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UDC

本 科 毕 业 论 文

东海沉积物中色素提取

与分析方法研究

学生姓名 晏茂军 学号 12030021069

指导教师 辛宇

院、系、中心 化学化工学院

专业年级 2012 化学

论文答辩日期 2016 年 6 月 6 日

中 国 海 洋 大 学

东海沉积物中色素提取与分析方法研究

完成日期：

指导教师签字：

答辩小组成员签字：

东海沉积物中色素提取与分析方法研究

摘要

沉积物色素是研究海洋生物地球化学循环重要方法之一，研究沉积物中色素

含量和转化等内容，对海洋初级生产力估算、富营养化水平和氧化还原状态等研

究有重要意义。本论文通过测定不同有机溶剂氮空白含量，发现丙酮氮含量过高，

为 3 μmol·l-1,不能直接用于沉积物色素萃取。其他溶剂都低于 0.1μmol·l-1。

在对沉积物中色素提取方法的探究中，通过大量对照试验，发现最佳萃取剂体系

为甲醇-二氯甲烷，用 5.00ml 萃取 2.0g 沉积物得到色素浓度为 5.8μmol·l-，效

率比 90%丙酮高 13%，比丙酮-甲醇高 30%。超声萃取最佳时间为 15 分钟。萃取体

积对色素萃取效率影响较小。通过高效液相色谱对萃取的色素进行分离和测定，

并与叶绿素-a 标准和脱镁叶绿素-a 标准进行对比，确定萃取液中色素种类和含量。

关键词：沉积物、氮空白、色素、高压液相、叶绿素-a

A Study for Extraction and Analysis of Pigments

in Sediments of East China Sea

Abstraction

Pigment in sediment is an important part of biogeochemical cycles

and its analysis provides rich information on ocean primary

productivity, eutrophication and redox state in sediment. This study

examined the nitrogen content in different organic solvents through

trace-level nitrogen analysis, and found out that the nitrogen content

in acetone is as high as 3μmol·l-1, and barely meets the demand for

pigment extraction from sediment. And it in other solvent was less

than 0.1μmol·l-1。 The extraction methods of pigment extraction from

sediments was established in this study. We found that the optimal

extraction solvent was methanol-methylene chloride and obtain a

pigment concentration of 5.8μmol·l- when 2.0g sediment was extracted

in 5.00ml solvent，which was 13% higher than 90% acetone and 30%

higher than acetone-methanol. And 15 minutes was the proper time for

ultrasonic extraction. The extraction volume had little effect on the

extraction efficiency. With the use of high performance liquid

chromatography (HPLC), we separated and determined the extracted

pigment, and measured the concentration of pigment with the referring

to working standards of chlorophyll a and pheophytin a.

Keywords: sediment、nitrogen blank、pigment、HPLC、chlorophyll-a

目录

1 文献综述 ............................................................ 1

1.1 东海沉积物研究意义 ................................................. 1

1.2 东海沉积物中色素形成与转化 ......................................... 1

1.3 沉积物色素提取方法 ................................................. 2

1.3.1 直接浸泡萃取法 ................................................. 3

1.3.2 研磨法 ......................................................... 4

1.3.3 超声波提取法 ................................................... 4

1.4 色素分析方法 ....................................................... 5

1.5 硝酸盐测定方法 ..................................................... 6

1.6 沉积物色素研究现状 ................................................. 7

1.7 主要研究内容 ....................................................... 7

2 材料和方法.......................................................... 8

2.1 仪器和试剂 ......................................................... 8

2.1.1 仪器 ........................................................... 8

2.1.2 试剂 ........................................................... 9

2.2 实验步骤 .......................................................... 10

2.2.1 实验容器处理 .................................................. 10

2.2.2 溶剂氮空白测定 ................................................ 10

2.2.3 萃取分离 ...................................................... 10

2.3 色素检测 .......................................................... 11

3 结果与讨论......................................................... 13

3.1 溶剂与氧化剂氮空白测定。 .......................................... 13

3.1.1 氮空白测定数据结果 ............................................ 13

3.1.2 氮空白测定问题与改进 .......................................... 15

3.1.3 最大吸收波长扫描 .............................................. 15

3.1.4 萃取溶剂配比 .................................................. 16

3.1.5 萃取剂用量 .................................................... 18

3.1.6 超声萃取时间 .................................................. 18

3.1.7 萃取次数 ...................................................... 19

3.2 高压液相（HPLC）色素分析方法 ...................................... 20

3.2.1 高效液相色谱谱图 .............................................. 20

3.2.2 叶绿素 a工作曲线 .............................................. 21

3.2.3 样品中各种色素含量 ............................................ 21

3.2.4 色素分析中存在的不足 .......................................... 22

4 结论与展望......................................................... 23

参考文献 ............................................................... 24

致谢 .................................................................... 27

1

1 文献综述

1.1 东海沉积物色素研究意义

我国东海是一个典型的大河影响下的陆架边缘海，受到世界上输水量第五、

输沙量第四的长江的重要影响。长江带来的大量陆源物质在东海通过一系列物理

化学介质条件等变化以及沿岸流系的作用，促成了东海内陆架泥质区的形成。同

时长江带来的丰富营养物质也参与到东海的物质循环以及沉积物中有机物再矿化

和埋藏(McKee et al., 2004)。

海洋浮游植物色素是海洋中重要的生物标志物，可以用于海洋初级生产力的

估算、浮游植物种群的表征(Bianchi, T. et al., 2002)等研究。沉积物是浮游

植物色素重要的汇（埋藏渠道），研究沉积物中的色素组成成分，对于反演上层

水体中的浮游植物种群变化具有重要的意义(Chen et al., 2001)。

光合色素( 藻类色素、其他植物色素、细菌色素) 能表征特定生物来源,因

为它在埋藏到沉积物甚至发生某些结构变化后仍保留其源信息(Meyers, 2003)。

不同类型色素（叶绿素、类胡萝卜素、藻胆素）及他们的衍生物因为结构和稳定

性不同，而在早期成岩过程有不同变化，从而用来研究浮游植物和光合细菌群落

组成、初级生产、富营养化水平、氧化还原条件、气候条件和碳循环等的现状及

其历史变化(赵军 et al., 2010)。

1.2 东海沉积物中色素形成与转化

色素按其结构和特性可以分为叶绿素、类胡萝卜素和藻胆素。

叶绿素是带有一个五元环和植基的卟啉环的镁配位化合物，主要有叶绿素 a、

b、c和细菌叶绿素 a、b、c等。叶绿素 a（Chl-a）是自然环境中最普遍的植物色

素，在水体环境中也可以用来指示海洋初级生产力和浮游植物生物量。在酸、碱、

热等条件下，叶绿素很容易降解，形成的脱镁叶绿素、脱植基叶绿素、甾醇绿素

酯等衍生物可以用来作为浮游植物摄食的证据。

类胡萝卜素是由有共轭的碳骨架组成的四萜类化合物，分为胡萝卜素和叶黄

素两大类，叶黄素是胡萝卜素的非酸性氧化衍生物。其中，类胡萝卜素能够吸收

2

和传递光能，所以可以辅助叶绿素进行光合作用，还可以起到保护叶绿素免受过

量光能的危害。许多类胡萝卜素具有种类特异性，可以用来指示不同来源。另外，

类胡萝卜素容易氧化讲解，而低氧环境利于其保存。

藻胆素与叶绿素和类胡萝卜素不同，其由于具有水溶性，所以不易被常用的

色素分析方法检测，且分类有限，所以目前应用不多。

在沉积物中色素的迁移和转化过程中，营养盐结构可能是影响表层水体中浮

游植物生物量进而影响表层沉积物中色素空间分布的最主要因素。在海洋浮游植

物生长勃发的春末和秋初，受到浙闽沿岸流、台湾暖流和黑潮的影响，长江冲淡

水成为表层水体主要来源并决定此海域浮游植物生物量(石晓勇 et al., 2013)。

水动力条件和沉积环境差异也会影响沉积物中植物色素的空间分布，例如杭州湾

内水域遭受了不亚于长江冲淡水的严重富营养化(李云, 2008)。

沉积物中色素的早期成岩过程是时间的函数，并遵循一定的 G模型(Sun et

al., 1991),此模型广泛应用于具有稳定混合和稳定沉积速率的海洋环境里模拟

有机质的降解。但是在实际自然环境中几乎不存在理想化的稳态沉积环境，比如

上层水体中浮游植物的初级生产力存在季节性变化，从而引起海源有机质沉积通

量变化。陆源有机质受季节性陆地径流变化影响入海通量也会发生变化。

Stephens等（1997）曾指出当所要研究的沉积有机质垂向剖面所代表的时间尺

度较有机质输入的变化周期或者沉积有机碳的降解半衰期要长很多时，可以在一

定程度上将该时期对应的沉积环境近似看作稳态沉积环境(Stephens et al.,

1997)。此外，多 G 成岩降解模型中，还要假设难降解和易降解的两种组分的降

解速率自始至终均保持一致(Zimmerman & Canuel, 2000)，可以在一定程度上将

沉积物中海洋浮游植物色素作为沉积有机碳的一部分，其降解通常也符合这个成

岩降解方程并且在沉积物剖面中呈指数降解趋势(Chen et al., 2005)。

1.3 沉积物色素提取方法

目前对于海洋沉积物中色素的提取主要是采用萃取的方法，为了将色素从样

品中定性定量地提取到溶剂中，同时还根据样品的不同和需要分析的色素种类不

同，萃取过程的操作、溶剂选择和实验条件会有一定差异。总的来说提取方法有

直接浸泡萃取、研磨和超声波提取法三种(范燕, 2004)。

3

1.3.1 直接浸泡萃取法

用有机溶剂直接浸泡萃取叶绿素是最简单同时也是应用最广泛的提取方法之

一。萃取液用分光光度法测定，适合大批量样品处理。主要影响萃取效率的是萃

取剂种类、萃取时间、以及萃取温度等，理想的萃取剂应该具有以下特点：

(1)能同时萃取多种色素。

(2)操作简单且提取.

(3)挥发性、毒性小，对人体刺激性小。

(4)色素在其中能长时间稳定。

(5)价格便宜，易于获取。

但是在实际实验条件下，完全符合以上要求的试剂很少，人们一直在寻找着

更加合适的试剂和试剂配比。目前已经使用过的萃取剂有一下几种：

丙酮（Acetone）

1940 年，Mackinney 首次提出使用丙酮做萃取剂，并得到叶绿素 a和 b 的消

光系数(Mackinney, 1940)。1949 年 Amon用 80%丙酮萃取菠菜叶的叶绿素并且进

行分光光度测定(Arnon, 1949)，该方法至今在国际上广泛应用。1966 年，国际

海洋研究科学委员会（SCOR-UNESCO）推荐使用将样品浸泡于 90%丙酮中低温过夜

萃取的方法(SCOR-UNESCO, 1966)。后有 Inskeep 等人指出对测定叶绿素的最大

吸收波长和计算叶绿素的光谱经验公式的修正(Inskeep & Bloom, 1985)。到目

前为止，90%丙酮仍是广泛使用的色素萃取溶剂。

甲醇（Methanol）

虽然科研人员在研究湖泊和海洋是一直使用丙酮作萃取剂，但是丙酮在时候

不如甲醇迅速和完全。但是 1985 年 Bowles 等发现对有些藻类来说，100%丙酮和

丙酮：甲醇=1：1的混合液萃取效率高于 90%和 100%甲醇(Bowles et al., 1985)。

研究人员发现不同溶剂对不同色素提取效率有差异，而且没有一种试剂能够对所

有色素有很好的萃取效果。

以前认为叶绿素 a在甲醇中稳定性低于在丙酮中，但 1999年 Jeffry和Wright

在甲醇提取定鞭金藻产物中发现有 1.5%的叶绿素 a以叶绿素盐、差向异构体和异

构同晶体的形式存在。在甲醇萃取叶绿素的过程中叶绿素酶持续活动，生成叶绿

素甲基盐。由于甲醇使原始样品中叶绿素生成器甲基盐，所以可以将它们加以区

4

分(Jeffrey et al., 1999)。

乙醇（Ethanol）

已知的色素萃取剂中，乙醇是最安全的。但乙醇主要用于淡水植物的色素萃

取，海洋植物应用较少。1978 年 Moed 和 Halleyrae 及 1980 年 Mush 的研究表明

乙醇与甲醇萃取效率相近(Moed & Hallegraeff, 1978; Mush, 1980)。但 1981年

Arvola 认为甲醇略优于乙醇(ARVOLA, 1981)。1984 年 Satory 和 Grobbelaar 发

现 90%乙醇和加入沸腾的无水乙醇提取淡水植物的叶绿素效率明显高于丙酮和 90%

丙酮-二甲基亚砜等体积混合液(Sartory & Grobbelaar, 1984)。Jespersen 和

Christoffersen （1987)在提取淡水浮游植物时发现室温下用乙醇萃取 6 小时的

萃取效率和甲醇相当，但提取大型海藻时需要更长时间和加热条件(Jespersen &

Christoffersen, 1987)。陈宇炜等（2000）用 90%乙醇在 80℃水浴中萃取淡水浮

游植物，发现热乙醇法测定效率高于丙酮萃取法，标准偏差也较小 (陈宇炜 & 高

锡云, 2000)。

1.3.2 研磨法

研磨法主要是通过研磨机械破碎植物细胞，使溶剂更加容易进入细胞萃取色

素。早期研磨是使用聚四氟乙烯小锤在玻璃的搅拌器中以 500 转/分钟的转速将

藻类细胞捣碎，使溶剂进入(SCOR-UNESCO, 1966)。这种方法至今仍在使用，但是

也存在缺点：小锤与搅拌器间距影响萃取效率，若太小引起局部过热且滤液不易

进入缝隙；转移过程中不可避免遗漏并且操作者不得不直接接触溶剂，带来危险。

较常使用的研磨方法还有在玛瑙研钵中人工研磨和在 20 转/秒的玻璃珠搅拌

器中研磨等方法。

1.3.3 超声波提取法

超声波提取法通过超声波破坏植物细胞壁，来提高萃取效率。超声波在狭小

的空间内能产生 20000 个大气压，并能产生穿越几个微米的震动波，产生的瞬间

高温可达 10000 K。Alliger等（1975）用超声波早溶剂中形成破坏空穴破碎细胞

(Alliger, 1975)。研究发现超声仪功率为 73.5 W·cm-1时效果不如研磨法，但当

达到 398W·cm-1时效果比研磨法好。如果总功率达到 60w，超声波不容易穿透置于

5

超声仪中的样品容器外壁进入溶液(Chang & Rossmann, 1982)。传输功率大小极

大地影响萃取时间的长短，使用大功率超声仪 10min 会导致萃取液温度上升和色

素降解。

另外，还有其他研究人员在不同实验条件上有自己的探索，不断优化色素萃

取条件。Zapata等(2000) 在探讨含吡啶组分的流动相分析方法时，采用的萃取

剂是浓度 95%甲醇。Bianchi等（2009）建议不采用冷冻干燥，应直接对样品进

行萃取，认为冷冻干燥会使沉积物中的一部分色素降解(Bianchi, T. S. &

Allison, 2009)。Chen 等（2001）对沉积物提取色素时，为了萃取更加完整，

加入萃取剂以后，在－20 ℃的冰箱中静置一夜(约 12 小时) (Chen et al.,

2001)。Buffan-Dubau 等（2000）在提取色素前对样品冷冻干燥，还试验了 100%

丙酮和加入部分甲醇对萃取的影响(Buffan-Dubau & Carman, 2000)。但由于沉

积物类型的多样性，并没有适合所有类型沉积物的统一的色素提取方法。

1.4 色素分析方法

浮游植物色素组分分析对于浮游植物分类和生物量反演有重要意义。测定植

物色素最常用的方法是分光光度法和荧光光度法(Boto & Bunt, 1978)，但是具

有以下缺点：

（1）叶绿素 b和 c甚至细菌叶绿素与叶绿素 a的吸收带和发射带存在重

叠。

（2）叶绿素的降解产物（甚至是色素的主要组分）或者没有被检测，或者

是同母体叶绿素同时被检测。

（3）由于不同文献可能采用不同分光光度方程，对叶绿素浓度的测定出现

不同结果，不能很好地进行比较。

（4）分光光度法不够灵敏，需要较高浓度或者较多样品。

（5）一些类胡萝卜素不能被检测，而它们是有些藻类的标志物(Mantoura &

Llewellyn, 1983)。

为了克服这些缺点，必须分离不同类的色素，所以发展出色谱法来分离色

素。柱色谱能分离植物色素，但是灵敏度低不适合低生物量的海洋浮游植物测

定。纸色谱法能用于培养的浮游植物的色素分离和分析，但是不适合天然浮游植

物测定，只能做半定量测定。薄层色谱在藻类生长旺盛期能够有效分离色素，定

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量测定准确度也更高，但是也只有±5%，而且对叶绿素降解产物和一些叶黄素无

法有效分离。

自从 1975年高效液相色谱（HPLC）用于分离色素首次报道以来(Evans et

al., 1975)，HPLC已经成为大家普遍接受的分析色素的有效手段。80年代以

来，随着高效液相色谱技术的发展，色素分析技术也不断发展。Shoaf 用已经分

离了类胡萝卜素的色素提取液经过 HPLC分离了叶绿素 a和 b(Shoaf, 1978)。

Abaychi等采用正相 HPLC成功分离了培养的藻类的叶绿素和类胡萝卜素，但是

该方法不适用于水体，进而不适用于天然水体和沉积物萃取液(Abaychi &

Riley, 1979)。Brown 等利用反相 HPLC对淤泥丙酮提取液中叶绿素 a进行了快

速测定,但由于分辨率的限制,大多数叶绿素降解产物、叶绿素 c和类胡萝卜素等

所有极性化合物没能很好的分离(Brown et al., 1981)。Mantoura 等（1983）

改进了从培养的藻体和天然水样的丙酮提取液中分离叶绿素和类胡萝卜素的方

法,在 Hypersil-ODS 柱上采用离子对技术,用四丁基铵-甲醇-水(V/V,10:10:80)

和丙酮-甲醇(V/V,20:80)线性梯度洗脱,分析了 14种叶绿素及其降解产物和 17

种类胡萝卜素(Mantoura & Llewellyn, 1983)。 Wright等 1991年建立了分析

海洋浮游植物光合色素组成的高效液相色谱法(Wright & Jeffrey, 2006)，采用

Ｃ18柱实现了 40种类胡萝卜素和 12种叶绿素及其衍生物的分离。由于该方法

不能分离部分色素，Zapata等（2000）改进采用单体 C8柱、二元梯度、40 分

钟内分离色素 50多(Zapata et al., 2000)。其他人根据不同需要对该方法也进

行不同程度的改进。

现在具有光二极管阵列检测器的数据处理系统已经能够应用于 HPLC，从而能

够贮存、处理包括三维色素图的各种色谱和光谱数据，可以对未知组分进行鉴

定。然而诸如载体材料、流动相极性、柱温和洗脱速率等色谱条件根据不同分析

对象而不同，仍需要不断发展。

1.5 硝酸盐测定方法

为实现对所分离色素氮含量的定量分析，所有有机溶剂需要测定氮含量的本

底空白。传统方法是通过过硫酸钾湿法氧化，把有机溶剂中的氮氧化为硝酸盐，

硝酸根先通过铜镉柱还原成亚硝酸根后，再通过重氮偶氮法用分光光度计测定

(Grasshoff, 1976)。

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臭氧化学发光法是先将水体中的 NO3-和 NO2

-用不同的还原剂选择性的还原成

NO，后 NO 与臭氧反应,产生化学发光,通过检测放出的光子数便可测定出 NO3-和

NO2-的浓度。与重氮偶氮法相比，化学发光法具有灵敏度高、检测限低、检测范

围宽、样品用量少、不受悬浮物质及有色物质的影响、能够进行大批样品的测定

等优点(Li et al., 2011; Zhao et al., 2012; Zhu et al., 2014; 王燕,

2009)。此方法更加符合本次实验所需要求，所以选择使用化学发光法对实验所

用有机溶剂进行本底空白检测。

1.6 沉积物色素研究现状

近年来，已有研究使用沉积色素作为生物标志物来反演长江口及其邻近海域

的富营养化历史趋势和气候变化对该海域浮游植物生物量的影响。但诸如光照强

度、颗粒物在水体中的停留时间、表层水体初级生产力、微生物降解、外界溶解

氧含量、浮游和底栖生物摄食、沉积物类型和沉积环境稳定性等因素均会对沉积

色素的分布、降解和保存等产生影响(Leavitt, 1993; Leavitt & Hodgson,

2002; 赵军 et al., 2010)，因此如何在合适的区域选取有代表性的样品是进行

浮游植物初级生产力历史重建的首要问题，在一个比较大的区域范围内，先了解

沉积色素的组成、分布及其影响因素和指示意义是解决这一问题的一个思路，也

是本论文的研究目标。

1.7 主要研究内容

根据本论文研究目标，本论文实验内容主要包括以下三点：

i. 将探究沉积物样品中色素提取的最佳实验方案。通过比较各萃取剂

的种类、配比和用量；萃取过程中温度对水浴超声效率的影响；萃取时间

的影响等等，确定最有效快速的提取沉积物中色素的实验方案。

ii. 为测定萃取所用有机溶剂氮空白，通过浓缩有机溶剂，测得所用有

机溶剂氮含量，并比较不同厂家（国内外）产品的氮含量差异。

iii. 利用高效液相色谱，测定萃取的色素种类和含量，检验不同溶剂对

不同色素的萃取效率的差异。

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2 材料和方法

2.1 仪器和试剂

2.1.1 仪器

N2000 双通道色谱工作站(浙江大学智达信息工程有限公司)

氮氧化物化学发光仪（美国 Teledyne 公司）

减压阀(上海山松仪器仪表有限公司)

压力表(0-0.6Mpa,常熟扬子电工仪器厂)

WYE.1 型精密气体稳压阀(南京南达分析仪器应用研究所)

WLF 型精密气体稳流阀(南京南达分析仪器应用研究所)

LZB-6WB 型气体流量调节阀（杭州奥盛仪器有限公司）

DK800-4 型玻璃转子流量计（常州双环热工仪表有限公司）

微量进样器（0-100μL，瑞士 Hamilton 公司）

微量进样器（0-250μL，瑞士 Hamilton 公司）

高纯氮气（99.999%）

TE2101-L 型电子天平(量程:0-2100g,d=0.1g；赛多利斯科学仪器（北京）有限公司)

TE212-L 型电子天平（量程：0-210g，d=0.01g；赛多利斯科学仪器（北京）有限公

司）

电炉温度控制器（DRZ-4;山东省龙口市先科仪器公司）

高压灭菌锅（SX-500;日本 TOMY 公司）

氮吹仪（杭州奥盛公司）

石英管（美国 TGP 公司）

LC-20A 型液相色谱仪（日本 SHIMADZU 公司）

紫外可见分光光度计

100μl 液相（平头）进样针（上海高鸽工贸有限公司）

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2.1.2 试剂

二氯甲烷(天津市科密欧化学试剂有限公司 )

甲醇（色谱纯 国药集团化学试剂有限公司 ）

正己烷（高效液相色谱 天津市科密欧化学试剂有限公司）

乙酸乙酯（高效液相色谱 天津市科密欧化学试剂有限公司）

丙酮（色谱纯 韩国 Duksan 公司）

氢氧化钠（优级纯 山东莱阳经济技术开发区精细化工厂）

过硫酸钾（分析级 德国默克公司）

盐酸（优级纯 国药集团化学试剂有限公司）

氯化钒（美国 Alfa Aescar 公司）

甲醇（美国 Fluka 公司）

二氯甲烷（美国 Fluka 公司）

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2.2 实验步骤

2.2.1 实验容器处理

实验所用的石英管、棕色瓶（20ml、3ml）等玻璃用品先用氧化剂氧化，再在

3%稀盐酸中浸泡 12 小时，然后用 Milli-Q 水清洗 4 遍，晾干后在马弗炉中在 500℃

烧 5 小时。

使用的离心管（50ml）先用氧化剂氧化，再在 3%稀盐酸浸泡 12 小时，再用

Milli-Q 水清洗 4 遍，然后晾干待用。

2.2.2 溶剂氮空白测定

1.溶剂前处理：本次实验对甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、氧化剂中氮

含量进行测定。由于所有机溶剂中氮含量为痕量级，所以将先对样品进行浓缩处

理，使用纯氮气在 40℃氮吹，使有机溶剂完全挥发从而有机氮被浓缩。

2.实验所各规格玻璃容器统一处理，确保无碳、氮残留。使用 Milli-Q水和

过硫酸钾氧化剂等试剂为新制，同一批次生产。

3.氧化剂:取饱和过硫酸钾溶液 25.00 ml，加入 0.60 g NaOH,加水至

100.00 ml，配成 0.15 mol/L K2S2O8、0.05 mol/L NaOH的氧化剂备用。

4.甲醇、二氯甲烷和丙酮等有机溶剂，取同一批次样品 10.00 ml于石英管

中完全吹干后加入 2.00 ml氧化剂，在 121℃硝化 30分钟，检测硝酸盐含量。

2.2.3 萃取分离

取同一站点同一深度沉积物研磨成粉状，冷藏备用。所有样品的萃取程序相

同，如下:

取出每份 2.0g 样品，加入萃取剂之后在冰水浴中进行超声萃取，然后低温静

置一夜，再离心取上清液，之后把提取物经 0.2μm 玻璃纤维膜针筒滤器过滤，滤

液在紫外分光光度计测定吸光度。所有操作均在弱光环境中进行，保存样品于低

温避光环境中，最大程度上避免色素降解。

2.2.3.1 最大吸收波长

取同批次样品，分别加入 90%丙酮 4.00 ml，其他条件不变，萃取结束后在紫

外-可见分光光度计中进行 200-800 nm 波长扫描，根据图谱，选取测定最大吸收

波长。

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2.2.3.2 萃取剂选择

配置 90%丙酮、70%甲醇+30%丙酮、50 甲醇+50%二氯甲烷的萃取剂。取同批

次样品，分别加入不同萃取剂各 5.00ml，其他步骤不变，萃取结束后测定色素含

量。

2.2.3.3 萃取剂用量

取出同批次样品，分别加入 5.00mL、7.00mL、10.00mL90%丙酮，除萃取剂体

积不同外其他萃取步骤不变，萃取结束后测定色素含量。

2.2.3.4 超声萃取时间

取同批次样品，都加入 5.00 ml 90%丙酮，然后超声萃取时间分别为 15 分钟、

30 分钟、60 分钟，除时间外其他步骤相同，萃取结束测定色素含量。

2.3 色素检测

色素检测选用岛津高压液相色谱(型号 LA20)。色素检测和分离选择二元梯度

洗脱程序，洗脱溶剂由二元流动相构成，流动相 A 为甲醇:乙酸乙酯:丙酮(5:3:2，

体积比)，流动相 B 为甲醇:丙酮(9:1，体积比)，流动相配制完成后在水浴中超声

15min。

进样量为 100μl，柱温箱设置 30℃，保持柱温恒定，二极管阵列检测器(DAD)

检测波长为 430 nm、440 nm 和 450 nm，设置带宽为 8nm。紫外检测器的激发吸

收波长分别为 440 nm 和 663 nm。梯度洗脱程序如下所示，整个洗脱程序的运行

需要 70 分钟。在运行过程中系统流速始终是 1.000 ml/min。

12

梯度洗脱程序

时间

Min

流动相

A/%

流动相

B/%

流速

ml/min

0.00 100 0 1.000

3.00 95 5 1.000

5.00 95 10 1.000

10.00 95 15 1.000

30.00 50 50 1.000

50.00 0 100 1.000

60.00 100 0 1.000

70.00 100 0 1.000

1. 配置 Chl-a标准溶液，根据峰面积绘制标准曲线。

2. 在标准系列中加入一滴 2mol/L 盐酸，再次测定液相色谱谱图。

3. 将样品加入分析，由峰位置确定色素种类、由峰面积确定叶绿素 a 浓度。

1

3 结果与讨论

3.1 溶剂与氧化剂氮空白测定。

3.1.1 氮空白测定数据结果

实验设计为移取 10.00ml 有机溶剂在石英管中，在 40℃下用氮气吹干，另设

两个空白不加试剂同样处理，然后加入 2ml 氧化剂（0.015 M NaOH、0.05 M K2S2O8）,

再设置两个氧化剂空白，然后统一硝化测定。

实验处理步骤设计如下:

编号 加入样品 40℃氮吹 加入 2ml氧化剂 描述

1-3 × √ √ 样品空白

4-6 √ √ √ 样品

7-12 × × √ 氧化剂空白

经过测定各有机溶剂含量如下：

1.丙酮（进口）（单位μmol/L）

项目 1 2 3 4 5 6 7 Mean

氧化剂 1.197 1.197 1.197

样品空白 1.472 1.491 1.482

样品 18.26 15.81 15.92 14.02 16.39 16.41 14.12 15.85

溶剂空白 3.36 2.87 2.89 2.51 2.98 2.99 2.53 2.87

2.二氯甲烷（国产）（单位μmol/L）

项目 1 2 3 4 5 Mean

氧化剂 1.197 1.197 1.197

样品空白 1.880 1.736 1.808

样品 2.15 2.34 1.94 1.95 1.98 2.07

溶剂 0.068 0.106 0.026 0.028 0.034 0.052

14

3.二氯甲烷（进口）（单位μmol/L）

4.甲醇（国产）（单位μmol/L）

项目 1 2 3 4 5 Mean

氧化剂 1.88 1.88

样品空白 2.34 2.34

样品 2.38 2.36 2.87 3.33 2.45 2.68

溶剂 0.008 0.004 0.106 0.198 0.022 0.068

5.甲醇（进口）（单位μmol/L）

项目 1 2 3 4 5 Mean

氧化剂 1.88 1.88

样品空白 2.34 2.34

样品 2.06 2.63 2.52 2.64 2.72 2.514

溶剂 - 0.058 0.036 0.060 0.076 0.035

6.乙酸乙酯（单位μmol/L）

项目 1 2 3 4 5 Mean

氧化剂 1.88 1.88

样品空白 2.34 2.34

样品 3.37 3.20 4.03 4.81 4.65 4.01

溶剂 0.206 0.172 0.338 0.495 0.462 0.335

对以上各种溶剂数据对比发现，丙酮氮含量量最高，测量结果为 2.5-3.0μ

mol/L；国产甲醇为 0.07μmol/L，而进口为 0.04μmol/L；国产二氯甲烷为 0.05μ

项目 1 2 3 4 5 6 Mean

氧化剂 1.88 1.88

样品空白 2.34 2.34

样品 3.71 3.39 3.57 3.58 3.99 4.03 3.72

溶剂 0.274 0.210 0.246 0.248 0.330 0.338 0.274

15

mol/L，而进口二氯甲烷为 0.27μmol/L；乙酸乙酯为 0.34μmol/L。

可见甲醇国产和进口并无太大差别，也达到使用要求，乙酸乙酯也同样达到

要求。而进口二氯甲烷氮含量反而比国产高出一倍。

3.1.2 氮空白测定问题与改进

氮空白测定过程中，发现空白值较大，包括氧化剂空白和样品空白，氧化剂

空白通过对过硫酸钾重结晶，能够降低氧化剂氮含量，三次重结晶后最低达到

1.2μmol/L。而样品空白暂时还未找到原因，可能是氮吹过程中空气掉落，也可

能是氮吹仪管道内未能清洗，有灰尘和污垢等残留。还需要后续实验继续寻找原

因。

对溶剂本底空白的测定发现，丙酮氮含量最高，接近 3μmol/L，这个氮含

量远高于今后实验中萃取和测定等使用，需要对现在的丙酮试剂进行额外处理以

达到实验要求。另外进口二氯甲烷氮含量高于国产的，不符合一般情况，可能实

验设计或者操作出现问题。对于实验中出现的平行样出现较大误差的情况也需要

继续探究原因。

3.1.3 最大吸收波长扫描

对配置的叶绿素 a 标准和样品在紫外-可见分光光度计中在 200-800nm 全波

段扫描，扫描间隔为 1nm，得到图谱如下。

浓度 2μM 的叶绿素在不同溶剂中光谱图

16

样品在不同溶剂中光谱图

由上面两图比较得知，叶绿素 a在 431nm和 663nm 处有吸收峰，样品在 410nm

和 663nm 出有吸收峰，故选取 663nm 作为整个实验过程中测定吸光度的吸收波

长值。

3.1.4 萃取溶剂配比

用三种不同溶剂分别配制叶绿素 a标准 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0μmol/L，在

663nm 下测定吸光度，绘制工作曲线。

溶剂 90%丙酮工作曲线

17

溶剂为 30%丙酮+70%甲醇叶绿素-a 工作曲线

溶剂 50%甲醇+50%二氯甲烷工作曲线

三种不同溶剂萃取结果如下（单位μmol/L）：

溶剂种类 品行样 1 平行样 2 平行样 3 平均值

90%丙酮 5.79 5.79 - 5.79

30%丙酮+70%甲醇 4.54 4.28 5.10 4.64

50%甲醇+50%二氯甲烷 6.66 6.50 6.80 6.65

由表知，50%甲醇+50%二氯甲烷萃取效率最高，30%丙酮+70%甲醇萃取效率

最低，90%丙酮比 50%甲醇+50%二氯甲烷萃取效率低 13%，30%丙酮+70%甲醇比

50%甲醇+50%二氯甲烷萃取效率低 30%。三种溶剂依次极性增强，但是萃取效率

并不是同样依次增强，所以除了极性可能还有其他因素影响萃取效率，以后可以

继续做相同溶剂不同配比来进行比较，确定更加优化的萃取方法。

18

虽然由本次实验看出，90%丙酮萃取效率略低于 50%甲醇+50%二氯甲烷，但

值相差并不大，考虑操作方便以及前人实验条件，以下实验使用 90%丙酮为溶

剂，探究其他条件对萃取效率的影响。

3.1.5 萃取剂用量

此时实验中，按照样品：萃取剂体积比为 1:2.3、1:3.5、1:5 来进行比较，萃

取结果如下（表中数值单位为μmol/L）：

萃取剂 体积比 平行样 1 平行样 2 平行样 3 平均值 总含量/nmol

90%丙酮 1：2.5 1.02 1.00 1.26 1.09 5.45

90%丙酮 1：3.5 0.88 0.80 - 0.84 5.88

90%丙酮 1：5 0.58 0.47 - 0.52 5.2

由上表数据计算绝对量可知，不同萃取体积萃取后得到的色素含量相差为

7%-11%。所以在体积比为 1：2.5-1：5 之间，可以选取需要的体积比来进行实

验。考虑到体积太大会使浓度较低增大测定误差，体积太小不足以进行分析，故

选取 5ml 为实验中萃取剂用量。

3.1.6 超声萃取时间

实验中设置 15min、30min、60min 的超声萃取时间，萃取结果测定如下（单

位μmol/L）:

萃取时间/min 平行样

平均值 1 2 3

15 2.30 2.79 1.88 2.32

30 1.75 1.64 1.66 1.68

60 1.71 1.79 1.76 1.75

由上表数据可知，超声萃取时间由 15 分钟增加到 30 分钟后，萃取效率降低

超过 1/4，继续增加到 60min 后，萃取效率基本不变。可能是超声过程中能量较

高，使部分性质不太稳定的色素分解，所以导致萃取得到色素量减少。综合考虑

到萃取时间和萃取效率，最终选取 15min 为最佳超生萃取时间。

19

3.1.7 萃取次数

萃取过程中发现，萃取离心后不可能完全得到上清液，还有可能萃取剂中

一种或者多种色素达到饱和，所以对已经萃取过的样品进行第二次萃取，从而得

知萃取效率和合适的萃取次数。

萃取剂 90%丙酮 30%丙酮+70%甲

醇

50%甲醇+50%二氯

甲烷

第二次萃

取平行样

1 0.53 0.55 0.58

2 0.62 0.71 0.56

3 0.55 0.62 0.57

第二次平均值 0.57 0.63 0.57

第一次萃取值 5.79 4.64 6.65

第二次萃取色素量占色

素总量比例/% 9 12 8

从表中数据可以看出，第二次萃取得到的色素含量约占总色素含量的 10%左

右，所以使用 5ml 萃取剂是一次几乎就能完全萃取样品中的色素，剩余量非常

少。而且离心后无法完全分离上清液，剩下的色素可能只是残留的萃取剂中的，

所以如果想得到样品中全部的色素可以考虑增大萃取剂的体积，这样能增加一次

萃取得到的色素总量。

20

3.2 高压液相（HPLC）色素分析方法

3.2.1 高效液相色谱谱图

在液相色谱中使用二元梯度洗脱测定叶绿素-a 标准、脱镁叶绿素标准（叶绿

素 a 标准溶液中加入一滴酸）和样品，由前两张谱图得到叶绿素-a、脱镁叶绿素

的保留时间，根据不同色素的性质不同，推断各个峰代表的色素种类。

未加酸叶绿素 a 标准溶液谱图

家酸后叶绿素 a 标准溶液谱图

由上两张谱图对比得知，叶绿素 a 保留时间为 9.7min，脱镁叶绿素 a 保留

时间为 20.5min。

21

3.2.2 叶绿素 a 工作曲线

配制系列叶绿素 a 标准，并测定峰面积，得到工作曲线。

浓度/（μmol/L） 1.00 2.00 5.00 10.00

峰面积 14517 30839 71368 156981

叶绿素-a 标准溶液的 HPLC 谱图工作曲线

得到工作曲线用于各种色素的定量分析。

3.2.3 样品中各种色素含量

下图是以 90%丙酮做萃取剂得到的色素的液相色谱谱图。

通过对峰的保留时间对照，得到图中代表叶绿素 a 和脱镁叶绿素 a 的位置。

三种不同溶剂中叶绿素 a 的含量分别是：

22

溶剂 峰面积 叶绿素 a 浓度/μmol.L-1 Chl-a 占总色素/%

90%丙酮 12119 0.92 15.9

30%丙酮+70%甲醇 11428 0.88 18.9

50%甲醇+50%二氯甲烷 12360 0.94 14.1

可以看出三种溶剂萃取得到的色素中叶绿素 a 所占比例差别不大，在 14%-

18%之间。还是说明 50%甲醇+50%二氯甲烷对于叶绿素-a 的萃取效率并无明显优

势。但是对于其它色素，还是具有一定优势的。这提示我们，虽然萃取总的色

素，50%甲醇+50%二氯甲烷最高，但是对于其他色素，比如某种特定的色素，就

不一定高，这还需要交叉萃取实验来验证。

3.2.4 色素分析中存在的不足

通过液相色谱技术能够有效分离萃取液中不同种类色素，并对能够定性的色

素进行定量分析。但是分析结果显示，在分光光度测定和液相色谱测定之间，色

素损失比较严重，可以看出液相色谱中各个峰代表的色素总值明显小于分光光度

测量的色素值，所以需要注意样品的保存条件和减少测定过程样品中色素的损

失。没有对同一样品进行不同溶剂交叉萃取，从而确定不同溶剂萃取效率及萃取

时是否对色素有一定选择性。

23

4 结论与展望

本论文通过大量实验得到各种有机溶剂及氧化剂的氮空白值，对以后进行色

素定量分析积累了数据基础。在实验中发现丙酮的氮含量过高，所以需要重蒸以

达到后续实验所需要的纯度。部分测定结果有异常，需要以后继续改进实验仪器

和实验方法，达到更高的精密度和准确度。

对于色素萃取条件的实验发现：萃取剂种类和比例对萃取效率有很大影响，

在已选的三种溶剂中，50%甲醇+50%二氯甲烷萃取效率最高；超声萃取时间不宜

过长，否则会降低萃取得到的色素含量；萃取体积对萃取效率影响不大，所以选

择时应根据测定需要的量及残留溶剂的影响来合理选择体积；对沉积物萃取时，

第一次就能得到总色素量 90%，根据这个比例可以选择自己需要的萃取次数。另

外同样溶剂的不同配比对萃取效率的影响本次实验并未涉及到，以后还需要继续

探究这个变量，以达到更好的萃取条件。不同溶剂对特定种类色素的萃取差异没

有准确测定，以后需要继续研究。

在色素的分析过程中发现，各种色素可以被很好地分离。可以对更多色素标

准进行对比，确定所有色素种类及其含量，并根据不同色素代表的生物指标，来

进行沉积物来源、浮游植物群落结构、生产力水平等研究。

24

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27

致谢

感谢辛宇老师在这个毕业设计期间对作者的悉心指导，不但传授专业知识，

更在行为和思想上对我有积极影响。辛老师广博的眼界和创新的思维是学习的楷

模。本论文是在辛老师多次修改的基础上完成的，对老师的付出表示衷心的感谢。

感谢钟晓松同学的热心帮助。

感谢实验室全体成员的关心和帮助。

感谢家人和朋友在生活和学习中对我的支持。

感谢所有老师和同学们。