Università di Modena e Reggio Emilia MicroRNA and Lung Cancer CLINICA DI MALATTIE DELLAPPARATO...

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MicroRNA and Lung CancerMicroRNA and Lung Cancer

CLINICA DI MALATTIE DELL’APPARATO CLINICA DI MALATTIE DELL’APPARATO RESPIRATORIORESPIRATORIO

Università degli Studi di Modena e Reggio EmiliaUniversità degli Studi di Modena e Reggio Emilia

Journal ClubJournal Club


CLINICA DI MALATTIE DELL’APPARATO RESPIRATORIO

Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia

MicroRNA and Lung Cancer

Matthias Eder, Michaela Scherr

New Engl J Med 2005; June 9; 23:2446-2448



• RAS e tumore polmonareRAS e tumore polmonare

• microRNA: definizione e funzionemicroRNA: definizione e funzione

• Ruolo dei microRNA nel tumore polmonareRuolo dei microRNA nel tumore polmonare

LA TRASFORMAZIONE NEOPLASTICALA TRASFORMAZIONE NEOPLASTICA

OncogeniOncogeni

OncosoppressoriOncosoppressoriOnOn

OffOff OncosoppressoriOncosoppressori

OncogeniOncogeni

OffOff

OnOn

1)1) Mutazioni puntiformiMutazioni puntiformi

2)2) Amplificazione genicaAmplificazione genica

3)3) Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche

4)4) delezionidelezioni

ONCOGENE: carattere dominanteONCOGENE: carattere dominante

ONCOSOPPRESSORE: carattere recessivoONCOSOPPRESSORE: carattere recessivo

Chronology of genetic and molecular lesionsChronology of genetic and molecular lesions

C.Brambilla; Eur Respir J 2003; 21 Suppl.39, 36s-44sC.Brambilla; Eur Respir J 2003; 21 Suppl.39, 36s-44s

Normal Hyperplasia Metaplasia Dysplasia ISC CarcinomaNormal Hyperplasia Metaplasia Dysplasia ISC Carcinoma

3p-3p-

9p-9p-

17p-17p-

AneuploidyAneuploidy

P53 mutP53 mut

Ras mutRas mut

Telomerase + FHITTelomerase + FHIT

RbRb

MAJOR MOLECULAR ALTERATIONS IN LUNG CANCERMAJOR MOLECULAR ALTERATIONS IN LUNG CANCER

Proto-oncogenes and growth stimulation

Putative autocrine loops GRP/GRP receptor HGF/MET

SCF/KIT NDF/ERBB

RAS mutation <1 15-20

MYC amplification 15-30 5-10

Other molecular changes

BCL-2 expression 75-95 10-35

Telomerase activity 100 80-85

SCLC (%) NSCLC (%)

Clinics in chest medicine, march 2002 vol.23; n1:83

Codifica per 3 proteine di 21-kD (H-Ras, N-Ras, K-Ras) che allo stato attivo Codifica per 3 proteine di 21-kD (H-Ras, N-Ras, K-Ras) che allo stato attivo legano GTP e allo stato inattivo legano GDPlegano GTP e allo stato inattivo legano GDP

Ruolo di GTPasi intrinseca a ras (p21 ) nel ritorno allo stato di Ruolo di GTPasi intrinseca a ras (p21 ) nel ritorno allo stato di quiescenza della proteinaquiescenza della proteina

Attivazione dell’oncogene K-ras mediante mutazione puntiforme al codone Attivazione dell’oncogene K-ras mediante mutazione puntiforme al codone 12 (occasionalmente: 13 e 61) avviene nel 30% degli adenocarcinomi del 12 (occasionalmente: 13 e 61) avviene nel 30% degli adenocarcinomi del polmonepolmone

La mutazione è correlata all’abitudine tabagicaLa mutazione è correlata all’abitudine tabagica

Am J Respir Crit Car Med vol 161.pp 1355-1367, 2000

RASRAS

rasras

MUTAZIONE DI KRAS MUTAZIONE DI KRAS

Inactive KRAS

active KRAS

Inactive KRAS

GDPGDP

GTPGTPGDPGDP

GAP

Downstream signal transduction cascadeDownstream signal transduction cascade

++

Mutant Mutant KRAS KRAS activeactive

++

GTPGTP

GAP

Drugs that block specific downstream signals

Drugs that inhibit mutant KRAS expression or

function

Clinics in Chest Medicine , march 2002 Vol 23 n°1:83

Ras e stimoli proliferativiRas e stimoli proliferativi

RasRas

PDGFRPDGFR EGFREGFR

AF-6AF-6 RGLRGL PI3KPI3K RafRaf Rin1Rin1 MekkMekk Nore1Nore1

Gap JunctionsGap Junctions PLDPLD AktAkt MAPKMAPK BCRBCR JNKJNK ??

Effetti biologiciEffetti biologici

IntegrineIntegrine

GPCRGPCR

IL-2RIL-2R

Cellular Signalling 2000; 12: 425-434Cellular Signalling 2000; 12: 425-434

Mutazione di K-RAS identificata in circa il 30% degli adenocarcinomi Mutazione di K-RAS identificata in circa il 30% degli adenocarcinomi polmonaripolmonari

Associata a riduzione della sopravvivenza nei pazienti affetti da neoplasia Associata a riduzione della sopravvivenza nei pazienti affetti da neoplasia polmonare NSCLCpolmonare NSCLC

la presenza di mutazione di K-RAS è associata a resistenza al trattamento la presenza di mutazione di K-RAS è associata a resistenza al trattamento con gefitinibcon gefitinib

Journal of Clinica Oncol 2005;23:3227-3234

RASRAS

MicroRNAMicroRNA


• Piccoli frammenti di RNA (lunghezza 21-25 nucleotidi) non codificanti

• Regolazione negativa della trascrizione genica mediante ibridazione a sequenze complementari nella regione 3’ (3’UTR) del mRNA target

• Meccanismo simile nelle piante e negli animali

• Alcuni miRNA sono alterati nelle neoplasie

MicroRNA: sintesiMicroRNA: sintesi

RISC: RNA-induced silencing complex

Nature 2005;435:745-746


Interazione tra microRNA e mRNA targetInterazione tra microRNA e mRNA targetJournal of Cell Biology 2002; 156:17-21

Cell 2004; 116:281-297

Funzione dei microRNAFunzione dei microRNA

RISCRISC

RISCRISC3’ UTR mRNA3’ UTR mRNA 3’ UTR mRNA3’ UTR mRNA

Clivaggio Clivaggio dell’mRNAdell’mRNA

Inibizione della Inibizione della trascrizione trascrizione

proteicaproteica

microRNAmicroRNA

microRNAmicroRNA

Copyright ©2004 by the National Academy of Sciences

Calin, George Adrian et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2999-3004

Fig. 1. Correlation between FRAs and miRs

Sito fragile:regione cromosomica soggetta a rottura spontanea o indotta

Copyright ©2004 by the National Academy of Sciences

Calin, George Adrian et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2999-3004

Fig. 3. MiRs as cancer players


Let-7Let-7

• lethal-7 (let-7) è un membro della famiglia dei miRNAlethal-7 (let-7) è un membro della famiglia dei miRNA

• La mutazione di let-7 non permette l’uscita dal ciclo La mutazione di let-7 non permette l’uscita dal ciclo cellulare comportando divisione delle cellule in modelli cellulare comportando divisione delle cellule in modelli sperimentali sperimentali

• Nell’uomo sono stati identificati geni codificanti per Nell’uomo sono stati identificati geni codificanti per let-7 che mappano regioni delete nelle neoplasielet-7 che mappano regioni delete nelle neoplasie

• la iperespressione di let-7 ha inibito la cerscita di linee la iperespressione di let-7 ha inibito la cerscita di linee cellulari di tumore polmonarecellulari di tumore polmonare


microRNA e tumore polmonaremicroRNA e tumore polmonare

• Takamizawa J. Takamizawa J. Reduced expression of the let-7 Reduced expression of the let-7 microRNA in human lung cancer in association with microRNA in human lung cancer in association with shortened postoperative survivalshortened postoperative survival. Cancer Res 2004; . Cancer Res 2004; 64:3573-375664:3573-3756

• Johnson SM. Johnson SM. RAS is regulated by the let-7 microRNA RAS is regulated by the let-7 microRNA family.family. Cell 2005;120:635-647 Cell 2005;120:635-647

Analisi della espressione di let-7 nel tumore polmonareAnalisi della espressione di let-7 nel tumore polmonare

Northen blot in linee cellulari di neoplasie polmonari

Northen blot in neoplasie polmonari in vivo

HNLEC = human normal lung epithelial cell lines

20 linee cellulari di neoplasia polmonare

5S rRNA = controllo

Takamizawa J; Cancer Reesearch 2004; 64:3753-3756Takamizawa J; Cancer Reesearch 2004; 64:3753-3756

Sopravvivenza di NSCLC in base all’espressione di let-7Sopravvivenza di NSCLC in base all’espressione di let-7

143 NSCLCReal-Time Reverse Transcription-PCR

Hierarchical ClusteringcDNA primer

cDNA primer

105 adk

Takamizawa J; Cancer Reesearch 2004; 64:3753-3756Takamizawa J; Cancer Reesearch 2004; 64:3753-3756


microRNA e tumore polmonaremicroRNA e tumore polmonare

• Takamizawa J. Takamizawa J. Reduced expression of the let-7 Reduced expression of the let-7 microRNA in human lung cancer in association with microRNA in human lung cancer in association with shortened postoperative survivalshortened postoperative survival. Cancer Res 2004; . Cancer Res 2004; 64:3573-375664:3573-3756

• Johnson SM. Johnson SM. RAS is regulated by the let-7 microRNA RAS is regulated by the let-7 microRNA family.family. Cell 2005;120:635-647 Cell 2005;120:635-647

LA PRESENZA DI let-7 INFLUENZA LA ESPRESSIONE DI RAS

Cellule HeLa let-7 + transfettate con oligonucleotidi antisenso inibenti

Quantificazione della immunofluorescenza di RAS

Cellule HepG2 trasfettate con let-7

Quantificazione della immunofluorescenza di RAS

Controllo negativo

Controllo negativo


let-7 E’ SCARSAMENTE ESPRESSO NEL TUMORE POLMONARE

NAT: normal adjacent tissue

Northen blot

20 neoplasie:polmone, colon,mammella

3 Ca squamocellulari

Eder, M. et al. N Engl J Med 2005;352:2446-2448

MicroRNA-Mediated Regulation of RAS Expression in Caenorhabditis elegans and Humans


MicroRNA and Lung Cancer:MicroRNA and Lung Cancer:

ConclusioniConclusioni

• MicroRNA hanno ruolo fondamentale nella regolazione della MicroRNA hanno ruolo fondamentale nella regolazione della espressione proteicaespressione proteica

• let-7 è in grado di inibire la trascrizione di RASlet-7 è in grado di inibire la trascrizione di RAS

• Nel tumore polmonare è presente una ridotta espressione di Nel tumore polmonare è presente una ridotta espressione di let-7let-7

• L’assenza di let-7 si associa ad una iperespressione di RAS e L’assenza di let-7 si associa ad una iperespressione di RAS e ad un peggioramento della prognosi nel tumore polmonaread un peggioramento della prognosi nel tumore polmonare

• Possibilità di terapia genica in futuro?Possibilità di terapia genica in futuro?



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MicroRNA AND Lung CancerMicroRNA AND Lung Cancer


RUOLO DELLA FARNESILTRANSFERASI NELLA RUOLO DELLA FARNESILTRANSFERASI NELLA ATTIVAZIONE DI RASATTIVAZIONE DI RAS

CANCER RESEARCH 63, 5656-5668, september 15; 2003CANCER RESEARCH 63, 5656-5668, september 15; 2003

Cell Cell MembraneMembrane

RAS CAAX RAS CAAX

RAScc

AAX

COCHCOCH33COCHCOCH33COCHCOCH33Lys lysLys lys

K RAS

N RAS

H RAS

PTIPTICompetitive inhibitor of Competitive inhibitor of

prenyltransferaseprenyltransferaseP-P Prenyltransferase + P-P Prenyltransferase + isoprenyl-pyrophosphateisoprenyl-pyrophosphate

Isoprenyl groupIsoprenyl group

Proteolysis Proteolysis (Rce-1)(Rce-1)

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