Primenjena enzimologija1a. Istraivake laboratorije 1b. Industrija 2. Klinike laboratorije

Kliniki aspekti enzimologije

Odredjivanje enzimskih aktivnosti za kliniku dijagnostikuEnzim bi trebalo da bude prisutan u krvi, urinu, ili nekom lako dostupnom tkivnom fluidu. Enzimski test bi trebalo da bude jednostavan. Razlike u enzimskoj aktivnosti izmedju normalnog i patolokog stanja bi trebalo da budu dijagnostiki znaajne, uz dobru korelaciju izmedju enzimske aktivnosti i patolokog stanja. Poeljno je i da je enzim dovoljno stabilan. Enzimi su prisutni u krvi kao: plazma-specifini enzimi (npr. prokoagulanti i fibrinolititiki enzimi); plazma-nespecifini enzimi (npr. sekretorni i intracelularni enzimi).

Ne-funkcionalni enzimi plazmeZa kliniku hemiju su posebno znaajne promene u aktivnosti onih enzima u plazmi koji su intracelularni i normalno prisutni u krvi u niskoj aktivnosti.Oslobaanje ("curenje") ovakvih enzima u krv ukazuje na oteenja elija (elijsku smrt, hipoksiju, unutarelijsku toksinost).

Merenjem promena u aktivnosti ovih enzima mogue je utvrditi lokaciju i prirodu patolokih promena na tkivima.Organo-specifinost "nefunkcionalnih" enzima nikada nije apsolutna!

Informacije koje se mogu dobiti praenjem enzimske aktivnosti u krvnoj plazmi:1. 2. 3. inicijalna dijagnostika; praenje toka bolesti; praenje odgovora pacijenta na tretman.

Idealno je pratiti aktivnost enzima koji je visoko tkivno-specifian (kisela-fosfataza u prostati, ili acetil-holinesteraza u eritrocitima). Neki enzimi imaju tkivno-specifine izoenzimske forme (laktat-dehidrogenaza) koje je mogue razlikovati elektroforezom.

ta su izoenzimi ? ta imaju zajedniko ? Po emu se razlikuju ?Izoenzimi su razliite forme istog enzima. Katalizuju isti tip hemijske reakcije. Razlikuju se po strukturi, aktivnosti, Km, fizikim svojstvima (npr. otpornost na denaturaciju toplotom), ekspresiji u razliitim elijama i tkivima (vano za kliniku enzimologiju!!!) i u elektroforetskom profilu.

Enzimi ija se aktivnost u plazmi rutinski odreujeIme enzima:Aspartate Amino transferase Alanine Amino transferase Serum glutamate-oxaloacetate transaminase Serum glutamate-pyruvate transaminase Alkaline Phosphatase Acid Phosphatase glutamyl Transferase Creatine kinase Lactate Dehydrogenase Amylase

Prisutan u:Heart and Liver Heart and Liver

Bone, intestine and other tissues Prostate Liver Muscle including cardiac muscle Heart, liver, muscle, RBC Pancreas

Laktat dehidrogenaza (LDH)(anaerobna glikoliza; Korijev ciklus u jetri)

Funkcionalni enzim je tetramerni protein izgraen od dva tipa subjedinica (H=Heart, M=skeletal muscle) Postoji u 5 razliita izoenzimska oblika (razliite kombinacije H i M subjedinica) Jako poveana (ukupna) aktivnost LDH u serumu nakon infarkta miokarda. Serumski LDH povean i kod kancera, meningitisa, encefalitisa, akutnog pankreatitisa i HIV-a.

Odreivanje enzimske aktivnosti pri postavljanju klinike dijagnoze

Klinika enzimologija bolesti jetreAlkalna fosfataza (AP) Aspartat aminotransferaza (SGOT), alanin aminotransferaza (SGPT), i glutamiltransferaza (GTT). Laktat dehidrogenaza i izocitrat dehidrogenaza. Ornitin karbamoiltransferaza. Oboljenja jetre: hepatitis (viralni ili toksini), ciroza, primarni i sekundarni tumori jetre, obstrukcija une kese... /akutna, intermitenta, ili hronina stanja/ Aktivnost aminotransferaza, tj. odnos SGOT i SGPT Alkalne fosfataze su prisutne u jetri i kostima, izoenzimske forme...

Klinika enzimologija bolesti jetreAlkalna fosfataza (AP) katalizuje deforforilaciju razliitih molekula.

Aktivnost AP je praena merenjem hidrolize p-nitrofenil fosfata.

Transferaze: enzimi koji katalizuju transfer neke funkcionalne grupe.Aktivnost -glutamiltransferaze (GTT) je praena merenjem intenziteta otputanja p-nitroanilina, kada se -glutamil-p-nitroanilid upotrebljava kao jedan od supstrata. p-nitroanilin apsorbuje na 400 nm.

AP/SGPT odnos...-glutamiltransferaza: hronini alkoholizam (ciroza jetre), metastaze...

Merenje transaminaza je korisno za dijagnostiku bolesti jetreAminotransferaze (transaminaze) su unutarelijski enzimi koji katalizuju prenos amino grupe sa aminokiseline na -ketokiselinu, pri emu iz ketokiseline nastaje aminokiselina.Alanin transaminaza (ALT) i aspartat transaminaza (AST) su najzastupljeniji u jetri i njihova aktivnost u serumu raste kao rezultat curenja iz oteenih elija.

Virusni hepatitis: veoma brz porast nivoa transaminaza (20-50 puta u odnosu na normalni nivo) u serumu pre porasta nivoa bilirubina.

Kreatin kinaza (CK)Creatine + ATP phosphocreatine + ADP(Fosfokreatin slui kao rezerva energije tokom kontrakcije miia)

Kreatin kinaza je dimer, sastavljen od dva monomera Skeletni miii sadre M, a mozak B (Brain) subjedinicu Tri razliite izoforme CK mogu da se formiraju Poveana aktivnost CK-2 (MB) u akutnom infarktu miokarda

Klinika enzimologija bolesti srcaKreatin kinaza (izoforme, osim CK-3 (MM tip) iz skeletnih miia, ima i oko 15 % CK-2 (MB tip) izoforme), SGOT i laktat dehidrogenaza (takodje se prati izoenzimski profil). SGOT/SGPT u miokardu je 20-25, a u jetri 3-5! Medjutim, CK i GT su precizniji pokazatelji.

-Amilaza Pankreas i pljuvane lezde Akutni pankreatitis (20-30 puta) Hronini pankreatitis ili karcinom pankreaza malo povien nivo. Zbog niske Mm (49 kD) moe se detektovati i u urinu (kao i uropepsinogen). Kreatin-kinaza i fruktozo-bisfosfat aldolaza Oboljenja skeletnih miia (distrofije), izoenzimkski profil CK Alkalna fosfataza Veliki broj izoformi. Nalazi se u velikom broju tkiva: intestinalni epitelijum, bubrezi, kosti, leukociti, jetra i placenta. Tri tipa: placentalni (termostabilan), intestinalni i iz drugih tkiva. Kisela fosfataza Nalazi se u velikom broju tkiva: jetra, slezina, eritrociti i prostata. Vaan za dijagnostiku kancera prostate. Veoma je labilan, kontaminacija usled lize eritrocita (inhibicija tartaratom i formaldehidom). Prostatini enzim je veoma specifian za timoftalein fosfat.

Otkrivanje & znaaj enzimske deficijencije (nedostatka)Za detekciju oboljenja se redje koriste enzimski testovi: detektuju se metaboliti (fenilketourija se detektuje merenjem fenilpiruvata u urinu ili krvi). Neke urodjene (genetske) greke u metabolizmu su relativno nekodljive (albinizam, alkaptonurija), ali se druge moraju rano detektovati da bi se tetni efekti defekata spreili na vreme (npr. fenilketourija i galaktozemija).

Otkrivanje & znaaj enzimske deficijencije

Kod fenilketonurije nedostaje enzim fenilalanin-4-monooksigenaza koji katalizuje reakciju:

Zbog toga se Phe razgradjuje putem minornog mehanizma preko gradjenja fenilpiruvata.

Akumulacija fenilalanina vodi do modanih oteenja i progresivne mentalne retardacije.

Kod galaktozemije deficijentni enzim je galaktozo-1-fosfat uridiltransferaza.

Ovaj enzim je prisutan u brojnim tkivima, ukljuujui eritrocite. Detektuje se testom liziranim eritrocitima.Zbog nedostatka ovog enzima ne moe da se iskoristi galaktoza iz mleka, to je ranije dovodilo do smrti novoroenadi.

na

Najea urodjena bolest koja deluje na eritrocite je deficijencija glukozo-6-fosfat dehidrogenaze. Manifestuje se kao hemolitika anemija indukovana sniavanjem nivoa glutationa (nakon tretmana lekovima koji inhibiraju ovaj enzim koji je prisutan u veoma malim koncentracijama). Sniava se intracelularna koncentracija NADPH koji je neophodan za redukciju oksidovanog glutationa.

Primaquine (antimalarik)

Drugi primer osetljivosti na lekove koja je povezana sa urodjenom deficijencijom je u sluaju serum holinesteraze (pseudoholinesteraza). Sukcinil holin (miini relaksant) u sluaju deficijencije pseudoholinesteraze se ne razgradjuje normalno i daleko due deluje nego kod normalnih subjekata. Ovaj enzim kod deficijentnih osoba ima daleko viu Km za sve testirane supstrate nego normalna forma ovog enzima.

Local anesthetic

Upotreba enzima za odreivanja koncentracije metabolita od klinikog znaajaMetabolit se enzimski transformie u proizvod ija koncentracija se odredjuje spektrofotometrijski. Visoka specifinost enzima omoguava odredjivanje metabolita u prisustvu brojnih drugih supstanci u urinu ili serumu. Kuplovane reakcije omoguavaju pomeranje ravnotee na desno, tj. u povoljnom smeru. Takodje, mogue je i hemijski ukloniti proizvod enzimske reakcije.

Merenje enzimske aktivnosti: kuplovani esejiPrisustvo inhibitora i aktivatora utie na merenje aktivnosti enzima od interesa. Stoga se njihova aktivnost odreuje tzv. kuplovanim esejima, gde se drugi enzim koristi da deluje na proizvod enzimom katalizovane reakcije od primarnog interesa.

Drugi (trei u nizu) enzim obino: 1. koristi NADH kao koenzim; 2. je neka peroksidaza.

Upotreba enzima radi odreivanja koncentracije metabolita od klinikog znaaja

2-oksoglutarat ili 2-ketoglutarat (kljuni intermedijer u Krebsovom ciklusu!!!) reaguje sa hidrazinom:

-Ketoglutarat se prodaje kao dijetetski suplement za bodibildere.

Odreivanje glukoze u krviDijabetes je najei endokrini poremeaj metabolizma ugljenih hidrata. Razliite vrste enzimskih kitova za odreivanje glukoze:

Biosenzori za glukozu...

Mokrana kiselinaMokrana kiselina se stvara kao produkt katabolizma purinskih nukleotida.

Visoka koncentracija mokrane kiseline u krvi moe dovesti do gihta (jedan tip artritisa).

Urea (karbamid)Urea ima esencijanu ulogu u metabolizmu jedinjenja koja sadre azot u kod ivotinja... krajnji proizvodmetabolizma proteina. BUN blood urea nitrogen!

Poviena koncentracija uree u serumu je kod bolesnika koji imaju smanjenu funkcionalnu sposobnost bubrega i kojih je poveana razgradnja proteina (groznica, nekroza) u organizmu.

Holesterol & trigliceridiPovean sadraj holesterola u cirkulacije je primarni faktor rizika za razvoj kardiovaskularnih bolesti (ateroskleroza). Najvei deo holesterola u serumu (u sastavu lipoproteina) je esterifikovan.

Merenje nivoa serumskih triglicerida u plazmi i serumu je korisno pri praenju toka dijabetesa, nefroza i obstrukcije ui. Merenje se moe vriti i enzimski, obino nakon alkalne hidrolize triglicerida, preko odreivanja osloboenog glicerola.

Ostali metaboliti...

http://www.youtube.com/watch?v=70TPrfL_8-M&feature=relmfu http://www.youtube.com/watch?v=RRbuz3VQ100&feature=relmfu