Serología - Inmunidad Celular

INMUNODIAGNOSTICO

Sustrato

Producto

AP

AP

Prof. Rosanna Citti de PetriconeCátedra de Microbiología e

InmunologíaFCV-UCV

Pruebas Inmunológicas queanalizan la reacción Ag-Ac

• La respuesta inmunitaria de los animales se puede emplear de dos maneras en un laboratorio de diagnóstico– Para identificar un antígeno

– Para detectar anticuerpos en el suero

Aplicaciónes Diagnósticas de las Pruebas Inmunológicas

• SEROLOGIASEROLOGIA– Medición de las interacciones Ag-Ac con fines

diagnósticos

• Principales reactivos empleados en las Pruebas Serológicas– Suero sanguíneo (fuente de Ac´s o Ig)

– Suero fresco de cobayo (fuente de C´)

– Antiglobulinas (anti-anticuerpos)

– Anticuerpos monoclonales

Reactivos Empleados en las Pruebas Serológicas

• Suero

Alicuotar el suero,

identificar y guardar

a -20ºC

Incubar sangre

37ºC x 2 h

Transporte Separarcoagulo

de paredes

4ºC toda la noche

2.000 r.p.m.Durante 15´(OPCIONAL)

• Plasma

Recolección sin anticoagulante

Alicuotar el plasma,identificar y guardar

a -20ºC

Transporte

2.000 r.p.m.Durante 15´

(OBLIGATORIO)

Recolección con anticoagulante

SepararSobrenadantedel sedimento

Reactivos Empleados en las Pruebas Serológicas

• Suero

Recolección sinanticoagulante

• Antiglobulinas

Alicuotar el suero,

identificar y guardar

a -20ºC

Separarcoagulo

de paredes

2.000 r.p.m.Durante 15´

Incubar sangre

37ºC x 2 h

Transporte 4ºC toda la noche

Recolección sinanticoagulante

IgG Bovina Inmunización Antiglobulinas

IgG + Antiglobulinas

• Anticuerpos monoclonalesCélulas esplénicas

(Plasmocitos)Células de mieloma

Células de mielomade ratón en cultivo

Ratón inmunizado con el antígeno

Ensayo de producción de anticuerpos

Identificación de clonas positivas

Reclonación de los híbridos positivos

Fusión con Polietilenglicol

Selección de los híbridosen el medio HAT

Hipoxantina, Aminopterina, Timidina

Clonación

Propagación de clonas seleccionadas

Anticuerposmonoclonales

Congelamiento de células para almacenarlas-196 ºC

Clasificación de las Pruebas Serológicas

• Pruebas de Unión Primaria• Pruebas de Unión Secundaria• Pruebas Terciarias o en sistemas

vivos

Clasificación de las Pruebas Serológicas

Unión Primaria: Miden captación del Ag por el Ac

Unión Secundaria: Miden los resultados unión Ag-Ac in vitro

Unión Terciaria: Miden el efecto protector de los Ac en un aminal.

Pruebas de Unión Primaria

• Los Principales grupos de pruebas de unión primaria son:

1. Radioinmunoanálisis2. Pruebas de Inmunofluorescencia3. Pruebas Inmunoenzimáticas

Pruebas de Unión Primaria1) Radioinmunoanálisis (RIA)

– Técnica desarrollada en 1960 (Berson & Yallow)

– Capacidad de las proteínas de acoplarse a radioisótopos: 125I, 3H, 32P, 14C

– Ampliamente utilizado para medir niveles de un antígeno determinado. Ej. Fármacos, hormonas en sangre y orina Aplicación clínica: Test radioalergoabsorbente (RAST) para medir concentraciones de IgE en pacientes alérgicos

Radioinmunoanálisis Radioinmunoanálisis para detectar Ac (No comp.)

– RAST – Prueba radioalergoabsorbente (Ig E) Sumerge en suero problema (x) discos de celulosa impregnados de Ag y después de lavados, se vuelven a sumergir en

antiglobulina radiomarcada, se mide la radioactividad del disco y es posible medir la r.a de Ac presentes en el suero

Antígeno Lavado Lavado LavadoSuero XAntiglobulinaradiomarcada

RadioinmunoanálisisRadioinmunoanálisis para detectar (Ag) (competitivo)

El Ag no marcado desplazará al Ag radiomarcado de los complejos inmunitarios. Muy sensible. Detecta cantidadesdiminutas de fármacos (Morfina en orina) hasta 108 y 1010 M

Suero problema

Ag marcado Ac

Ag marcado

Ag No marcado

Ac

Proteína precipitada

Sobrenadante no radioactivo

Proteína precipitada Proteína precipitada

Sobrenadante radioactivo

125I 14C3H

Pruebas de Unión Primaria

2) Pruebas de Inmunofluorescencia

– Reacción Ag-Ac se hace visible por incorporación de colorante fluorescente

Isotiocionato de Fluoresceina-FITCRodamina

– Se acoplan fácilmente a moléculas proteícas– Observación Microscopio de Fluorescencia

FLUOROCROMOSFLUOROCROMOSFLUOROCROMOSFLUOROCROMOS

Inmunofluorescencia

Pruebas de Inmunofluorescencia directa– Prueba directa de Ac Fluorescentes

Detecta la presencia de antígenos cuando el nº es pequeñoSe emplean frotis de líquidos corporales y cultivos de

tejidos que contienen el Ag. (Virus rábico, virus de leucemia felina), Clostridium, L. monocytogenes etc.)

Antígeno ? Anticuerpos fluorescentes

Lavado

Inmunofluorescencia

Pruebas de Inmunofluorescencia indirecta– Prueba indirecta de Ac Fluorescentes

Detección de anticuerpos en suero o de antígenos en tejidos o cultivos celulares

Antígenoconocido

Suero problema

Lavado

Antiglobulinas Fluorescentes o marcadasLavado Ac + Ag

Inmunofluorescencia

• Citometría de Flujo

Marcar una suspensión celular con un Ac monoclonal fluorescente

dirigido contra un Ag específico de superficie celular (CD)

Técnica de Ac Fluorescentesutilizada para detectar Ag.

(Proteínas) en superficie celular (Fenotipos)

Ej. Poblaciones de Linfocitos

Principios

CITOMETRÍA DE FLUJO

Principios del funcionamiento del Citómetro de Flujo

CITOMETRÍA DE FLUJO

• Patrón que se observa en un citómetro de flujoEmpleando Ac con diferentes marcadores fluorescentes puede analizarse de manera simultánea la expresión de diversos Ag. de superficie (CD)

Pruebas de Unión Primaria

3) Pruebas InmunoenzimáticasDetecta y cuantifica Ag (Ag en solución) como AcUtiliza enzimas que se acoplan a Ac específicos u otras proteínas– Reacción enzima-sustrato (covalente)

Reacción colorimétrica (sustrato incoloro sustrato color)

– Intensidad de color Directamente proporcional a la cantidad de

complejos Ag-Ac formados– Aplicaciones clínicas:

Diagnóstico enfermedades bacterianas, virales y prasitarias

PRUEBAS INMUNOENZIMÁTICAS

• Marcadores enzimáticos empleados – Se han empleado 20 enzimas diferentes

– Las más populares: Fosfatasa alcalina

Peroxidasa de rábano picante

Beta galactosidasa

– No costosas y fáciles

– Producción de productos luminiscentes o fluorescentes:

Ej. Luciferasa

Pruebas de Unión Primaria

Pruebas Inmunoenzimáticasa)Ensayos Inmunoabsorbentes ligados a enzima

(ELISA) 1) Prueba indirecta de Elisa

2) Elisa en sandwich

3) Elisa con Ag marcado

b)Técnicas de Inmunoperoxidasa

c) Inmunoelectrotransferencia (Western blotting)

d) Inmunoanálisis de AVIDINA-BIOTINA

1) ELISA INDIRECTO

Pruebas Inmunoenzimáticas

(ELISA Indirecto) Detecta Ac.

– Intensidad del color

Simple vista ó

espectrofotometría

1) ELISA INDIRECTO

ELISA indirecto (Detecta Ac)

Antígeno Antígeno+

Suero problema

Antígeno+

Suero problema+

Antiglobulina +enzima

Antígeno+

Suero problema+

Antiglobulina-enzima

+sustrato

2) ELISA SANDWICH

Pruebas Inmunoenzimáticas– (ELISA sandwich)

Se detecta ó

cuantifican Ag

Ej. detectar en

sangre el virus

de la Leucemia

felina

Ac de captura

Ac. específico

3) ELISA ANTIGENO MARCADO

Pruebas Inmunoenzimáticas– (ELISA Ag marcado)

– Detecta Ac

– La más comercial

– Funciona en sangre

entera

b)TÉCNICAS DE INMUNOPEROXIDASA

Pruebas Inmunoenzimáticas– Se observa con M. optico

– Emplea enzimas conjugadas

a Ig o antiglobulina para

detección de Ag en tejidos

Marcadores:

Peroxidasa de rábano picante

Fosfatasa Alcalina

β-galactosidasa B

Ej. Pénfigo folíaceus (perro)

c)WESTERN BLOTTING3) Pruebas Inmunoenzimáticas (Transferencia Proteínas)

– Inmunoelectrotransferencia (Western blotting)

Detecta Ag mezclado con otros Ags. (Posición diferentes Proteinas, dependerá del tamaño molecular)

1º Etapa: Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS)

d) INMUNOANÁLISIS AVIDINA-BIOTINA

• 3) Pruebas Inmunoenzimáticas – Biotina: mol. peqeña

se une a proteína Avidina

Avidina: proteína pequeña

presente en la clara huevo

que se une con fuerza a la

Biotina, y se conjuga

con la peroxidasa de

rabano

Desventajas de la Pruebas enzimáticas

• Radioisotopos tienen vida media corta

• Son peligrosos (radioactivos)

• Necesitan dispositivos medición caros

• Las Enzimas son estábles y baratas

• Pierden actividad enzimática al conjugarlos con antiglobulinas

• Inhiben la actividad de los Ac.

Por quedarse dormido en clase… se fue de cabeza

ACCIDENTE TRAGICO

Pruebas de Unión Secundaria• Miden los resultados de la unión Ag-Ac in vitro• La reacción antígeno-anticuerpo por lo general va seguida de una

segunda reacción• Pruebas de dos etapas:

1º Etapa Interacción Ag-Ac (uniones covalentes)2º Etapa Determinada por el estado físico del Ag

a) Ag. Soluble PRECIPITACIÓN

b) Ag. Párticulas (bacterias, eritrocitos) AGLUTINACIÓN

3º Etapa Ac activa la vía clásica del Complemento Ag. Se encuentra sobre superficie celular LISIS CELULAR

Pruebas de Unión Secundaria

• La reacción Ag-Ac por lo general va seguida de una segunda reacción determinada por el estado físico del antígeno

Pruebas de Unión Secundaria1) Precipitación

– Inmunodifusión– Inmunoelectroforesis y técnicas afines

2) Aglutinación– Pruebas de antiglobulina– Aglutinación pasiva

3) Hemaglutinación viral (HA) y su inhibición de la HA (HI)

4) Pruebas de Fijación del Complemento– Pruebas de citotoxicidad

PRECIPITACIÓN

• Curva de Precipitación cuantitativa

Ag soluble + Antisuero

Mezcla (flocula)

• Mecanismo de PrecipitaciónAg soluble + cantidad constante Ac

INMUNODIFUSION

Inmunodifusión ó difusión en gel

Inmunodifusión Radial

Inmunodifusión Doble

Ag A Ag A

Ac Anti A

Pruebas de Unión Secundaria

• Precipitación: Inmunodifusión– Inmunodifusión doble

IMPORTANTE EN VETERINARIA:•Detectar Ac en suero contra el virus de la Anemia Infecciosa Equina (Tests de Coggin)

•Detectar animales infectados con el virus de la Leucemia bovina

INMUNOELECTROFORESIS

• Precipitación: Inmunoelectroforesis(Identifica proteinas de liquidos

corporales)

Pruebas de Unión Secundaria

• AGLUTINACIÓN• Ac (bivalentes) establecen enlaces cruzados con Ags particulados (bacterias o eritrocitos) extraños, haciendo que se aglutinen• Más sensible que la Precipitación Ig G Ig M Ig AAglutinación + +++ +Precipitación +++ + +/-Neutralización + + +

Ag particulado

Amontonamiento de Ag (Aglutinación)

INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN

HEMAGLUTINACIÓN (HA) PASIVA•Detecta Ac frente a Ag de eritrocitos y frente a Ag que no se encuentran en la superficie de los eritrocitos (eritrocitos sensibilizados)

• Caracteriza virus desconocidos

INHIBICIÓN DE LA HA• Mide conc. de Ac en suero contra un virus• Identifica un virus específico• Virus muy hemoaglutinantes: (Ortomyxovirus, Paramyxovirus, Alfavirus, Flavivirus, Bunyavirus

Pruebas Terciarias- Pruebas en sistemas vivos

• Pruebas de NEUTRALIZACIÓN Capacidad del Ac de anular la actividad biológica del Ag

cuando se mezcla con él in vitro. Altamente sensibles y específicas

Identificar toxinas bacterianas (Toxina α del C. perfringes) Identificar partículas virales desconocidas o títulos de Ac

antivirales específicos

• Pruebas de PROTECCIÓN– Análisis de neutralización que se realiza totalmente in vivo

Mide las eficacia terapéutica de un antisuero específico Administrar diluciones crecientes de Ac, retando posteriormente

con dosis estándar de M.O patógeno o toxina.– Dosis de inoculación: LD50, ID50

– Efecto protector de un antisuero: PD50