Trabajo de grado presentado como requisito parcial para ... · INSPECCIÓN POST-MORTEM Y CULTIVO...

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

PREVALENCIA DE TUBERCULOSIS BOVINA (TBB) MEDIANTE

INSPECCIÓN POST-MORTEM Y CULTIVO BACTERIOLÓGICO EN EL

MATADERO MUNICIPAL DEL CANTÓN MEJÍA (PICHINCHA)

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar el Grado o

Título de Médico Veterinario Y Zootecnista

AUTOR:

Diego Martín Cushicóndor Collaguazo

TUTOR:

Prof. Washington Vicente Benítez Ortiz, Ph.D.

ASESOR CIENTÍFICO:

Ing. Gustavo Echeverría

Quito, Octubre, 2014

ii

“R. Koch jamás estaba satisfecho solo con nuevos descubrimientos, siempre quería aplicarlos a resolver problemas de Salud Pública”.

M. E. M. Walker. 1930.

iii

DEDICATORIA

A Dios

A mi familia

Diego Cushicóndor

iv

AGRADECIMIENTOS

El autor desea agradecer el apoyo financiero y logístico otorgado por el

Centro Internacional de Zoonosis de la Universidad Central del Ecuador, a su

director Prof. Washington Benítez O. Ph.D., por haberme permitido ser parte

del proyecto, para la realización de esta tesis.

Al personal científico-técnico del Centro Internacional de Zoonosis,

especialmente agradezco al Ing. Gustavo Echeverría, por su disponibilidad y

paciencia al ofrecer de forma desinteresada sus conocimientos, sugerencias,

comentarios y rápidas respuestas a las diferentes inquietudes surgidas en

todo momento de esta tesis, a la Bioq. Paulina Fernández, al Ing. Lenin Ron,

al Dr. Marco Coral por su ayuda brindada en este proyecto.

Estoy agradecido por la importante contribución de mi compañera y amiga

del Centro Internacional de Zoonosis, Estefanía Ortega, quien me ha

colaborado durante el trabajo de campo y laboratorio.

También agradezco a las autoridades de la Facultad de Medicina Veterinaria

y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador y del Matadero Municipal

del Cantón Mejía por su apoyo administrativo, especialmente al Dr. Antonio

Viteri, Dr. Carlos Luna, Dr. Pablo Tayupanda, por su colaboración durante el

trabajo de campo.

viii

ÍNDICE GENERAL

CONTENIDO pp.

LISTA DE CUADROS ............................................................................................................. x

LISTA DE GRÁFICOS ............................................................................................................ x

RESUMEN .............................................................................................................................. xi

ABSTRACT ............................................................................................................................ xii

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 13

CAPÍTULO I .......................................................................................................................... 15

EL PROBLEMA .................................................................................................................... 15

Planteamiento del problema .............................................................................................. 15

Objetivos ............................................................................................................................. 17

CAPÍTULO II ......................................................................................................................... 18

MARCO TEÓRICO .............................................................................................................. 18

Antecedentes ...................................................................................................................... 18

Fundamentación teórica ..................................................................................................... 19

CAPÍTULO III ....................................................................................................................... 35

METODOLOGÍA ................................................................................................................... 35

Diseño de la investigación .................................................................................................. 35

Procedimiento de la investigación ...................................................................................... 37

Técnicas de procesamiento y análisis de datos .................................................................. 38

CAPÍTULO IV ...................................................................................................................... 41

RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................................... 41

Descripción de la muestra .................................................................................................. 41

Resultados de la inspección post-mortem y cultivo bacteriológico ................................... 42

Análisis de la inspección macroscópica post-mortem ........................................................ 43

Análisis del cultivo bacteriológico ....................................................................................... 46

Análisis de los factores de riesgo ........................................................................................ 48

CAPÍTULO V ....................................................................................................................... 53

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................................. 53

Conclusiones ....................................................................................................................... 53

ix

Recomendaciones ............................................................................................................... 53

LISTA DE REFERENCIAS ................................................................................................. 55

ANEXOS ................................................................................................................................ 79

Anexo A: Registro de muestreo -Tuberculosis .................................................................... 80

Anexo B: Procedimiento de las pruebas utilizadas. ............................................................ 95

Anexo B-1: Protocolo para la inspección macroscópica post-mortem. .......................... 95

Anexo B-2: Protocolo para preparación de medios de cultivo ....................................... 96

Anexo B-4: Protocolo para microscopía por la técnica de Ziehl-Neelsen. ...................... 99

Anexo C.- Fórmulas utilizadas para la asociación de las variables ................................... 100

Anexo D.- Lista de siglas y abreviaturas ............................................................................ 101

x

LISTA DE CUADROS

CUADRO pp.

Cuadro 1.- Clasificación taxonómica ............................................................ 21

Cuadro 2.- Resultados de IP y cultivo bacteriológico positivo para

tuberculosis bovina observado en 13 animales diferentes, muestreados en el

Matadero del Cantón Mejía, Ecuador * ......................................................... 42

Cuadro 3.- Características de los aislamientos en los medios de cultivos para

micobacterias* .............................................................................................. 43

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO pp.

Gráfico 1.- Distribución de la enfermedad en el periodo Enero - Junio del

2013. ............................................................................................................. 28

Gráfico 2.- Área de estudio del Cantón Mejía: a) figura de la zona; ............ 36

Gráfico 3.- Distribución de los animales muestreados: a) por edad (años),

b) por biotipo y c) por sexo, en el Matadero Municipal del Cantón Mejía,

2013. ............................................................................................................. 41

xi

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

Prevalencia de tuberculosis bovina (TBB) mediante inspección post-mortem y cultivo bacteriológico en el Matadero Municipal del Cantón

Mejía (Pichincha).

Autor: Diego Cushicóndor Tutor: Dr. Washington Benítez O., Ph.D.

Asesor Científico: Ing. Gustavo Echeverría Fecha: octubre, 2014

RESUMEN

La presente investigación es un estudio transversal o de prevalencia de

tuberculosis bovina (TBB) en el Matadero Municipal del Cantón Mejía, de la

Provincia de Pichincha-Ecuador. El muestreo se realizó entre el 27 de Mayo

y 17 de Julio del 2013. Se examinaron 395 animales mediante inspección

macroscópica post-mortem (IP), obteniendo una prevalencia aparente de

lesiones compatibles con la enfermedad de 1.01% (IC95%: 0.28% – 2.57%).

Además, mediante cultivo bacteriológico, de las muestras de tejido

colectadas de los 395 animales, se logró determinar una prevalencia

aparente de Mycobacterium bovis de 1.52% (IC95% = 0.56% – 3.28%),

logrando confirmar el microorganismo en una de las lesiones encontradas. Al

analizar los factores biológicos y de procedencia en relación con la

positividad de lesiones visibles (LV) y de M. bovis, no se logró determinar

que la edad, el biotipo, el sexo y la procedencia de los animales estuvieran

asociados a una mayor probabilidad de presentar lesiones macroscópicas

compatibles con la enfermedad o M. bovis. En conclusión, los resultados

sugieren ser corroborados con otros estudios de mayor escala, de tal manera

que podrían ayudar a desarrollar estrategias para el control y erradicación de

la tuberculosis bovina.

Palabras claves: CULTIVO BACTERIOLÓGICO / FACTORES DE RIESGO /

INSPECCIÓN POST-MORTEM / MATADERO / TUBERCULOSIS BOVINA.

xii

Prevalence of bovine tuberculosis (BTB) found through post-mortem inspection and bacteriologic culture in the Municipal Slaughterhouse

in Mejía Canton, Pichincha Province.

ABSTRACT

The current research is a transversal study on prevalence of bovine tuberculosis (BTB) in the Municipal Slaughterhouse in Mejía Canton, Pichincha Province, Ecuador. Sampling was taken from May 27, to July 17, 2013. A total of 395 animals were undertaken a post-mortem (IP) microscopic exam, after which an apparent prevalence of disease-compatible injuries was found in 1.01% (IC95%: 0.28% – 2.57%). Additionally, through a bacteriologic culture of tissue collected from 395 animals, an apparent prevalence of Mycobacterium bovis 1.52% (IC95% = 0.56% – 3.28%) was found, which confirmed the presence of the microorganism in one of the injuries. When biologic factors and origin were analyzed in relation to positive presence of M. bovis in visible injuries (VI), age, biotype, sex and origin of animals associated to a higher probability of having compatible macroscopic injuries compatible with the disease or M. bovis were not determined. It has been suggested to confirm results with further and larger scale studies, so as to produce strategies to control and eradicate bovine tuberculosis. Keywords: BOVINE TUBERCULOSIS / BACTERIOLOGIC CULTIVATION / POST-MORTEM INSPECTION / SLAUGHTER HOUSE / RISK FACTORS.

INTRODUCCIÓN

La tuberculosis fue reconocida en 1888 como la principal causa de muerte en

el hombre, además, los signos clínicos propios de la enfermedad también

han sido reportados en el ganado y en otros animales domésticos

(McFadyean 1888; citado en Pritchard, 1988). La tuberculosis bovina (TBB)

se trata de una enfermedad crónica e infecto-contagiosa causada por

bacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis que desarrollan lesiones

granulomatosas en diferentes órganos. (Cousins, 2001; Phillips et al., 2003;

Herrera-León et al., 2009). La principal vía de ingreso del patógeno, es la vía

respiratoria (Whipple et al., 1996; Acha & Szyfres 2001; Goodchild & Clifton-

Hadley, 2001). En el ganado bovino, Mycobacterium bovis ha demostrado

ser el principal patógeno que produce la enfermedad (Amanfu, 2006), o

puede permanecer en un estado de latencia en el animal (Acosta-Salinas et

al., 2009).

Datos fiables de prevalencia de la enfermedad es una condición previa para

plantear un programa de control y erradicación adecuado (Ngandolo et al.,

2009); por lo tanto, la inspección veterinaria (IV) puede ser una herramienta

útil que ha demostrado ser un buen indicador de la presencia de TBB, ya que

permite identificar lesiones, principalmente, a nivel de ganglios linfáticos y

pulmones (Whipple et al., 1996; Biffa et al., 2010), además, la aplicación de

varios métodos de laboratorio, permite dar un diagnóstico más seguro

(Medeiro et al., 2010).

La información disponible sobre los factores de riesgo, tienen importancia

epidemiológica, ya que se puede entender la compleja interacción entre el

agente, el huésped y el medio ambiente (Reyes-Hernández, n.d.) o la

dinámica entre animales domésticos, de vida silvestre y seres humanos, que

mantiene la enfermedad (Palmer et al., 2012). Esta información podría

permitir implementar medidas de control de la enfermedad a nivel de

individuo, manada, región o país (Humblet et al., 2009).

14

Existen estudios aislados de prevalencia de tuberculosis bovina en diferentes

áreas geográficas del Ecuador, desde el año 1972 hasta el 2011. Se han

utilizado diferente métodos de diagnóstico, sin lograr estimar una prevalencia

de la enfermedad a nivel nacional, por lo tanto, el programa nacional para el

control y erradicación de la enfermedad no se puede aplicar de manera

correcta ( Gil & Samartino, 2000; Proaño-Pérez et al., 2006; Espinoza, 2011;

León, 2011; Proaño-Pérez et al., 2011b; Echeverría, 2014).

Si bien, se está aplicando una política de prueba de tuberculina y sacrificio

de los animales reactores positivos, con resultados a largo plazo, se puede

hacer uso de exámenes complementarios con el fin evaluar y evitar falsos

positivos, sobre todo en la última fase del programa. Por lo tanto, se realizó

una investigación de prevalencia de la TBB mediante inspección post-

mortem y cultivo bacteriológico en el Matadero Municipal del Cantón Mejía de

la Provincia de Pichincha-Ecuador.

15

CAPÍTULO I

EL PROBLEMA

Planteamiento del problema

La Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) clasifica a la TBB como

una enfermedad de declaración obligatoria (OIE, 2010), que tiene gran

distribución en el ganado bovino a nivel mundial (Michel et al., 2010). Causa

pérdidas económicas en la producción ganadera, restricciones comerciales,

muerte del animal (Cousins, 2001; Milian-Suazo et al., 2003; Zinsstag et al.,

2006) y es un potencial riesgo para la salud humana (de Kantor et al., 2012).

En América Latina el concepto de eliminar todo animal positivo a una prueba

de tuberculina en la práctica pocas veces se cumple, esto podría depender

principalmente de las políticas de Estado y la colaboración del productor (Gil

& Samartino, 2000). Además, el limitado uso de pruebas de laboratorio y la

poca eficacia en la inspección post-mortem por falta de inspectores

veterinarios y personal altamente calificado (de Kantor & Ritacco, 2006;

Proaño-Pérez et al., 20011b), ha complicado aplicar un sistema de control de

la enfermedad y de la vigilancia epidemiológica (FAO, 2012).

En el Ecuador, el incremento de cabezas de ganado de 3.6% para el año

2011, en la región sierra del país (INEC, 2011; Proaño-Pérez et al., 2011b),

probablemente, favorece el mantenimiento y propagación de la infección por

M. bovis, debido al contacto directo (Palmer et al., 2004). Además, la

enfermedad no cuenta con registros adecuados de los animales positivos a

las diferentes pruebas ante-mortem y post-mortem (Proaño-Pérez et al.,

2011b), para realizar una correcta trazabilidad del ganado afectado hasta la

explotación de origen y su posterior control (de Kantor et al., 2008).

16

Justificación

Con esta revisión de la situación de la enfermedad se evidenció la necesidad

de realizar, este estudio, en el Matadero Municipal del Cantón Mejía, debido

a que se sacrifican, principalmente, bovinos procedentes del Cantón Mejía,

donde se desarrolla una ganadera orientada, principalmente, a la industria

lechera, presenta antecedentes de la TBB (Proaño-Pérez et al., 2011a), alta

densidad y movilización del ganado (GAD, 2013). Se puede obtener

información útil de la presencia, distribución geográfica y posibles factores de

riesgo que mantienen la enfermedad (Good & Duignan, 2011).

Una de las estrategias utilizada en la vigilancia de la TBB, es la inspección

veterinaria (Corner, 1994), a pesar de que tiene sus desventajas a la hora de

identificar lesiones compatibles con la enfermedad (Biffa et al., 2010). Las

pruebas de laboratorio, por lo tanto, son necesarias para confirmar las

diferentes lesiones e identificar micobacterias involucradas (Proaño-Pérez et

al., 2011b), pero si se quiere utilizar como estrategia de vigilancia

epidemiológica, se tiene que considerar costos y otros recurso (Fischer et al.,

2005).

Siendo este estudio parte del proyecto “Epidemiología molecular de la

Tuberculosis bovina zoonótica y animal en la sierra central del Ecuador”,

llevada a cabo por el Centro Internacional de Zoonosis, los resultados

obtenidos aportarían con información útil para posteriores investigaciones

relacionadas, además podría formar parte de una base de datos

epidemiológica actualizada que permita el planteamiento de políticas, para

apoyar el programa de control y erradicación de la enfermedad, llevado a

cabo por los Organismos del Estado, del mismo modo beneficiaría la salud

humana, animal y al sector agropecuario en lo que respecta a pérdidas

económicas.

17

Objetivos

General

Determinar la prevalencia aparente de tuberculosis bovina mediante métodos

de diagnóstico de inspección macroscópica post mortem y cultivo

bacteriológico en ganado bovino faenado en el Matadero Municipal del

Cantón Mejía ubicado en la Provincia de Pichincha.

Específicos

Determinar la prevalencia aparente de TBB mediante inspección

macroscópica post-mortem de tejidos lesionados compatibles con la TBB en

ganado bovino faenado en el Matadero Municipal del Cantón Mejía.

Determinar la prevalencia aparente de TBB mediante aislamiento de

Mycobacterium bovis por cultivo bacteriológico a partir de muestras de tejidos

ganglionar y pulmonar, recolectadas del ganado bovino faenado en el

Matadero Municipal del Cantón Mejía.

Analizar los posibles factores de riesgo asociados a la presencia de TBB en

la zona de estudio a partir de los resultados de los animales muestreados.

18

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

Antecedentes

Proaño-Pérez et al. (2011a) en el estudio, titulado “Examen post-mortem y

análisis de laboratorio para el diagnóstico de tuberculosis bovina en el

ganado lechero en el Ecuador”, comparó el desempeño de las

herramientas diagnósticas más utilizadas para identificar M. bovis en

muestras de tejido, de los animales que fueron examinados en un periodo

entre febrero y marzo en los años 2007 y 2008, llegando a inspeccionar

1.390 bovinos en el Matadero de Machachi del Cantón Mejía, en 29

intervenciones. En esta investigación se determinó una prevalencia aparente

de lesiones visibles (LV) de 2.33% (16/687) y 2.42% (17/703) en los años

2007 y 2008, respectivamente, mismas que fueron confirmadas mediante

cultivo bacteriológico, dando 36.4% (12/33) de M. bovis. Se concluyó que se

requiere el uso de varias herramientas para un diagnóstico fiable.

Espinosa (2011) en la tesis de grado, titulada “Determinación de la

prevalencia de Mycobacterium spp. de animales faenados y del

personal de los camales municipales de Tungurahua”, determinó una

prevalencia aparente de 8% (87/1051) por inspección veterinaria,

estableciendo en el Camal Municipal de Pelileo una prevalencia de 17.92%

(55/307), a diferencia del Camal Municipal de Ambato que fue de 4.30%

(32/744), los resultados en el Camal de Pelileo pueden ser debido a que la

mayor parte de animales sacrificados fueron hembras (81.11%) dedicadas a

la producción lechera, y porque no existe un control riguroso en los permisos

pertinentes para el faenamiento.

19

Según León (2011) en el estudio, titulado “Prevalencia de Mycobacterium

spp. en humanos y bovinos en el Hospital Raúl Maldonado Mejía y en el

Camal Municipal de Cayambe”, determinó una prevalencia aparente de

Mycobacterium spp. mediante baciloscopía y cultivo in vitro, además de

analizar los factores de riesgo. Los resultados de prevalencia aparente de

Mycobacterium spp. y de M. bovis fue de 1.08% (3/279) y 0.72% (2/279)

respectivamente, encontrando asociación significativa entre la infección/la

procedencia del ganado, y aunque no hubo asociación entre la infección/el

sexo del animal, todos los casos positivos se presentaron en hembras.

Fundamentación teórica

Definición

El nombre de tuberculosis bovina está dado ya que el ganado bovino es el

principal hospedero de M. bovis (Michel et al., 2010), patógeno, de lento

crecimiento que produce lesiones granulomatosas en los órganos y ganglios

linfáticos regionales a la infección, puede llegar a transmitirse principalmente

por vía aerógena, y afectar a los animales domésticos, de vida silvestre y al

ser humano (Cousins, 2001; Acosta-Salinas et al., 2009; OIE, 2011).

Historia

En 1882, Robert Koch descubre el bacilo causante de la tuberculosis

(Boschung & Schopfer, 1995) y en 1890 desarrolla el purificado proteico

(tuberculina) necesario para identificar la infección causada por el bacilo

tuberculoso (Mechnikov, 2003; Gradmann, 2006). En 1902, Dorset basado

en los estudios iniciales de Robert Koch, desarrolla el actual medio de

cultivo, Löwenstein Jensen, al agregar huevos de gallina, nutrientes e

inhibidores. En 1921, Calmette y Guérin desarrollan una vacuna (BCG) con

una variante atenuada de M. bovis, aplicable al ser humano (Ledermann,

2003).

20

Durante los años 1915 a 1929, Smith establece que el bacilo de la

tuberculosis bovina y humana difiere en muchos aspectos relacionados con

su patogenicidad, además se le atribuye el aislamiento de M. bovis en el año

de 1898 ( Smith, 1898; Schultz, 2008).

La enfermedad ha presentado una distribución mundial a lo largo de los años

y, en el continente americano la tuberculosis bovina tiene 17.000 años de

antigüedad, al confirmar micobacterias pertenecientes al complejo

Mycobacterium tuberculosis (CMTB) en una muestra de esqueleto de bisonte

que presentaba una lesión compatible con TBB (Rothschild et al., 2001).

Clasificación taxonómica

Las micobacterias están ubicadas taxonómicamente en la familia

Mycobacteriaceae, género Mycobacterium, que cuenta con más de 120

especies diferentes (Dorronsoro & Torroba, 2007), las mismas que se

encuentran divididas en 2 grandes grupos que son: las del CMTB y las

micobacterias no tuberculosas o atípicas (MNT) (Tortoli, 2006).

El CMTB engloba 9 especies que afectan a diversos huéspedes: M.

tuberculosis (humanos), M. bovis (ganado bovino) (Karlson & Lessel, 1970),

Mycobacterium bovis BCG (derivado atenuado de la cepa de M. bovis)

(Thoen et al., 2006), Mycobacterium africanum (humanos en el continente

africano), Mycobacterium canettii (humanos) (Van Soolingen et al., 1997),

Mycobacterium microti (pequeños roedores y humanos) (Van Soolingen et

al., 1998), Mycobacterium caprae (ganado caprino) (Aranaz et al., 2003),

Mycobacterium pinnipedi (especialmente a pinnípedos) (Cousins et al., 2003)

y Mycobacterium mungi (mangostas) (Alexander et al., 2010) (ver Cuadro

1). Por otro lado, estudios de análisis del genoma de Mycobacterium

comprueban que M. canetti es la especie ancestral del CMTB (Thoen et al.,

2009).

21

EL grupo de MNT son micobacterias ambientales u oportunistas distribuidas

en el medio ambiente (Dorronsoro & Torroba, 2007), dentro de este grupo se

considera de importancia en la ganadería a Mycobacterium avium ssp.

paratuberculosis, por causar la enfermedad de Johne en el ganado bovino

(Yamasaki et al., 2013).

Cuadro 1.- Clasificación taxonómica

REINO Bacteria

PHYLUM Actinobacteria

CLASE Actinobacteria

SUBCLASE Actinobacteridae

ORDEN Actinomicetales

SUBORDEN Corynebacterineae

FAMILIA Mycobacteriaceae

GENERO Mycobacterium (único género)

Especies del

Complejo

Mycobacterium

tuberculosis

M. tuberculosis

M. bovis

M. bovis BCG

M. africanum

M. microti

M. canettii

M. caprae

M. pinnipedii

M. mungi

Fuente: Karlson & Lessel, (1970); Van Soolingen et al. (1997); Van Soolingen et al. (1998); Aranaz et al. (2003); Cousins et al. (2003); Garrity et al. (2004); Thoen et al. (2006); Alexander et al. (2010).

Elaboración: El autor

22

Género Mycobacterium

La tuberculosis es causada por una bacteria ácido alcohol resistente, tiene

una forma de bacilo, alargada, ligeramente curva, inmóvil y no esporulada,

con un tamaño entre 1-10 µm de longitud y 0.2-0.6 µm de diámetro (Velayati

& Farnia, 2012). La característica principal del género es su pared celular

que posee un alto contenido de lípidos (20-60%), principalmente ácidos

micólicos (Barry et al., 1998). También se ha descrito una capa serosa que le

brinda a la membrana características de solidez, hidrofobicidad, resistencia a

antimicrobianos y a la desecación (Daffé & Draper, 1998), propiedades

patogénicas y también está involucrada en la lenta tasa de crecimiento

(Barrera, 2007; Forbes et al., 2009), sin embargo, son muy sensibles al calor,

luz solar, radiación ultravioleta y la pasteurización (Biberstein & Hirsh, 1999).

Estructura

El género está representado esquemáticamente por una membrana

plasmática, una pared celular, una membrana externa (Chatterjee & Khoo,

1998) y cuando se trata de micobacterias patógenas posee una cápsula

(Zuber et al., 2008) que consta de polisacárido, proteínas y restos de lípidos

que impiden la difusión de macromoléculas hacia el interior (Daffé & Etienne,

1999).

La membrana plasmática se encuentra rodeada de carbohidratos, lípidos y

proteínas que juega un papel importante en los procesos patológicos (Daffé

& Draper, 1998).

La pared celular está constituida por péptidoglicanos unidos de manera

covalente al arábino-galactano, el cual, están a su vez unidos a los ácidos

micólicos (Brennan, 2003), además contienen proteínas intercaladas

responsables de la construcción de la pared (Barrera, 2007) y otras proteínas

llamadas porinas necesarias para el transporte de solutos a través de la capa

de ácidos micólicos (Forrellad et al., 2013).

23

Anclados a la membrana plasmática y al exterior de la pared se encuentran

los glicolípidos, estructuras específicas altamente antigénicos, que son

potentes para el serodiagnóstico de las infecciones micobacterianas (López

et al., 2006). El complejo mycolyarabinogalactano-peptidoglicano (POP)

constituye el núcleo de la pared, mientras que el lipoarabinomanano (LAM)

tiene funciones fisiológicas como facilitar la entrada de la bacteria al

macrófago e inhibir la unión fago-lisosomal (Chatterjee & Khoo, 1998),

también lipomanano (LM) y fosfatidilmioinositol (PIM) están involucrados en

la respuesta inmune, importante para la patogénesis del agente infeccioso

(Kaur et al., 2009).

La membrana externa está compuesta por ácidos micólicos, hidratos de

carbono, lípidos y algunas proteínas responsables de las características

antigénicas de la bacteria (Hoffmann et al., 2008).

Factores de virulencia

Según Sakamoto, 2012, los factores de virulencia pueden ser proteínas o

componentes de la pared como: el factor cordón que en micobacterias del

complejo Mycobacterium tuberculosis forma estructuras que se parecen a

cuerdas (Julián et al., 2010), con características de ejercer toxicidad por

alteración en la cadena respiratoria mitocondrial (Brennan, 2003); los

sulfolípidos que están involucrados en la inactivación del fagosoma de los

macrófagos (Rivera & Giménez, 2010) y la enzima superóxido dismutasa que

actúa inhibiendo la apoptosis (Edwards et al., 2001). Por otro lado, también

existen receptores como el CR3, que inhiben los mecanismos microbicidas

del macrófagos, permitiendo el ingreso y persistencia del patógeno en el

interior de la célula hospedera (Álvarez et al., 2009).

Toda esta participación y efectos acumulativos de los lípidos y proteínas de

las micobacterias, le permiten multiplicarse dentro de la células e inducir una

respuesta mientras escapa de la célula huésped, para favorecer el desarrollo

de la enfermedad (McNeil & Brennan, 1991; Young et al., 1988).

24

Mycobacterium bovis

Es un patógeno intracelular obligado que reside dentro del fagosoma de los

macrófagos (Jordao et al., 2008), difiere de otras especies del género en

virulencia, estabilidad y antigenicidad (Skuce & Neill, 2001) e inclusive es

resistente al fármaco pirazinamida, debido a que produce la inactivación de

la enzima pirazinamidasa, sin embargo, se han descrito subtipos de M. bovis

sensibles a pirazinamida (Niemann & Rüsch-Gerdes, 2000). Además, M.

bovis metaboliza piruvato en lugar de glicerol como principal fuente de

carbono (Garnier et al., 2003). La tasa de supervivencia del bacilo en el

ambiente varía de acuerdo a la disponibilidad de nutrientes y condiciones

climáticas (Morris et al., 1994).

El genoma de este patógeno tiene una similitud del 99.95% a nivel de

nucleótidos con M. tuberculosis (Garnier et al., 2003). A nivel estructural

contiene 65.63% de G-C (Guanina - Citosina), necesaria para el metabolismo

de ácidos micólicos y estabilidad estructural (Portillo et al., 2007). Su tamaño

reducido se atribuye a las delecciones que presenta en el genoma (Hewinson

et al., 2006).

Patogénesis

En lo que se refiere a la patogénesis de Mycobacterium bovis, se ha

considerado para su estudio: las fuentes, vías de infección, respuesta

inmunitaria y la patología (Neill et al., 1986), que muchas veces no es bien

entendida como la tuberculosis en los humanos (Palmer & Ray, 2006).

Fuentes

La especie de M. bovis tiene una amplia gama de huéspedes, que incluyen

animales domésticos, silvestres, primates no humanos y humanos (Biet et al.,

2005), demás se encuentra en el medio ambiente, persistiendo por varios

días e incluso semanas o meses en el maíz, heno, tierra y agua, bajo

condiciones favorables (Fine et al., 2011).

25

Transmisión y vías de infección

La transmisión directa es a través de la vía aerógena mediante aerosoles, la

cual es más común en el ganado, debido al contacto directo con el animal

infectado (Menzies & Neill, 2000). También la transmisión puede ser

indirecta, por ingestión de productos derivados y a través del agua o los

alimentos que se encuentran contaminados por secreciones nasales, orina o

heces de los animales infectados (Morris et al., 1994; Biet et al., 2005).

Aunque la transmisión horizontal es la más frecuente (Cousins, 2001), la

transmisión vertical también puede darse mediante vía congénita (Perdomo

& Pauller, 1986), principalmente, través de los vasos umbilicales (Neill et al.,

1994).

Proceso patológico

El principal agente causal de la tuberculosis en el ganado es M. bovis, que

puede afectar a otros huéspedes susceptibles como: seres humanos,

primates no humanos, cabras, gatos perros, zorros, cerdos, caballos, llamas,

alpacas, tejones, comadrejas, camellos, ciervos, búfalos y bisontes (O’Reilly

& Daborn, 1995; Szewzyk et al., 1995).

Una vez que el patógeno toma contacto con la superficie de la mucosa de un

individuo inicia la fagocitosis mediada por los macrófagos alveolares,

originando una lesión inflamatoria inespecífica con reclutamiento de

leucocitos (Sakamoto, 2012), que formarán una capa alrededor de los bacilos

vivos y muertos produciendo una pequeña lesión necrótica en la zona de

ingreso y en las regiones análogas, que es conocida como una fase de

expresión de inmunidad protectora (Ebnet & Vestweber, 1999; Saunders &

Cooper, 2000).

26

Inmunidad

La inmunidad celular contra infecciones micobacterianas inicia a los 10 a 15

días posteriores al primer contacto (Rey-Pérez et al., 1992), está mediada

principalmente por células, produciéndose una interacción de los macrófagos

con los linfocitos T (Neill et al., 2001). La manifestación de la inmunidad

celular frente a la antigenicidad de la pared celular da lugar a la formación del

granuloma (Cooper et al., 1993), que está compuesto por macrófagos

centrales infectados, rodeados de macrófagos epitelioides, células

espumosas, células gigantes multinucleadas, linfocitos periféricos y tejido

alveolar condensado o una cápsula fibrosa (Neill et al., 1994; Sakamoto,

2012), que puede llegar a caseificarse por una desregulación del

metabolismo de los lípidos del huésped, provocada por las micobacterias, o

finalmente puede calcificarse (Neill et al., 1994; Kim et al., 2010).

Las micobacterias virulentas fagocitadas por macrófagos pueden sobrevivir al

inhibir la fusión del fagosoma con el lisosoma, la misma que normalmente

ocurre para destruir al bacilo (Lobue et al., 2010), o también pueden

sobrevivir de modo extracelular dentro del granuloma (McCune et al., 1965).

Fases de la enfermedad

En el curso de la enfermedad se distinguen cronológicamente tres fases:

La fase de primo-infección, que da lugar a la formación del complejo primario

(respiratorios, digestivos, hepáticos o renal), que es la aparición de lesiones

en el órgano de penetración y su ganglio dependiente. En el pulmón, la

lesión primaria puede darse en la zona sub-pleural de la porción dorso-

caudal del lóbulo diafragmático del pulmón o en el lóbulo craneal (Perdomo &

Pauller, 1986; Menin et al., 2013). El complejo primario puede evolucionar a

una curación total, a una bacilemia sin reacción tisular, a un estado de

latencia o a una bacilemia con reacción tisular por la diseminación del bacilo

por las diferentes vías (Perdomo & Pauller, 1986; SAG, 2004).

27

La fase post-primaria es la que ocurre debido a una infección sobreaguda,

dada por los bacilos adquiridos del exterior (reinfección exógena) o por una

reactivación de los focos preexistente de la fase de primo-infección

(reinfección endógena). La diseminación es por difusión canicular (bronquios

y bronquiolos en el pulmón, túbulos renales en el riñón, conductos

galactóforos en la glándula mamaria, etc.) en el pulmón, riñón, glándula

mamaria, hígado y útero. Estas lesiones se asientan en un solo órgano,

razón por la cual se denomina “tuberculosis crónica del órgano” (Perdomo &

Pauller, 1986; SAG, 2004).

La fase de agravamiento ocurre debido a que la resistencia adquirida por la

exposición al bacilo es vencida, posiblemente porque el animal se encuentra

en un estado de inmunodepresión debido a una subalimentación,

agotamiento, enfermedades intercurrentes, gestación, periodo de lactancia,

entre las principales razones (Perdomo & Pauller, 1986).

Excreción y periodo de incubación

La eliminación del microorganismo se produce por diferentes vías, siendo en

mayor cantidad en el último estadío de la infección a través de los diferentes

fluidos corporales como saliva, leche, orina, secreciones vaginales y semen,

además de ser excretadas por las heces (Jha et al., 2007; Srivastava et al.,

2008; CFSPH, 2009).

Los signos de la tuberculosis tardan meses (15 - 34) en desarrollarse en el

ganado (Perez et al., 2002) o pueden presentarse después de varios años

cuando el animal es sometido a un periodo de estrés o se encuentra en una

edad avanzada (CFSPH, 2009).

28

Epidemiología

Mundial

Según datos del Sistema Mundial de Información Zoosanitaria (WAHID) de la

OIE, 70 países notificaron casos de TBB en el año 2010, 49 países en el año

2011 y diferentes países de África, Europa, Asia y América Latina siguen

notificando para el año 2012 y 2013 (OIE, 2014) (ver Gráfico 1).

Gráfico 1.- Distribución de la enfermedad en el periodo Enero - Junio del 2013.

Fuente: OIE (2014)

Según la FAO (2012), la aplicación de programas de vigilancia en países

desarrollados como: Australia, Eslovaquia, Estonia, Lituania, Letonia,

Luxemburgo, Republica Checa, Canadá, Singapur, Jamaica, Barbados e

Israel han logrado erradicar la enfermedad (Thoen et al., 2009); mientras

que, en Irlanda, Nueva Zelanda, Gran Bretaña y partes de América del Norte

no se encuentran libres de la enfermedad, debido a que animales silvestres

actúan como reservorios de la infección para el ganado (Corner, 2006; Thoen

29

et al., 2009). En los países del continente africano, en Asia y en

Latinoamérica la enfermedad va en aumento (Thoen et al., 2009).

América Latina y el Caribe

En América Latina y el Caribe existen aproximadamente 374 millones de

cabezas de ganado, encontrándose el 70% en países donde la tasa de

infección es mayor al 1 % y el 30% en países donde la tasa de infección es

menor al 1 %, incluido 62 millones de bovinos donde la infección es

prácticamente nula (de Kantor & Ritacco, 2006). También se han reportado

regiones con muy baja prevalencia de TBB en las islas del Caribe, con

prevalencia intermedia en México y otros países de Centro América, y con

prevalencia alta en Argentina, Brasil y Ecuador (de Kantor & Ritacco, 2006;

López et al., 2006).

En América Latina, el 24% de la población bovina no están bajo ningún

sistema de control o vigilancia epidemiológica, por lo que países como

Argentina, Bolivia, Chile, Perú, Guayana y Ecuador presentan mayor

prevalencia de TBB en un total de 265.1 millones de cabezas de ganado

bovino, con mayor importancia en explotaciones lecheras (Abalos &

Retamal, 2004; de Kantor & Ritacco, 2006; de Kantor et al., 2008).

Ecuador

Los casos de TBB en Ecuador no está bien documentada, cuantificada o no

se tiene información oficial reportada (de Kantor & Ritacco, 2006, Proaño-

Pérez, 2011b). La prevalencia de TBB al utilizar pruebas de

tuberculinización e inspección post-mortem varía en el tiempo, entre las

distintas provincias, y cantones ( Proaño-Perez et al., 2006; Proaño-Pérez et

al., 2011b). Mediante Inspección veterinaria se han realizado estudios en el

cantón Mejía, demostrando una prevalencia de lesiones macroscópicas de

2.33% y 3.34% en los años 2007 y 2008 respectivamente (Proaño-Pérez et

al., 2011a).

30

Factores de riesgo

Según Humblet et al. (2009), los factores de riesgo pueden existir a nivel del

animal, del rebaño y de la región o país. Además, factores ambientales y

dinámica entre la vida silvestre, el ganado doméstico y los seres humanos

favorecen la presentación de la enfermedad (Kaneene et al., 2002; Palmer et

al., 2012).

A nivel individual, se ha mencionado que el ganado de edad avanzada tiene

más probabilidad de estar expuesto a la enfermedad (Kazwala et al., 2001).

Además las vacas son más afectadas por la infección, al estar relacionadas

con prácticas de manejo referente a la producción lechera (Humblet et al.,

2009). El riesgo elevado de contraer la enfermedad está asociado a los

bovinos de raza pura en comparación con bovinos propios de la zona

geográfica (Omer et al., 2001). Otras causas que contribuyen a la aparición

de la enfermedad son la condición corporal del animal causada por una mala

alimentación (Griffin et al., 1993), y la inmunodepresión que puede ser

aumentada por el virus de la diarrea viral bovina (de La Rua-Domenech et

al., 2006).

A nivel de rebaño, el riesgo de contraer la enfermedad aumenta al estar

asociado con el mayor tamaño del hato (Porphyre et al., 2008) o rebaños

lecheros (Barlow et al., 1997), posiblemente por estar confinados en un

espacio reducido (Ameni et al., 2006). También ocurre por la introducción de

animales infectados a rebaños libres de TBB (Johnston et al., 2005).

Los factores que influyen para que prevalezca la TBB en una región o país

son la historia de la tuberculosis en el ganado en esa zona (White & Benhin,

2004) y/o los brotes esporádicos (Aranaz et al., 2004).

31

Diagnóstico

Clínico

La enfermedad puede ser subclínica (Budka et al., 2003) y presentar signos

clínicos en fases tardías (Acha & Szyfres, 2001), o también puede seguir un

curso rápidamente progresivo (González et al., 2007), por lo que el examen

clínico tiene un valor limitado (Strain et al., 2011).

Los signos clínicos que pueden evidenciarse son: aumento del tamaño de los

ganglios linfáticos, pelo áspero, emaciación progresiva, fiebre fluctuante,

debilidad, falta de apetito, flaqueza extrema y dolor respiratorio agudo y,

dependiendo del órgano afectado, las manifestaciones son tos, disnea,

taquipnea, ganglios linfáticos dilatados obstruyendo vías respiratorias, vasos

sanguíneos y tracto alimentario con manifestaciones de diarrea intermitente o

estreñimiento (CFSPH, 2009; OIE, 2009).

Inspección veterinaria (IV)

Este examen tiene una sensibilidad (Se) para inspecciones ordinarias en

matadero de 28.2% y una especificidad (Sp) para las lesiones identificadas

como tuberculosis de 99.3% (Biffa et al., 2010). Se realiza a nivel de camales

y consiste en una búsqueda macroscópica de lesiones tuberculosas de tipo

granulomatoso, caseoso o mineralizado (Corner, 1994) en tejidos como los

nódulos linfáticos (NL) y órganos que pueden estar relacionados con las vías

de ingreso del microorganismo (Corner et al., 1991).

Hay que tomar en cuenta que no todos los animales infectados con M. bovis

presentan lesiones visible (LV) (Corner, 1994) y dependiendo de los

protocolos no todas las lesiones son identificadas por los inspectores

encargados (Schiller et al., 2011) posiblemente porque no todas las áreas

son examinadas (Biffa et al., 2009). Además, las lesiones granulomatosas

pueden ser causados por otros microorganismos, como las micobacterias no

tubeculosas ( Zumla & James, 1996; Oloya et al., 2007).

32

Baciloscopía

La sensibilidad y especificidad de la baciloscopía en comparación con el

cultivo in vitro es de 43.5% y 94.4% respectivamente (Proaño-Pérez et al.,

2011a). La técnica de Ziehl-Neelsen se fundamenta en colorear bacilos ácido

alcohol resistentes (BAAR), en la cual se requiere que el colorante primario,

carbol fucsina, penetre en la pared de la micobacteria (Harada, 1976) y una

vez teñida resista a la decoloración por el ácido alcohol, encontrándose a

microscopia bacilos de color rojo contrastando con un fondo de color azul por

el uso del colorante azul de metileno como medio de contraste (Koneman &

Allen, 2008).

Esta técnica es barata, práctica y con resultados rápidos (Ayele et al., 2004)

pero su desventaja es que no diferencia especies de micobacterias (Vitale et

al., 1998). Para obtener una baciloscopía positiva la cantidad de bacilos

presentes en la muestra debe ser mayor a 1 X 104 bacilos por mililitro

(Diguimbaye, 2004), sin embargo, si la muestra para baciloscopía se procesa

pasados los 10 minutos, aumentaría el número de muestras positivas

(Cambanis et al., 2007).

Cultivo bacteriológico

El cultivo bacteriológico sigue siendo una prueba gold standard, no obstante

hay problemas de sensibilidad (Se) y especificidad (Sp), 53% y 88%

respectivamente (Estrada-Chávez et al., 2004; OIE, 2009; Rivera & Giménez,

2010). Esta prueba se utiliza, principalmente, para confirmar animales

reactores positivos a la prueba de tuberculina, a partir de muestras de tejido

obtenidas de pulmones y ganglios linfáticos (Medeiros et al., 2010), y/o

confirmar lesiones macroscópicas compatibles con la tuberculosis

(Diguimbaye et al., 2006).

Las muestras como esputo, leche, ganglios y órganos deben ser

descontaminados para eliminar microorganismos competitivos (Medeiros et

33

al., 2010). La descontaminación se realiza con Hidróxido de sodio (NaOH)

seguido de un ácido para su neutralización (Dundee et al., 2001),

posteriormente se inocula en el medio selectivo Stonebrink que contiene

piruvato (Adams, 2001) y se incuba a 37 0C en oscuridad (Young et al.,

2005), en una atmósfera con 9% de dióxido de carbono (Corner &

Nicolacopoulos, 1988). Finalmente, se observa el crecimiento de las

micobacterias semanalmente hasta la octava semana, registrando la

velocidad de crecimiento (Corner et al., 2012) y morfología de las colonias

basados en la apariencia (Lévy-Frébault & Portaels, 1992). Las colonias de

M. bovis son lisas, redondeadas y de color beige (OIE, 2009).

El aislamiento de M. bovis se ve influenciado por los procedimientos de

descontaminación, medios de cultivo empleados, las condiciones de la

incubación (Corner, 1994), además, se debe considerar la cantidad de

bacilos en muestras digeridas y concentradas superiores a 10 bacilos/ml para

conseguir un cultivo positivo (Nava & Prieto, 2001).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

El diagnóstico de M. bovis por PCR tiene igual o mayor sensibilidad,

siempre que se lo haga a partir de colonias de bacilos ácido alcohol

resistente (Mangiapan et al., 1996; Rodríguez et al., 1999), en lugar de

utilizar muestras biológicas del ganado bovino (Mangiapan et al., 1996).

Control y prevención

Como principal medida de control se realiza la tuberculinización y la

eliminación de los bovinos reactores positivos a la prueba, mediante

faenamiento (SENASA, 2010). Además se deben mejorar los sistemas de

cría del ganado, reducir al mínimo el hacinamiento, mejorar la ventilación de

los establos (Ameni et al., 2010), efectuar medidas de limpieza y desinfección

en las instalaciones (CFSPH, 2009; Torres, 2009b) y aplicar medidas de

bioseguridad a nivel de rebaño (Fine et al., 2011). Finalmente, el control debe

34

ejecutarse a nivel de los reservorios de M. bovis (Morris et al., 1994), fuentes

y vías de transmisión (Biet et al., 2005).

La inspección veterinaria puede ser aplicada para evaluar los programas de

control (Latini et al., 1997) que deben ir apoyados con un sistema de

trazabilidad del ganado más el reporte de información de tipo sanitario (de

Kantor et al., 2012). Todos estos principios de lucha contra la enfermedad

deben ser empleados de manera sostenida para tener éxito en los resultados

(Collins, 2006). Siendo la TBB una enfermedad zoonótica, se debe

considerar la pasteurización de la leche, buen tratamiento térmico de la carne

y medidas de precaución al contacto con los animales infectados (Ayele et

al., 2004).

Vacunación

La vacunación no está recomendada por organismos internacionales por la

eficacia baja que tiene y la posibilidad de reacciones cruzadas con la prueba

de tuberculina (López et al., 2006). Sin embargo, se ha demostrado que la

vacuna con la cepa M. bovis BCG ejerce una reducción de la carga

bacteriana, del número y tamaño de lesiones, evitando la diseminación de la

enfermedad (Buddle et al., 1999; Cai et al., 2005).

35

CAPÍTULO III

METODOLOGÍA

Diseño de la investigación

Se realizó un estudio epidemiológico observacional transversal (Dohoo et al.,

2003) de la tuberculosis bovina y el análisis de los posibles factores que

favorecen la presencia de LV e infección por M. bovis. El estudio estuvo

dividido en dos fases: a) El de campo que, comprendió la inspección

macroscópica post-mortem en busca de lesiones compatibles con la TBB,

para lo cual se examinó las unidades de muestreo a intervalos iguales

(muestreo sistemático) llegando a un total de 395 bovinos, de manera

paralela se tomó muestras de los tejidos ganglionar y pulmonar. Además, se

registró los datos de cada individuo como la edad, biotipo, sexo y

procedencia para determinar asociación entre las variables de estudio (ver

Anexo A). b) El de laboratorio, en el cual se preparó las muestras tomadas

en el matadero, para el aislamiento e identificación de M. bovis.

Descripción de la zona de estudio

El presente estudio se llevó a cabo en el Cantón Mejía, ubicado al sur-oriente

de la Provincia de Pichincha, con una superficie de 1.459 Km2, conformado

por una ladera occidental, meseta andina (2500 y 3500 msnm), páramos y

nevados. Limites, Norte: Distrito Metropolitano de Quito, Cantón Rumiñahui y

la Provincia de Santo Domingo de los Tsáchilas; al Sur: Provincia de

Cotopaxi; al Este: Provincia de Napo; al Oeste: Santo Domingo de los

Tsáchilas (GAD, 2013) (ver Gráfico 2). El clima es templado con una

temperatura media anual de 11.9 °C (20.9 °C máxima y 3.3 °C mínima).

36

Cuenta con 350.000 bovinos representando el 7% de la población bovina del

país y produce aproximadamente 865.000 litros de leche diarios para la

ciudad de Quito (GAD, 2013).

Gráfico 2.- Área de estudio del Cantón Mejía: a) figura de la zona;

b) distribución altitudinal del Cantón Mejía

Fuente: GAD (2013)

En el Matadero Municipal del Cantón Mejía se faenan los días lunes,

miércoles, viernes y sábados un promedio de 1.200 bovinos mensualmente.

El muestreo de realizó entre las 0:00 y 6:00 a.m. en un periodo comprendido

entre el 27 de Mayo y 17 de Julio de 2013, con 8 intervenciones.

a)

b)

37

Población y Muestra

La población de la que se extrajo la muestra (población de estudio) estuvo

conformada por los bovinos que llegaron al matadero, de los cuales, para el

estudio se realizó un muestreo sistemático aleatorio, sin considerar la

exposición o el evento como criterio de selección. De esta manera, el tamaño

de la muestra, para estimar la prevalencia, se basó en aproximadamente 384

animales, calculados con la fórmula correspondiente para un intervalo de

confianza del 95% (Thrusfield, 2008).

𝑛 =1.96²𝑃𝑒𝑥𝑝(1 − 𝑃𝑒𝑥𝑝)

𝑑²

Donde:

n= tamaño de la muestra requerida

Pexp= probabilidad de las incertidumbres involucradas (50%)

d= se desea una precisión absoluta (5%)

Procedimiento de la investigación

Procedimiento de campo

Se llevó a cabo la inspección macroscópica post-mortem de los pulmones,

ganglios traqueobronquial izquierdo y mediastínico caudal en 395 bovinos,

de acuerdo a la muestra calculada. Se procedió a registrar los datos

individuales de cada animal mediante el uso de un registro de campo que

contenía datos de edad, sexo, biotipo, procedencia del animal y lesiones

sospechosas de TBB encontradas durante la inspección macroscópica en los

bovinos que ingresaron al matadero (ver Anexo B-1).

De manera complementaria a la inspección macroscópica, se procedió a

tomar muestras de tejido ganglionar linfático (traqueobronquial izquierdo y

mediastínico caudal) y pulmonar de manera aséptica con cuchillo

38

desinfectado (con cloro al 10%). Cada una de las muestras se recogió de

manera individual en fundas herméticas estériles, previamente rotuladas,

para ser almacenadas en condiciones isotérmicas en una caja térmica y ser

transportadas el mismo día a los laboratorios del Centro Internacional de

Zoonosis, en Quito, donde se almacenó en congelación a -20oC hasta el

momento del procesamiento en el laboratorio de microbiología.

Procedimiento de laboratorio

El procesamiento de las muestras se llevó a cabo usando técnicas asépticas

en el laboratorio de microbiología nivel III, en una cabina de seguridad

biológica tipo 2B (II BSC), para evitar la contaminación cruzada entre las

muestras y su posible riesgo biológico. Se realizó un pool de las 3 muestras

para la homogeneización, posteriormente se descontaminó por el método de

Petroff indirecto (ver Anexo B-2), y se sembró las muestras en medios de

cultivo Stonebrink, selectivo para el aislamiento de las colonias de M. bovis, y

en medios de Löwenstein-Jensen, finalmente, se incubó a 37oC por 8

semanas (ver Anexo B-3). También, se realizó la técnica Ziehl-Neelsen de

las colonia con fenotipos sugerente de micobacterias, para confirmar bacilos

ácido alcohol resistente y tener un mejor seguimiento de los cultivos (ver

Anexo B-4).

Se utilizaron controles positivos que pertenecen a cepas de M. bovis, M.

Tuberculosis y M. Kansasii, aisladas en el Centro Internacional de Zoonosis

(CIZ) y el Hospital Vozandes, Quito-Ecuador.

Técnicas de procesamiento y análisis de datos

La edad se categorizó de acuerdo a su grupo etario, menor de 2 años, joven;

de 2 a 6 años, adulto; y más de 6 años, viejo (Pace & Wakeman, 2003). El

biotipo europeo, cebuino y mestizo fue determinado de acuerdo a Pourrain,

(2007) y, la procedencia fue establecida de acuerdo a las guías de

movilización de los animales. Se definió positivo a inspección post-mortem

39

(IP) al animal que presentó al menos una lesión compatible con tuberculosis

en alguno de sus pulmones. Un cultivo bacteriológico positivo a M. bovis se

tomó en cuenta por su tiempo de crecimiento (Gathogo et al., 2012). En

Stonebrink se observó el tiempo promedio de crecimiento de 4 a 5 semanas

(Corner et al., 2012) y en Löwenstein-Jensen se consideró un tiempo mayor

(8 semanas) (OIE, 2009) y con escaso crecimiento de colonias (Toledo et al.,

2009). También se tomó en cuenta otras características como el aspecto,

color y forma que son indicios para sospechar de M. bovis (Thoen et al.,

2006); sin embargo, no siempre son constantes en todas las cepas de una

especie (Lévy-Frébault & Portaels, 1992).

La base de datos que contenía información sobre edad, raza, sexo,

procedencia de cada animal, positividad a LV y M. bovis, se ingresó en una

hoja de cálculo de Microsoft Excel versión 2010 para realizar tablas

dinámicas, que facilitaron el análisis de los datos al utilizar programa

estadístico R (versión 3.0.2) con el paquete PropCIs y Rcomander.

Análisis de la prevalencia aparente

Para definir a la prevalencia aparente de lesiones compatibles con

tuberculosis, se tomó en cuenta los positivos a IP dividida para el número de

bovinos examinados. Para determinar la prevalencia aparente de M. bovis,

se consideró los positivos al cultivo bacteriológico dividido para el número de

bovinos en los que se realizó el cultivo bacteriológico. Los intervalos de

confianza para las prevalencias aparentes se calcularon con un 95% de

confiabilidad, utilizando el paquete PropCIs del programa estadístico R

(versión 3.0.2.). Para determinar la prevalencia aparente (PA) expresada en

porcentajes se utilizó la fórmula de Thrusfield, (2008).

𝑃𝐴 =

𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑑𝑖𝑣𝑖𝑑𝑢𝑜𝑠 𝑞𝑢𝑒 𝑡𝑖𝑒𝑛𝑒𝑛 𝑢𝑛𝑎 𝑒𝑛𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑𝑒𝑛 𝑢𝑛 𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑡𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜

𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑑𝑖𝑣𝑖𝑑𝑢𝑜𝑠 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑝𝑜𝑏𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑛 𝑠𝑖𝑡𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛𝑑𝑒 𝑟𝑖𝑒𝑠𝑔𝑜 𝑒𝑛 𝑒𝑠𝑒 𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜

𝑥100

40

Análisis de los factores de riesgo

Se utilizó el programa estadístico R (versión 3.0.2.) para realizar las pruebas

de Chi-cuadrado, Test exacto de Fisher (ver Anexo C) y un análisis binomial

univariado y multivariado usando un modelo lineal generalizado (GLM) de

regresión logística, para identificar, si posibles factores de riesgo como la

edad, el biotipo, el sexo y la procedencia están asociados a la ocurrencia o

positividad de LV o de M. bovis. Para todo el análisis realizado se tomado

como estadísticamente significativo un p-valor menor a <0.05.

41

CAPÍTULO IV

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Descripción de la muestra

El número de animales inspeccionados y muestreados en el matadero fue de

395 y estuvo compuesto de individuos de acuerdo a su edad, biotipo, sexo

con diferentes proporciones por categoría, destacando mayor porcentaje los

animales adultos (2 - 6 años) con 85% (336/395), el ganado europeo con

56% (222/395) y el sexo hembra con 75% (296/395) (ver Gráfico 3).

Mientras que con respecto a la procedencia se obtuvo una mayor muestra

del ganado proveniente del Cantón Mejía con 49% (194/395), seguido de

Santo Domingo de los Tsáchilas con 34% (133/395), Rumiñahui con 8%

(31/395), Saquisilí con 5% (20/395) y Quito con 4% (17/395).

Gráfico 3.- Distribución de los animales muestreados: a) por edad (años), b) por biotipo y c)

por sexo, en el Matadero Municipal del Cantón Mejía, 2013.

Fuente: Investigación directa


26%

56%

18%b)

Cebuino

Europeo

Mestizo

25%

75%

c)

Machos

Hembras

9%

85%

6%a)

< 2

2 a 6

> 6

42

Resultados de la inspección post-mortem y cultivo bacteriológico

Mediante la inspección post-mortem se identificó 4 animales con lesiones a

nivel de pulmón y mediante el cultivo bacteriológico se logró aislar 6 cepas

compatibles con M. bovis (ver Cuadro 2).

Cuadro 2.- Resultados de IP y cultivo bacteriológico positivo para tuberculosis bovina observado en 13 animales diferentes, muestreados en el Matadero del Cantón Mejía, Ecuador *

Área COD Biotipo Edad (años) Sexo IP M. bovis

Mejía 129 Europeo 2 a 6 hembra Positivo -

155 Europeo 2 a 6 hembra - -

369 Mestizo 2 a 6 hembra - -

399 Mestizo 2 a 6 hembra Positivo Positivo

448 Europeo 2 a 6 hembra Positivo -

458 Europeo 2 a 6 hembra Positivo -

473 Europeo > 6 hembra - -

488 Europeo 2 a 6 hembra - Positivo



Rumiñahui 381 Europeo > 6 hembra - Positivo


S. Domingo 480 Cebuino 2 a 6 hembra - -

* IP = inspección post-mortem, COD = código de CIZ, PCR = reacción en cadena de la polimerasa, - = negativo



La descripción de las características de las colonias de M. bovis aisladas en

los dos medios de cultivo se muestra en el Cuadro 3.

43

Cuadro 3.- Características de los aislamientos en los medios de cultivos para micobacterias*

Crecimiento (semanas)

COD N° Aspecto Color Forma LW-J ST ZN Cultivo

155 + Liso Beige Redondeada 3 - + M. sp.

369 11 Liso Beige Redondeada 3 - + M. sp.

381 3 Liso Beige Redondeada - 5 + M. bovis

383 5 Liso Beige Redondeada 8 - + M. bovis


473 + Liso Beige Irregular - 7 + M. sp.

480 + Liso Beige Irregular - 7 + M. sp.


517 2 Liso Beige Redondeada 8 - + M. bovis

574 5 Liso Beige Redondeada 8 - + M. bovis * COD = código del CIZ, No = número de colonias, LW-J = medio de cultivo Löwenstein-Jensen, ST = medio de cultivo Stonebrink, ZN = tinción Ziehl-Nelsen, + = positivo a micobacterias, M. sp. = especie no identificada del género Mycobacterium, M. bovis = Mycobacterium bovis.

Fuente: investigación directa


Análisis de la inspección macroscópica post-mortem

Diferentes países o regiones pueden encajar en uno de las tres categoría, en

función a la prevalencia de la enfermedad: inferior al 1%, baja; entre el 0,1%

y el 1%, intermedia; mayor que 1%, alta (de Kantor & Ritacco, 2006; Ritacco

et al., 2006); de acuerdo a la categoría, se debe seguir diferentes estrategias

de control con miras a reducir la prevalencia de la enfermedad, además de ir

haciendo uso de pruebas diagnósticas con mayor sensibilidad (de Kantor &

Ritacco, 1994).

Lesiones compatibles con tuberculosis fueron encontradas en 4 bovinos a

nivel de pulmón, presentando formaciones de pequeños tubérculos rodeados

por una cápsula fibrosa, resultado que se relaciona con investigaciones

previas en la zona de estudio y en las provincias aledañas (Espinoza, 2011;

Proaño-Pérez et al., 2011a), posiblemente porque la vía respiratoria es

considerada la principal ruta de transmisión de la infección (Boukary et al.,

44

2012), para posteriormente producir lesiones a nivel de los pulmones (Bekele

et al., 2011), esto puede darse con frecuencia en explotaciones lecheras,

donde la densidad de ganado es alta con más posibilidad de contacto entre

animales (Proaño-Pérez et al., 2011b).

Se determinó una prevalencia aparente de lesiones compatibles con la

enfermedad mediante inspección macroscópica post-mortem, en el Matadero

del Cantón Mejía, del 1.01% (4/395) [IC95% = 0.28% – 2.57%], considerada

como alta prevalencia (mayor al 1%), que concuerda con los resultados

encontrados en el Ecuador a nivel del matadero de Machachi [2.33%

(16/687) y 2.42% (17/703) en 2007 y 2008, respectivamente] (Proaño-Pérez

et al., 2011a), Pelileo [7.92% (55/307)] y Ambato [4.30% (32/744)] (Espinoza,

2011), de la misma manera hallazgos similares han sido encontrados en

otros países como Argentina [1.2% (140.840/12.018.251) en el año 2005]

(Torres, 2009a), y en otras partes de África como: Etiopía [10.2%

(337/3.322)] (Biffa et al., 2009), Nigeria [4.05% (12.259/302.700)] (Aliyu et al.,

2009), Kenia [18.95% (176/926)] (Gathogo et al., 2012) y Camerún [1.03%

(168/16.316)] (Koro et al., 2013).

Por otro lado, los resultados de este estudio de prevalencia aparente

presenta una diferencia con la prevalencia media (0.1% - 1%), reportadas en

la costa ecuatoriana como: Guayas (0.47% 16/3.425) (Mata, 1973; citado en

Proaño-Pérez et al., 2011a), Santo Domingo de los Tsáchilas (0.21%

6/2.778) (Coloma, 2000; citado en Proaño-Pérez et al., 2011a); y en otros

países como: Argentina [0.9% (116.798/13.483.515) en 2009) (Torres,

2009a), California, México (0.12 y 0.46% en 1995 y 1996, respectivamente)

(Hernández et al., 1997) y Minas-Gerais, Brasil [0.71% (681/954.640)]

(Baptista et al., 2004) y de la misma manera muestra una diferencia con la

prevalencia baja (menor a 0.1%), en Etiopía [0.050% (699/1.336.266)]

(Shitaye et al., 2006).

45

La diferencia en los resultados puede ser debido a la sensibilidad de la

prueba, ya que no todos los órganos y tejidos presentan LV, debido a que el

animal se encuentra en una etapa inicial de la enfermedad (Whipple et al.,

1996), no se examinan correctamente todos los sitios anatómicos que

pudieran presentar lesiones tuberculosas (Corner, 1994), o no se cuenta con

personal bien capacitado (Teklul et al., 2004). Por otro lado, también

dependen de la especificidad, debido a que las lesiones pueden ser

causadas por otros microorganismos patógenos diferentes de M. bovis

(Müller et al., 2008), entre los que podrían causar lesiones similares están las

especies de micobacterias no tuberculosas (Oloya et al., 2007) u otras

patologías que afectan a los pulmones (Mellau et al., 2010) como:

Actinomicosis, Actinobacilosis (Gilsdorf et al., 2006) y Leucosis que han sido

diagnosticadas en el matadero de Machachi (com. pers. Viteri A., 2013).

Conociendo que existen factores que afectan a la sensibilidad y especificidad

dando resultados falsos positivos (FP) y falsos negativos (FN) (Milian-Suazo

et al., 2010), la prevalencia en esta fase de estudio puede estar subestimada

o sobreestimada a la verdadera dimensión del problema, por la falta de

pruebas de diagnóstico más precisas que pueden disminuir estos problemas

(Pérez-Lagoa et al., 2013).

Además de los factores mencionados, la prevalencia aparente encontrada en

esta investigación se diferencia de las otras porque el área de muestreo fue

reducida, a una muestra heterogénea de los animales estudiados (Biffa et al.,

2011) o el número de sitios anatómicos examinados fue mínimo en relación

con otros estudios (Biffa et al., 2009). De la misma manera hay que

considerar que la enfermedad es endémica y su prevalencia puede variar de

acuerdo al área geográfica, al tipo de producción (leche o carne) (Abalos &

Retamal, 2004) y al tamaño de la explotación (pequeña, mediana o grande)

(Proaño-Pérez et al., 2006).

46

Esto da a entender que, se deben mejorar los protocolos de inspección post-

mortem, debido a su bajo nivel de eficacia (Biffa et al., 2010), y ajustarlos a

las condiciones de cada área en el Ecuador, o plantear un protocolo que se

pueda seguir, para obtener resultados favorables, que ha demostrado

incrementar su nivel de eficiencia en 4 veces (Aylate et al., 2012), y de esta

manera puedan ser utilizados en la vigilancia de la enfermedad (Aliyu et al.,

2009).

Análisis del cultivo bacteriológico

La prevalencia aparente de M. bovis mediante cultivo bacteriológico en el

Matadero del Cantón Mejía fue de 1.52% (6/395) [IC95% = 0.56 – 3.28]. No se

logró aislar M. bovis de tres animales que presentaban lesiones

granulomatosas encapsuladas, ya que se ha demostrado que está

correlacionada negativamente con el crecimiento de M. bovis, debido a que

la encapsulación es un mecanismo de contención que evita el crecimiento de

colonias en los medios de cultivo (Menin et al., 2013). Los otros 5

aislamientos se obtuvieron a partir de muestras que no presentaron lesiones

(Asseged et al., 2004; Teklul et al., 2004), posiblemente porque el animal

presentaba infección temprana por M. bovis (Corner, 1994) o mantenía a los

microorganismos en un estado de latencia (Pollock et al., 2002), resultados,

que están relacionados con el reporte de Echeverría et al., (2014), que

demostró con n-PCR directa (PCR anidada para la detección directa de M.

bovis) una prevalencia de 4.33% (25/578), en dos zonas de la sierra norte del

Ecuador.

La sensibilidad de la prueba pudo verse afectada por: a) efecto del

descontaminante, debido a que las micobacterias son sensibles al hidróxido

de sodio (Miller et al., 2002), b) elección del medio de cultivo empleado

(Corner et al., 2012) y c) pérdida de viabilidad durante la toma de muestra

(Latini et al., 1997) o durante el periodo de tiempo que transcurre entre la

recolección y procesamiento de la muestra (Araújo et al., 2005), ya que se

47

requiere concentraciones superiores a 10 bacilos/ml para obtener un cultivo

positivo (Nava & Prieto, 2001).

La especificidad de la prueba pudo verse afectada, debido a que las lesiones

pueden ser causadas por otros patógenos (Müller et al., 2008), que muchas

veces requiere otros procedimientos de descontaminación o necesidades de

diferentes requisitos en los medios de cultivo (Müller et al., 2009). Pero a

pesar de esto, existe la posibilidad de que se repliquen (Milian-Suazo et al.,

2000), pudiendo tratarse de micobacterias atípicas aisladas a partir de medio

Löwenstein-Jensen (Dorronsoro & Torroba, 2007) o medio Stonebrink

(Sepúlveda et al., 2001). Entre las que se han encontrado: Mycobacterium

terrae, Mycobacterium avium, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium

gordonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium flavescens,

Mycobacterium smegmatis (Cleaveland et al., 2007), Mycobacterium

aviumintracellulare-scrofulaceum, Mycobacterium gordonae y Mycobacterium

szulgai (Proaño-Perez et al., 2006). Estas micobacterias en ocasiones se

encuentra causando infección en el ganado bovino (Biet et al., 2005), por lo

tanto, vale la pena realizar estudios a nivel de micobacterias no tuberculosas

(MNT), ya que posiblemente estén afectando el rendimiento de la producción

(Müller et al., 2008).

Estudios a nivel de cultivo bacteriológico para determinar la prevalencia de

M. bovis, no han sido realizados. Sin embargo, se ha verificado el patógeno a

nivel de LV encontradas en ganado bovino como lo demuestran estudios en

el Cantón Mejía, Ecuador 36.34% (12/33) (Proaño-Pérez et al., 2011a), en

países como: México 59% (236/400) (Milian-Suazo et al., 2000), Etiopía

14.29% 9/63 (Aylate et al., 2012), Kenia 29.69% (19/64) (Gathogo et al.,

2012) y 17.21 % (58/337) (Biffa et al., 2014) y Gran Bretaña 67.43%

(2470/3663) (Shittu et al., 2013). Por lo tanto, los resultados de este estudio

nos da a entender que un diagnóstico de M. bovis a partir de animales que

no presentaron lesiones, es clave para conocer la infección y limitar su

contagio (Murphy et al., 2010).

48

La alta tasa de prevalencia aparente de M. bovis en el ganado bovino

faenado en el Matadero del Cantón Mejía, podría atribuirse a la procedencia

geográfica de los animales vinculados a una zona con explotaciones

lecheras que tienen sistemas de manejo intensivo, especialmente en grandes

rebaños (Proaño-Perez et al., 2006) donde se encuentra una alta densidad

poblacional de ganado lechero (Biffa, Skjerve, et al., 2010). Además podría

estar vinculada a la incidencia de la infección (White & Benhin, 2004), que es

de 1.70% en el Cantón Mejía (Proaño-Perez et al., 2009).

Finalmente, la prevalencia puede estar influenciada por la temporada, debido

a que los animales viejos o en mal estado, generalmente suelen ser vendidos

en cierta época del año, como es en el verano cuando hay escases de

alimento (Boukary et al., 2011), habitualmente en las Ferias de Ganado

(Johnston et al., 2005).

Los resultados del cultivo bacteriológico, nos indican la presencia de M. bovis

en las explotaciones de origen (Milian-Suazo et al., 2000) y el mantenimiento

de la infección debido a que la excreción comienza alrededor de los 87 días

(Neill et al., 1991), por un periodo menor a 30 días (Romero et al., 2006).

Esta alta tasa de prevalencia de M. bovis en las zonas encontradas en este

estudio podría ayudar a re-direccionar estrategias de vigilancia con mejores

pruebas diagnósticas.

Análisis de los factores de riesgo

Análisis de las pruebas de asociación de Chi-cuadrado (X2) y Test

Exacto de Fisher

Como se muestra en el Cuadro 4, al analizar los factores de edad, biotipo,

sexo y procedencia de los animales en relación a la positividad de LV

compatibles con la tuberculosis y de M. bovis, no se encontró ninguna

asociación significativa.

49

Cuadro 4.- Prevalencia aparente de lesiones visibles y de M. bovis con respecto a la edad, biotipo, sexo y cantón; pruebas de asociación*

Lesiones visibles M. bovis LV y M.

bovis

X2 - Fisher

Categorías (POS)/T PA % (IC 95%) (POS)/T PA % (IC 95%) Valor-p

Edad (años) > 0.05N.S.

< 2 0/34 (0 - 10.28) 0/34 (0 - 10.28)

2 a 6 3/336 1.19(0.33 - 3.02) 5/336 1.49 (0.48 - 3.44)

> 6 1/25 4 (0.10 - 20.35) 1/25 4 (0.10 - 20.35)

Biotipo > 0.05N.S.

Cebuino 0/104 (0 - 3.48) 0/104 (0 - 3.48)

Europeo 3/222 1.25(0.28 - 3.90) 5/222 2.25 (0.74 - 5.18)

Mestizo 1/69 1.45(0.04 - 7.81) 1/69 1.45 (0.04 - 7.81)

Cuadro 4 (cont.).

Sexo > 0.05N.S.

H 4/296 1.35(0.37 - 3.42) 6/296 2.03 (0.75 - 4.36)

M 0/99 (0 - 3.66) 0/99 (0 - 3.66)

Cantón > 0.05N.S.

Saquisilí 0/20 (0 - 16.84) 0/20 (0 - 16.84)

Mejía 4/194 2.06(0.56 - 5.19) 4/194 2.06 (0.56 - 5.19)

Quito 0/17 (0 - 19.51) 0/17 (0 - 19.51)

Rumiñahui 0/31 (0 - 11.22) 2/31 6.45 (0.79 - 21.42)

S. Domingo 0/133 (0 - 2.74) 0/133 (0 - 2.74) * TBB = tuberculosis bovina, M. bovis = Mycobacterium bovis, LV = lesiones visibles, X2 = chi-cuadrado, POS = positivo a lesiones visibles o M. bovis, T = total de muestras, PA = prevalencia aparente, IC = intervalo de confianza, N.S. = asociación no significativa.



Análisis del modelo de regresión logística univariable y multivariable

En este estudio, los resultados del análisis univariado y multivariado indican

que la positividad de lesiones compatibles con la tuberculosis y de M. bovis

no fue significativamente asociado con los factores biológicos y la

procedencia, por lo tanto, no se pudo inferir que la edad, biotipo, sexo y

50

procedencia del animal influyeran en la prevalencia aparente de las lesiones

y de la infección, lo que también significa que existe la misma probabilidad

para cualquier categoría analizada de presentar LV o M. bovis en el ganado

bovino faenado en el Matadero Municipal del Cantón Mejía.

Los factores de riesgo que pueden influir en la prevalencia de la enfermedad

no están muy bien definidos (Boukary et al., 2011), ya que existen muchas

causas como: características inherentes de la bacteria, el huésped, el medio

ambiente (Pollock & Neill, 2002) y factores antropogénicos (Lilenbaum et al.,

2007). Por lo que se tiene que realizar mayor investigación adicional para

disminuir la infección y propagación de la enfermedad (Phillips et al., 2002).

Análisis de la edad

La edad no influyó en la probabilidad de tener un resultado positivo a

inspección post-mortem o cultivo bacteriológico. Sin embargo, la mayor

prevalencia se encontró en ganado de mayor edad, ya que puede estar

relacionado con varias investigaciones que han demostrado una asociación

con la enfermedad (Kazwala et al., 2001; Munyeme et al., 2009; Ibrahim et

al., 2010), es decir, la presencia de la tuberculosis aumenta

significativamente con la edad (Álvarez et al., 2014; Cleaveland et al., 2007;

Proaño-Pérez et al., 2009).

Aunque la edad por sí sola no es una característica que se asocia

directamente a la enfermedad (Katale et al., 2013), este mayor riesgo de

presentar TBB en animales de edad avanzada (Phillips et al., 2002; Ameni et

al., 2007), podría explicarse debido a distintas razones: a) por la mayor

probabilidad de exposición a M. bovis (Pollock & Neill, 2002), cuando se

encuentra en entornos endémicos (Biffa et al., 2011), b) por las prácticas de

manejo que se aplican al ganado lechero (Kazwala et al., 2001) con una

actividad productiva más larga (Acha & Szyfres, 2001), c) por ser una

enfermedad crónica con un largo periodo de incubación (15 a 34 meses)

(Perez et al., 2002), d) por reactivación a causa de la inmunodepresión

51

(Humblet et al., 2009), ya que se sabe que el patógeno puede permanecer

en un estado de latencia (Pollock & Neill, 2002) y expresar posteriormente la

enfermedad clínica (Griffin et al., 1996), y e) por disminución de la respuesta

inmunológica a la infección por micobacterias en el ganado de edad

avanzada (Haynes et al., 1997; Biffa et al., 2010).

Análisis del sexo

El sexo no influyó en la presencia de LV y de M. bovis, aunque las hembras

fueron las más afectadas, ya que puede estar relacionado con otros estudios

que han demostrado asociación significativa (Cadmus et al., 2010; Mamo et

al., 2013), es decir, bovinos hembras están en mayor riesgo de presentar la

enfermedad (Cadmus et al., 2004; Inangolet et al., 2008), posiblemente

porque es debido a que tienen prácticas de manejo diferente, en lo que se

refiere a sistemas de producción (Humblet et al., 2010), provocando

hacinamiento del ganado e infección por contacto directo (Proaño-Pérez et

al., 2006; Proaño-Pérez et al., 2011), principalmente, en vacas lecheras de

alta producción (Barlow et al., 1997). También se ha demostrado que los

machos podrían ser afectados por la enfermedad si son utilizados como

bueyes (Kazwala et al., 2001).

Análisis del biotipo

En este estudio el biotipo no demostró estar asociado significativamente a la

positividad de LV y de M. bovis, aunque la mayor prevalencia de LV fue en el

ganado mestizo, posiblemente porque el escaso ganado de este tipo se

mantiene junto al más susceptible (Ameni et al., 2006). La mayor prevalencia

de M. bovis fue en ganado europeo, y puede tener relación con otros

estudios que han demostrado que tiene más probabilidad de presentar la

enfermedad que el cebuino o cruces (Omer et al., 2001; Cadmus et al.,

2010), especialmente en la raza Holstein-Friesian (Elias et al., 2008), por la

intensidad y tiempo de producción a la que es sometida (Humblet et al.,

2009). A nivel genético no se ha cuantificado adecuadamente (Brotherstone

52

et al., 2010) la susceptibilidad en el biotipo europeo (Morris, 2007) o posible

resistencia en el ganado cebú (Inangolet et al., 2008), a pesar de que se ha

demostrado la presencia de la enfermedad en este último (Diguimbaye-

Djaibé et al., 2006).

También, en ganado europeo comparado con cebú, se ha estimado

probabilidades más bajas de presentar la enfermedad (Álvarez et al., 2014),

ya que se ha demostrado una resistencia a la infección en Holstein-Friesian

de Gran Bretaña (Bermingham et al., 2011).

Análisis de la procedencia

En este estudio no se encontró asociación de la procedencia con la

presencia de LV o M. bovis, a pesar de que la mayor prevalencia de LV

encontradas fue en el Cantón Mejía, probablemente por ser una enfermedad

endémica en la zona de estudio (Proaño-Pérez et al., 2011a), sin un

adecuado control (White & Benhin, 2004), donde se maneja un sistema de

producción lechero y el contacto entre animales es mayor (Porphyre et al.,

2008). La infección por M. bovis fue más alta en el Cantón Rumiñahui, por

estar relacionada con un área endémica, un posible brote esporádico y/o por

no tener un control adecuado en el movimiento del ganado (Gilbert et al.,

2005). Una nula o disminuida prevalencia en otras zonas es más probable

que esté relacionado con el tipo de producción (sistemas extensivos), ya que

la transmisión a través de la vía respiratoria es mínima (Ameni et al., 2006).

Se ha demostrado que el lugar de procedencia de los animales es un factor

determinante en la presentación de M. bovis en dos zonas de la sierra norte

del Ecuador (Echeverría et al., 2014), posiblemente porque M. bovis de

acuerdo a las condiciones climáticas puede permanecer en el ambiente por

un determinado periodo de tiempo (Fine et al., 2011).

53

CAPÍTULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Conclusiones

Al aplicar la inspección macroscópica post-mortem se determinó una

prevalencia aparente de lesiones compatibles con la tuberculosis bovina de

1.01 % (4/395) [IC 95% = 0.28% – 2.57%], en el ganado bovino faenado en

el Matadero Municipal del Cantón Mejía.

Al aplicar cultivo bacteriológico se determinó una prevalencia aparente de M.

bovis de 1.52% (6/395) [IC 95% = 0.56 – 3.28], en el ganado bovino faenado

en el Matadero Municipal del Cantón Mejía.

No se logró determinar que los factores como la edad, el biotipo, el sexo y la

procedencia del ganado bovino fueran un riesgo o estuvieran asociados a

una mayor probabilidad de presentar lesiones tuberculosas compatibles con

la enfermedad y/o M. bovis, en el ganado bovino faenado el Matadero

Municipal del Cantón Mejía.

Recomendaciones

Aplicar como herramienta complementaria, especialmente en la última fase

del programa de TBB, el cultivo bacteriológico, con el propósito de cuantificar

con mayor exactitud los casos positivos y poder establecer procedimientos

epidemiológicos de supervisión en hatos y productores.

Estudiar los microorganismos que pueden causar lesiones compatibles con

la enfermedad y que generan confusión en el diagnóstico macroscópico.

Plantear un protocolo de inspección macroscópica ajustado a las condiciones

de cada área geográfica, con un monitoreo continuo de la eficacia de los

54

procedimientos, para que pueda ser utilizado en el control de la enfermedad

y/o vigilancia epidemiológica.

Realizar estudios posteriores considerando a los trabajadores de los

mataderos, personas relacionadas con el ganado y de manera

complementaria trabajar con el producto acabado.

Complementar el estudio con trazabilidad del ganado afectado, como

estrategia que permita el control sanitario y el movimiento del ganado, y

elaborar una base de datos con información de matadero y de laboratorio.

Considerar en próximos estudios una muestra más grande y homogénea con

un análisis de más variables, para corroborar los resultados de este estudio,

de tal manera, que se podrían establecer políticas de Estado que permitan

disminuir el impacto de la enfermedad sobre las poblaciones afectadas,

evitar riesgos sanitarios y pérdidas económicas.

55

LISTA DE REFERENCIAS

Abalos, P., & Retamal, P. (2004). Tuberculosis : ¿una zoonosis re-emergente? Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics), 23(2), 583–594.

Acha, P. N., & Szyfres, B. (2001). Bacteriosis y Micosis. En Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y a los animales (3ra ed., pp. 266–283). Washington D.C.: Organización Panamericana de la Salud (OPS).

Acosta-Salinas, R., Estrada-chávez, C., & Milián-Suazo, F. (2009). Genotyping methods for Mycobacterium bovis. Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias, 47(4), 389–412.

Adams, L. G. (2001). In vivo and in vitro diagnosis of Mycobacterium bovis infection. Revue Scientifique et Technique, 20(1), 304–24.

Alexander, K. A., Laver, P. N., Michel, A. L., Williams, M., van Helden, P. D., Warren, R. M., & van Pittius, N. C. G. (2010). Novel Mycobacterium tuberculosis complex pathogen, M. mungi. Emerging Infectious Diseases, 16(8), 1296–9.

Aliyu, M. M., Adamu, J. Y., & Bilyaminu, Y. A. (2009). Current prevalence of tuberculous lesions among slaughtered cattle in Northeastern States of Nigeria. Revue d’Élevage et de Médecine Vétérinaire Des Pays Tropicaux, 62(1), 13–16.

Álvarez, J., Pérez, A., Marqués, S., Bezos, J., Grau, A., de la Cruz, M. L., … Domínguez, L. (2014). Risk factors associated with negative in-vivo diagnostic results in bovine tuberculosis-infected cattle in Spain. BMC Veterinary Research, 10(1), 14.

Álvarez, N., Borrero, R., Reyes, F., Camacho, F., Mohd, N., & Sarmiento, M. E. (2009). Mecanismos de evasión y persistencia de Mycobacterium tuberculosis durante el estado de latencia y posibles estrategias para el control de la infección latente. Vaccimonitor, 18(3), 18–25.

Amanfu, W. (2006). The situation of tuberculosis and tuberculosis control in animals of economic interest. Tuberculosis Edinburgh Scotland, 86(3-4), 330–335.

Ameni, G., Aseffa, A., Engers, H., Young, D., Gordon, S., Hewinson, G., & Vordermeier, M. (2007). High prevalence and increased severity of

56

pathology of bovine tuberculosis in Holsteins compared to zebu breeds under field cattle husbandry in central Ethiopia. Clinical and Vaccine Immunology CVI, 14(10), 1356–1361.

Ameni, G., Aseffa, A., Engers, H., Young, D., Hewinson, G., & Vordermeier, M. (2006). Cattle husbandry in Ethiopia is a predominant factor affecting the pathology of bovine tuberculosis and gamma interferon responses to mycobacterial antigens. Clinical and Vaccine Immunology : CVI, 13(9), 1030–6.

Ameni, G., Desta, F., & Firdessa, R. (2010). Molecular typing of Mycobacterium bovis isolated from tuberculosis lesions of cattle in north eastern Ethiopia. The Veterinary Record, 167(4), 138–141.

Aranaz, A., Cousins, D., Mateos, A., & Domıínguez, L. (2003). Elevation of Mycobacterium tuberculosis subsp. caprae Aranaz et al. 1999 to species rank as Mycobacterium caprae comb. nov., sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 53(6), 1785–1789.

Aranaz, A., de Juan, L., Montero, N., Sánchez, C., Galka, M., Delso, C., … Domínguez, L. (2004). Bovine Tuberculosis (Mycobacterium bovis) in Wildlife in Spain. Journal of Clinical Microbiology, 42(6), 2602–2608.

Araújo, C. P., Fugimura, C. Q., de Prince, K. A., Gonçalves, K., & Alves, A. L. (2005). Mycobacterium bovis identification by a molecular method from post-mortem inspected cattle obtained in abattoirs of Mato Grosso do Sul, Brazil. Memorias Do Instituto Oswaldo Cruz, 100(7), 749–752.

Asseged, B., Woldesenbet, Z., Yimer, E., & Lemma, E. (2004). Evaluation of abattoir inspection for the diagnosis of Mycobacterium bovis infection in cattle at Addis Ababa abattoir. Tropical Animal Health and Production, 36(6), 537–546.

Ayele, W. Y., Neill, S. D., Zinsstag, J., Weiss, M. G., & Pavlik, I. (2004). Bovine tuberculosis: an old disease but a new threat to Africa. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease : The Official Journal of the International Union against Tuberculosis and Lung Disease, 8(8), 924–37.

Aylate, A., Shah, S. N., Aleme, H., & Gizaw, T. T. (2012). Bovine tuberculosis: prevalence and diagnostic efficacy of routine meat inspection procedure in Woldiya municipality abattoir north Wollo zone, Ethiopia. Tropical Animal Health and Production, 45(3), 855–864.

57

Baptista, F., Moreira, E. C., Santos, W. L. M., & Naveda, L. A. B. (2004). Prevalência da tuberculose em bovinos abatidos em Minas Gerais. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, 56(5), 577–580.

Barlow, N. D., Kean, J. M., Hickling, G., Livingstone, P. G., & Robson, A. B. (1997). A simulation model for the spread of bovine tuberculosis within New Zealand cattle herds. Preventive Veterinary Medicine, 32(1-2), 57–75.

Barrera, L. (2007). The basic of clinical bacteriology. En J. C. Palomino, S. Leão, & V. Ritacco (Eds.), Tuberculosis 2007: From Basic Science to patient care (pp. 93–112). Sao Pablo-Buenos Aires: Emma Raderschadt.

Barry, C. E., Lee, R. E., Mdluli, K., Sampson, A. E., Schroeder, B. G., Slayden, R. A., & Yuan, Y. (1998). Mycolic acids: Structure, biosynthesis and physiological functions. Progress in Lipid Research, 37(2-3), 143–179.

Bekele, M., Belay, I., & Box, P. O. (2011). Evaluation of Routine Meat Inspection Procedure to Detect Bovine Tuberculosis Suggestive Lesions in Jimma Municipal Abattoir, South West Ethiopia, 6(2), 172–179.

Bermingham, M. L., Brotherstone, S., Berry, D. P., More, S. J., Good, M., Cromie, A. R., … Woolliams, J. A. (2011). Evidence for genetic variance in resistance to tuberculosis in Great Britain and Irish Holstein-Friesian populations. BMC Proceedings, 5(4), S15.

Biberstein, E. L., & Hirsh, D. C. (1999). Mycobacterium species: the agents of animal tuberculosis. In D. C. Hirsh & Y. C. Zee (Eds.), Veterinary Microbilogy (pp. 158–164). Malden: Blackwell Publishing.

Biet, F. B., Boschiroli, M. L. B., Thorel, M. F., & Guilloteau, L. A. G. (2005). Review article Zoonotic aspects of Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium-intracellulare complex (MAC). American journal of veterinary research, 36, 411–436.

Biffa, D., Bogale, A., & Skjerve, E. (2010). Diagnostic efficiency of abattoir meat inspection service in Ethiopia to detect carcasses infected with Mycobacterium bovis: implications for public health. BMC Public Health, 10, 462.

Biffa, D., Inangolet, F., Bogale, A., Oloya, J., Djønne, B., & Skjerve, E. (2011). Risk factors associated with prevalence of tuberculosis-like lesions and associated mycobacteria in cattle slaughtered at public and export abattoirs in Ethiopia. Tropical Animal Health and Production, 43(2), 529–538.

58

Biffa, D., Inangolet, F., Oloya, J., Asseged, B., Badaso, M., Yilkal, A., & Skjerve, E. (2009). Prevalence of bovine tuberculosis in Ethiopian slaughter cattle based on post-mortem examination. Tropical Animal Health and Production, 41(5), 755–65.

Biffa, D., Johansen, T. B., Godfroid, J., Muwonge, A., Skjerve, E., & Djønne, B. (2014). Multi-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) reveals heterogeneity of Mycobacterium bovis strains and multiple genotype infections of cattle in Ethiopia. Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases, 23, 13–19.

Bonsu, O. A., Laing, E., & Akanmori, B. D. (2000). Prevalence of tuberculosis in cattle in the Dangme-West district of Ghana, public health implications. Acta Tropica, 76(1), 9–14.

Boschung, U., & Schopfer, K. (1995). Ludwig Lichtheim and Robert Koch. How the discovery of the tubercle bacillus in Switzerland was made known (1882/1883). Schweizerische Medizinische Wochenschrift, 125(37), 1715–1725.

Boukary, A. R., Thys, E., Abatih, E., Gamatié, D., Ango, I., Yenikoye, A., & Saegerman, C. (2011). Bovine tuberculosis prevalence survey on cattle in the rural livestock system of Torodi (Niger). PloS One, 6(9), e24629.

Boukary, A. R., Thys, E., Rigouts, L., Matthys, F., Berkvens, D., Mahamadou, I., … Saegerman, C. (2012). Risk factors associated with bovine tuberculosis and molecular characterization of Mycobacterium bovis strains in urban settings in Niger. Transboundary and Emerging Diseases, 59(6), 490–502.

Brennan, P. J. (2003). Structure, function, and biogenesis of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis, 83(1), 91–97.

Brotherstone, S., White, I. M. S., Coffey, M., Downs, S. H., Mitchell, A. P., Clifton-Hadley, R. S., ... & Woolliams, J. A. (2010). Evidence of genetic resistance of cattle to infection with Mycobacterium bovis. Journal of dairy science, 93(3), 1234-1242.

Buddle, B. M., Parlane, N. A., Keen, D. L., Aldwell, F. E., Pollock, J. M., Lightbody, K. E. N., & Andersen, P. (1999). Differentiation between Mycobacterium bovis BCG-vaccinated and M. bovis-infected cattle by using recombinant mycobacterial antigens. Clinical and diagnostic laboratory immunology 6(1), 1–5.

59

Budka, H., Buncic, S., Colin, P., Collins, J. D., Ducrot, C., Hope, J., … Vanopdenbosch, E. (2003). Opinion of the Scientific Panel on Biological Hazards of the European Food Safety on a request from the Commission related on “Tuberculosis in Bovine Animals: Risks for human health and control strategies. The EFSA Juornal, 13, 1–52.

Cadmus, S. I. B., Agada, C. A., Onoja, I. I., & Salisu, I. (2010). Risk factors associated with bovine tuberculosis in some selected herds in Nigeria. Tropical Animal Health and Production, 42(4), 547–9.

Cadmus, S. I. B., Atsanda, N. N., Oni, S. O., & Akang, E. E. U. (2004). Bovine tuberculosis in one cattle herd in Ibadan in Nigeria. Veterinarni Medicina-UZPI (Czech Republic), 49(11), 406–412.

Cai, H., Tian, X., Hu, X. D., Li, S. X., Yu, D. H., & Zhu, Y. X. (2005). Combined DNA vaccines formulated either in DDA or in saline protect cattle from Mycobacterium bovis infection. Vaccine, 23(30), 3887–95.

Cambanis, A., Ramsay, A., Wirkom, V., Tata, E., & Cuevas, L. E. (2007). Investing time in microscopy: an opportunity to optimise smear-based case detection of tuberculosis. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 11(1), 40–45.

Chatterjee, D., & Khoo, K. H. (1998). Mycobacterial lipoarabinomannan: an extraordinary lipoheteroglycan with profound physiological effects. Glycobiology, 8(2), 113–120.

Cleaveland, S., Shaw, D. J., Mfinanga, S. G., Shirima, G., Kazwala, R. R., Eblate, E., & Sharp, M. (2007). Mycobacterium bovis in rural Tanzania: Risk factors for infection in human and cattle populations. Tuberculosis, 87(1), 30–43.

Collins, J. D. (2006). Tuberculosis in cattle: strategic planning for the future. Veterinary Microbiology, 112(2-4), 369–381.

Cooper, A. M., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Griffin, J. P., Russell, D. G., & Orme, I. M. (1993). Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. The Journal of Experimental Medicine, 178(6), 2243–2247.

Corner, L. A. (1994). Post mortem diagnosis of Mycobacterium bovis infection in cattle. Veterinary Microbiology, 40(1-2), 53–63.

Corner, L. A. (2006). The role of wild animal populations in the epidemiology of tuberculosis in domestic animals: How to assess the risk. Veterinary Microbiology, 112(2-4), 303–312.

60

Corner, L. A. L., Gormley, E., & Pfeiffer, D. U. (2012). Primary isolation of Mycobacterium bovis from bovine tissues: conditions for maximising the number of positive cultures. Veterinary Microbiology, 156(1-2), 162–71.

Corner, L., & Nicolacopoulos, C. (1988). Comparison of media used for the primary isolation of Mycobacterium bovis by veterinary and medical diagnostic laboratories. Australian Veterinary Journal, 65(7), 202–5.

Corner, L., Melville, L., McCubbin, K., Small, K. J., McCormick, B. S., Wood, P. R., & Rothel, J. S. (1991). Efficiency of inspection procedures for the detection of tuberculous lesions in cattle. Australian Veterinary Journal, 67(6), 389–392.

Cosivi, O., Meslin, F. X., Daborn, C. J., & Grange, J. M. (1995). Epidemiology of Mycobacterium bovis infection in animals and humans, with particular reference to Africa. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics), 14(3), 733-746.

Cosivi, O., Grange, J. M., Daborn, C. J., Raviglione, M. C., Fujikura, T., Cousins, D., ... & Meslin, F. X. (1998). Zoonotic tuberculosis due to Mycobacterium bovis in developing countries. Emerging infectious diseases, 4(1), 59.

Cousins, D. V. (2001). Mycobacterium bovis infection and control in domestic livestock. Revue Scientifique et Technique International Office of Epizootics, 20(1), 71–85.

Cousins, D. V., Bastida, R., Cataldi, A., Quse, V., Redrobe, S., Dow, S., … Bernardelli, A. (2003). Tuberculosis in seals caused by a novel member of the Mycobacterium tuberculosis complex: Mycobacterium pinnipedii sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 53(5), 1305–1314.

Cvetnic, Z., Katalinic-Jankovic, V., Sostaric, B., Spicic, S., Obrovac, M., Marjanovic, S., … Vickovic, I. (2007). Mycobacterium caprae in cattle and humans in Croatia. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 11(6), 652–658.

Daffé, M., & Draper, P. (1998). The envelope layers of mycobacteria with reference to their pathogenicity. Advances in Microbial Physiology, 39, 131–203.

Daffé, M., & Etienne, G. (1999). The capsule of Mycobacterium tuberculosis and its implications for pathogenicity. Tubercle and Lung Disease, 79(3), 153–169.

61

de Kantor, I. N., & Ritacco, V. (1994). Bovine tuberculosis in Latin America and the Caribbean: current status, control and eradication programs. Veterinary Microbiology, 40(1-2), 5–14.

de Kantor, I. N., & Ritacco, V. (2006). An update on bovine tuberculosis programmes in Latin American and Caribbean countries. Veterinary Microbiology, 112(2-4), 111–118.

de Kantor, I. N., Paolicchi, F., Bernardelli, A., Torres, O. M., Canal, A., Lobo, J. R., … Ambroggi, M. (2008). La Tuberculosis Bovina en América Latina. Situación actual y recomendaciones. Recuperado de http://www.oie.int/doc/ged/D10872.PDF

de Kantor, I. N., Torres, P. M., Morcillo, N., Imaz, M. S., & Sequeira, M. D. (2012). Tuberculosis zoonótica en la Argentina. Medicina. Recuperado de http://www.scielo.org.ar/pdf/medba/v72n6/v72n6a14.pdf

de la Rua-Domenech, R., Goodchild, A. T., Vordermeier, H. M., Hewinson, R. G., Christiansen, K. H., & Clifton-Hadley, R. S. (2006). Ante mortem diagnosis of tuberculosis in cattle: a review of the tuberculin tests, gamma-interferon assay and other ancillary diagnostic techniques. Research in Veterinary Science, 81(2), 190–210.

Diguimbaye, C. (2004). La tuberculose humaine et animale au Tchad : Contribution à la mise en évidence et caractérisation des agents causaux et leur implication en santé publique. (Tesis doctoral). Universidad de Basilea, Basilea.

Diguimbaye-Djaibé, C., Hilty, M., Ngandolo, R., Mahamat, H., Pfyffer, E., Baggi, F., … Schelling, E. (2006). Mycobacterium bovis Isolates from Tuberculous Lesions in Chadian Zebu Carcasses. Emerging Infectious Diseases, 12(5), 769–771.

Dirección de Gestión Estratégica del Cantón Mejía (GAD). (2013). Plan estratégico institucional del Gobierno A.D. Municipal del Cantón Mejía 2013-2014. Recuperado de http://www.municipiodemejia.gob.ec/downloads/lotaip2013/K/Plan_Estratgico_Insitucional_2013-2014.pdf

Dohoo, I., Martin, W., & Styhn, H. (2003). Introducción a los estudios observacionales. In S. M. McPike (Ed.), Veterinary Epidemiologic Research (pp. 139–146). Canada: AVC Inc.

Dorronsoro, I., & Torroba, L. (2007). Microbiología de la tuberculosis. Anales del Sistema Sanitario de Navarra, 30(2), 67–86.

62

Dundee, L., Grant, I. R., Ball, H. J., & Rowe, M. T. (2001). Comparative evaluation of four decontamination protocols for the isolation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from milk. Letters in Applied Microbiology, 33(3), 173–7.

Ebnet, K., & Vestweber, D. (1999). Molecular mechanisms that control leukocyte extravasation: the selectins and the chemokines. Histochemistry and Cell Biology, 112(1), 1–23.

Echeverría, G., Ron, L., León, A. M., Espinosa, W., Benítez-Ortiz, W., Proaño-Pérez, F. (2014). Prevalence of bovine tuberculosis in slaughtered cattle identified by nested-PCR in abattoirs from two dairy areas of Ecuador. Tropical animal health and production.

Edwards, K. M., Cynamon, M. H., Voladri, R. K. R., Hager, C. C., Destefano, M. S., Tham, K. T., … Kernodle, D. S. (2001). Iron-cofactored superoxide dismutase inhibits host responses to Mycobacterium tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 164(12), 2213–2219.

Elias, K., Hussein, D., Asseged, B., Wondwossen, T., & Gebeyehu, M. (2008). Status of bovine tuberculosis in Addis Ababa dairy farms. Revue Scientifique et Technique International Office of Epizootics, 27(3), 915–923.

Espinoza, W. (2011). Determinación de la prevalencia de Mycobacterium spp. de animales faenados y del personal de los camales municipales de Tungurahua. (Tesis de pregrado). Universidad Central del Ecuador, Quito.

Estrada-Chávez, C., Otero, F. D., Díaz, C. A., Villegas-Sepúlveda, N., González, R. P., & Salazar, D. G. (2004). Concordancia de la PCR y métodos rutinarios para el diagnóstico de tuberculosis bovina. Vet. Méx. 35(3), 225.

Fine, A. E., Bolin, C. A., Gardiner, J. C., & Kaneene, J. B. (2011). A Study of the Persistence of Mycobacterium bovis in the Environment under Natural Weather Conditions in Michigan, USA. Veterinary Medicine International, 2011, 12.

Fischer, E. a. J., van Roermund, H. J. W., Hemerik, L., van Asseldonk, M. a. P. M., & de Jong, M. C. M. (2005). Evaluation of surveillance strategies for bovine tuberculosis (Mycobacterium bovis) using an individual based epidemiological model. Preventive Veterinary Medicine, 67(4), 283–301.

63

Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). (2012). La tuberculosis bovina en la interfaz entre animales, seres humanos y ecosistema. Boletín de Enfermedades Transfronterizas de Los Animales. Recuperad de www.fao.org/empres

Forbes, B., Sahm, D., & Welssfeld, A. (2009). Micobacterias. En S. Rondinone (Ed.), Bailey & Scott Diagnóstico Microbilógico (12va ed., pp. 478–509). Buenos Aires: Médica Panamericana.

Forrellad, M. A., Klepp, L. I., Gioffré, A., Sabio, J., Morbidoni, H. R., de la Paz, M., … Bigi, F. (2013). Virulence factors of the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence, 4(1), 3–66.

Frankena, K., White, P. W., O’Keeffe, J., Costello, E., Martin, S. W., van Grevenhof, I., & More, S. J. (2007). Quantification of the relative efficiency of factory surveillance in the disclosure of tuberculosis lesions in attested Irish cattle. The Veterinary Record, 161(20), 679–684.

Galindo, E. (2008). Problemas y Ejercicios de Probabilidad y Estadística (3ra ed., p. 255). Quito: ProCiencia.

Garnier, T., Eiglmeier, K., Camus, J.-C., Medina, N., Mansoor, H., Pryor, M., … Hewinson, R. G. (2003). The complete genome sequence of Mycobacterium bovis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100(13), 7877–7882.

Garrity, G. M., Bell, J. A., & Lilburn, T. G. (2004). Taxonomic outline of the prokaryotes bergey’s manual ® of systematic bacteriology (2da ed.). New York: Bergey’s Manual Trust.

Gathogo, S. M., Kuria, J. K. N., & Ombui, J. N. (2012). Prevalence of bovine tuberculosis in slaughter cattle in Kenya: a postmortem, microbiological and DNA molecular study. Tropical Animal Health and Production, 44(7), 1739–1744.

Gil, A. D., & Samartino, L. (2000). Zoonosis en los sistemas de producción animal de las áreas urbanas y periurbanas en América Latina. Food and Agriculture Organization. Recuperado de http://www.bvsde.paho.org/bvsea/fulltext/gil.pdf

Gilbert, M., Mitchell, A., Bourn, D., Mawdsley, J., Clifton-Hadley, R., & Wint, W. (2005). Cattle movements and bovine tuberculosis in Great Britain. Nature, 435(7041), 491–6.

Gilsdorf, M., Ebel, E. D., & Disney, T. W. (2006). Benefit and cost assessment of the U.S. bovine tuberculosis eradication program. En C.

64

O. Thoen, J. H. Steele, & M. J. Gilsdorf (Eds.), Mycobacterium bovis Infection in Animals and Humans (2da ed., pp. 89–99). USA: Wiley-Blackwell.

González, D., Díaz, F., Jaramillo, L., Santillán, M. A., Erazo, R., & Díaz, C. (2007). Detección y descripción anatomopatológica de tuberculosis en una colonia de Ankole-Watusi. Técnica Pecuaria en México, 45(001), 101–109.

Goodchild, A. V., & Clifton-Hadley, R. S. (2001). Cattle-to-cattle transmission of Mycobacterium bovis. Tuberculosis, 81(1), 23-41.

Good, M., & Duignan, A. (2011). Perspectives on the History of Bovine TB and the Role of Tuberculin in Bovine TB Eradication. Veterinary Medicine International, 2011, 11.

Gradmann, C. (2006). Robert Koch and the white death: from tuberculosis to tuberculin. Microbes and Infection Institut Pasteur, 8(1), 294–301.

Griffin, J. M., Hahesy, T., Lynch, K., Salman, M. D., McCarthy, J., & Hurley, T. (1993). The association of cattle husbandry practices, environmental factors and farmer characteristics with the occurence of chronic bovine tuberculosis in dairy herds in the Republic of Ireland. Preventive Veterinary Medicine, 17(3-4), 145–160.

Griffin, J. M., Martin, S. W., Thorburn, M. A., Eves, J. A., & Hammond, R. F. (1996). A case-control study on the association of selected risk factors with the occurrence of bovine tuberculosis in the Republic of Ireland. Preventive Veterinary Medicine, 27(3-4), 217–229.

Gumi, B., Schelling, E., Berg, S., Firdessa, R., Erenso, G., Mekonnen, W., … Zinsstag, J. (2012). Zoonotic transmission of tuberculosis between pastoralists and their livestock in South-East Ethiopia. EcoHealth, 9(2), 139–49.

Harada, K. (1976). The nature of mycobacterial acid-fastness. Stain Technology, 51(5), 255–260.

Haynes, L., Linton, P. J., & Swain, S. L. (1997). Age-related changes in CD4 T cells of T cell receptor transgenic mice. Mechanisms of Ageing and Development, 93(1-3), 95–105.

Hernández, D. A. J., Rentería, E. T., López, V. G., & Montaño, H. M. (1997). An abattoir monitoring system for diagnosis of tuberculosis in cattle in Baja California, Mexico. Journal of the American Veterinary Medical Association, 211(6), 709–711.

65

Herrera-León, L., Pozuelo-Díaz, R., Molina, T., Valverde, A., Saiz, P., & Jiménez, M. S. (2009). Aplicación de métodos moleculares para la identificación de las especies del complejo Mycobacterium tuberculosis. Enfermedades Infecciosas Y Microbiología Clínica, 27(9), 496–502.

Hoffmann, C., Leis, A., Niederweis, M., Plitzko, J. M., & Engelhardt, H. (2008). Disclosure of the mycobacterial outer membrane: Cryo-electron tomography and vitreous sections reveal the lipid bilayer structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105(10), 3963–3967.

Humblet, M.-F., Boschiroli, M. L., & Saegerman, C. (2009). Classification of worldwide bovine tuberculosis risk factors in cattle: a stratified approach. Veterinary Research, 40(5), 24.

Humblet, M.-F., Gilbert, M., Govaerts, M., Fauville-Dufaux, M., Walravens, K., & Saegerman, C. (2010). New assessment of bovine tuberculosis risk factors in Belgium based on nationwide molecular epidemiology. Journal of Clinical Microbiology, 48(8), 2802–2808.

Ibrahim, S., Agada, C. A., Umoh, J. U., Ajogi, I., Farouk, U. M., & Cadmus, S. I. B. (2010). Prevalence of bovine tuberculosis in Jigawa State, northwestern Nigeria. Tropical Animal Health and Production, 42(7), 1333–1335.

Inangolet, F. O., Demelash, B., Oloya, J., Opuda-Asibo, J., & Skjerve, E. (2008). A cross-sectional study of bovine tuberculosis in the transhumant and agro-pastoral cattle herds in the border areas of Katakwi and Moroto districts, Uganda. Tropical Animal Health and Production, 40(7), 501–508.

Instituto Nacional de Estadística y Censos (INEC). (2011). Datos Estadisticos Agropecuarios. Encuesta de Superficie y Producción Agropecuaria Continua (ESPAC). Recuperado de http://www.inec.gob.ec/estadisticas/?option=com_content&view=article&id=103&Itemid=75

Jha, V. C., Morita, Y., Dhakal, M., Besnet, B., Sato, T., Nagai, A., … Kimura, H. (2007). Isolation of Mycobacterium spp. from milking buffaloes and cattle in Nepal. The Journal of Veterinary Medical Science the Japanese Society of Veterinary Science, 69(8), 819–825.

Johnston, W. T., Gettinby, G., Cox, D. R., Donnelly, C. a, Bourne, J., Clifton-Hadley, R., … Woodroffe, R. (2005). Herd-level risk factors associated with tuberculosis breakdowns among cattle herds in England before the 2001 foot-and-mouth disease epidemic. Biology Letters, 1(1), 53–6.

66

Jordao, L., Simoes, M., Bleck, C., Griffiths, G., & Anes, E. (2008). Characterization of Mycobacterium bovis Phagosome. Microscopy and Microanalysis the Official Journal of Microscopy Society of America Microbeam, 14 Suppl 3, 124–125.

Julián, E., Roldán, M., Sánchez-Chardi, A., Astola, O., Agustí, G., & Luquin, M. (2010). Microscopic cords, a virulence-related characteristic of Mycobacterium tuberculosis, are also present in nonpathogenic mycobacteria. Journal of Bacteriology, 192(7), 1751–60.

Kaneene, J. B., Bruning-Fann, C. S., Granger, L. M., Miller, R. A., & Porter-Spalding, B. A. (2002). Environmental and farm management factors associated with tuberculosis on cattle farms in northeastern Michigan. Journal of the American Veterinary Medical Association, 221(6), 837–842.

Karlson, A. G., & Lessel, E. F. (1970). Mycobacterium bovis nom. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 20(3), 273-282.

Katale, B. Z., Mbugi, E. V, Karimuribo, E. D., Keyyu, J. D., Kendall, S., Kibiki, G. S., … Matee, M. I. (2013). Prevalence and risk factors for infection of bovine tuberculosis in indigenous cattle in the Serengeti ecosystem, Tanzania. BMC Veterinary Research, 9(1), 267.

Kaur, D., Guerin, M. E., Skovierová, H., Brennan, P. J., & Jackson, M. (2009). Biogenesis of the cell wall and other glycoconjugates of Mycobacterium tuberculosis. Advances in Applied Microbiology, 69, 23–78.

Kazwala, R. R., Kambarage, D. M., Daborn, C. J., Nyange, J., Jiwa, S. F., & Sharp, J. M. (2001). Risk factors associated with the occurrence of bovine tuberculosis in cattle in the Southern Highlands of Tanzania. Veterinary Research Communications, 25(8), 609–614.

Kim, M.-J., Wainwright, H. C., Locketz, M., Bekker, L.-G., Walther, G. B., Dittrich, C., … Russell, D. G. (2010). Caseation of human tuberculosis granulomas correlates with elevated host lipid metabolism. EMBO Molecular Medicine, 2(7), 258–74.

Kirschner, P., Rosenau, J., Springer, B., Teschner, K., Feldmann, K., & Böttger, E. C. (1996). Diagnosis of mycobacterial infections by nucleic acid amplification: 18-month prospective study. Journal of Clinical Microbiology, 34(2), 304–312.

Koneman, E., & Allen, S. (2008). El papel del laboratorio de microbiología en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas: guía para la práctica y el

67

tratamiento. En M. de Alvear (Ed.), Diagnostico Microbiologico: Texto y Atlas a color (6ta ed., pp. 1-61). Buenos Aires, Argentina: Médica Panamericana.

Koro, F. K., Foko, E., Ngatchou, A. F., Eyangoh, S., & Etoa, F. (2013). First Insight into the Current Prevalence of Bovine Tuberculosis in Cattle Slaughtered in Cameroon : the Case of Main Abattoirs of Yaoundé and Douala. British Microbiology Research Journal, 3(3), 272–279.

Latini, O., Canal, A. M., Ferrara, M. E., Sequeira, M. D., Sequeira, G., Bagnaroli, R., & Torres, P. (1997). Confiabilidad en la determinación de prevalencia de infección por Mycobacterium bovis en ganado bovino por decomisos en frigoríficos. Archivos de Medicina Veterinaria, 29(2), 197–204.

Ledermann, W. (2003). La tuberculosis después del descubrimiento de Koch. Revista chilena de infectología, 20, 48–50.

León, A. (2011). Prevalencia de mycobacterium spp. en humanos y bovinos en el hospital Raúl Maldonado Mejía y en el Camal Municipal en el Cantón Cayambe. (Tesis de pregrado). Universidad Central del Ecuador, Quito.

Lévy-Frébault, V. V, & Portaels, F. (1992). Proposed minimal standards for the genus Mycobacterium and for description of new slowly growing Mycobacterium species. International Journal of Systematic Bacteriology, 42(2), 315–323.

Lilenbaum, W., Souza, G. N., & Fonseca, L. de S. (2007). Fatores de manejo associados à ocorrência de tuberculose bovina em rebanhos leiteiros do Rio de Janeiro, Brasil. Revista Brasileira de Ciência Veterinária, 14(2), 98–100.

López, L. M., Díaz, F., Vallecillo, J. A., Esquivel, H., & Gutiérrez, Á. J. (2006). Tuberculosis humana y bovina en Latinoamérica : De estudios sobre virulencia hacia herramientas para su control. Revista Latinoamericana de Microbiología, 48(2), 173–178.

Mamo, G., Abebe, F., Worku, Y., & Hussein, N. (2013). Bovine tuberculosis and its associated risk factors in pastoral and agro-pastoral cattle herds of Afar Region, Northeast Ethiopia. Journal of Veterinary Medicine and Animal Health, 5, 171–179.

Mangiapan, G., Vokurka, M., Schouls, L., Cadranel, J., Lecossier, D., Van Embden, J., & Hance, A. J. (1996). Sequence capture-PCR improves

68

detection of mycobacterial DNA in clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology, 34(5), 1209–1215.

McCune, R. M., Feldmann, F. M., & McDermott, W. (1965). Microbial persistence. The Journal of experimental medicine, 123(3), 445-468.

McIlroy, S. G., Neill, S. D., & McCracken, R. M. (1986). Pulmonary lesions and Mycobacterium bovis excretion from the respiratory tract of tuberculin reacting cattle. Veterinary Record, 118(26), 718–721.

McNeil, M. R., & Brennan, P. J. (1991). Structure, function and biogenesis of the cell envelope of mycobacteria in relation to bacterial physiology, pathogenesis and drug resistance; some thoughts and possibilities arising from recent structural information. Research in Microbiology, 142(4), 451–63.

Mechnikov, I. (2003). Robert Koch. Emerging Infectious Diseases, 5(3), 18–19.

Medeiros, L. D. S., Marassi, C. D., Figueiredo, E. E. S., & Lilenbaum, W. (2010). Potential application of new diagnostic methods for controlling bovine Tuberculosis in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, 41(3), 531–541.

Mellau, L. S. B., Nonga, H. E., & Karimuribo, E. D. (2010). A slaughterhouse survey of lung lesions in slaughtered stocks at Arusha, Tanzania. Preventive Veterinary Medicine, 97(2), 77–82.

Menin, Á., Fleith, R., Reck, C., Marlow, M., Fernandes, P., Pilati, C., & Báfica, A. (2013). Asymptomatic cattle naturally infected with Mycobacterium bovis present exacerbated tissue pathology and bacterial dissemination. PloS One, 8(1), e53884.

Menzies, F. D., & Neill, S. D. (2000). Cattle-to-cattle transmission of bovine tuberculosis. Veterinary Journal London England 1997, 160(2), 92–106.

Michel, A. L., Müller, B., & van Helden, P. D. (2010). Mycobacterium bovis at the animal-human interface: a problem, or not? Veterinary Microbiology, 140(3-4), 371–81.

Milian-Suazo, F., Anaya, A. M., & Gallegos, R. M. (2003). A review of M. bovis BCG protection against TB in cattle and other animals species. Preventive Veterinary Medicine, 58(1-2), 1–13.

Milián-Suazo, F., Harris, B., Arriaga, C., Thomsen, B., Studer, T., González, D., … Estrada, C. (2010). Sensibilidad y especificidad de PCR anidada y

69

Spoligotyping como pruebas rápidas de diagnóstico de tuberculosis bovina en tejido fresco Sensitivity and specificity of nested PCR and spoligotyping as quick diagnostic tests for bovine tuberculosis in fresh. Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias, 1(4), 403–415.

Milian-Suazo, F., Salman, M. D., Ramirez, C., Payeur, J. B., Rhyan, J. C., & Santillan, M. (2000). Identification of tuberculosis in cattle slaughtered in Mexico. American Journal Of Veterinary Research, 61(1), 86–89.

Miller, J. M., Jenny, A. L., & Payeur, J. B. (2002). Polymerase chain reaction detection of Mycobacterium tuberculosis complex and Mycobacterium avium organisms in formalin-fixed tissues from culture-negative ruminants. Veterinary Microbiology, 87(1), 15–23.

Morris, C. A. (2007). A review of genetic resistance to disease in Bos taurus cattle. Veterinary Journal, 174(3), 481–491.

Morris, R. S., Pfeiffer, D. U., & Jackson, R. (1994). The epidemiology of Mycobacterium bovis infections. Veterinary Microbiology, 40(1-2), 153–177.

Müller, B., Steiner, B., Bonfoh, B., Fané, A., Smith, N. H., & Zinsstag, J. (2008). Molecular characterisation of Mycobacterium bovis isolated from cattle slaughtered at the Bamako abattoir in Mali. BMC Veterinary Research, 4(1), 26.

Müller, B., Vounatsou, P., Ngandolo, B. N. R., Diguimbaye-Djaïbe, C., Schiller, I., Marg-Haufe, B., … Zinsstag, J. (2009). Bayesian receiver operating characteristic estimation of multiple tests for diagnosis of bovine tuberculosis in Chadian cattle. PloS One, 4(12), e8215.

Munyeme, M., Muma, J. B., Samui, K. L., Skjerve, E., Nambota, a M., Phiri, I. G. K., … Tryland, M. (2009). Prevalence of bovine tuberculosis and animal level risk factors for indigenous cattle under different grazing strategies in the livestock/wildlife interface areas of Zambia. Tropical Animal Health and Production, 41(3), 345–52.

Murakami, P. S., Fuverki, R. B. N., Nakatani, S. M., de Barros Filho, I. R., & Biondo, A. W. (2009). Tuberculose bovina : Saúde Animal e Saúde Pública. Arquivos de Ciências Veterinárias e Zoologia Da UNIPAR, 12(1), 67–74.

Murphy, D., Gormley, E., Costello, E., O’Meara, D., & Corner, L. A. (2010). The prevalence and distribution of Mycobacterium bovis infection in European badgers (Meles meles) as determined by enhanced post

70

mortem examination and bacteriological culture. Research in Veterinary Science, 88(1), 1–5.

Nava, O., & Prieto, L. (2001). Diagnóstico bacteriológico de tuberculosis pulmonar (revisión). Kasmera, 1–15.

Neill, S. D., Bryson, D. G., & Pollock, J. M. (2001). Pathogenesis of tuberculosis in cattle. Tuberculosis Edinburgh Scotland, 81(1-2), 79–86.

Neill, S. D., O’Brien, J. J., & Hanna, J. (1991). A mathematical model for Mycobacterium bovis excretion from tuberculous cattle. Veterinary Microbiology, 28(1), 103–109.

Neill, S. D., Pollock, J. M., Bryson, D. B., & Hanna, J. (1986). Pathogenesis of Mycobacterium bovis infection in cattle. Progress in Veterinary Microbiology and Immunology, 2(1-2), 198–214.

Neill, S. D., Pollock, J. M., Bryson, D. B., & Hanna, J. (1994). Pathogenesis of Mycobacterium bovis infection in cattle. Veterinary Microbiology, 40(1-2), 41–52.

Ngandolo, B. N. R., Müller, B., Diguimbaye-Djaïbe, C., Schiller, I., Marg-Haufe, B., Cagiola, M., … Zinsstag, J. (2009). Comparative assessment of fluorescence polarization and tuberculin skin testing for the diagnosis of bovine tuberculosis in Chadian cattle. Preventive Veterinary Medicine, 89(1-2), 81–89.

Niemann, S., Richter, E., & Rüsch-Gerdes, S. (2000). Differentiation among members of the Mycobacterium tuberculosis complex by molecular and biochemical features: evidence for two pyrazinamide-susceptible subtypes of M. bovis. Journal of Clinical Microbiology, 38(1), 152–7.

O’Reilly, L. M., & Daborn, C. J. (1995). The epidemiology of Mycobacterium bovis infections in animals and man: a review. Tubercle and Lung Disease the Official Journal of the International, 76 Suppl 1(Supplement 1), 1–46.

Oficina Internacional de Epizootias (OIE). (2009). Tuberculosis bovina. Manual de La OIE Sobre Animales Terrestres. Recuperado de http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/Health_standards/tahm/2.04.07_BOVINE_TB.pdf

Oficina Internacional de Epizootias (OIE). (2011). Tuberculosis bovina ¿ Qué es la tuberculosis bovina ? Fichas de Información General Sobre Enfermedades Animales. Recuperado de

71

http://www.oie.int/fileadmin/Home/esp/Media_Center/docs/pdf/Disease_cards/BOVINE-TB-ES.pdf

Oficina Internacional de Epizootias (OIE). (2014). Mapa de distribución de enfermedades. World Animal Health Information Database (WAHID). Recuperado de http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Diseaseinformation/

Olea-Popelka, F., Freeman, Z., White, P., Costello, E., O’Keeffe, J., Frankena, K., … More, S. (2012). Relative effectiveness of irish factories in the surveillance of slaughtered cattle for visible lesions of tuberculosis, 2005-2007. Irish Veterinary Journal, 65(1), 2.

Oloya, J., Kazwala, R., Lund, A., Opuda-Asibo, J., Demelash, B., Skjerve, E., … Djønne, B. (2007). Characterisation of mycobacteria isolated from slaughter cattle in pastoral regions of Uganda. BMC Microbiology, 7(95), 1–7.

Omer, M. K., Skjerve, E., Woldehiwet, Z., & Holstad, G. (2001). A cross-sectional study of bovine tuberculosis in dairy farms in Asmara, Eritrea. Tropical Animal Health and Production, 33(4), 295–303.

Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). (2010). Tuberculosis bovina. Código Sanitario Para Los Animales Terrestres. Recuperado de http://web.oie.int/esp/normes/mcode/es_chapitre_1.11.6.pdf

Pace, J. E., & Wakeman, D. L. (2003). Determining the age of cattle by their teeth. Journal of the American Veterinary Medical Association, 121(909), 483.

Palmer, M. V, & Ray Waters, W. (2006). Advances in bovine tuberculosis diagnosis and pathogenesis: what policy makers need to know. Veterinary Microbiology, 112(2-4), 181–90.

Palmer, M. V, Thacker, T. C., Waters, W. R., Gortázar, C., & Corner, L. a L. (2012). Mycobacterium bovis: A Model Pathogen at the Interface of Livestock, Wildlife, and Humans. Veterinary Medicine International, 2012, 236205.

Palmer, M., Waters, R., & Whipple, D. (2004). Investigation of the transmission of Mycobacterium bovis from deer to cattle through indirect contact. American Journal Of Veterinary Research, 65(11), 1483–1489.

Perdomo, E., & Pauller, C. (1986). Patología de la tuberculosis bovina. En G. Gómez, I. Sena, C. Bove, & M. Blanco (Eds.), Tuberculosis y Brucelosis bovina en el Uruguay (pp. 11–16). Montevideo, Uruguay: IICA.

72

Perez, A. M., Ward, M. P., & Ritacco, V. (2002). Simulation-model evaluation of bovine tuberculosis-eradication strategies in Argentine dairy herds. Preventive Veterinary Medicine, 54(4), 351–360.

Pérez-Lagoa, L., Navarroa, Y., & García-de-Viedma, D. (2013). Current knowledge and pending challenges in zoonosis caused by Mycobacterium bovis. A review. Research in veterinary science.

Phillips, C. J. C., Foster, C. R. W., Morris, P. A., & Teverson, R. (2002). Genetic and management factors that influence the susceptibility of cattle to Mycobacterium bovis infection. Animal Health Research Reviews Conference of Research Workers in Animal Diseases, 3(1), 3–13.

Phillips, C. J. C., Foster, C. R. W., Morris, P. A., & Teverson, R. (2003). The transmission of Mycobacterium bovis infection to cattle. Research in Veterinary Science, 74(1), 1–15.

Pollock, J. M., & Neill, S. D. (2002). Mycobacterium bovis infection and tuberculosis in cattle. Scandinavian Journal of Respiratory Diseases, 49(2), 115–127.

Porphyre, T., Stevenson, M. A., & McKenzie, J. (2008). Risk factors for bovine tuberculosis in New Zealand cattle farms and their relationship with possum control strategies. Preventive Veterinary Medicine, 86(1-2), 93–106.

Portillo, P. Del, Reyes, A., Salazar, L., Menéndez, D. M. C., & García, M. J. (2007). Genomics and Proteomics. En C. Palomino, S. Leão, & V. Ritacco (Eds.), Tuberculosis 2007: From Basic Science to patient care (1ra ed., pp. 113–156). Sao Pablo-Buenos Aires.

Pritchard, D. G. (1988). A Century of Bovine Tuberculosis 1888-1988: Conquest and Controversy. Journal of Comparative Pathology, 99(4), 357–399.

Proaño-Pérez, F. (2011). Contribution to the epidemiology of bovine tuberculosis in northern Ecuador. Université de Liege.

Proaño-Pérez, F., Benitez-Ortiz, W., Celi-Erazo, M., Ron-Garrido, L., Benitez-Capistros, R., Portaels, F., … Linden, A. (2009). Comparative intradermal tuberculin test in dairy cattle in the north of Ecuador and risk factors associated with bovine tuberculosis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 81(6), 1103–1109.

Proaño-Pérez, F., Benitez-Ortiz, W., Desmecht, D., Coral, M., Ortiz, J., Ron, L., … Linden, A. (2011a). Post-mortem examination and laboratory-

73

based analysis for the diagnosis of bovine tuberculosis among dairy cattle in Ecuador. Preventive Veterinary Medicine, 101(1-2), 65–72.

Proaño-Pérez, F., Benítez-Ortiz, W., Portaels, F., Rigouts, L., & Linden, A. (2011b). Situation of bovine tuberculosis in Ecuador. Revista Panamericana de Salud Pública Pan American Journal of Public Health, 30(3), 279–86.

Proaño-Pérez, F., Rigouts, L., Brandt, J., Dorny, P., Ron, J., Chavez, M.-A., … Benitez-Ortiz, W. (2006). Preliminary observations on Mycobacterium spp. in dairy cattle in Ecuador. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 75(2), 318–23.

Reyes-Hernández, P. (n.d.). Bovine Tuberculosis : The importance of risk factors in the introduction and exposure-dissemination of M. bovis in bovine herd. Recuperado de http://www2.sag.gob.cl/Pecuaria/bvo/BVO_15_I_semestre_2012/libros/monografia_TB_factores_riesgo_PReyes.pdf

Rey-Pérez, J. M., Hermoso de Mendoza, J., & Cardenal, A. (1992). Tuberculosis boniva: Patogenia. Bovis, 47, 35–42.

Ritacco, V., Torres, P., Sequiera, M. D., Reneiro, A., & de Kantor, I. N. (2006). Bovine Tuberculosis in Latin America and the Caribbean. In C. O. Thoen, J. H. Steele, & M. J. Gilsdorf (Eds.), Mycobacterium bovis infection in animals and humans (2da ed., pp. 149–160). Ames, Iowa, USA: Blacwell.

Rivera, S., & Giménez, J. F. (2010). La Tuberculosis Bovina en Venezuela: patogénesis, epidemiología, respuesta inmunitaria y nuevas alternativas para el diagnóstico. Revista Electrónica de Veterinaria, 11(9), 1–27.

Rodríguez, J. G., Fissanoti, J. C., Del, P., Patarroyo, M. E., Romano, M. I., & Cataldi, A. (1999). Amplification of a 500-Base-Pair Fragment from Cultured Isolates of Mycobacterium bovis. Journal of Clinical Microbiology, 37(7), 2330-2332.

Romero, A., Arriaga, C., Guevara, J., García, J. A., Torres, R. A., & Estrada-Chávez, C. (2006). Nota de investigación Confi rmación de la excreción de Mycobacterium bovis en exudados nasales mediante PCR anidada Confi rmación de la excreción de Mycobacterium bovis en exudados nasales mediante PCR anidada en un hato lechero. Vet. Méx., 37(1), 137–143.

Rothschild, B. M., Martin, L. D., Lev, G., Bercovier, H., Bar-gal, G. K., Greenblatt, C., … Brittain, D. (2001). Mycobacterium tuberculosis

74

Complex DNA from an Extinct Bison Dated 17,000 Years before the Present. Clinical Infectious Diseases, 33(3), 305-311.

Sakamoto, K. (2012). The Pathology of Mycobacterium tuberculosis Infection. Veterinary Pathology, 49(3), 423–439.

Saunders, B. M., & Cooper, a M. (2000). Restraining mycobacteria: role of granulomas in mycobacterial infections. Immunology and Cell Biology, 78(4), 334–41.

Schiller, I., Waters, W. R., RayWaters, W., Vordermeier, H. M., Jemmi, T., Welsh, M., … Oesch, B. (2011). Bovine tuberculosis in Europe from the perspective of an officially tuberculosis free country: trade, surveillance and diagnostics. Veterinary Microbiology, 151(1-2), 153–9.

Schultz, M. (2008). Theobald Smith. Emerging Infectious Diseases, 14(12), 1940–1942.

Sepúlveda, A., García-Martos, P., Rodríguez, M. J., Márquez, A., Puerto, J. L., & Saldarreaga, A. (2001). Evaluación del medio de Stonebrink para la recuperación de micobacterias. Revista de Diagnóstico Biológico, 50(4).

Servicio Agrícola y Ganadero (SAG). (2004). Bases para la inspección de la Tuberculosis Bovina en Matadero. Recuperado de http://dbordon.cfrd.cl/proyectos/tbc/tbc_bovina.pdf

Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA). (2010). Programa de control y erradicación de la tuberculosis bovina. Recuperado de http://www.senasa.gov.ar/contenido.php?to=n&in=858&io=3240

Seseña, G., Rodríguez, M. J., Martínez, M. D. C., & Jiménez, M. S. (2009). Shepherd with fever of 2 weeks of evolution. Enfermedades Infecciosas Y Microbiología Clínica, 27(1), 56–7.

Shitaye, J. E., Getahun, B., Alemayehu, T., Skoric, M., & Treml, F. (2006). A prevalence study of bovine tuberculosis by using abattoir meat inspection and tuberculin skin testing data, histopathological and IS 6110 PCR examination of tissues with tuberculous lesions in cattle in Ethiopia. Veterinarni Medicina-PRAHA, 51(11), 512–522.

Shittu, A., Clifton-Hadley, R. S., Ely, E. R., Upton, P. U., & Downs, S. H. (2013). Factors associated with bovine tuberculosis confirmation rates in suspect lesions found in cattle at routine slaughter in Great Britain, 2003-2008. Preventive Veterinary Medicine, 110(3-4), 395–404.

75

Skuce, R. A., & Neill, S. D. (2001). Molecular epidemiology of Mycobacterium bovis: exploiting molecular data. Tuberculosis Edinburgh Scotland, 81(1-2), 169–175.

Skuce, R. A., Allen, A. R., & McDowell, S. W. J. (2012). Herd-level risk factors for bovine tuberculosis: a literature review. Veterinary Medicine International, 2012, 10.

Smith, T. (1898). A Comparative Study of Bovine Tubercle Bacilli and of Human Bacilli From Sputum. The Journal of Experimental Medicine, 3(4-5), 451–511.

Srivastava, K., Chauhan, D. S., Gupta, P., Singh, H. B., Sharma, V. D., Yadav, V. S., & Thakral, S. S. (2008). Isolation of Mycobacterium bovis & M. tuberculosis from cattle of some farms in north India - Possible relevance in human health, Indian Journal of Medical Research, 128(1).

Strain, S. M., McNair, J., & McDowell, S. W. J. (2011). Bovine tuberculosis : A review of diagnostic tests for M. bovis infection in cattle. Recuperado de http://www.dardni.gov.uk/afbi-literature-review-tb-review-diagnostic-tests-cattle.pdf

Szewzyk, R., Svenson, S. B., Hoffner, S. E., Bölske, G., Wahlström, H., Englund, L., … Källenius, G. (1995). Molecular epidemiological studies of Mycobacterium bovis infections in humans and animals in Sweden. Journal of Clinical Microbiology, 33(12), 3183–3185.

Teklul, A., Asseged, B., Yimer, E., Gebeyehu, M., & Woldesenbet, Z. (2004). Tuberculous lesions not detected by routine abattoir inspection: the experience of the Hossana municipal abattoir, southern Ethiopia. Revue Scientifique et Technique International Office of Epizootics, 23(3), 957–964.

Terefe, D. (2014). Gross pathological lesions of bovine tuberculosis and efficiency of meat inspection procedure to detect- infected cattle in Adama municipal abattoir. Journal of Veterinary Medicine and Animal Health, 6(2), 48–53.

The Center for Food Security and Public Health (CFSPH). (2009). Tuberculosis bovina. Recuperado de http://www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdfs/bovine_tuberculosis.pdf

Thoen, C., Lobue, P., & De Kantor, I. (2006). The importance of Mycobacterium bovis as a zoonosis. Veterinary Microbiology, 112(2-4), 339–345.

76

Thoen, C., Lobue, P., & Enarson, D., Kaneene, J. B., de Kantor, I. N. (2009).

Tuberculosis : a re ‐ emerging disease in animals and humans. Veterinaria Italiana, 45(1), 135–181.

Thrusfield, M. (2008). Veterinary Epidemiology (3ra ed., p. 626). Blackwell Publishing.

Toledo P., Milian F., Santillán M. Ramírez I. 1999. Aislamiento e identificación de Mycobacterium bovis a partir de muestras de expectoración de pacientes humanos con problemas respiratorios crónicos. Vet. Méx. 30(3) 227.

Torres, P. M. (2009a). Sistema de vigilancia epidemiológica mediante la detección en faena de la Tuberculosis bovina para la caracterización epidemiológica y control de la enfermedad en la Provincia de Entre Ríos. Recuperado de http://www.senasa.gov.ar/Archivos/File/File3383-tuber-bovina-tesis.pdf

Torres, P. M. (2009b). Situación de la Tuberculosis bovina en la República de Argentina. Programa Nacional de Control Y Erradicación de La Tuberculosis, Servicio Nacional de Sanidad Animal (SENASA). Recuperado de http://www.senasa.gov.ar/Archivos/File/File1013-situacion_tuberculosis_31_12_09.pdf

Tortoli, E. (2006). The new mycobacteria: an update. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 48(2), 159–78.

Van Soolingen, D., Hoogenboezem, T., De Haas, P. E., Hermans, P. W., Koedam, M. A., Teppema, K. S., … Van Embden, J. D. (1997). A novel pathogenic taxon of the Mycobacterium tuberculosis complex, Canetti: characterization of an exceptional isolate from Africa. International Journal of Systematic Bacteriology, 47(4), 1236–1245.

Van Soolingen, D., van der Zanden, a G., de Haas, P. E., Noordhoek, G. T., Kiers, A., Foudraine, N. a, … van Embden, J. D. (1998). Diagnosis of Mycobacterium microti infections among humans by using novel genetic markers. Journal of Clinical Microbiology, 36(7), 1840–5.

Velasco, G., & Wisniewski, P. (2001). Probabilidades y estadística para ingeniería y ciencia. Cengage Learning Editores.

Velayati, A. A., & Farnia, P. (2012). Morphological Characterization of Mycobacterium tuberculosis. Recuperado de http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/28419.pdf

77

Vitale, F., Capra, G., Maxia, L., Reale, S., Vesco, G., & Caracappa, S. (1998). Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex in Cattle by PCR Using Milk, Lymph Node Aspirates, and Nasal Swabs. Journal of Clinical Microbiology, 36(4), 1050–1055.

Vordermeier, H. M., Chambers, M. A., Cockle, P. J., Whelan, A. O., Simmons, J., & Hewinson, R. G. (2002). Correlation of ESAT-6-specific gamma interferon production with pathology in cattle following Mycobacterium bovis BCG vaccination against experimental bovine tuberculosis. Infection and immunity, 70(6), 3026-3032.

Whipple, D. L., Bolin, C. a., & Miller, J. M. (1996). Distribution of Lesions in Cattle Infected with Mycobacterium bovis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 8(3), 351–354.

White, P. C. L., & Benhin, J. K. A. (2004). Factors influencing the incidence and scale of bovine tuberculosis in cattle in southwest England. Preventive Veterinary Medicine, 63(1-2), 1–7.

Yamasaki, E. M., Brito, M. F., Mota, R. A., Mcintosh, D., Tokarnia, C. H., M, A. Y. E., … Pa-, T. C. H. (2013). Paratuberculose em ruminantes no Brasil. Pesq. Vet. Bras, 33(2), 127–140.

Young, D., Lathigra, R., Hendrixt, R., Sweetsert, D., & Young, R. A. (1988). Stress proteins are immune targets in leprosy and tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 85, 4267–4270.

Young, J. S., Gormley, E., Elizabeth, M. H., & Wellington, E. M. H. (2005). Molecular Detection of Mycobacterium bovis and Mycobacterium bovis BCG (Pasteur) in Soil. Applied and Environmental Microbiology, 71(4), 1946–1952.

Zinsstag, J., Schelling, E., Roth, F., & Kazwala, R. (2006). Economics of Bovine Tuberculosis. En C. O. Thoen, J. H. Steele, & M. J. Gilsdorf (Eds.), Mycobacterium bovis Infection in Animals and Humans (2da ed., pp. 68 – 83). USA: Wiley-Blackwell.

Zuber, B., Chami, M., Houssin, C., Dubochet, J., Griffiths, G., & Daffé, M. (2008). Direct Visualization of the Outer Membrane of Mycobacteria and Corynebacteria in Their Native State. Journal of Bacteriology, 190(16), 5672–5680.

Zumla, a, & James, D. G. (1996). Granulomatous infections: etiology and classification. Clinical Infectious Diseases, 23(1), 146–58.

79

ANEXOS

80

Anexo A: Registro de muestreo -Tuberculosis

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR CENTRO INTERNACIONAL DE ZOONOSIS (CIZ) REGISTRO DE MUESTREO DE TUBERCULOSIS

Matadero: Matadero Municipal del Cantón Mejía

Provincia: Pichincha Encuestador: Diego Cushicóndor

Cantón: Mejía Fecha: 27-05-2013 al 17-07-2013

N° Código Fecha

INFORMACIÓN DEL ANIMAL PROCEDENCIA Tipo de muestra

Lesión

Especie Raza Edad Sexo M/H

Provincia Cantón Parroquia Hacienda/Feria TB-M P

1 108 27-05-2013 Bovino EUR 8 H Pichincha Mejía Chaupi ND x x -

2 115 27-05-2013 Bovino EUR 5 H Pichincha Mejía Machachi ND x x -

3 117 27-05-2013 Bovino EUR 8 M Pichincha Mejía Machachi ND x x -


5 131 27-05-2013 Bovino CEB 7 H S. Domingo S. Domingo S. Domingo ND x x -

6 132 27-05-2013 Bovino CEB 5 H Cotopaxi Saquisilí Saquisilí Feria x x -



9 135 27-05-2013 Bovino CEB 8 H Cotopaxi Saquisilí Saquisilí ND x x -


11 137 27-05-2013 Bovino CEB 5 H S. Domingo S. Domingo S. Domingo Hacienda x x -

12 138 27-05-2013 Bovino CEB 6 H S. Domingo S. Domingo S. Domingo Feria x x -



81

Anexo A (cont.).

15 142 27-05-2013 Bovino EUR 4 H Pichincha Mejía Machachi Feria x x -

16 143 27-05-2013 Bovino CEB 5 M S. Domingo S. Domingo S. Domingo ND x x -









25 153 27-05-2013 Bovino MES 3 H Cotopaxi Saquisilí Saquisilí Feria x x -





30 158 27-05-2013 Bovino EUR 3 H S. Domingo S. Domingo S. Domingo Feria x x -










40 168 27-05-2013 Bovino MES 3 H S. Domingo S. Domingo S. Domingo Feria x x -

82






46 174 07-06-2013 Bovino EUR 4 H Pichincha Mejía Aloag Feria x x -


48 176 07-06-2013 Bovino EUR 5 H Pichincha Rumiñahui Sangolquí Feria x x -


50 179 07-06-2013 Bovino EUR 1,4 H Pichincha Rumiñahui Sangolquí Feria x x -

51 180 07-06-2013 Bovino EUR 5 M Pichincha Mejía Tambillo Feria x x -

52 181 07-06-2013 Bovino EUR 3 M Pichincha Rumiñahui Sangolquí Feria x x -


54 183 07-06-2013 Bovino EUR 2 H Pichincha Mejía Chaupi Feria x x -

55 184 07-06-2013 Bovino EUR 2 M Pichincha Rumiñahui Sangolquí Feria x x -

56 185 07-06-2013 Bovino EUR 1,4 M Pichincha Mejía Machachi Feria x x -


58 187 07-06-2013 Bovino EUR 2 M Cotopaxi Saquisilí Cochapamba Feria x x -

59 188 07-06-2013 Bovino EUR 5 H Cotopaxi Saquisilí Cochapamba Feria x x -










83




72 201 07-06-2013 Bovino CEB 1,4 H S. Domingo S. Domingo S. Domingo Hacienda x x -



75 204 07-06-2013 Bovino CEB 1,4 M S. Domingo S. Domingo S. Domingo ND x x -

76 205 07-06-2013 Bovino CEB 1,4 M S. Domingo S. Domingo S. Domingo ND x x -

77 206 07-06-2013 Bovino CEB 2 M S. Domingo S. Domingo S. Domingo Feria x x -

78 207 07-06-2013 Bovino CEB 1,4 M S. Domingo S. Domingo S. Domingo Feria x x -






84 111 12-06-2013 Bovino EUR 8 H Pichincha Rumiñahui Cotogchoa Feria x x -






90 121 12-06-2013 Bovino EUR 1,4 H S. Domingo S. Domingo S. Domingo Feria x x -




94 126 12-06-2013 Bovino MES 2 M Pichincha Mejía ND Feria x x -

95 127 12-06-2013 Bovino EUR 2 M Pichincha Mejía Machachi Feria x x -


84

97 129 12-06-2013 Bovino EUR 5 H Pichincha Mejía Machachi Feria x x positivo

98 130 12-06-2013 Bovino MES 4 H Pichincha Mejía Machachi Feria x x -










108 219 12-06-2013 Bovino EUR 1,4 M Cotopaxi Saquisilí Cochapamba Feria x x -


110 221 12-06-2013 Bovino EUR 4 H Pichincha Mejía Aloag ND x x -


112 223 12-06-2013 Bovino CEB 2 M Pichincha Mejía ND ND x x -

113 224 12-06-2013 Bovino CEB 2 M Pichincha Mejía Machachi ND x x -

114 225 12-06-2013 Bovino CEB 2 H Pichincha Mejía Machachi ND x x -

115 226 12-06-2013 Bovino EUR 3 H S. Domingo S. Domingo S. Domingo ND x x -










85

125 131a 12-06-2013 Bovino EUR 2 H Pichincha Rumiñahui Sangolquí Feria x x -

126 134a 12-06-2013 Bovino EUR 1,4 H Pichincha Quito Amaguaña Feria x x -

127 136a 12-06-2013 Bovino EUR 2 M Cotopaxi Saquisilí Cochapamba Feria x x -




131 239 19-06-2013 Bovino EUR 1,4 H Pichincha Mejía Machachi ND x x -


133 271 19-06-2013 Bovino EUR 2 M Cotopaxi Saquisilí Saquisilí ND x x -

134 272 19-06-2013 Bovino EUR 1,4 H Pichincha Mejía Aloag ND x x -

135 273 19-06-2013 Bovino EUR 2 M Pichincha Quito Pintag ND x x -

136 274 19-06-2013 Bovino EUR 1,4 H Pichincha Mejía Aloag ND x x -

137 276 19-06-2013 Bovino EUR 5 H Pichincha Mejía Chaupi Hacienda x x -

138 277 19-06-2013 Bovino EUR 2 M Pichincha Quito Pintag Hacienda x x -


140 279 19-06-2013 Bovino MES 4 M Pichincha Mejía Machachi ND x x -

141 280 19-06-2013 Bovino EUR 4 M Pichincha Mejía Machachi Hacienda x x -

142 281 19-06-2013 Bovino EUR 2 H Pichincha Mejía Machachi Hacienda x x -

143 282 19-06-2013 Bovino MES 2 M Cotopaxi Saquisilí Saquisilí Hacienda x x -







150 289 19-06-2013 Bovino MES 2 M S. Domingo S. Domingo S. Domingo Feria x x -



86




156 295 19-06-2013 Bovino CEB 1,4 M S. Domingo S. Domingo S. Domingo Feria x x -




160 299 19-06-2013 Bovino EUR 1,4 M S. Domingo S. Domingo S. Domingo Feria x x -




164 303 19-06-2013 Bovino EUR 2 M S. Domingo S. Domingo S. Domingo Feria x x -















179 319 19-06-2013 Bovino MES 4 M S. Domingo S. Domingo S. Domingo Hacienda x x -


87

181 338 03-07-2013 Bovino EUR 2 H Pichincha Quito Chillogallo Hacienda x x -

182 352 03-07-2013 Bovino EUR 5 H Pichincha Quito Chillogallo Hacienda x x -









191 376 03-07-2013 Bovino MES 2 M Pichincha Rumiñahui Sangolquí ND x x -

192 377 03-07-2013 Bovino EUR 8 H Pichincha Rumiñahui Sangolquí ND x x -

193 378 03-07-2013 Bovino MES 4 H Pichincha Rumiñahui Sangolquí ND x x -



196 381 03-07-2013 Bovino EUR 8 H Pichincha Rumiñahui Cotogchoa ND x x -

197 382 03-07-2013 Bovino EUR 1,4 H Pichincha Rumiñahui Cotogchoa ND x x -





202 387 03-07-2013 Bovino EUR 5 H Pichincha Mejía Tambillo ND x x -


204 389 03-07-2013 Bovino EUR 3 H Pichincha Quito Chillogallo Feria x x -





88






214 399 03-07-2013 Bovino MES 5 H Pichincha Mejía Machachi Feria x x positivo



217 402 03-07-2013 Bovino MES 1,4 H S. Domingo S. Domingo S. Domingo Feria x x -





222 407 03-07-2013 Bovino EUR 5 H Pichincha Mejía Tambillo Hacienda x x -


224 413 08-07-2013 Bovino EUR 2 H Pichincha Rumiñahui Rumipamba ND x x -


226 415 08-07-2013 Bovino MES 4 H Pichincha Rumiñahui Rumipamba ND x x -



229 419 08-07-2013 Bovino EUR 1,4 H Pichincha Mejía Machachi Hacienda x x -


231 421 08-07-2013 Bovino MES 2 H Pichincha Mejía Machachi Hacienda x x -

232 422 08-07-2013 Bovino MES 2 M Pichincha Mejía Machachi Hacienda x x -





89







243 433 08-07-2013 Bovino MES 1,4 H Pichincha Mejía Machachi Feria x x -








251 442 08-07-2013 Bovino MES 2 M Pichincha Mejía Machachi Feria x x -











262 454 08-07-2013 Bovino EUR 2 M Pichincha Quito Amaguaña ND x x -

263 455 08-07-2013 Bovino MES 3 M Pichincha Mejía Machachi ND x x -

264 456 08-07-2013 Bovino EUR 1,4 H Pichincha Mejía Machachi Feria x x -

90











275 467 08-07-2013 Bovino MES 1,4 H S. Domingo S. Domingo S. Domingo Feria x x -


















91








300 492 15-07-2013 Bovino MES 1,4 M Pichincha Mejía Machachi Hacienda x x -



303 495 15-07-2013 Bovino EUR 2 H Cotopaxi Saquisilí Cochapamba Hacienda x x -



306 498 15-07-2013 Bovino EUR 1,4 H Pichincha Mejía Chaupi ND x x -




310 502 15-07-2013 Bovino MES 1,4 M Pichincha Mejía Machachi Hacienda x x -


312 504 15-07-2013 Bovino EUR 2 H Pichincha Rumiñahui Cotogchoa Hacienda x x -









92



323 516 15-07-2013 Bovino EUR 1,4 H Pichincha Mejía Machachi Feria x x -





328 521 15-07-2013 Bovino MES 1,4 H Pichincha Rumiñahui Sangolquí ND x x -


330 523 15-07-2013 Bovino MES 1,4 M Pichincha Rumiñahui Sangolquí ND x x -







337 531 15-07-2013 Bovino CEB 5 H Pichincha Mejía Machachi Feria x x -












93








356 544 17-07-2013 Bovino MES 3 H Pichincha Quito Amaguaña ND x x -




360 561 17-07-2013 Bovino EUR 4 H Pichincha Quito Amaguaña ND x x -






366 567 17-07-2013 Bovino MES 1,4 M Pichincha Quito Amaguaña ND x x -


368 569 17-07-2013 Bovino MES 2 H Pichincha Mejía ND ND x x -

369 570 17-07-2013 Bovino MES 2 H Pichincha Mejía ND ND x x -

370 571 17-07-2013 Bovino CEB 2 H Pichincha Mejía ND ND x x -

371 572 17-07-2013 Bovino EUR 2 M Pichincha Mejía ND Hacienda x x -

372 573 17-07-2013 Bovino EUR 1,4 H Pichincha Mejía ND ND x x -


374 575 17-07-2013 Bovino MES 1,4 H Pichincha Mejía Machachi ND x x -



94


378 579 17-07-2013 Bovino EUR 3 H Pichincha Mejía Aloag Hacienda x x -









387 588 17-07-2013 Bovino EUR 5 H Pichincha Mejía ND ND x x -






393 602 17-07-2013 Bovino MES 4 H Pichincha Mejía Machachi ND x x -



* Código = código del CIZ, EUR = europeo, CEB = cebuino, MES = mestizo, H = hembra, M = macho, ND = no dato, x = si, - = negativo a lesión



95

Anexo B: Procedimiento de las pruebas utilizadas.

Anexo B-1: Protocolo para la inspección macroscópica post-mortem.

Reactivos

Alcohol antiséptico

Cloro al 10% Materiales

Caja térmica

Cuchillo

Fundas herméticas de 8 X 12 cm

Fundas industriales negras y rojas

Hielo químico

Tabla y hojas de registro

Marcador indeleble

Procedimiento Una vez separado el pulmón, se incide tejido conectivo que esta entre el pulmón izquierdo y la tráquea para localizar el ganglio traqueobronquial. Se retira la grasa que se encuentra entre los pulmones para localizar la cadena de ganglios mediastínicos. Los ganglios linfáticos se cortan en secciones finas (~ 2 mm de espesor) y se examina la presencia de lesiones compatibles con TBB. En el caso de los pulmones, se examina por visualización y palpación los 7 lóbulos en busca de pequeños tubérculos, seguido por un corte del pulmón (borde dorsal del lóbulo caudal) en rodajas (~ 2 cm de espesor) para examinar la superficie de corte (Vordermeier et al., 2002). Del pulmón se toma tejido de la parte caudal dorsal del lóbulo diafragmático del pulmón. Se muestrea el ganglio mediastínico caudal y el traqueobronquial izquierdo (Sierra et al., 2004).

96

Anexo B-2: Protocolo para preparación de medios de cultivo

Reactivos

Agua destilada estéril (del Equipo Direct Q. ® 3UV - Millipore, MERCK - Alemania)

Agar Löwenstein Medium Base (Difco T. M. - Francia; # 224420-500)

Glicerol (J.T. Baker - México; # 2136.03)

Piruvato de sodio al 4% (Fisher Scientific - China; # O4376-100)

Huevos

Equipos

Incubadora (37oC) (memmert; 100-800)

Mechero de bunsen

Refrigeradora (G.E.; TBS17XA)

Licuadora

Materiales

Tubos de ensayo de 20 ml

Pipetas Pasteur desechables

Ayudante de pipeteo

Embudo erlenmeyer

Probeta (10 y 100 ml)

Gasa estéril

Botellas con tapa rosca de color azul Procedimiento Suspender 37.3 g de polvo en 600 ml de agua destilada y agregar 12ml de glicerina o 6.30 g de piruvato de sodio (4%) para el caso de Stonebrink. Calentar agitándolo continuamente y hervir por un minuto. Auto-clavar a 121 OC durante 15 minutos. Enfriar a 50oC aproximadamente. Adicionar asépticamente un litro de huevos previamente licuados y mezclar hasta que quede homogéneo. Distribuir en tubos de vidrio estéril y tapar herméticamente. Colocar los tubos en posición inclinada en la incubadora a 85oC durante 45 minutos y almacenarlos a 4oC.

97

Anexo B-3: Protocolo para el aislamiento Reactivos

Hidróxido de Sodio (NaOH 4%) [4 g de NaOH en perlas (J.T.Baker- México; # 3722-19) + 100 ml de H2O destilada]

Ácido Sulfúrico (H4SO2) [2.8 ml de H2SO4 absoluto (MERCK - Alemania; # 1.00731.2511) + 97 ml de H2O destilada]

Rojo de fenol (1 % v / v) [0.1 g de Fenol (Reactivos H.V.O - Ecuador) +

10 ml de Etanol 95% (PANREAC - España; # 121086.0716) + 90 ml

de H2O destilada]

Agua destilada estéril (del Equipo Direct Q. ® 3UV - Millipore,

MERCK- Alemania)

Equipos

Cabina de bioseguridad microbiológica (ESCO, Clase II BSC; AC2- 452)

Centrífuga (SIGMA; 2-5)

Autoclave (TRIDENT MEDICAL; EA - 632)

Incubadora (37oC) (memmert; 100-800)

Refrigeradora (G. E.; TA04D04)

Vortex (Fisher Scientific; 52 BF)

Materiales

Tubos falcon cónicos con tapa rosca de 15 ml (Cellstar ® # 227261)


Tijeras y pinzas estériles de disección

Morteros y pistilos estériles de porcelana Preparación del tejido Retirar grasa y tejido conectivo de las muestras y cortar aproximadamente 1 cm3 la biopsia en un mortero estéril con un par de pinzas y tijeras estéril. Triturar el tejido con el mortero en 2 ml de agua estéril hasta obtener una suspensión homogénea. Transferir la suspensión a un tubo falcon cónico de 15 ml (Cellstar ®).

98

Descontaminación por el Método de Petroff Añadir NaOH al 4 % en un volumen de 1:2 o de 1:1. Mezclar en el vórtex. Incubar a 37oC por 20 minutos, con agitaciones intermedias cada 5 min. Centrifugar durante 20 minutos a (2000 a 3000 rpm). Decantar el sobrenadante y añadir 500ul de H2O. Agregar una gota de rojo fenol. Añadir gota a gota 600ul ácido sulfúrico 1N hasta el viraje del indicador de rosado a amarillo. Homogenizar en vórtex.

Inoculación en medio sólido

Inocular 0,2 ml (4 gotas con una pipeta Pasteur) en el medio sólido Löwenstein-Jensen, y de Stonebrink. Cubrir la superficie del medio con el inóculo y dejar inclinado una semana en la incubadora a 37 °C, posteriormente colocarlos en posición vertical. Leer semanalmente el crecimiento de las colonias por un periodo de 8 semanas. Cualquier colonia que presente fenotipos sugerentes de micobacterias debe ser observado por el método de Ziehl-Neelsen para confirmar bacilos ácido alcohol resistente.

Interpretación del crecimiento de colonias en el cultivo de acuerdo con el procedimiento estándar

Crecimiento

Resultado

sin crecimiento negativo menos de 50 colonias contar el número de colonias 50 – 100 colonias + 100 – 200 colonias ++ > 200 colonias (crecimiento confluente) +++

99

Anexo B-4: Protocolo para microscopía por la técnica de Ziehl-Neelsen.

Reactivos

Carbol Fucsina (2 % v / v) (PANREACQUIMICA S.A - España)

Azul de metileno [1 g de Azul de metileno (PANREAC QUIMICA S.A - España; M325-100) + 100 ml de H2O destilada)

Etanol 95% (PANREAC - España; # 1.00983.2500)

Ácido clorhídrico 37% (MERCK - Alemania)

Alcohol ácido (3%) (3 ml de Ácido clorhídrico 37% (MERCK - Alemania; # 1.00317.2500) + 97 ml de Etanol 95% (PANREAC - España; # 1.00317.2500)

Agua destilada estéril (del Equipo Direct Q. ® 3UV - Millipore, MERCK

- Alemania)

Equipos

Cabina de bioseguridad microbiológica (ESCO, Clase II BSC; AC2- 452)

Microscopio óptico (OLIMPUS; CX31)

Mechero de bunsen Materiales


Porta objetos

Procedimiento Tomar una pequeña gota del homogenizado o de las colonias sugerentes de micobacterias. Realizar un extendido hasta lograr una película uniforme que forme un óvalo de un poco más de 2 cm de longitud por 1 cm de ancho. Secar el frotis a temperatura ambiente dentro de la cámara de flujo laminar activado la radiación ultra violeta y fijar con la llama azul del mechero. Colocar papel filtro sobre cada frotis. Colorear el frotis con un exceso de carbol fucsina, cubrir la placa completamente por 20 minutos. Lavar con agua para retirar restos de colorante. Cubrir los portaobjetos completamente de ácido - alcohol y dejar durante 3 minutos (repetir 2-3 veces). Lavar con agua para retirar restos de ácido-alcohol. Cubrir los portaobjetos completamente con azul de metileno durante 1 minuto. Lavar con agua para retirar restos de colorantes y secar las placas a temperatura ambiente, en posición vertical. Finalmente observar al microscopio bacilos de color rojo sobre un fondo de color azul.

100

Anexo C.- Fórmulas utilizadas para la asociación de las variables Prueba de Chi cuadrado (X2)

𝑋2𝑜𝑏𝑠 = ∑

(𝑛𝑖 − 𝑓𝑖)2

𝑓𝑖

𝐾

𝑖=1

(Galindo, 2008) Donde:

𝑛𝑖 = frecuencia observada

𝑓𝑖 = frecuencia esperada 𝐾 = categoría

Prueba exacta de Fisher

𝐹 =𝑈/𝑣1

V/𝑣2

(Velasco & Wisniewski, 2001). Donde:

𝑈, V = variables aleatoria 𝑣1, 𝑣2 = grados de libertad

101

Anexo D.- Lista de siglas y abreviaturas

ADN: ácido desoxirribonucleico

BAAR: bacilo ácido alcohol resistente

BCG: bacillus Calmette-Guérin

BSC II: cabina de seguridad biológica 2

CFSPH: The Center for Food Security and Public Health

CMTB: complejo Mycobacterium Tuberculosis

CR3: complement receptor 3

FAO: Food and Agriculture Organization

GAD: Dirección de Gestión Estratégica

G-C: guanina-citocina

GLM: modelos lineales generalizados

IP: inspección post-mortem

LAM: lipoarabinomanano

LV: lesiones visibles

MNT: micobacterias no tuberculosas

NL: nódulo linfático

OIE: Organización Mundial de Sanidad Animal

OR: odds ratio

PA: prevalencia aparente

PIM: fosfatidilmioinositol

POP: complejo mycolyarabinogalactano-peptidoglicano

PPD: derivado proteico purificado

Rcmdr: comando del programa estadístico R

SAG: Servicio Agrícola y Ganadero

102

Se: sensibilidad

SENASA: Servicio Nacional de Sanidad Animal

Sp: especificidad

TBB: Tuberculosis bovina

WAHID: World Animal Health Information System

ZN: Ziehl-Neelsen

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para ... · INSPECCIÓN POST-MORTEM Y CULTIVO...

Documents

Transcript of Trabajo de grado presentado como requisito parcial para ... · INSPECCIÓN POST-MORTEM Y CULTIVO...