE), an alternative to conventional solvent extraction for separation of organic

compound in many analytical processes as well as extraction of plant natural dye has gained wide acceptance in recent years since this technique is safe for health, inexpensive and harmonize with nature. SFE uses carbon dioxide as a solvent. This method is based on the enhanced solvating power of gases above their critical point (Samanta and Konar, 2011). Cardoni et al. (2000) studied the extraction of lycopene

and β-carotene from ripe tomatoes using SFE. The detail information and procedure of this method has been reported by Sapkale et al. (2010).

3) Extraction by acid or alkaline assisted system This method adjusts the pH of the extraction by adding hydrochloric acid or sodium carbonate in aqueous medium. The different pH in extraction protocols may give differently results as percent yield and hue of the extracted dye which due to the reaction of the chemical structure of the dye to the pH variation. Samanta et al, 2007 studied the extraction of color from jackfruit wood under various pH conditions (ranged between pH 4-12) and reported that the optimum condition for the extraction is at pH 11.0. 4) Extraction by other methods

4.1) Ultrasound assisted extraction


73

This method is carried out by mixing dried and ground plant materials in solvent in a flask, which was then placed in an ultrasonic bath. The ultrasound applied for the extraction results in intermolecular tearing and surface scrubbing, causing plant tissue rupture and improving the release of intracellular substances into the solvent. The extraction is repeated two-three times before the extract is collected. Sivakumar et al. (2009) used ultrasound with 80W ultrasonic power for 3h contact time assisted enhancement in natural dye extraction from beetroot for industrial applications and natural dyeing of leather.

4.2) Enzyme assisted extraction This method uses enzymes (pectinase,

cellulose, protease, esterase etc.) for dye extraction. The enzymes are usually applied as a pre-treatment of plant materials before subjecting the plant material to solvent extraction. Various enzyme combinations are used to loosen the structural integrity of plant materials thereby enhancing the extraction of the desired color components. Conditions for optimum activity and selection of the right type of enzymes are essential to use them effectively for extraction (Sowbhagya and Chitra, 2010). Ultrasound assisted and enzyme assisted extraction can be used in combination in order to improve the extraction efficiency.

Mordants Natural dyes are mostly non-

substantive and must be applied by adding mordants which after combining with dye in the materials including the tissues, it forms an insoluble precipitate or lake and thus both the dye and mordant get fixed to become wash and light fast. Mordants are also often added to keep dyes from fading, or to brighten, deepen, or dull a color. They can be used before, during or after the dye bath due to the desired effect. There are different kinds of mordant as metallic mordants, tannin and oil mordants that have been generally used for fabric dyeing by natural dye for a long time. Similarly, they are also added in the histological staining protocols when the plant dyes are used (Al Tikritti and Walker, 1977; Avwioro et al., 2007). The metallic mordants are common used for tissue staining.

Metalic mordants are polyvalent metal ions such as metal salts of aluminium, potassium, chromium, iron, copper and tin. The two most common metals used in natural dyeing are aluminium and ferric ions that having valences of three. Two types of bonds are involved in the reaction between a mordant dye and a mordant. One is covalent bond and the other is coordinate bond. Different mordants give different hue colors with the same dye. Metalic mordants are divided into two types as brightening


74

and dulling mordants. Alum (potassium aluminum sulfate), potassium dichromate and stannous chloride are brightening mordants while copper sulphate and ferrous sulfate are dulling mordants Prabhu and Bhute, 2012). Although metallic mordants are effective, they are relatively toxic and environmentally pollutants. Thus, the natural mordants are considered. The sample of natural mordant is tannin which found in plant parts as Tara pods (Caesalpinia spinosa) and gallnuts from Rhus semialata. Ali et al. (2010) studied the effect of tannic acid and metallic mordants on the dyeing properties of natural dye extracted from Acacia nilotica bark.

Discussion and Conclusion The natural dyes have long been used

in various purposes including tissue staining. However, their application has reduced since the synthetic dyes were developed. Haematoxylin is an example of natural dye that widely used in histology, histopathology and histochemistry. At present, many commercial synthetic and some natural dyes used for tissue staining are available in the markets. However, the hazardous effects of synthetic dyes on human and environment caused scientists to concern about using the natural dyes instead of synthetic dyes. Therefore, alternative natural dyes have been studied for their potential use in

histological staining. There are many studies that investigated plant dye staining in diverse tissues as follow. The dried skin of pomegranate (Punica Granatum) fruit extract was used for rat brain staining and the yellow staining was detected in the astrocytes, neurons, red blood cells and elastic fibers (Gharravi et al., 2006). Bassey et al. (2011) stained the sections of the testes with the ethanolic extract of Curcuma longa. They used this extract as a counterstain for haematoxylin. Their results indicated that the dye distinctly stained the seminiferous epithelium and interstitium yellow that provided a good counter stain for haematoxylin. Kola nut (cola acuminata) extract was also used as a substitute to histological tissue stain eosin in rat tissues. The dye extract was detected in the cytoplasm of various tissues with yellow-brown color (Shehu et al., 2012). Suabjakyong et al. (2011) investigated the extraction of dye from black plum fruit (Syzygium cumini) using various solvents and its staining property on the rat hepatic tissue.

Suebkhumpet and Sotthibandhu (2012) used aqueous extract of butterfly pea flowers (Clitoria ternatea) to stain blood cells in different animal peripheral blood smears. They presented that the dye extract could stain and differentiate blood cells on the blood smears. Jan et al. (2011) studied


75

the staining effect of dry extracted from dry leaves of henna (Lawsonia intermis) on histological sections of angiospermic stem. Okolie (2008) studied the staining of ova of intestinal parasites with extracts of Hibiscus Sabdariffa and Azadirachta Indica. The plant extract produced satisfactory staining in comparison to conventional methods used in identifying intestinal parasites on a preparation of stool sample. Ihuma et al. (2012) used methanolic extracts from Hisbiscus sabdariffa as a biological staining agent for some fungal species. Their results suggested that the dye extract could be use as a mycological stain. Al-Amura et al. (2012) studied the staining technique for helminthes by using red beet (Beta vulgaris) extract. They reported that stained helminthes were acquired a good stain with distinction their internal structures. Tousson and AL-Behbehani (2011) used black mulberries as a natural dye for tissue staining.

Although using natural dyes have many advantages, there still be some limitations that should be concerned. They are difficult to standardize the dye and its application because dyes collected from similar plants or natural sources vary due to climate, soil, maturity period and cultivation methods etc. Moreover, most natural dyes require mordants for fixing them on the stained tissues. The widely used metallic

mordants that applied in the dye solutions may cause health and disposal problems. Therefore, searching for the new natural mordants is an option for safer tissue staining. Many factors should be considered, if the natural dyes are used for tissue staining. One of them is the source of plants selected, it should be available in the endemic region in order to reduce the cost and to avoid raw materials insufficiency. The known chemical structures and properties of some plant dye extracts are also important and useful for determining the optimal extraction and tissue staining procedures. More detailed studies are needed to evaluate the potential and availability of natural dyes-yielding resources in many others plants. In addition, biotechnology and various fields of studies are required to increase the quantity and improve quality of plant natural dyes. More study about staining procedures of each dye plant still be required to establish new permanent preparations in the future.

References Al-Amura, M. F.A., Hassen, Z.A. and AL-

Mhanawi, B.H. 2012. Staining technique for helminth parasites by use red beet (Beta Vulgaris L.) extract. Bas. J. Vet. Res. 11(1): 283-292.

Ali, A., Ali, S., Saleem, H. and Hussain, T. 2010. Effect of tannic and metallic


76

mordants on the dyeing properties of natural dye extracted from Acacia nilotica bark. Asian J. Chem. 22(9): 7065-7069.

Al-Tikritti, S.A. and Walker, F. 1977. Anthocyanin BB: anuclear stain substitute for haematoxylin. J. Clin. Pathol. 31: 194-196.

Avwioro, O.G., Onwuka, S.K., Moody, J.O., Agbedahunsi, J.M., Oduola, T., Ekpo, O.E. and Oladele, A.A. 2007. Curcuma longa extract as a histological dye for collagen fibres and red blood cells. J. Anat. 210: 600–603.

Baker, F.J. and Silverton, R.E. 1976. The theory of staining: Introduction to Medical Laboratory Technology. 6th edition. Butterworths. 385-391p.

Bancrot, J.D. and Gamble, M. 2008. Theory and practice of histological techniques. 6th edition. Churchild Vivingstone Elsevier. 725p.

Bassey, R.B., Oremosu, A.A. and Osinubi, A. A.A. 2011. Curcuma Longa: Staining effect on histomorphology of the testis. Maced. J. Med. Sci. http://dx.doi.org/10.3889/MJMS.1857-5773.2011.0209.

Carleton, H.M., Drumy, R.A.B., Wallington, E.A. and Cameron R. 1976. Histological technique. 4th edition. Oxford University Press. London 108p.

Chaturvedi, T.P. 2009. Uses of turmeric in dentistry: an update. Indian J. Dent. Res. 20(1): 107–109.

Chengaiah, B., Rao, K.M., Kumar, K.M., Alagusundaram,M. and Chetty, C.M. 2010. Medicinal important of natural dyes-a review. Int. J. Pharm. Tech. Res. 2(1): 144-154.

Culling, C.F.A. 1974. Handbook of histopathological and histochemical techniques. 3rd edition. London: Butterworth. 712p.

Egbujo E. C., Adisa O. J. and Yahaya, A. B 2008. A study of the staining effect of Roselle (Hibiscus sabdariffa) on the histologic section of the testis. Int. J. Morphol. 26(4): 927-930.

Eom, S., Shin, D., and Yoon, K. 2001. Improving the dyeability of natural colourants on cotton by cationization. Ind. J. Fibre Text Res. 26:425–431.

Gharravi, A.M., Golarlipour, M.J., Ghorbani, R. and Khazaei, M. 2006. Natural dye for staining astrocytes and neurons. J. Neuro. Sci. (Turkisk) 23(3): 215-218.

Gulrajani, M.L. 1992. Dyeing properties of natural dyes extracted from eucalyptus. J. Textile I. 98: 431-437.

Habbal, O., Hasson, S.S., El-Hag, A.H., Al-Mahrooqi, Z., Al-Hashmi, N., Al-Bimani, Z., Al-Balushi, M.S. and Al-Jabri, A.A. 2011. Antibacterial activity of Lawsonia inermis Linn (Henna) against


77

Pseudomonas aeruginosa. Asian Pac. J. Trop. Biomed. 1(3): 173–176.

Hashim, E.A. 2006. The use of watery extract of kujarat flowers Hibiscus Sabdariffa as a natural histological stain. Iraqi J. Med. Sci. 5(1): 29-33.

Ihuma, J.O., Asenge, G. H., Abioye, J.O.K and Dick, S.K. 2012. Application of methanoloc extracts from Hisbiscus Sabdariffa Linn as a biological staining agent for some fungal species. Int. J. Plant Anim. Environ. Sci. 2(2): 254-259.

Jan, H.U., Shinwari, Z.K. and Khan, A.A. 2011. Staining effect of dye ectracted from dry leaves of Lawsonia Intermis Linn (Henna) on angiospermic stem tissue. Pak. J. Bot. 43(1): 383-389.

Llewellyn, B.D. 2005 (cited 7 November 2013). Stains File: mordants. Available from: http://stainsfile.info/StainsFile/ theory/mordant.htm.

Morsingh, F. and Robinson, R. 1970. The synthesis of diazilin and haematoxylin. Tetrahedron. 26: 281-289.

Okolie, N.J.C. 2008. Staining of ova of intestinal parasites with extracts of Hibiscus Sabdariffa and Azadirachta Indica. Inter. Sci. Res. J. 1(2): 116-119.

Prabhu, K. H. and Bhute, A.S. 2012. Plant based natural dyes and mordnats: A review. J. Nat. Prod. Plant Resour. 2(6): 649-664.

Ratna and Padhi, B.S. 2012. Pollution due to synthetic dyes toxicity & carcinogenicity studies and remediation. Int. J. Environ. Sci. 3(3): 940-955.

Samanta, A. K., Agarwal, P. and Datta, S. 2007. Dyeing of jute and cotton fabrics using jackfruit wood extract: Part-I : Effects of mordanting and dyeing process variables on colour yield and colour fastness properties. Indian J Fibre & Text Res. 32(12): 466-476.

Samanta, A.K. and Konar, A. (cited 7 November 2013) 2011. Dyeing of textiles with natural dyes. Available from: http://www.intechopen.com/ books/natural-dyes

Sapkale, G. N., Patil, S.M., Surwase, U. S. and Bhatbhage, P.K. 2010. A review: supercritical fluid extraction. Int. J. Chem. Sci. 8(2): 729-743.

Shehua, S.A., Sonfada, M.L., Danmaigoro, A., Umar, A.A., Hena, S.A. and Wiam, I.M. 2012. Kola nut (Cola acuminata) extract as a substitute to histological tissue stain eosin. Sci. J. Vet. Adv. 1(2): 33-37.

Siva, R. 2007. Status of natural dyes and dye yielding plants in India. Curr. Sci. 92(7): 916-925.

Sivakumar, V., Anna, J.L., Vijayeeswarri, J. and Swaminathan, G. 2009. Ultrasound assisted enhancement in natural dye extraction from beetroot for industrial


78

applications and natural dyeing of leather. Ultrason. Sonochem. 16(6): 782-789.

Sowbhagya, H. B. and Chitra, V. N. 2010. Enzyme-assisted extraction of flavorings and colorants from plant materials. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 50: 146–161.

Suabjakyong, P., Romratanapun, S. and Thitipramote, N. 2011. Extraction of natural histological dye from black plum fruit (Syzygium cumini). J. Microsc. Soc. Thailand. 4(1): 13-15.

Suebkhampet, A. and Sotthibandhu, P. 2012. Effect of using aqueous crude extract from butterfly pea flowers (Clitoria ternatea L.) as a dye on animal blood smear staining. Suranaree J. Sci. Technol. 19(1): 15-19.

Titford M. 2005. The long history of haematoxylin. Biotech Histochem. 80(2): 73-78.

Tousson, E. and Al-Behbehani, B. 2011. Black Mulberries (Morus nigra) as a natural dye for animal tissue staining. Animal Biol. 62(11): 49-56.

[ปรศนา-สตวปวย] สตวแพทยมหานครสาร ปท 9 ฉบบท 1 มกราคม-มถนายน 2557

79

ปรศนาปรศนา--สตวปวยสตวปวย WWhhaatt’’ss yyoouurr ccyyttoollooggiiccaall ddiiaaggnnoossiiss??

สวรน ภาวสทธไพศฐ1,2

1ภาควชาพยาธวทยา, 2หนวยพยาธวทยาคลนก ศนยบรการชนสตรโรคสตว คณะสตวแพทยศาสตร

มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร หนองจอก กรงเทพฯ 10530

ภาพท 1 ภาพท 2

ภาพท 3 ภาพท 4

ประวตสตวปวย สนขพนธ Golden Retriever เพศเมย อาย

13 ป ตรวจพบกอนผดปกตทผวหนงบรเวณขาหนาและลาตว ลกษณะกอนเนอแนน ผวเรยบ จากการซกประวตทราบวากอนเนอนพบมานานประมาณ 1 ป สตวแพทยไ ดท าการ เ กบตวอยาง ดวย ว ธ fine needle aspiration: (FNA) จากกอนเนอดงกลาว

แลวปายลงบนสไลดดวยวธ squash smear technique ทาการตรงสภาพดวยเมทานอล และยอมดวยส Modified Wright’s stain (Diff-Quick®) ลกษณะทปรากฏในกลองจลทรรศน แสดงดงภาพท 1-4 จากภาพและขอมลประวตสตวปวย จงใหการวนจฉยทางเซลลวทยา

อานคาตอบพลกไปหนาท 80

80

คาตอบคาตอบ ปรศนาปรศนา--สตวปวยสตวปวย

WWhhaatt’’ss yyoouurr ccyyttoollooggiiccaall ddiiaaggnnoossiiss??

Cytological findings ผลการตรวจจากกลองจลทรรศนพบกลมเซลลบ

ผวรปรางแบน (anuclear squamous epithelial cells) จานวนมาก (ภาพท 1) และไมพบเซลลอกเสบ (inflammatory cells) องคประกอบอนๆ ทพบ ไดแก เศษโปรตน เศษเซลลหนงกาพรา และเศษเคราตน (keratin bar) ดงแสดงในภาพท 2 (ลกศร) ปะปนกบเศษตะกอนและเศษเซลลซ งยอมตดส นาเงนฟา (blue amorphous materials) โดยพบในพนหลง (background) ทวสไลด รวมกบเซลลเยอบผวทเสอมสลาย (ภาพท 3) พบคลอเรสเตอรอล ครสตล (cholesterol crystals) ซงยอมไมตดส อนเปนลกษณะทสามารถสงเกตไดดวยกาลงขยายตา (ภาพท 4) Cytological diagnosis: Highly suggestive for nonneoplastic and noninflammatory tumor like lesions. The first choice of differential diagnosis is Epidermal inclusion cyst.

วจารณ รายงานการตรวจพบถง ใ ตผ วห นงช นด

epidermal inclusion cyst พบไดบอยในสนข อายมาก โดยคดเปนหนงในสามของกอนผดปกตบรเวณผ วห น งช น ดท ไ ม ใ ช เ น อ งอกห รอกา ร อ ก เ สบ (nonneoplastic noninflammatory tumor like lesions) ถงใตผวหนงทพบสวนมากเปนถงชนด

Follicular cyst ซงมกพบเปนถงเดยว บางรายตรวจพบแบบหลายถง สาเหตเกดจากการเสยดสของผวหนงกอใหเกดการอดตนของรขมขน (Raskin and Meyer, 2010) โดยทวไปกอนเนอจะมลกษณะผวเรยบ เนอนมหรอแนน การตรวจทางจลพยาธวทยานนจะสามารถชวยในการจาแนกชนดถงใตผวหนงได เมอทาการเกบตวอยางโดยใชการเจาะดดเซลล (fine needle aspiration: FNA) ไปตรวจจะพบองคประกอบสวนใหญ คอ เซลลผวชนนอกรปรางแบนซงไมมนวเคลยส (anucleated squamous epithelial cells) เคราตน (keratin) และเสนเคราตน (keratin bars) นอกจากนสามารถพบคลอเรสเตอรอล ซงยอมไมตดสไดโดยเกดจากการรวมตวกนของเศษเซลลทเสอมสลายภายใน cyst สวนเซลลบ ผ ว ร ป ร า ง แ บ น ม น ว เ ค ล ย ส (nucleated squamous cells) สามารถตรวจพบไดนอย ถาพบนวเคลยสมกมลกษณะหดเลก (pkynosis) บนพนหลงของสไลด (background) จะพบเศษตะกอนและเศษเซลลซงยอมตดสนาเงนฟา (blue amorphous materials) ในกรณทถงขนแตกและเศษเคราตนหลดออกไปบรเวณเนอเยอขางเคยงอาจพบกลมเซลลอกเสบชนดตางๆ รวมดวยได ซงเมอดดวยตาเปลาจะพบเศษสงคดหลงมลกษณะเปนครมขนสดาคลายโคลนได (Shelly, 2003) ทงนมขอควระวงในกรณทเกบตวอยางเซลลไดไมครบถวน เชน squamous cell carcinoma ซงมกมแผลหลมปรากฏ เปนตน ดงนนจงควรทาการวนจฉยรวมกบประวตสตวปวย

81

อนงถงใตผวหนงนไมใชเนอรายสามารถทาการรกษาโดยการผาตดเลาะกอนถงใตผวหนงออก

เอกสารอางอง

Raskin, R. and Meyer, D.J. 2010. Canine and feline cytology: A color atlas and interpretation guide. (2nd ed.). China: Saunders; p. 26-27.

Shelly, S.M. 2003. Cutaneous lesions: Cytology, Part II. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 33: 22.

ใบสมคสมาชกใบสมคสมาชก สตวแพทยมหานครสารสตวแพทยมหานครสาร


ชอ นามสกล บานเลขท หม ตรอก/ซอย .ถนน ตาบล/แขวง อาเภอ/เขต จงหวด รหสไปรษณย โทรศพท โทรสาร E-mail สถานททางาน ตาแหนง เลขท หม ตรอก/ซอย .ถนน ตาบล/แขวง อาเภอ/เขต จงหวด รหสไปรษณย โทรศพท โทรสาร E-mail

สถานททตดตอไดสะดวก คอ ทบาน ททางาน มความประสงคขอสมครเปนสมาชกวารสาร “สตวแพทยมหานครสาร”

ประเภทราย 1 ป (140 บาท) 2 ป (280 บาท) 3 ป (420 บาท) ตลอดชพ (1,000 บาท)

ตงแตปท ฉบบท ถงปท ฉบบท

ชาระโดย ธนาณต ตวแลกเงน

โอนเงนเขาบญชออมทรพย เลขท 193-209867-0

ชอบญช นายจาลอง มตรชาวไทย ธนาคารไทยพาณชย จากด สาขายอย ถนนเชอมสมพนธ (มหานคร) และกรณาสงใบสมครสมาชกพรอม สาเนาใบโอนเงนมาท รชกฤช เลศภทรโกมล โทรสารหมายเลข 0-2988-4040

ลงชอ ผสมคร ( )

สาหรบเจาหนาท ใบเสรจเลมท...............เลขท................ลงวนท.......................หมายเลขสมาชก............................

ใบสงโฆษณาใบสงโฆษณา สตวสตวแแพพทยมหานครสารทยมหานครสาร


เขยนท......................................................................... วนท..................เดอน............................พ.ศ.................

ขาพเจาในนามบรษท เลขท หม ตรอก/ซอย .ถนน ตาบล/แขวง อาเภอ/เขต จงหวด รหสไปรษณย โทรศพท โทรสาร E-mail สถานททางาน ตาแหนง

ยนดใหความอปการคณ จดพมพวารสาร “สตวแพทยมหานครสาร” ประจาป 2557 จานวน เลม เปนจานวนเงน บาท ( )

ปท 9 ฉบบท 2 เดอน กรกฎาคม – ธนวาคม พ.ศ. 2557

ปท 10 ฉบบท 1 เดอน มกราคม – มถนายน พ.ศ. 2558 โดยการลงโฆษณา ขอความทแนบมาดวยแลว ในสวนของ

ปกหลงดานนอก (พมพ 4 ส) 10,000 บาท

ปกหลงดานใน (พมพ 4 ส) 8,000 บาท

ใบแทรกดานใน (พมพขาว-ดา) 5,000 บาท

ขาพเจาจะชาระเงนคาลงโฆษณาแจงความประสงคกบเจาหนาทของคณะผจดทาวารสาร ทนาใบเสรจรบเงนและหนงสอ “สตวแพทยมหานครสาร” มาใหขาพเจาเปน จานวน.................เลม เมอพมพเสรจเรยบรอยแลว

ลงนาม (ตวบรรจง) ตาแหนง

โปรดสงคน “ใบสงโฆษณา” ไปยง คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร เลขท 140 ถนนเชอมสมพนธ แขวงกระทมราย เขตหนองจอก กรงเทพฯ 10530 โทร. 0-2988-3655 ตอ 5102-5103 โทรสาร 0-2988-4040

ISSN: 1905-7571JOURNAL OF MAHANAKORN VETERINARY MEDICINE

ป ที่ 9 ฉบับที่ 1 · สัตวแพทย์มหานครสาร...

Documents

Transcript of ป ที่ 9 ฉบับที่ 1 · สัตวแพทย์มหานครสาร...