为什么说基因克隆和 DNA 分析非常重要

19 世纪中叶， Gregor Mendel 通过分离规律和自由组合规律来解释生物性状的遗传现象。孟德尔定律是建立在这样一个基本假设下，即：生物体的每个可遗传的性状 (inherent properties ) 都是由细胞内以颗粒形式存在的遗传因子控制的，这种遗传因子后来被称为基因(gene) 。 Mendel 定律被重新发现，标志着遗传学（ Genetics ）的诞生，从此以后，理解并掌握这些控制遗传性状的基因的结构和功能就成为了这门学科前进的方向。

1.1 遗传学的早期发展

在最初的 30 年里，这门新出现的学科以令人吃惊的速度向前发展着： W. Sutton 首先于 1903 年提出了基因是定位于染色体 (Chromosome) 上的假设，随后这一假设得到了 T. H. Morgan 的实验证实；接下来， Morgan 和他的同事开发出了遗传作图 (Gene mapping) 技术，并通过这一技术于 1922 年取得了果蝇 (fruit fly) 对全部 4条染色体上的 2 000 多个基因相对位置的全面分析。

但是，除了这些经典遗传学研究所取得的辉煌成就外，直到 20世纪 40 年代，人们仍然没有认识到基因的分子本质。 Avery 等人 1944 年的转化实验，以及 Hershey 和 Chase 于 1952 年所做的实验使人们认识到脱氧核糖核酸是遗传物质。在 1952-1966 年的 14 年间是遗传学发展的第二个高峰，这一时期的成果是惊人的： DNA 的结构被精确地表述，遗传密码 (genetic code) 被破译、转录和翻译的过程也得到了阐明。

1.2 基因克隆和聚合酶链反应的出现

经过一段时间的活跃发展后，遗传学迎来了平静的发展时期。在 20世纪 60 年代的后几年，实验技术的精确性还不能对基因作更加细致的研究，这成为了当时遗传学发展最大的瓶颈。

然而，在 1971-1973 年这 3年里，遗传学又开始了新一轮的快速发展，这一切都归功于重组 DNA (recombinant DNA technology) 技术的出现，其核心就是基因克隆。由 DNA 重组技术发展而来的快速有效的 DNA测序技术使得基因的结构的确定成为可能，并且进一步发展为大规模基因组测序计划， 2000 年完成的人类基因组计划代表着基因组测序计划的最新成就。而由重 DNA 组技术发展而来的研究基因表达调控的方法，也使得分子生物学家了解到基因调控的失常可能会导致一系列人类疾病，如癌症。由重组 DNA 技术衍生出了生物工程学 (biotechnology) ，使得利用基因生产蛋白质及其他医药和工业过程所需的化合物变成了现实。

20 世纪 80 年代，出现了另一个同样新颖、同样革命性的实验技术。 1985 年的一天晚上， Kary Mullis在驾车沿着 California海岸线兜风时，灵机一动，发明了聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 。这项非常简单的技术，作为基因克隆的完美补充，在分子生物学发展上发挥了关键作用。相对于基因克隆的方法， PCR能够把困难的实验变得相对简单。它拓宽了 DNA 分析的研究范围，使得分子生物学在传统的应用领域如医学、农业、生物工程学之外找到了新的位置，就像分子生态学、生物分子考古学和 DNA法医学一样，很多新兴的学科伴随着 PCR的诞生而出现。

1.3 什么是基因克隆

基因克隆的实验步骤见图 1－ 1 。 (1) 一个包含所需目的基因的 DNA片段被插入到载体（ vector ） DNA 分子中，生产重组 DNA 分子。 (2)把载体导入受体细胞，通常是一个细菌，但也能够使用其他类型的细胞。 (3)载体在宿主细胞内增殖，产生大量同一拷贝，不仅包括载体本身的基因，也包括它所携带的外源基因。

(4)宿主细胞增殖时，重组 DNA 分子的拷贝转移到子细胞中，并且伴随载体的进一步复制。

(5) 在多次细胞分裂后，一个由相同细胞组成的细胞群（克隆）被产生出来，其中每一个细胞包含一个或多个重组 DNA 分子。

1.4 什么是 PCR

聚合酶链反应（ The polymerase chain reaction, PCR）是在体外利用与 DNA模板序列的两端互补的一对寡聚核苷酸 (oligonucleotide)引物来扩增一段 DNA序列。由一种热稳定的 DNA聚合酶经三步反应即变性、引物退火和聚合的循环来大量扩增引物之间的序列。 PCR实验的基本步骤如下： （ 1）反应混合物被加热到 94℃，在该温度下， DNA双螺旋两条链之间的氢键被打断， DNA 分子发生变性。

（ 2）混合物被冷却到 50～ 60 ℃ ，每个分子的两条双链能够在该温度下重新结合，但这种情况不大可能发生，因为混合物中大量的短 DNA 分子与长链 DNA分子在特殊的位点发生退火。这些短的 DNA 分子被称为引物。 （ 3）接着温度又被升高到了 74 ℃ 。这是 Taq DNA聚合酶的最适工作温度。 Taq DNA聚合酶延伸引物合成与模板互补的新链。这样与刚开始的两条链相比，我们就有了 4条 DNA链，实现了一次倍增。

（ 4）接下来温度又被升到 94 ℃ 。双链 DNA 分子又变性成为单链，于是便开始了第二轮变性－退火－合成的循环，并随之产生 8条 DNA链。在重复这一循环达 25次后，我们在反应开始时用到的双链 DNA 分子中就会有一段序列的拷贝数超过 5千万。至于是那个区段被扩增完全由退火时引物所处的位置决定的。

Each cyclecomprising

denaturation (95°C), 30 sec.annealing (55–60°C), 30 sec.extension (72°C),time depends on product size.

5’ 3’

5’3’

Double stranded DNA template

Region to be amplified

5’ 3’

5’3’

Double stranded DNA template

Design primers with this sequence information

Identical to this sequence

Reverse complement of this sequence

5’ 3’

5’3’

PCR CYCLE 1 Double stranded DNA template

Primers

Taq

Taq

5’

5’3’

3’

PCR CYCLE 1 Denaturation950Cstrands separate

Primers

Taq

Taq

Taq polymerase is thermostable

3’5’

5’3’

PCR CYCLE 1 Annealing~550CPrimers bind

Taq

Taq

Forward primer anneals to lower strandReverse primer anneals to upper strand

3’5’

5’3’

PCR CYCLE 1 Extension72oCTaq copies DNA strand

Taq

Taq

Taq synthesises DNA in the 5’ to 3’ direction

3’5’

5’3’

PCR CYCLE 1 Extension72oCTaq copies DNA strand

Taq

Taq

Taq synthesises DNA in the 5’ to 3’ direction

3’5’

5’3’

PCR CYCLE 1 Extension72oCTaq copies DNA strand

Taq

Taq

Taq synthesises DNA in the 5’ to 3’ direction

3’

5’

5’

3’

5’

3’

5’ 3’

PCR CYCLE 1 End cycle 1

3’5’

5’3’

5’

5’ 3’

3’

PCR CYCLE 2 Denaturation950Cstrands separate

3’5’

5’3’

5’

5’ 3’

3’

PCR CYCLE 2 Annealing~550CPrimers bind

PCR CYCLE 2 Extension72oCTaq copies DNA strand

PCR CYCLE 2

Two single strandsof correct length

PCR CYCLE 3Denaturation950C

PCR CYCLE 3Annealing550C

PCR CYCLE 3Extension 720C

Amplimer 1

Amplimer 2

1.5 为什么基因克隆和 PCR 如此重要

无论是基因克隆还是 PCR的实验步骤都相当的简单和容易掌握，可为什么这样简单的实验技术却在生物学研究中占有如此重要的地位呢？主要是这两项技术都可以给我们提供一种纯净的基因样品。

1.5.1 通过克隆对基因进行分离

在图中所要克隆的 DNA片段来源于一个由不同 DNA片段组成的混合物，这个混合物可以是一个有机体的全部 DNA序列。每个片段都会连接到不同的载体分子上，产生一个重组 DNA 分子家族，其中一个重组 DNA分子携带有我们所感兴趣的目的基因。通常情况下，每个宿主细胞只能被一个重组 DNA 分子所转化，因此每一个克隆所包含的是单一分子的多个拷贝，这样目的基因就从最初的混合物中与其他基因实现了分离，也就能够对它进行详细的结构和功能分析。

实际上，决定基因克隆实验是否成功的关键，在于能否从许许多多个克隆中鉴定出含有目的基因的克隆。我们将在第 8中讲解如何从大量的克隆中筛选出正确的基因克隆。

1.5.2 通过 PCR 对基因进行分离

PCR也能够被用来获得纯净的基因样品。如果引物退火的位点位于目的基因的两侧，那么目的基因的大量拷贝就会被合成出来，产生与基因克隆相同的效果。通过 PCR对基因进行分离的另一个好处是省去了筛选的步骤。 一次 PCR可以在数小时内完成，相对于基因克隆要方便得多，但是基因克隆仍然在被人们使用呢？这里我们就不得不提到 PCR的两个局限性：

（ 1）为了使引物能够在正确的位置上与模板 DNA 实现退火，我们必须清楚目的基因两端将要发生退火的位点的序列。在已知序列的情况下，合成引物是件很容易的事，但是如果不清楚要进行退火的位点的序列，就无法合成引物。这就意味着， PCR不可能用来对一些从未进行过研究的基因进行分离，而这就要用到基因克隆技术。

（ 2）利用 PCR进行扩增的 DNA序列在长度上受到一定的限制。 5 Kb的片段通常能够利用 PCR进行有效的扩增，而用 PCR 扩增长度达到 40 Kb的片段是非常困难的。但是， 40 Kb对于许多基因来说还是太短了，尤其是对于人类和其他哺乳动物的一些基因。如果要分离一个长的基因的完整拷贝，就必须使用克隆技术。

因此，基因克隆是分离长的或从未进行过研究的基因的惟一方法。但是 PCR仍还有许多重要的应用。在很多情况下需要对已知序列的基因进行分离和探测。比如，人体珠蛋白基因的 PCR可被用来检测可能会导致地中海贫血的基因突变。为这个 PCR设计引物是一件很简单的事，因为人类珠蛋白基因的序列是已知的。在 PCR 完成之后，就可以利用其他方法对基因拷贝进行测序或做进一步研究，以判断导致地中海贫血的基因突变。 PCR的另一临床应用是致病病毒 DNA 的检测，PCR的灵敏度极高，可以在感染的最初阶段将其检测出来。

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e, crack, lull, anticlimax, gear, archaeology, forensics, ab

erration, chimera, vehicle, clone, denature, oligonucleoti

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bases, globin,