Effects of light intensity and phosphate supply on algal density and growth of Dunaliella viridis.

García-Gutiérrez Ana.1.

1 University of Málaga, Faculty of Sciences, 0617514422@alu.uma.es

Resumen. Dunaliella es un tipo de micro-alga holafila que puede encontrarse con facilidad en lagos poco profundos y ambientes hipersalinos conocida por su actividad antioxidante y su capacidad de producir gran cantidad de carotinoides (Wikfors & Ohno, 2001). El crecimiento de cultivo de las algas puede ser monitorizado en función de la turbidez y medidas sobre la deflacción de la luz (Borowitzka 1992, Hosseini & Shariati 2009). Cuando el número de células aumenta en la solución, esta, se vuelve cada vez más turbia debido a que la luz que pasa a través de ella es dispersada por las partículas en suspensión presentes. Los organismos fotosintéticos como las algas pueden también ser monitorizados midiendo la producción de clorofila. Independientemente del tipo, la clorofila es una molécula que puede ser detectada por absorbancia (Lichtenhaler 1977). En el presente estudio se prepararon varios cultivos experimentales de Dunaliella Viridis y se realizaron mediciones durante un periodo de 12 días de su tasa de proliferación celular, producción de clorofila (a y b) y de β-caroteno, entre otras medidas, que se estudiaron en condiciones de baja irradiancia (50 mmol m² s¹) y alta irradiancia (500 m² s¹ mu mol), con y sin limitación de Fosfato. Al termino del experimento, y visto los resultados, concluimos que la irradiancia no es un factor clave en la tasa de crecimiento del cultivo mientras que la cantidad de fosforo disuelto en el medio actúa como un factor limitante, siendo ambos determinantes en la capacidad de carga del sistema.

Palabras clave: Algae, irradiancia, Fosfato, Clorofila, Caroteno, Dunaliella Viridis

Abstract. Dunaliella is a type of halophile green-orange microalgae especially found in lake and salty fields and is known for its antioxidant activity; because of its ability to create large amount of Carotenoids (Wikfors & Ohno, 2001). Growth on algae cultures can be monitored using turbidity or light scatter measurements (Borowitzka 1992, Hosseini & Shariati 2009). As the number of cells increases the solution becomes increasingly cloudy or turbid because light passing through it is scattered by the suspended particle present. Photosynthetic organisms such as algae can also be monitored using Chlorophyll. Regardless of the type Chlorophyll is a molecule that can be detected by absorbance (Lichtenhaler 1977). In the present study, Dunaliella Viridis isolates were cultured and their cell proliferation rate, chlorophyll (a and b) and β-carotene production, and other measures were studied under conditions of low irradiance (50 µmol mˉ² sˉ¹) and high irradiance levels (500 µmol mˉ² sˉ¹), with and without Phosphate limitation. At the end of the experiments, we conclude that the irradiance isn´t a key factor in cell growth rate while the amount of phosphate dissolved in the medium acts as a limiting factor, both being crucial in the capacity of the system jointly or separately.

Keywords: Algae, irradiance, Phosphate, Chlorophyll, Carotene, Dunaliella Viridis.

1 Introduction

Las algas eucariotas del género Dunaliella resultan muy interesantes no solo por sus características propias, entre las que destacan su tolerancia a la alta salinidad del medio y producción de sustancias osmoreguladoras junto con otras de interés (Ben-Amotz et al., 1982) tanto para su uso con fines científicos, con fines alimenticios o dietéticos (Spectovora et al., 1982), comerciales (como biocombustibles, síntesis de metabolitos secundarios (Tafreshi & Shariati, 2009), o en acuicultura entre otras aplicaciones.

El género Dunaliella fue descrito por primera vez por Teodoresco en el año 1905. Hoy día pertenecen a este género 23 subespecies, cada una de las cuales, muestra un crecimiento óptimo a distinta concentración salina (Massyuk, 1973).

En nuestro estudio emplearemos al alga Dunaliella Viridis, una microalga unicelular verde biflagelada (flagelos de la misma longitud), fotosintética (clorofila a y b además de una serie de pigmentos accesorios), que carece de pared celular (lo que le permite cambiar de tamaño y de volumen en respuesta al estrés) y de un solo cloroplasto en forma de copa (Borowitzka and Borowitzka, 1992), cuyo crecimiento se ve condicionado por los valores de nutrientes, temperatura y salinidad. Su forma de reproducción es la bipartición, aunque también forma quistes de resistencia ante condiciones adversas (Teodoresco, 1906).

En general, Dunaliella spp. destaca en aguas que sean hipersalinas, donde forman flores, coloreando las aguas de colores verdes o rojos, ya que algunas especies de Dunaliella forman blooms rojos ya que acumulan una parte de su peso seco de β-caroteno, que es muy apreciado por las industrias de alimentos y piensos (Jin and Melis, 2003).

Dunaliela Viridis, es por tanto un alga halófila, que resiste elevadas concentraciones de sales gracias a la acumulación del glicerol, que actúa como soluto osmoregulador (Ben-Amotz & Avron, 1973). Se sabe que es capaz de sobrevivir en medios por encima de la salinidad marina, tolerando concentraciones de NaCl de entre 0,2 y el 35% (Ben-Amotz and Avron, 1983, 1990). La temperatura óptima de Dunaliela vi. está entre 14-30 ºC con un límite superior de supervivencia de hasta 35 ºC (Goldman, 1977). La concentración óptima de fosfato que se conoce para Dunaliela Viridis. está entre 115-144 mM, solo concentraciones por encima de 28.7 mM le son toxicas, y pueden dar lugar a inhibición en su crecimiento (Mil’ko et al., 1962). .Con respecto a la salinidad óptima se da entre 5.8-8.9% (w/v) con una tolerancia de hasta 32.2% de NaCl (Borowitzka et al., 1977). El PH óptimo de crecimiento para Dunaliella Viridis es de un valor de 9 (Loeblich, 1972)

2 Materiales y métodos

2.1 Preparación y diseño del experimento

La cepa de Dunaliella Viridis que hemos utilizado provenía del Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía, perteneciente al Centro superior de investigaciones científicas (CSIC) en Puerto Real (Cádiz).

Sometemos nuestra cepa a cuatro tipos diferentes de condiciones de cultivo como se describió previamente en la introducción:

Alta irradiancia (500 µmol mˉ² sˉ¹) y alto Fosfato (250 mM) (I+P+)

Alta irradiancia (500 µmol mˉ² sˉ¹) y bajo Fosfato (50 mM) (I+P-)

Baja irradiancia (50 µmol mˉ² sˉ¹) y alto Fosfato (250 mM) (I-P+)

Baja irradiancia (50 µmol mˉ² sˉ¹) y bajo Fosfato (50 mM) (I-P-)

En el día 0, se inoculan 300.000 células por mililitro para cada cultivo, que tendrían un volumen de 300ml. Todas se mantienen en aireación constante, controlando la temperatura a 25 grados centígrados y con luz permanente sin descansos las 24 horas.

Se prepararon dos cultivos de cada medio manteniendo las mismas condiciones en la réplica para minimizar el error en las mediciones.

Todas las variables de interés fueron estudiadas y medidas a lo largo de los días 3,6 y 11 del periodo de experimentación.

El día 12, finalmente se hizo una última medida de densidad celular y se midió el pH.

2.2 Densidad celular

La medida de densidad celular fue obtenida mediante conteo directo haciendo uso un microscopio optico. Se tomó 1ml de cada cultivo y se depositó sobre una cubeta de Technicon, a la que posteriormente se le añadió una gota de lugol (que tiñe el almidón celular) para fijar las células y teñirlas. Se tomó una gota de la mezcla con una pipeta Pasteur y se colocó sobre una cámara de conteo Neubauer (o cámara cuenta glóbulos) que nos permitió poder contar el número de células en un volumen determinado de cultivo puesto que dispone de una cuadrícula de dimensiones conocidas.

Hecho esto, lo cubrimos con un porta objetos y se realizó el conteo sobre la superficie de 20 cuadrículas con el microscopio. El valor medio del número de células en cada cuadrado se multiplicó por 160000 (factor de corrección) y por el factor de dilución empleado para obtener la densidad en nº cel/ml. Si el número de células por cuadrado salía de media mayor de 30 se realizaron diluciones. La medida se realizó durante los días 3,6,11.

2.3 Tasa intrínseca de crecimiento r y capacidad de carga del sistema k

Linealizando la ecuación del crecimiento logístico y representando la densidad celular con respecto al tiempo se calculó la tasa intrínseca de crecimiento, r, y la capacidad de carga del sistema, k, (densidad máxima que soporta el cultivo) se estimó a partir de los datos de crecimiento de cada cultivo, de cada uno de los cuales se obtuvo una densidad celular máxima.

Operando tenemos que,

c−rt=lnK−N

N ; N= K

1+ec−rt ; c=ln ( K

N 0−1)

De donde obtenemos

lnK−N

N = ln ( K

N 0−1)−rt

Siendo r la tasa intrínseca de crecimiento (en este caso indica la pendiente de la recta), y K la capacidad de carga del medio.

Se sabe por estudios anteriores que La máxima tasa intrínseca de crecimiento (r) y la máxima capacidad de carga (k) se obtiene a 250 μmoles mˉ¹ sˉ¹ (Gordillo et al., 2001).

2.3 Nefelometria

La nefelometría es un procedimiento analítico que se basa en la dispersión de la radiación que atraviesan las partículas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensión de partículas sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. Se midió la turbidez del cultivo in vivo , es decir, su absorbancia, usando el espectofotómetro a 750nm. Se usó 1ml de cultivo y se calibró el espectrofotómetro usando como blanco medio de cultivo sin células o agua destilada. De esta manera se pudo enfrentar la absorbancia a 750nm al número de células/ ml y ajustarlo a una recta llevándose a cabo un análisis de correlación (los cálculos algebraicos pueden consultarse en detalle en el anexo 2 del presente documento).

2.4 Producción de pigmentos

Para estimar los pigmentos fotosintéticos se filtraron 3ml de cada cultivo por jeringuilla con soporte Swinnex y filtros de microfibra de vidrio GF/F. Se sumergió el filtro en 3 mL de acetona al 90% en un tubo Falcon de 15 mL y se dejó 20 min en oscuridad. Transcurrido ese tiempo se recogió el sobrenadante y volvió a filtrarse. De esta manera se evita el margen de error debido a un aumento de turbidez que puede causar la acetona al descomponer parcialmente el filtro.

Después se pasó a medir la absorbancia en el espectrofotómetro del sobrenadante a las distintas longitudes de onda: 750 nm (para la turbidez), 664 nm (el máximo de absorbancia de la clorofila a), 647 nm (máximo de absorbancia de la clorofila b) y 480 nm (máximo de absorbancia de los carotenos) según (Lichtenhaler 1977). Se usó de nuevo acetona como blanco, lo que obliga en este caso a usar cubetas de vidrio y no de plástico en el espectofotómetro.

El valor de 750 nm se usó para obtener los valores sin turbidez de los 3 tipos de pigmentos mencionados. Como a 750 nm se mide la turbidez del extracto acetónico, hay que restar 750 a las demás medidas para poder efectuar los cálculos de la concentración de cada pigmento de forma correcta:

Clorofila a (µg ml-1) = 12.25 DO664 – 2.79 DO647

Clorofila b (µg ml-1) = 21.5 DO647 – 5.1 DO664

Carotenoides totales (µg ml-1) = (1000 DO470 – 1.82 Clor.a – 85.02 Clor.b)/189)

2.5 Efecto de empaquetamiento

El PE o efecto empaquetamiento, indica la diferencia de absorción entre la clorofila presente en los tilacoides y la clorofila en solución. Podemos calcularlo fácilmente a partir de la concentración de pigmentos mediante la siguiente ecuación:

P.E. = 1 – (DO668 / DO664).

Donde,

664 nm es el máximo de absorbancia de la clorofila a y 668 nm es el máximo de la clorofila a en vivo

Al igual que los casos anteriores a ambos valores de DO se le restó previamente los valores de DO750 nm que corresponde a la turbidez para el cálculo de la concentración de pigmentos en el apartado anterior, (DO668-DO750) para el cultivo in vivo y (DO664-DO750) para el extracto en acetona.

2.6 Irradiancia

Usando la irradiancia a la que se expusieron cada uno de los cultivos que se calculó con un radiómetro poniéndolo en el punto central del matraz el valor del coeficiente de extinción de la luz o Kd para cada uno de ellos. Lo que nos permite aplicar la ley de Lambert-Beer que describe las propiedades de la muestra atravesada en función de la absorción de a luz.

I x=I 0 . e−Kd . x

Donde,

Ix es la radiación incidente en el centro del cultivo en los que se toma una distancia consensuada de 5 cm por ser este el radio del matraz (x) e I0 es la irradiancia inicial. La irradiancia se midió usando un luxómetro colocado en el centro del cultivo durante los días 3, 6 y 11 del experimento

Con los datos obtenidos para la Kd se calculó la correlación entre la concentración de pigmentos totales y el coeficiente de extinción de la luz, que puede consultarse en detalle en el anexo 2.

2.7 Tasa de fotosíntesis y respiración

Para calcularla las tasas de respiración y de fotosíntesis necesitamos medir la cantidad de oxígeno de cada cultivo usando un oxímetro en varias situaciones. Usamos matraces de 125 ml, que enrasamos con cada medio, del que tomaremos usando el oxímetro la cantidad de oxígeno de forma inicial. Tomada la medida, tapamos cada matraz con un parafilm procurando que no queden burbujas y se somete cada matraz a un tratamiento de 20 minutos en luz, transcurrido los cuales se vuelve a medir la cantidad de oxígeno. Repetimos la misma operación, 20 min pero esta vez en oscuridad y se volvió a

medir la cantidad final de oxígeno. Una vez obtenidas las medidas de oxigeno inicial y final, en luz (para fotosíntesis) y en oscuridad (para respiración), se calcularon las tasas:

μmoles O2 celˉ¹ minˉ¹ = (O2final-O2inicial)//(num.cel/mL min.incubación)

2.6 Fosfato inorgánico

Se utilizó el método del verde malaquita (Fernández et al. 1985). Se filtraron 3 mL de cada cultivo por filtros GF/ de fibra de carbono, se incubaron para cada caso 0,5 ml de cultivo con 1 ml de verde malaquita haciendo dos réplicas durante 5 minutos, y pasados estos se midió la absorbancia a 660 nm. Las absorbancias que se obtuvieron de dichas muestras se extrapolaron con una recta patrón para calcular las concentraciones de fosfato en μmoles/ L. Esta recta se construyó midiendo la absorbancia a 660 nm de una serie de soluciones de concentraciones conocidas de fosfato de 2.5-5-10-15-25 μmoles/ L. El blanco se hizo con una mezcla de un mililitro de reactivo junto con 0,5 ml de agua destilada.

3 Resultados

3.1 Densidad celular

Sabemos que Dunaliella Viridis sigue un crecimiento logístico (Rodriguez-Martinez 2010), en el que el número de células del cultivo va en aumento hasta alcanzar un máximo (dN/dt = r.N.(1-N/K))).

Interpretando los datos de nuestro experimento elaborados en la gráfica superior ( densidad celular en millones de células por mililitro enfrentada a tiempo en días )podemos observar que efectivamente la densidad celular va aumentando progresivamente a lo largo de los días de experimentación, siendo este crecimiento más destacado para el tratamiento I+P+ cuya densidad aumentó progresivamente hasta el día once . Igualmente llamativo resulta el crecimiento del tratamiento I+P-, que alcanzó una densidad máxima el día 6, viéndose mermada la densidad a partir de ese día. I-P- decrece a partir del séptimo día y I-P+ presentaron un crecimiento sostenido desde el día 3.

Ilustración 1. Densidad celular (en millones de células por mililitro) frente a tiempo (en días) para los cultivos de Dunaliella Viridis

3.2 Tasa intrínseca de crecimiento y capacidad de carga

La siguiente tabla representa las medias y desviaciones típicas de r y k para los cuatro tratamientos de irradiancia y fosfato. Podemos observar que para la tasa intrínseca de crecimiento que el tratamiento I+P- es el que valores más elevados tiene, seguido de cerca por I+P+. En cambio, I-P+ y I-P- tienen valores mucho más bajos. Con respecto a la capacidad de carga es el tratamiento P+I+ el que destaca siendo mucho superior a los otros tres.

Tabla 1 Valores para la r y la k para los 4 parámetros de irradiancia fosfato.

R K

I+, P+ µ±d 0,49±0,04 65±25,46

I+, P- µ±sd 65±25,46 6,82±0,52

I-, P+ µ±sd 0,29±0 7,15±0,21

I-, P- µ±sd 0,37±0,05 2,85±0,81

3.3 Nefelometría

Se realizó una correlación entre la variación de absorbancia de 750 nm y la densidad celular en millones de células (para estimar la turbidez).

La correlación que se obtuvo fue de R2 =0,5579, siendo la ecuación de la recta obtenida

Y = 0,0142X + 0,3575

El coeficiente de correlación resultó significativo ya que se puede observar que la absorbancia aumenta proporcionalmente a medida que aumenta la densidad celular.

Ilustración 2. Correlación entre la absorbancia a 750 nm frente a la densidad celular (en millones de células) para los cultivos de Dunaliella Viridis

Sin embargo por la forma de la distribución de los datos, podrían estudiarse en posteriores experimentos, relaciones de correlación diferentes al lineal. Por ejemplo, si tratamos de ajustar un polinomio de tercer grado, vemos que el coeficiente de correlación aumentaría hasta 0,7164 para los datos dados, sin embargo con la corta duración del experimento y el pequeño número de valores no parece prudente hacer conjeturas en este aspecto.

3.4 Medición de la acidez (pH)

La medida y el equilibrio de pH está intimamente relacionado con los procesos de respiración y fotosíntesis. El pH es la medición de la alcalinidad o la acidez de una solución. Un pH de 7 es neutral. Un pH por debajo de 7 indica una naturaleza ácida; por encima de 7 indica naturaleza alcalina.

A partir de los datos recogidos, se realizó un diagrama de barras que enfrenta el pH a lo largo de los días 3,6,11 y 12 de experimento para los cuatro tratamientos (figura

En general pudo verse un descenso del pH a lo largo de los días en todos los casos, siendo más destacable ese descenso en el tratamiento I+P-. El resto aunque también descendieron, lo hicieron de forma más suave e incluso en el caso de I-P- e I-P+ hubo un ligero aumento en el día 12.

Ilustración 3. Niveles de pH frente al tratamiento de irradiancia y fosfato aplicado para los cultivos de Dunaliella Viridis.

3.5 Producción de pigmentos

3.5.1 Clorofila a

Se realizó un diagrama de barras que enfrenta la cantidad de clorofila A a lo largo de los días 3,6 y 11 de experimentación para los cuatro tratamientos a los que fue sometida Dunaliella . El tratamiento I+P+ destacó en la concentración de clA en el día 6 sobre los otros tres tratamientos, siendo este tratamiento el que mayor cantidad alcanzó a lo largo de todo el periodo de experimentación. I-P+ también obtuvo valores elevados en el día 11 alcanzando la concentración para el mismo día de I+P+. I-P- se mantuvo en aumento suave pero progresivo, mientras que I+P- mostró un leve descenso en el día 11.

Ilustración 4. Concentración de clorofila a (µg/ml)frente al tiempo (en días) de cada uno de los tratamientos de irradiancia y fosfato aplicados a los cultivos de Dunaliella Viridis

3.5.2 Clorofila b

Se realizó un diagrama de barras que enfrenta la cantidad de clorofila B a lo largo de los días 3,6 y 11 de experimentación para los cuatro tratamientos a los que fue sometida Dunaliella. Los tratamientos I+P+, I-P+ y I-

P- presentaron un aumento progresivo de la concentración de clorofila b a lo largo de los días, siendo el más destacado el de I+P+, como vimos que ocurrió también con la concentración de clorofila A. I+P- sin embargo presenta un descenso en el día 6 y un nuevo aumento de cara al día 11.

Ilustración 5. Concentración de clorofila b (µg/ml) frente al tiempo (en días) de cada uno de los tratamientos de irradiancia y fosfato aplicados a los cultivos de Dunaliella Viridis

3.5.3 Caratonoides

A Se realizó de nuevo un diagrama de barras que enfrenta la cantidad de carotenoides a lo largo de los días 3,6 y 11 de experimentación para los cuatro tratamientos a los que fue sometida Dunaliella. En este caso, I+P+, I-P+ e I-P- presentaron un aumento de carotenoides progresivo siendo en todos los casos el día 11 el de mayor concentración y volviendo a destacar como en los casos anteriores de clorofila A y B el tratamiento I+P+. I+P- por el contrario mostró aumento hasta el día 6, tras el cual empezó a disminuir.

Ilustración 6. Concentración de carotenos total (µg/ml) frente al tiempo (en días) de cada uno de los tratamientos de irradiancia y fosfato aplicados a los cultivos de Dunaliella Viridis.

3.8 Efecto de empaquetamiento

Como se aprecia en la gráfica 7, el tratamiento I-P+ es el que presentó mayor empaquetamiento desde el día tres hasta el día 11, aunque experimento un gran descenso a lo largo de los días que finalizó a partir del día seis manteniendo constante el valor. I-P- no experimentó cambios, manteniéndose constantes a lo largo de todos los días de medida. P+ I+ en este caso desciende progresivamente mientras I+P- primero desciende del día 3 al 6 y luego sufre un ascenso.

Ilustración 7. Efecto empaquetamiento (PE) frente a tiempo en días medidos para los cultivos de Dunalliela viridis.

3.9 Irradiancia

Se realizó una regresión de los datos que se obtuvieron donde el coeficiente de correlación fue de 0,9055 (el procedimiento algebraico puede consultarse en el anexo 2.

Usamos los datos obtenidos para la Kd (coeficiente de extinción de la luz) y los enfrentamos a la concentración de pigmentos totales, resultando la tabla superior, en la que podemos observar que conforme aumenta la concentración de pigmentos en el medio, la luz se ve cada vez más atenuada. Este hecho resuelta especialmente visible para I+P+ e I-P+.

Ilustración 8. Coeficiente de extinción de luz (Kd) frente a pigmentos totales (µg/ml) para los cultivos de Dunalliela Viridis

3.9 Tasa de fotosíntesis

En esta prueba se observó que los tratamientos que mayor tasa de fotosíntesis presentaron entorno al día 3 fueron los de I-P- y el de I+P+, pero también fueron los que del día 3 al 6 presentaron mayor descenso pronunciado de la misma. I+P- presenta una tasa de fotosíntesis muy baja, que baja aun más a lo largo de los días. I-P+ por el contrario aumenta la tasa de fotosíntesis del día 3 al 5, para después disminuirla entre el día 6 y el 12.

Ilustración 9. Tasa de fotosíntesis frente a tiempo en días del tratamiento para los cultivos de Dunalliela viridis

3.9 Tasa de respiración

Se representó los datos obtenidos en una tabla que enfrentó la tasa de respiración de cada tratamiento con el tiempo en días transcurridos de experimentación. Se observó que el tratamiento I-P- fue el que mayor tasa presentó en el día 3, descendiendo esta pronunciadamente entre el día 3 y el 6 y volviendo a aumentar levemente hacia el dia 11. Los otros tres tratamientos presentan tasas y trayectorias parecidas. I-P+ es la que le sigue a I-P-. I+P- aumenta del día 6 al 11 levemente mientras que I+P+ disminuye hasta alcanzar practicamente el cero en el día 11.

Ilustración 10. Tasa de respiración frente al tiempo en días de tratamiento para los cultivos de Dunalliela viridis.

3.9 Fosfato inorgánico

En este caso se observó que I-P+ fue el tratamiento que presentó lo mayores valores de fosfato inorgánico, siendo el máximo en el día 3, trasd el cual sufrió leve descenso entre el día 3 y 6 para después descender más bruscamente del día 6 al 11. El segundo tratamiento que presentó valores más elevados fue I+P+ en el día 3, pero este sufrió un descenso acentuado de cara al día seis y alcanzó casi el cero en el día 11. I-P- e I+P- presentan trayectorias parecidas, presentando sus valores más elevados el día tres y confluyendo con I+P+ en los resultados medidos en el día 11 de experimentación.

Ilustración 11. Concentración de fosfato (mmoles Lˉ¹) frente a tiempo en días para los cultivos de Dunalliela Viridis

3.9 Incorporación de Fosfato

Para esta tabla se enfrentó la incorporación de fosfato como necesidad nutricional frente de Dunaliella para cada tratamiento frente al tiempo en día de experimentación. Se observó que los valores más altos se dieron en I-P+ entorno al día 3. Ese valor descendió notablemente en la medida del día seis y volvió a resultar menos en el día 11. El tratamiento I-P- fue el segundo que mayor valor obtuvo también entorno al día seis e igual que el I-P+, del día tres al seis sufrió un bruco descenso, y del seis al once siguió descendiendo pero de una forma mas suave. I+P+ en el día 3 tuvo un valor muy bajo que se hizo casi inexistente entorno al día 6 y 11. I+P- presenta los valores más bajos de todo el periodo de experimentación.

Ilustración 12. Incorporación de fosfato (mmoles/Mcel) frente a tiempo (días) de tratamiento para los cultivos de Dunalliela Viridis

3.9 Indice de producción de biomasa

El tratamiento I+P+ presentó los valores más altos de todo el experimento .El día 3 fue el día de menos valor y este alcanzó el máximo el día 11. I+P- alcanzó el valor máximo el día 6 y el más bajo el día 11. I-P+ se mantuvo estable en todos los días de experimentación, con un ligero aumento el día 11. Por último I-P- que el día 6 tuvo se mayor valor, que fue disminuyendo hasta el día 11 a partir de ahí.

Ilustración 13. Tasa de renovación de los cultivos de Dunalliela viridis frente al tiempo medido en días

4 Discusión

4.1 Densidad celular, capacidad de carga y tasa intrínseca de crecimiento

Observando los datos reflejados en la gráfica 1 y las medias y desviaciones típicas de r y k para los cuatro tratamientos de irradiancia y fosfato recogidos en la tabla 1, podemos concluir que, a la vista de los datos la interacción de ambos parámetros ponen de manifiesto en la gráfica un volumen celular de I+P+ muy superior a los otros tratamientos. Este volumen celular crece hasta alcanzar una capacidad de carga a partir de la cual la densidad celular debe disminuir por muerte de la población celular, que se hace tan densa que no permite el paso de la irradiancia necesaria para la fotosíntesis y que consume las reservas de fosfato haciendo que merme la producción de demás nutrientes.

Por tanto la densidad celular sí que presenta diferencias en base al tratamiento al que se la somete, siendo muy parecido a lo largo de los días de experimentación para los tratamientos en los que uno o varios parámetros son negativos.

Además, los datos para r y k de la tabla 1 se ven apoyados por los resultados del contraste de varianzas adjuntos en el anexo1 que finalmente confirman que las variaciones de irradiancia no producen diferencias significativas en los valores de r, mientras que las variaciones de fosfato si y que la variaciones de irradiancia, las de fosfato, así como la combinación de ambos afectan a la capacidad de carga del sistema. Es decir, tanto por separados (Sathasivam & Juntawong 2013) como en interacción, fosfato e irradiancia controlan la densidad celular del cultivo. Irradiancia necesaria para fotosíntesis y el fosfato actúa como factor limitante (Gordillo et al. 2001)

4.2 Nefelometría

En base a los resultados obtenidos y a la correlación (Gráfica 2) en la que se obtuvo un valor bajo al ser de 0,55, asumimos que al aumentar el número de células de la muestra, aumenta también la turbidez del medio y por tanto menos luz atraviesa el cultivo. De esta manera a medida que aumenta la turbidez mediada por el aumento de la densidad celular, La absorbancia también se vería modificada por las células que alcanzada la capacidad de carga van muriendo, pero que igualmente permanecen en el contenido de la muestra. Esta podría ser una posible explicación al por qué el coeficiente de correlación no alcanza valores cercanos a 1, sino que se queda en 0,5579, ya que cuanto más cercano es el valor a 1, más significativa y mejor sería la correlación entre los datos. Este hecho hace cuestionar que la nefelometría sea un estimador fiable de la densidad celular una vez alcanzada k.

4.3 Medidas del PH

El PH del medio depende de las relaciones metabólicas que se dan en las células de Dunaliella, puesto que, el crecimiento celular, la fotosíntesis y la respiración intercambian en su procesos Co2, protones, y otros metabolitos con el medio. Sabemos que el PH óptimo de Dunaliella Viridis está en torno a 9.Observando los datos obtenidos en la gráfica 3, podemos ver como la tendencia a lo largo de los días de experimentación en los cuatro tratamientos es que el PH disminuya, especialmente de forma

destacable en el tratamiento I+P-. Esta disminución de Ph está relacionada con la fotosíntesis que se ve favorecida por la irradiancia y que, retira protones del medio, por lo que el Ph se hace más básico a medida que aumenta la fotosíntesis ,pero además también se retira Co2. En el caso de la respiración ocurre justo lo contrario, libera Co2 al medio que al combinarse con el agua forma protones que se liberan al medio y acidifican el Ph.

4.4 Medida de pigmentos

El valor de la correlación entre la densidad celular y la clorofila adjunto en el anexo2 dan un valor de R2 = 0,4365, que resulta ser muy bajo . Esto no concuerda con los estudios conocidos (Hernández et al., 2011)los cuales describen una buena correlación entre ellos. Por tanto, debieron cometerse errores experimentales durante la realización del estudio de correlación y debemos asumir que las concentraciones de clorofila a son un buen estimador de la biomasa.

Si observamos los datos de las gráficas 4, 5 y 6 podemos ver que los medios con bajo fosfato y baja irradiancia muestran una baja concentración de clorofila a, b y de carotenos. Cuando organismos fotosintéticos están sometidos a condiciones de baja irradiancia aumentan el número de pigmentos para captar la luz de la forma más eficiente. El tratamiento I+P+ tiene mayor densidad celular en la gráfica 1 y esto puede estar relacionado con que se alcancen valores máximos en el tratamiento. Mientas que la clorofila a, parece que aumenta en la mayoría de los casos, a excepción de I+P-, en los que se ve estancada desde el sexto día del experimento, no pasa así con la clorofila b y si en los carotenos, cuya subida podría deberse tanto a la densidad celular como a la intensa irradiancia puesto que estos actúan como protectores de la auto oxidación celular, además de intervenir en la transferencia de energía.

4.5 Efecto de Empaquetamiento

El efecto empaquetamiento trata de calcular el grado de apilamiento de los pigmentos en los tilacoides de los cloroplastos. Estos pigmentos se encuentran formando parte de antenas de captación de luz. Es esta la forma en la que Dunaliella se aclimata a los cambios de irradiancia para no resultar dañada, cambiando el apilamiento de los pigmentos de esas antenas recolectoras de luz, ya que al estar más juntos, disminuye la cantidad de energía que llega a las cadenas de electrones. Es por eso que el número y el tamaño de las antenas fotosintéticas es regulable y que el efecto de empaquetamiento juega su papel como defensa frente a la irradiancia.

Si observamos los datos de la gráfica 7, vemos que el empaquetamiento en I+P+ va disminuyendo con los días de experimentación, mientras que para I+P- se produce un descenso que se para en el día 6 . Si esto lo comparamos con los datos obtenidos para la tasa de fotosíntesis en la gráfica 9 vemos que los datos para el tratamiento I+P+ la tasa de fotosíntesis va disminuyendo y para I+P- en el día 6 se produce un descenso de la fotosíntesis que la lleva hasta los mínimos.

4.6 Coeficiente de extinción Lumínica kd e Irradicancia

Los niveles de irradiancia que llegan a los cultivos sufren un proceso de absorción y dispersión que denominamos extinción o atenuación. Las aguas más transparentes presentan un Kd menor que las aguas más turbias que contengan materia orgánica disuelta, las cuales tendrán un Kd mayor. En base a esto la gráfica 8 nos confirma que cuantos más pigmentos y más células hay en el cultivo mayor es el coeficiente de extinción de la luz , puesto que menor irradiancia puede atravesar la muestra. Los tratamientos I+P- e I-P- son los que presentan valores más bajos, coincidiendo esto, con los valores de estos tratamientos en la gráfica 1 con los de menor densidad celular de los 4 estudiados. El coeficiente de correlación R2=90,55 indican que efectivamente hay una correlación entre el número de pigmentos e indirectamente la densidad celular y el coeficiente de extinción de la luz.

4.7 Tasa de Fotosíntesis y Tasa de respiración

Gracias a experimentos realizados anteriormente sabemos que el valor de irradiancia para el cual se alcanzan una mayor tasa de fotosíntesis en D.viridis es de 250 μmoles de fotones . m-2 . s-1, valores superiores o inferiores al mismo producen una disminución de dicha tasa (Gordillo et al., 2001)

Los resultados de la tasa de fotosíntesis en la gráfica 9 tienden a disminuir a lo largo de los diferentes días de experimentación excepto en el caso de I-P+. Esto podría justificarse por una disminución en

los niveles de nutrientes a lo largo del tiempo de experimentación ya que la disminución de los niveles de fosfatos produce una disminución de la energía disponible en las células (ATP), energía necesaria entre otras cosas para realizar fotosíntesis, al ser este un factor limitante como dijimos anteriormente. El incremento en la densidad celular podría estar también relacionado con este descenso de la tasa de fotosíntesis, ya que, como antes comentamos la muerte celular y el exceso de células pueden dificultar la llegada de irradiancia a los centro de reacción.

La tasa de respiración deben estar directamente relacionados con los de densidad celular, siendo esto lo esperado para los tratamientos I+P+ e I+P- , pero si observamos la gráfica 11 y la comparamos con la gráfica 1 vemos que los valores no se corresponden con lo dicho anteriormente, ya que para el tratamiento I+P+ se obtienen los valores más bajos de tasa de respiración, y para el tratamiento I+P- los valores son muy bajos pero aumentan los últimos días del experimento. También se puede ver que en el tratamiento I-P- se produce los valores más altos de tasa de respiración, lo que tampoco se corresponde con lo que es de esperar. Estos valores contrarios pueden deberse a posibles errores experimentales y errores en los aparatos de medida.

4.8 Incorporación y asimilación de Fosfato

Las células de los cultivos acumulan el fosfato presente en el medio en el interior de sus vacuolas, produciéndose a lo largo del tiempo una disminución de las concentraciones de fosfato del medio. Como dijimos anteriormente el fosfato es necesario para aumentar las reservas de energía de las células, y es esta por tanto, la razón por la que los tratamientos de alta irradiancia que deberían tener mayor tasa de fotosíntesis, son las que más rápidamente consumen el fosfato del medio de cultivo, esto está directamente relacionado también con el número de células, es decir con la densidad celular, más células supone mayor necesidad de fosfato para su crecimiento y metabolismo.

4.9 Índice de P/B

El tiempo que tarda un cultivo en renovar su biomasa es el inverso del índice P/B .Si observamos en la gráfica 13 los tratamientos a alta irradiancia I+P+ e I+P- , vemos que estos tuvieron un índice P/B mayor durante los primeros días y bajaron en los últimos días debido a la disminución celular que sufren cuando van muriendo las células de los cultivos. Deducimos por tanto que la irradiancia es un factor determinante para la velocidad de renovación de la biomasa de los cultivos.

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Anexo 1: Anovas o analisis de la varianza

Para comprobar si la capacidad de carga k o la tasa intrínseca de crecimiento r se ven afectados o no por los parámetros de los distintos tratamientos a los que sometimos los cultivos de Dunaliella Viridis, se llevan a cabo dos Anovas, una para la r y otra para la k que se desarrollan a continuación:

ANOVA de la r:Se realizó un ANOVA de dos factores con dos réplica ,con un nivel de significación de 0’05.

Las hipótesis nulas son:

Ho: No existen diferencias significativas en la tasa intrínseca de crecimiento debido a las distintas variaciones de irradiancia.Ho’: No existen diferencias significativas en la tasa intrínseca de crecimiento debido a las distintas variaciones de de fosfato.Ho’’: No existen diferencias significativas en la tasa intrínseca de crecimiento debido a La interacción de los factores irradiancia y fosfato.

Las hipótesis alternativas son:H1: Si existen diferencias significativas en la tasa intrínseca de crecimiento debido a las distintas variaciones de irradiancia.H1’: Si existen diferencias significativas en la tasa intrínseca de crecimiento debido a las distintas variaciones de fosfato.H1’’: Si existen diferencias significativas en la tasa intrínseca de crecimiento debido a la interacción de los factores irradiancia y fosfato.

Datos:

TRATAMIENTO RÉPLICA VALOR DE r

I+P+ A 0.459

B 0.511

I+P- A 0.511

B 0.529

I-P+ A 0.290

B 0.286

I-P- A 0.406

B 0.338

Cálculos:Suma total = 3’33 SC A = 0’007Suma total de cuadrados = 1,45774 SC B = 0’06Suma de los cuadrados de cada subgrupo = 1,454 SC A x B = 0’001Suma de las columnas al cuadrado = 1,393 SC del error (intragrupo) = 0’004Suma de cuadrados en filas = 1,446 MC de las columnas = 0’007Término de corrección = 1,386 MC de las filas = 0’06SC total = 0’072 MC de la interacción = 0’001SC de los subgrupos = 0’068 MC del error = 0’004

Frecuencias:GL SC MC F observada F crític

Irradiancia (A)

1 0.007 0.007 7 7.71

Fosfato (B) 1 0.06 0.06 60* 7.71Interacción (A x B)

1 0.001 0.001 1

Error 4 0.004 0.001

Al obtener en la tabla un Fcrítico de 7.71 podemos afirmar que Ho’ se rechaza y se acepta la hipótesis alternativa H1’ ,y que se aceptan las hipótesis nulas para Ho y Ho’’ por lo que podemos afirmar con

un 95% de fiablididad que las variaciones de irradiancia no producen diferencias significativas en los valores de r, mientras que las variaciones de fosfato sí.

ANOVA de la K:Se realizó un ANOVA de dos factores con dos réplicas ,con un nivel de significación de 0’05.Las hipótesis nulas son:Ho: No existen diferencias significativas en la capacidad de carga debido a las distintas variaciones de irradiancia.Ho’: No existen diferencias significativas en la capacidad de carga debido a las distintas variaciones de de fosfato.Ho’’: No existen diferencias significativas en la capacidad de carga debido a la interacción de los factores irradiancia y fosfato.

Las hipótesis alternativas son :H1: Si existen diferencias significativas en la capacidad de carga debido a las distintas variaciones de irradiancia.H1’: Si existen diferencias significativas en la capacidad de carga debido a las distintas variaciones de fosfato.H1’’: Si existen diferencias significativas en la capacidad de carga debido a la interacción de los factores irradiancia y fosfato.

Datos:TRATAMIENTO RÉPLICA VALOR DE k

I+P+ A 47

B 83

I+P- A 6.45

B 7.18

I-P+ A 7.30

B 7.00

I-P- A 3.42

B 2.28

Cálculos:Suma total = 163,63 SC A = 1952,1947Suma total de cuadrados = 9310,03 SC B = 1910,55Suma de los cuadrados de cada subgrupo = 8661,375

SC A x B = 1451,79

Suma de las columnas al cuadrado = 5299,03 SC del error (intragrupo) = 648,66

Suma de cuadrados en filas = 5257,39 MC de las columnas = 1952,19Término de corrección = 3346,84 MC de las filas = 1910,55SC total = 5963,19 MC de la interacción = 1451,79SC de los subgrupos = 5314,53 MC del error = 162,165

Frecuencias:GL SC MC F observada F critic

Irradiancia (A)

1 1952.18 1952.18 12.03 7.71

Fosfato (B) 1 1910.54 1910.54 11.78 7.71Interacción (A x B)

1 1451.81 1451.81 8.95

Error 4 648.96 162.24

Al obtener en la tabla un Fcrítico de 7.71 y siendo los valores Fobs mayores en todos los casos, podemos afirmar que las tres hipótesis nulas Ho, Ho’ y Ho’’ se rechazan y se aceptan las alternativas,por lo tanto la variaciones de irradiancia, las de fosfato, así como la combinación de ambos ,afectan a la capacidad de carga del sistema con un 95% de fiabilidad.

Anexo 2: Ajuste de una recta de regresiones y medición de la correlación

Regresión de los inversos del coeficiente de extinción de la luz y la concentración de pigmentos totales:

Representación de la concentración de clorofila a (µg/ml) frente a densidad celular por mililitro: