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Microscopia Eletrônica Microscopia Eletrônica em Biologiaem Biologia

MMáárcia rcia AttiasAttiasInstituto de BiofInstituto de Biofíísica UFRJsica UFRJ

mattias@biof.ufrj.brmattias@biof.ufrj.br

22

Um pouco de histUm pouco de históóriaria

33

Amostras biolAmostras biolóógicas e o MEgicas e o MECCéélulas:lulas:

FrFráágeisgeisHidratadasHidratadasMuito espessas para o feixe de elMuito espessas para o feixe de eléétronstronsAmbiente no interior do ME: vAmbiente no interior do ME: váácuo e calorcuo e calor

44

55

Porque as cPorque as céélulas não podem lulas não podem ser observadas vivas no ser observadas vivas no MicroscMicroscóópio Eletrônico ?pio Eletrônico ?

Não pode haver Não pode haver áágua na coluna do gua na coluna do microscmicroscóópiopioAs cAs céélulas têm de ser resistentes ao lulas têm de ser resistentes ao feixefeixeAs cAs céélulas precisam apresentar lulas precisam apresentar contrastecontrasteAs cAs céélulas têm de ser cortadas em fatias lulas têm de ser cortadas em fatias finasfinas

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FIXAFIXAÇÇÃOÃO

PreservaPreservaçção da integridade ão da integridade morfolmorfolóógica x moleculargica x molecular

77

FixaFixaçção de amostrasão de amostrasFixar Fixar éé matar a cmatar a céélula preservando sua lula preservando sua estruturaestrutura

Pode ser QuPode ser Quíímica oumica ouFFíísica: congelamentosica: congelamento

88

FixadoresFixadores ququíímicosmicos

Permanganato de PotPermanganato de Potáássio (KMnOssio (KMnO44))

99

ContrastaContrastaççãoão negativanegativa

Células

Estruturas macromoleculares

vírus

1010

FormaldeFormaldeíídodoInstInstáável, preparado a partir de vel, preparado a partir de paraformaldeparaformaldeíídodo. Não forma liga. Não forma ligaçções ões cruzadas. Degrada rapidamente em metanolcruzadas. Degrada rapidamente em metanolPreserva Preserva antigenicidadeantigenicidade da amostrada amostraPenetraPenetraçção rão ráápidapida

FixadoresFixadores ququíímicosmicos

1111

Famous first electron micrograph of an intact cell was published in The Journal of Experimental Medicine in March 1945, in "A Study of Tissue Culture Cells by Electron Microscopy," by Keith R. Porter, Albert Claude, and Ernest F. Fullam. The cell is a cultured fibroblast originating from a chick embryo, which was grown by Porter on polyvinyl film, then peeled off and transferred to a wire specimen grid. The cell was fixed with osmium tetroxide, washed and then dried in order to prevent evaporation in the electron microscopeUs vacuum chamber. Magnified 1600 times

OsO4 OsO4 –– tetrtetróóxidoxido de de óósmiosmio

LigaLiga--se aos se aos áácidos graxos cidos graxos insaturadosinsaturadosAge como contrastanteAge como contrastanteAge como mordenteAge como mordente

FixadoresFixadores ququíímicosmicos

1212

GlutaraldeGlutaraldeíídodo (Sabatini, 1963)(Sabatini, 1963)Forma ligaForma ligaçções cruzadas com proteões cruzadas com proteíínasnasMelhor preservaMelhor preservaçção estruturalão estruturalPenetraPenetraçção mais lenta que o ão mais lenta que o formaldeformaldeíídodo

FixadoresFixadores ququíímicosmicos

1313

1414

1515

SoluSoluçções tampãoões tampãoOs Os fixadoresfixadores são sempre dilusão sempre diluíídos em dos em solusoluçções tampão paraões tampão para

Manter o equilManter o equilííbrio osmbrio osmóótico do materialtico do materialManter o pH prManter o pH próóximo ao fisiolximo ao fisiolóógicogico

Tampões mais comuns Tampões mais comuns Fosfato de SFosfato de SóódiodioCacodilatoCacodilato de Sde Sóódiodio

1616

Perguntas mais Perguntas mais frequentesfrequentes

Que Que fixadorfixador usar? Fixar por imersão ou por perfusão?usar? Fixar por imersão ou por perfusão?Qual a concentraQual a concentraçção de Glutaraldeão de Glutaraldeíído, formaldedo, formaldeíído, do, tetrtetróóxido de xido de óósmio?smio?RecomendaRecomenda--se adicionar o ferrocianeto de potse adicionar o ferrocianeto de potáássio na pssio na póóss--fixafixaçção?ão?Sacarose, Sacarose, NaClNaCl, , áácido tânico. Qual seu papel na fixacido tânico. Qual seu papel na fixaçção?ão?Quanto tempo se deve deixar a amostra no Quanto tempo se deve deixar a amostra no fixadorfixador??Quanto tempo se deve lavar para retirar o Quanto tempo se deve lavar para retirar o fixadorfixador??A que temperatura deve ser a fixaA que temperatura deve ser a fixaçção?ão?Que tamanho deve ter a amostra?Que tamanho deve ter a amostra?Como selecionar o tampão?Como selecionar o tampão?

1717

FixaFixaçção Quão Quíímica por mica por imersãoimersão

ÉÉ a mais utilizada. O protocolo padrão a mais utilizada. O protocolo padrão compreende as seguintes etapas:compreende as seguintes etapas:

1.1. fixafixaçção primão primááriaria2.2. lavagemlavagem3.3. ppóóss--fixafixaçção (ou fixaão (ou fixaçção secundão secundáária)ria)4.4. lavagemlavagem5.5. desidratadesidrataççãoão6.6. infiltrainfiltraçção em resinaão em resina7.7. polimerizapolimerizaçção da resinaão da resina

1818

?

Passo a passo da fixaPasso a passo da fixaççãoão

1919

Amostras precisam ser bem Amostras precisam ser bem pequenaspequenas

2020

DIFUSÃODIFUSÃO

Palavra chave:Palavra chave:

2121

ProteProteçção contra vapores e soluão contra vapores e soluççõesões

2222

PPóóss--FixaFixaççãoão

2323

DESIDRATADESIDRATAÇÇÃOÃO

2424

DesidrataDesidrataççãoão

A amostra A amostra éé passada por passada por concentraconcentraçções crescentes de ões crescentes de

etanol ou acetonaetanol ou acetona

2525

InfiltraInfiltraçção em resinaão em resina

Em seguida, o fluido de transiEm seguida, o fluido de transiçção serão seráásubstitusubstituíído por uma resina ldo por uma resina lííquida.quida.Este processo Este processo éé feito gradualmente ao feito gradualmente ao longo de 24 horas.longo de 24 horas.

Resina no estado líquido

2626

Tipos de resinaTipos de resinaEPOXIEPOXI

HidrofHidrofóóbicasbicasPolPolíímeros de trama meros de trama mais fechadamais fechadaPolimerizaPolimerizaçção a 60ão a 60ooCC

METACRILATOSMETACRILATOSHidrofHidrofíílicaslicasPolPolíímeros de trama meros de trama mais abertamais abertaPolimerizaPolimerizaçção a baixa ão a baixa temperatura sob U.V.temperatura sob U.V.

2727

• Quando as amostras estiverem completamente infiltradas na resina elas serão distribuídas em moldes e levadas à estufa...

2828

Na estufa a resina se solidificarNa estufa a resina se solidificaráá..Os blocos contendo as amostras podem Os blocos contendo as amostras podem ser retirados e ser retirados e desenformadosdesenformados..

48 horas60oC

2929

Em seguida, os blocos são preparados Em seguida, os blocos são preparados para serem cortados em fatias para serem cortados em fatias ultrafinas.ultrafinas.

Número de identificação amostra

3030

UltramicrotomiaUltramicrotomia

As amostras precisam ser cortadas em seções ultrafinas para que ofeixe de elétrons possa atravessá-las. Isto é feito num ultramicrótomo

3131

O bloco é preso no braço do instrumento. A cada oscilação do braço, há um pequeno avanço. Ao passar pelo gume de diamante da faca, uma fina fatia flutua sobre o espelho d´água

diamante

bloco

espelho d´água

braço

3232

3333

3434

Os cortes flutuam sobre um Os cortes flutuam sobre um espelho espelho dd´́ááguagua

Cortes ultrafinos (60 a 100 nm)

3535

Os cortes são recolhidos em Os cortes são recolhidos em telas de cobretelas de cobre

Cada tela tem 3 mm de diâmetro !

3636

A grade é então inserida no microscópio eletrônico de transmissão

3737

3838

19651965

3939

ConsideraConsideraçções sobre fixaões sobre fixaçção ão ququíímicamica

De acordo com os De acordo com os fixadoresfixadores e solue soluçções ões utilizados utilizados éé posspossíível identificar vel identificar seletivamente espseletivamente espéécies moleculares ou cies moleculares ou proteproteíínas, havendo metodologias nas, havendo metodologias especespecííficas para a localizaficas para a localizaçção ou realce de ão ou realce de vváários componentes celulares.rios componentes celulares.

4040

PrincPrincíípios da Fixapios da Fixaçção a frioão a frio

Congelamento Congelamento ““instantâneoinstantâneo”” do momento do momento celularcelularEvita: sofrimento, difusão de solutos, Evita: sofrimento, difusão de solutos, deformadeformaçção osmão osmóótica, alteratica, alteraçção ão bioqubioquíímicamicaProblemas: velocidade de fixaProblemas: velocidade de fixaçção em ão em funfunçção da espessura da amostraão da espessura da amostra

4141

CriofraturaCriofraturaMMéétodos de congelamentotodos de congelamento

4242

4343

4444

MMéétodos de congelamentotodos de congelamento

PlungePlunge FreezingFreezing

4545

MMéétodos de congelamentotodos de congelamento

Congelamento por Congelamento por Alta pressão (Alta pressão (HighHighpressurepressure freezingfreezing))

4646

CrioCrio--SubstituiSubstituiççãoão((freezefreeze substitutionsubstitution))

4747

CrioCrio--eletronmicroscopiaeletronmicroscopia

4848

4949