VACUNAS

Papel central: preparar al sistema inmune, a fin de que su respuesta resulte vasta y oportuna cuando el individuo sea invadido por el agente patógeno correspondiente o afectado por sus respectivas toxinas

VACUNAS

• Es segura • Desencadena una vasta respuesta

con dosis mínimas del Ag • Es estable • No requiere refrigeración para su

almacenamiento o traslado • Su administración es sencilla • Es económica • No presenta efectos

adversos • Es polivalente

LA VACUNA IDEAL

Se clasifican con base en las características de los inmunógenos que las conforman:

Las constituidas por microorganismos

inactivados

Las conformadas por microorganismos atenuados

Las diseñadas con subunidades (moléculas aisladas pertenecientes al agente causal)

Las fabricadas mediante ingeniería genética (“vacunas de la tercera generación”)

VACUNAS

• La obtención y preparación del Ag debe involucrar procedimientos “sencillos y seguros” (cultivos, síntesis química o molecular)

• El Ag debe funcionar como buen inmunógeno y, en especial, inducir una respuesta inmune de memoria, dependiente de linfocitos T

VACUNAS

• Se utiliza al microorganismo completo

• El proceso de inactivación se realiza vía tratamientos físicos o químicos que no alteran la inmunogenicidad de las determinantes antigénicas correspondientes

• Su eficacia es limitada, ya que la inmunidad generada sólo es humoral, y resulta menos intensa y duradera

• Se requieren grandes cantidades del Ag, lo que impacta negativamente en el aspecto económico

• Pueden ocasionar efectos adversos relacionados con endotoxinas de las bacterias Gram negativas

Vacunas de μo inactivados

Inducen inmunidad imitando la infección

El μo se reproduce naturalmente, presentando sus Ags

Propician una efectiva, vasta y duradera respuesta inmune humoral y celular, sin que ocurra la enfermedad

Pueden ser polivalentes

Implican un riesgo potencial de que la virulencia se revierta y, por lo tanto, que se reduzca su seguridad

Vacunas constituidas por μo vivos atenuados

• Influyen los costos de almacenamiento y conservación: se deben mantener a 4°C para preservar su viabilidad y eficacia

• Involucran la posibilidad de que, durante la atenuación, el μo afecte al personal del laboratorio o de que el producto en elaboración se contamine con agentes virales

• Las dificultades asociadas a la atenuación y la reversión de la virulencia dejarán de representar un problema con la detección-deleción de los genes que codifican para factores de patogenicidad

Vacunas constituidas por μo vivos atenuados

Sustento: No hay desviación de la respuesta inmune

Vacunas de subunidades

• Se les denomina así por estar conformadas con una parte definida de los microorganismos (por ejemplo, la cápsula) o de sustancias excretadas por ellos

• Incluyen polisacáridos, proteínas o péptidos, elaborados frecuentemente mediante la tecnología del DNA recombinante o por síntesis química

• Su desventaja reside en la posible carencia de complejidad estructural, la cual se traduce en menor inmunogenicidad

• La cápsula bacteriana es uno de los factores de virulencia más importantes, pero la mayoría sólo está

compuesta por monosacáridos o polisacáridos

• La baja inmunogenicidad de los polisacáridos se ha superado uniéndolos a proteínas transportadoras: “vacunas conjugadas”.

Éstas promueven una inmunidad celular con linfocitos T de memoria, así como una vasta respuesta humoral

Vacunas de subunidades

Las dirigidas contra:

H. influenzae tipo b (Hib), 5 serotipos de meningococos y 7 a 11 serotipos de S. pneumoniae,

han resultado exitosas; empero, son sólo parcialmente efectivas en niños < 2 años

Vacunas de subunidades

• Estudios en modelos animales han demostrado ampliamente su eficacia aunque, por razones aún indeterminadas, los resultados no se han podido reproducir en humanos

• Se intenta superar esas limitaciones, vía:

La optimización de los sistemas de liberación

La variación de las vías de administración

La potenciación de la expresión del Ag implicado El establecimiento de mejores esquemas de

inmunización El empleo de adyuvantes apropiados

Vacunas de DNA Generalidades

Cuando el producto es ino- culado se pretende que:

• Ocurra la transfección hacia diferentes células del hospedero

• El DNA exógeno alcance el núcleo “blanco”, en donde tendría lugar la transcrip-ción bajo la influencia de la RNA pol II

Vacunas de DNA

• Transfección de APCs, para que éstas presenten el Ag a los linfocitos T: Las DCs, Mø y linfocitos B producirán directamente el Ag, lo procesarán y lo presentarán a linfocitos T, vía el MHC-II y, eventualmente, el MHC-I

Vacunas de DNA Su manejo dentro del hospedero

• Transfección de céls somáticas (miocitos, queratinocitos y céls epiteliales)

Presentación cruzada. Las céls somáts sintetizan el Ag y lo secretan para que sea endocitado por APCs y lo procesen y presenten dando origen a la respuesta inmune adaptativa

El Ag no liberado es procesado en el proteasoma y presentado, vía el MHC-I, a céls T CD8+. Así, las céls somáticas serán destruidas y liberarán al Ag restante, para su captación por APCs

Un plásmido suele constituir el vehículo transportador del gen que codifica para el inmunógeno; proviene de alguna bacteria inocua (E. coli), o bien, es producto de técnicas de ingeniería genética y se puede adquirir comercialmente

Sólo los plásmidos menores de 15 kilobases se asocian a elevados índices de transformación bacteriana y a tasas convenientes de transfección en las células “blanco” de los individuos vacunados

Vacunas de DNA Componente indispensable

a) Para su replicación en bacterias

• El origen bacteriano de replicación. Útil para que el plásmido se pueda replicar en bacterias, generándose múltiples copias

b) Para la identificación de las céls bacterianas clonadas

• Marcadores de selección: genes de resistencia a antibióticos, los cuales facilitan la selección de las colonias bacterianas que han adquirido el plásmido

Vacunas de DNA Componentes del plásmido

• El promotor eucariótico. Es el sitio de unión para la RNA pol II. De él depende que inicie la transcripción en células de mamíferos. Los más usados son virales: el del HCMV origina altos niveles de expresión génica

• Secuencia de DNA que codifica para el Ag de interés. Indispensable para prevenir padecimientos. Se inserta en el “sitio de clonación”, corriente arriba del promotor

• Secuencias finalizadoras de la transcripción. Garantizan que el mRNA sea terminado apropiadamente; destacan las poli A derivadas del virus SV40

Lipofectamina • Secuencias inmunoestimulatorias. PAMPs. destacan

dinucleótidos no metilados: motivos CpG (citosina-fosfato-guanina) flanqueados por dos purinas en la posición 5’ y dos pirimidinas en la 3’ (útiles en transfección de APCs)

Vacunas de DNA Componentes del plásmido

Vacunas de DNA. Plásmidos

Gen del

Gen de Resistencia a Ampic

ORI

Motivos CpG

Señal de termi- nación (SV40)

Gen que codifi- ca para el Ag bacteriano de interés

Promotor eucarionte (CMV)

Obtención del gen microbiano de interés

BamHI (G GATCC) BamHI

Gen de interés

Gen de interés

Clonación del vector

ligasas

ligasas

ligasas

BamHI

Gen de interés Plásmido en construcción

BamHI

… …

Clonación del vector

+

Pretreated with BamH1

Incub 48 h Sembrar en placa

Selección de colonias clonadas

incubación

Ca++ / 42°C, 30 seg Shock térmico = poros en PC

• Intradérmica (i.d.) • Intramuscular (i.m.) • Intravenosa (i.v.) • Intranasal (i.n.) • Oral • Vaginal

Vacunas de ADN Vías de administración

Vacunas de DNA Manejo por el hospedero

Vacunas de DNA Manejo por el hospedero

No se insertan en el genoma del hospedero, ya que de lo contrario podrían activar oncogenes o inactivar genes supresores de tumores (p53) –se estima que dicha inserción ocurre sólo una vez por cada millón de células transfectadas–

No originan defectos genéticos heredables, por integrarse a las células germinales

No desencadenan la producción de Acs anti-DNA responsables de provocar o acelerar el desarrollo de enfermedades autoinmunes

Vacunas de DNA Es indispensable comprobar que:

Virus: HIV, herpes simplex, herpes bovino, HCMV, ébola, hepatitis B, hepatitis C, influenza (flu), sarampión, rabia y rotavirus

Bacterias: Mycoplasma pulmonis, Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Bacillus anthracis, ECET, Salmonella sp, Rickettsia, Yersinia enterocolytica y Listeria monocytogenes

Parásitos: Leishmania major, Plasmodium yoelii, Plasmodium falciparum, Schistosoma japonicum y Entamoeba histolytica

Otros: toxina tetánica, alergias y cánceres

Vacunas de DNA Probables aplicaciones futuras

El principal competidor de las vacunas también reside en la propia industria farmacéutica: los antibióticos, cuya comercialización representa para las empresas productoras una opción más interesante desde el punto de vista económico, a pesar del serio riesgo para la salud pública que significa la propagación de la multirresistencia bacteriana

Vacunas de ADN Obstáculo a vencer

Biotecnología y proteínas

recombinantes

1. Obtención del gen ¿eu o procarionte? de interés

2. Inserción del gen en el vector

3. Transformación de la bacteria o levadura que producirá la proteína

4. Selección de la cepa transformada (productora)

5. Proceso de producción

6. Extracción de la proteína recombinante

7. Purificación del producto

8. Formulación

Producción de proteínas recombinantes

Producción de proteínas recombinantes humanas

Obtención del gen eucarionte de interés

7-methylguanosine-phosphate

Proteínas recombinantes Gen eucarionte de interés

Isopropanol

Cloroformo-fenol

Ac. nucleicos

1. DNAsa 2. proteinasa K

Proteínas recombinantes

Vector

Promotor procariote

Gen de la proteína a producirse (cDNA si es humana)

Señal de Terminación

Ori

Resistencia a Antibióticos

(Ampic)

Producción de la proteína recombinante

Recuperación de la proteína recombinante

Producción de proteínas Gen de interés

cDNA

Proteínas recombinantes

Baja en plasminógeno es trombogénico Hemofilia Eritropoyesis (GR) MG-GSF Detergentes (subtilisina proteasa) Quesos

Bacterium

CRISPRs: clustered regularly

interspaced short palindromic repeats

CRISPRs: clustered regularly

interspaced short palindromic repeats

=

2nd infection