分子克隆技术实验流程Molecular Cloning Workflow
孟文举
上海翊圣生物科技有限公司 产品主管
2018.09 匠心品质,快乐科研
Good Science
,Good Products
匠心品质,快乐科研/Good Products ,Good Science
重组DNA技术 基因影响性状
定义:目的是将不同的 DNA片段(如某个基因或基因的一部分)按照人们的 设计定向连接起来,在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达,产生影响受体细胞的新的遗传性状。也叫分子克隆技术。
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重组质粒
蛋白表达质粒克隆质粒 病毒表达质粒 报告基因质粒 基因敲除质粒
pSpCas9-GFP9325bppUC18/19
2686bppET-28a5369bp
pLenti-puro7067bp
pCMV-luc6226bp
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重组质粒的组成元件• 复制起始位点Ori
• 抗性基因
• MCS
• 表达系统元件
• 标签蛋白
• 报告基因
决定拷贝数、兼容性
选择性标记
外源基因插入
调控转录、翻译
FLAG、His、GST
Luciferase
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“认识”质粒,读懂质粒图谱
质粒图谱
Promoter
MCS
Transcription Termination
Ribosome binding site
Ampr
Origin of replicationneor
“relaxed” or “stringent”
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“认识”质粒,读懂质粒图谱
启动子
genepromoter5' 3'
RNA聚合酶 转录因子
真核生物 原核生物
CMVEF1α
U6
T7T7lac
常见启动子
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★
★
★
1. TA克隆2. 酶切连接克隆3. TOPO克隆
克隆方法
连接酶 修饰酶
重组
酶
5. SLIC
7. Gateway克隆 6. 一步法克隆★
★
特殊内切酶
混合
酶
4. Golden Gate Clone质粒改造——分子克隆方法
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1.传统TA克隆
T4 DNA ligase
• ccdB基因:suicide gene
ccdB
AmpR
pUC originTOPO-Vector1865bp
• Topoisomerse I:末端活化
• T-A配对:特异性
• 依赖布朗运动
2.TOPO克隆
克隆载体构建“有时”很重要
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Polymerase
T4 DNA Polymerase
insert
homologyhomology
A5'3'
Exonuclease
dTTP
A5'3'
Exonuclease
T
homology
vector
2.SLIC方式
NNNNNNNN
NNNNGGTCTCNCCAGAGNNNNN
GGTCTCNNNNNCCAGAGNNNNN
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5'
3'
recognition sequence homology
insert
BsaⅠ
insert
识别序列丢失
insertVector
T4 DNA ligase
3.Golden Gate Assembly方式
酶切连接克隆方法 SLIC Golden Gate克隆技术
Gateway克隆技术
Enzymes ü restriction enzyme
ü T4 DNA ligaseü T4 DNA Polymerase
ü BsaⅠ
ü T4 DNA ligase
ü BP Clonase
ü LR Clonase
Advantages • 性价比高 • 不受酶切位点限制• 多片段连接
• 高通量克隆• 多片段连接
• 高通量克隆• 快速• 效率高
Disadvantages
• 克隆效率低• 酶切位点选择困难• 操作步骤多• 操作时间长• 实验应用性有限
• 克隆效率低• 受载体限制• 应用范围有限
• 受载体限制• 价格昂贵• 步骤较繁琐• 1-4个片段的连
接
Applications CAS9载体构建 高通量构建
各种方法的比较
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一步法克隆技术的原理
3'
5' 5'
5'
5'
3'
Exonuclease
Annealing
5'
3'
High Fidelity Polymerase
Extension
Repair DNA ligase
5'3'
质粒载体 线性化质粒
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一步法克隆技术的实验流程
①质粒线性化
• 线性化方式:酶切或者PCR
• 酶切产物纯化:胶回收
②插入片段的制备
引物设计 带末端同源序列的插入片段
• 引物设计:15bp载体重叠序列
• PCR产物纯化:单一产物(建议纯化)
③片段重组&产物转化
• 线性化载体/插入片段:1:2-1:3
• 反应条件:50℃ 15min
• 感受态细胞:108cfu/ug
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片段扩增 片段纯化 片段酶切
连接 转化
载体酶切
产物纯化
产物纯化
片段扩增 片段纯化 15min连接 转化
载体酶切 产物纯化
传统方法
One Step
一步法克隆技术更加简便、快速
克隆鉴定
克隆鉴定
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连接时间:15-30min 载体/片段比:1:2-1:4
插入片段范围:几百bp- 8kb
载体:pFastBac1,4.7 kb 载体:pCDH,8 kb
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点突变载体构建策略
例:某疾病模型机制研究时,需要构建K基因点突变模型,
观察点突变前后疾病严重程度变化。一步法克隆技术的应用
K13 5’UTR K13 3’UTR
K13 ORF (2217b)Chromosome
K13 point mutation ••
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点突变载体构建策略
例:某疾病模型机制研究时,需要构建K基因点突变模型,
观察点突变前后疾病严重程度变化。
vector
一步法克隆技术的应用
•••
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构建策略:
•••
K13
arm1 3' UTR
•••arm1 3' UTR
•••
1、突变点的引入
2、多个片段的连接
arm1Vector
•••
3' UTR Vector•••
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快速
高效
简单
限制因素少
应用广泛
成本低
不受酶切位点限制
单片段、多片段、点突变
片段制备简单,无需酶切
15min完成连接反应
阳性克隆率达90%以上一步法克隆技术的优势
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http://122.112.245.84:8080/hieff-clone/ 引物设计工具
一步法克隆技术的引物设计
基因扩增的Tm值重叠序列的Tm值
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无克隆生长、克隆数少
无克隆或克隆数较少
假阳性率高
一步法克隆技术的疑难问题
①排除试剂失效 阳性对照实验
②引物设计不合适 检查序列,GC含量
③载体与片段比例错误 重新计算
④含抑制剂 载体与片段胶回收
⑤感受态细胞问题 ①效率低;②转化体积过大;③克隆感受态细胞
⑥筛选抗生素错误 阳性对照
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无克隆或克隆数较少
假阳性率高
★★★ ★★ ★★
一步法克隆技术的疑难问题
★无条带,菌落PCR不含插入片段
有条带,大小不对
有条带,大小正确,测序错误
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2.假阳性率高
一步法克隆技术的疑难问题
★无条带,菌落PCR不含插入片段
有条带,大小不对
有条带,大小正确,测序错误
• 插入片段污染质粒:设置阴性对照
• 线性化片段污染质粒:设置阴性对照
• 序列同源性:不适合,换传统方法构建
• 非特异性扩增:提高特异性
• 插入片段污染模板质粒:设置阴性对照
• 插入片段加入量过大:设置以测序引物和基因特异性引物扩
增鉴定
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