Tim Hieu Ve Vi Khuan Salmonella CvEbb9ZTTe 20130427110121 11208

Khóa luận: Tìm hiểu về vi khuẩn Salmonella

Chương I: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng trở nên cấp

thiết, các báo cáo cho thấy phần lớn các vụ ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật. Đã có

nhiều cảnh báo, nhưng tình trạng ngộ độc thực phẩm vẫn đang leo thang và ngày càng

nghiêm trọng.

Có rất nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm, ví dụ như Clostridium

butolinum, Escherichia Coli, Listeria monocytogenes… trong đó, Salmonella là loài vi

sinh vật gây ngộ độc rất nguy hiểm. Salmonella thuộc họ Enterobactriaceae, gây ra

bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết và nhiều bệnh nghiêm trọng khác.

Xuất phát từ nhu cầu tìm hiểu về độc tố, khả năng gây bệnh và cách phát hiện

cũng như cách phòng phòng chống bệnh vi khuẩn Salmonella,tôi thực hiện nghiên cứu

đề tài “tìm hiểu về vi khuẩn Salmonella” để có cái nhìn tổng quan hơn về vi khuẩn

Salmonella và một số chủng vi sinh vật khác.

1.2 Mục đích

- Tổng quan về một số loại vi sinh vật thường lây nhiễm vào thực phẩm

và tìm hiểu về Salmonella với độc tố của nó.

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa, sinh lý, kháng nguyên, độc tố và cơ

chế gây độc của một số chủng vi sinh vật.

- Nghiên cứu về cách phát hiện Salmonella và đề xuất biện pháp phòng

ngừa.

GVHD: KS. Huỳnh Văn Thành 1SVTH: Nguyễn Hữu Liêm


Chương II: TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về một số vi sinh vật nhiễm trong thực phẩm

2.1.1 Escherichia Coli

2.1.1.1 Giới thiệu

- Escherichia Coli do Theodore Escherich (1857 – 1911), một bác sĩ nhi

khoa người Áo phát hiện năm 1885.

- E.Coli là một trong những thành viên chính của hệ vi khuẩn bình

thường ở đường ruột, nhưng cũng là căn nguyên của nhiều bệnh nhiễm trùng.

- E.Coli đã được sử dụng làm mô hình nghiên cứu về sinh học phân tử

trong lĩnh vực vi sinh học nói riêng và sinh học nói chung. Trong đó, chủng E.coli K12

là mô hình được nghiên cứu nhiều nhất. Nhiều thành tựu về di truyền học, hóa sinh

học đã thu được dựa trên cơ sở nghiên cứu vi khuẩn này.

2.1.1.2 Phân loại

- Về phân loại, Escherichia Coli được xếp vào:

Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gamma Proteobacteria

Bộ: Enterobacteriales

Họ: Enterobacteriaceae

Chi: Escherichia

Loài: Escherichia Coli

2.1.1.3 Đặc điểm

- E.Coli là trực khuẩn, Gram âm, kích thước trung bình từ 2 – 3 µm × 0,5

µm. Một số ít chủng E.Coli có vỏ, nhưng hầu hết đều có lông và có khả năng di động.

- E.Coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có khả năng sinh hơi

E.Coli có khả năng sinh Indol, không sinh H2S, không sử dụng được nguồn carbon của

citrat trong môi trường Simmons, có deoxycarboxylase nên có khả năng phân giải

carborxyl của lysin, ornithin, arginin và acid glutamic. Thử nghiệm VP (Voges –

Proskauer) sau 24h âm tính, sau 48h có thể dương tính .



Hình 2.1 : Vi khuẩn Escherichia Coli

2.1.1.4 Yếu tố độc lực

- Người ta chia E.coli thành nhiều nhóm, mỗi nhóm sinh ra các loại độc

tố khác nhau, hiện có 5 nhóm chính : STEC (Shiga toxin-producing E.Coli) hoặc

VTEC (Verotoxigenic E.Coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E.Coli), EPEC

(Enteropathogenic E.Coli), ETEC (Enterotoxigenic E.Coli), EAEC (Enteroaggregative

E.Coli) và EIEC (Enteroinvasive E.Coli).

a) Nhóm STEC

- Hiện nay có khá nhiều thuật ngữ khác nhau để gọi tên cho nhóm E.Coli

này. Tên gọi Verotoxigenic E.Coli (VTEC) được Konowalchuk và cộng tác viên

(1977) đặt cho nhóm này khi phát hiện việc sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào

Vero. Tên gọi Enterohaemorrhagic E.Coli (EHEC) là do dòng này gây viêm kết tràng

xuất huyết và hội chứng huyết niệu (Nataro và Kaper, 1989). Và thuật ngữ Shiga

toxin-producing E.Coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga-like toxin producing E.Coli -

SLTEC) chỉ rõ khả năng sản sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố Shiga.

- STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt), còn gọi là Shiga toxin

(Stx) hay Verotoxin (VT). Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo

với nhau là Stx1 và Stx2. Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về

trình tự, tạo ra nhiều subtype như Stx2c, Stx2hb, Stx2e, Stx2g. Một dòng STEC có thể

sản sinh Stx1, Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, và thậm chí nhiều dạng của Stx2.



- Hai độc tố Stx1 và Stx2 đều được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B có khối

lượng phân tử 7,7 kDa và 1 tiểu đơn vị A có khối lượng phân tử 32 kDa. Tiểu đơn vị A

gồm peptide A1 28 kDa và peptide A2 4 kDa nối với nhau bằng cầu nối disulfur.

Peptide A1 có hoạt tính enzyme và peptide A2 có nhiệm vụ gắn kết tiểu đơn vị A vào

những tiểu đơn vị B. Những tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với receptor đặc hiệu

Gb3 (globotriaosylceramide) hiện diện trên bề mặt của những tế bào eukaryote (Stx2e

có receptor là Gb4). Sau khi được chuyển vào bên trong tế bào, tiểu đơn vị A đến tế

bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome. Peptide A1 có hoạt tính enzyme

hoạt động như một N-glycosidase cắt một gốc adenin khỏi rRNA 28S của ribosome,

do đó gây trở ngại cho sự tổng hợp protein. Do không tổng hợp được protein, những tế

bào bị Stx tác động (tế bào nội mô của thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào

Hela hay bất cứ tế bào nào có receptor là Gb3, receptor Gb4 đối với Stx2e) sẽ chết.

Hậu quả gây độc cho tế bào ruột do Stx và các yếu tố độc lực khác của STEC là gây sự

hư hại những tế bào nhung mao ruột, gây tiêu chảy và viêm kết tràng xuất huyết

(Haemorrhagic colitis – HC). Sự hư hại những tế bào thành mạch máu do Stx2e sẽ gây

nên hiện tượng phù thủng ở heo.

- Yếu tố bám dính của STEC/EHEC đã được chứng minh là đóng vai trò

quan trọng trong sự định vị vi khuẩn ở ruột. Đó chính là intimin, một protein màng

ngoài có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa. Intimin được mã hóa bởi gen eae (E.Coli

attaching and effacing). Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy (attaching-

and-effacing, A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và

ctv, 1993). Gen eae này cũng được tìm thấy ở nhóm EPEC. Gen eae gây tổn thương

kiểu A/E là một trong số các gen nằm trên vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư

hại tế bào ruột – locus of enterocyte effacement, LEE). Vùng LEE của STEC/EHEC

chứa những gen mã hóa cho intimin, mã hóa receptor của intimin Tir (translocated

intimin receptor) và một số gen khác. Vùng LEE không chỉ là điều kiện cần mà còn là

điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương A/E. Tuy nhiên không phải tất cả STEC

đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có gen eae.

- Yếu tố khác có liên quan đến độc lực của STEC là việc tạo ra

enterohaemolysin (EHEC-Hly) và có thể cả độc tố ruột chịu nhiệt EAST1

(enteroaggregative heat – stabe toxin – 1). EHEC-Hly được mã hóa bởi gen trên



plasmid 60 MDa (pO157) mà plasmid này được tìm thấy ở gần như tất cả các dòng

O157:H7 và cũng khá phổ biến cả những dòng STEC non-O157 nữa (Nataro và Kaper,

1998). Trên plasmid này có sự hiện diện của một operon gồm 4 khung đọc mở (open

reading frame ORF) là hlyCABD. Trong đó hlyA là gen cấu trúc khởi đầu cho

haemolysin. Độc tố ruột chịu nhiệt EAST1 (đầu tiên được mô tả ở nhóm EAEC là

EAEC heat-stable enterotoxin 1), cũng được tìm thấy ở nhiều dòng STEC. Tầm quan

trọng của EAST1 đối với khả năng gây bệnh của STEC vẫn chưa được biết, nhưng có

ở một vài trường hợp tiêu chảy không có máu mà thường thấy ở những người nhiễm

STEC.

b) Nhóm EPEC

- Các yếu tố độc lực chính bao gồm gen eae mã hóa protein itimin cần

thiết cho việc tạo ra tổn thương dạng A/E, plasmid 50 – 70 Mda ( EAF ) : mã hóa BFP

(bundle – forming pilus), PER (plasmid – encoded regulator) và Ler (LEE – encorded

regulator). Các protein tiết : Tir, EspA, EspB, EspD, EspF, EspG và MAP

( mitochondria – associated protein), EAST – 1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô và

CDT (Cytolethan distending toxin)

c) Nhóm ETEC

- Nhóm ETEC có hai nhóm quyết định độc lực chính là độc tố ruột

(enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF).

- Độc tố ruột enterotoxin

+ Nhóm ETEC gồm những E.Coli tạo ra ít nhất một trong hai loại

độc tố đường ruột là ST và LT. ETEC gây bệnh bằng cách vi khuẩn bám vào bề mặt

màng nhầy ruột non và tiết ra độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch. Nhóm

ETEC gây tiêu chảy thông qua sự tiết độc tố đường ruột LT và ST. E.Coli nhóm này

có thể chỉ tiết độc tố LT, hoặc chỉ tiết ST, hoặc có thể tiết cả LT và ST.

Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin - LT): Độc

tố LT của E.Coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với

độc tố tả (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra. LT và CT giống nhau nhiều

đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau khoảng 80%), tương đồng về

receptor, hoạt tính enzym, và tác động của nó trên thú hay nuôi cấy tế bào.



LT có 2 serogroup chính là LT-I và LT-II. LT-I và LT-

II không có phản ứng chéo về mặt miễn dịch. LT-I được tiết bởi những dòng E. coli

gây bệnh trên người và thú. Còn LTII được tìm thấy chủ yếu ở E. coli trên thú và hiếm

khi ở người. LT-I là một oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị

A 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5 kDa. Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm trong hoạt tính

enzyme của độc tố gồm peptide A1 và peptide A2 liên kết nhau bởi cầu nối disulfur.

Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành vòng, liên kết chắc chắn với ganglioside GM1 và

liên kết lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein ruột – chúng là các receptor của LT.

Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và có thể phản ứng chéo một phần với nhau là LTp

(LTp-I) đầu tiên được phân lập từ heo và LTh (LTh-I) được phân lập từ người. Gen

mã hóa cho LT là elt hay lt-I nằm trên plasmid mà plasmid này có thể chứa cả gen mã

hóa ST và/hoặc gen mã hóa những kháng nguyên của yếu tố định vị (colonization

factor antigen - CFA).

Sau khi độc tố đi vào nội bào, chúng di chuyển trong tế

bào nhờ hệ thống vận chuyển của Golgi. Đích đến của LT trong tế bào là enzym

adenylate cyclase nằm ở lớp màng ngoài của tế bào biểu mô ruột. Peptide A1 có hoạt

tính ADP-ribosyltransferase chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến của protein liên

kết GTP (GTP-binding protein) là GS, gây hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm gia

tăng AMP vòng (cAMP) trong tế bào. Vì vậy enzyme cAMP-dependent protein kinase

(A kinase) được họat hóa dẫn đến sự phosphoryl hóa kênh chloride (Cl-) ở màng tế bào

biểu mô vượt quá mức bình thường. Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào bên dưới

tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thụ NaCl bởi những tế bào có lông nhung. Hàm lượng ion

trong lòng ruột gia tăng kéo theo sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng

ruột, gây tiêu chảy (Nataro và Kaper, 1998). Mặc dù sự kích thích của Cl- do sự gia

tăng lượng cAMP trong tế bào là cách giải thích cổ điển về cơ chế gây tiêu chảy của

LT và CT, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy rằng đáp ứng tăng tiết đối với

những độc tố này có cơ chế phức tạp hơn. Một cơ chế tác động khác của độc tố có liên

quan đến những prostaglandin E (PGE1 và PGE2) và yếu tố hoạt hóa tiểu cầu. Sự tổng

hợp và phóng thích những chất chuyển hóa của acid arachidonic như prostaglandin và

leukotriene có thể kích thích sự vận chuyển các chất điện giải và kích thích nhu động

ruột. Cơ chế tác động khác thứ hai có liên quan đến hệ thần kinh ruột (enteric nervous



system – ENS) điều hòa nhu động và sự tiết ion ở ruột. Cơ chế thứ ba là CT và LT gây

đáp ứng viêm ruột dạng nhẹ.

Nhóm LT-II giống với LT-I và CT khoảng 55 - 57% ở

tiểu đơn vị A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B. LT-II làm gia tăng

cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II sử dụng GD1 làm

receptor thay vì GM1. Như đã nói ở trên, LT-II không có liên quan đến bệnh trên

người và thú.

Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin - ST): Ngược với

LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả

năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau

về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả 2 nhóm được tìm thấy chủ yếu

trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon. Sta (hay còn

gọi là ST-I) được tạo bởi ETEC và một vài vi khuẩn Gram âm khác như Yersinia

enterocolitica và V. cholerae non – O1. ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố

chịu nhiệt EAST1 của EAEC. Gần đây, còn có báo cáo cho rằng một vài dòng của

ETEC cũng có thể sản sinh độc tố EAST1 ngoài độc tố STa. Còn STb chỉ được tìm

thấy ở ETEC.

STa là một peptide gồm 18 -19 amino acid với trọng

lượng phân tử khoảng 2 kDa. STa được chia thành 2 loại là STp (ST porcine hay STIa)

phân lập được đầu tiên trên heo và STh (ST human hay STIb) phân lập trên người. Cả

2 loại độc tố có thể được tìm thấy ở dòng ETEC người. Receptor chính của STa là

enzyme xuyên màng GCC (guanylate cyclase C) thuộc họ những enzyme receptor

cyclase. Sự kết hợp của STa vào GC-C kích thích hoạt tính GC, dẫn đến việc gia tăng

lượng cGMP nội bào. Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự kích thích tiết Cl - hoặc

ngăn cản sự hấp thụ NaCl, gây ra sự tiết chất lỏng trong ruột. STb: STb chủ yếu có liên

quan đến dòng ETEC phân lập từ heo mặc dù cũng có báo cáo về vài chủng ETEC

người cũng sản sinh STb. Không như STa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô

học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của biểu mô ruột và teo nhung

mao một phần. Receptor của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng

độc tố có thể kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào trong tế bào.

Không tạo ra sự tiết Cl- như STa, STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3-)



STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tăng lượng calci

nội bào từ ngoại bào. STb cũng kích thích phóng thích PGE2 và serotonin, từ đó người

ta cho rằng ENS có thể cũng có liên quan đến đáp ứng tiết gây ra bởi độc tố này

(Hitotsubashi, 1992).

- Yếu tố định vị (CF): Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng

nhầy ruột đã được nghiên cứu kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào

tế bào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF). CFA

có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái. Có 3 loại chính gồm loại lông hình

que cứng, lông hình que mềm có dạng bó, lông có cấu trúc mảnh mềm. Gen của CFA

thường được mã hóa trên plasmid, cũng là nơi mã hóa cho độc tố ST và/hoặc LT.

d) Nhóm EAEC

- Những yếu tố độc lực chính của EAEC bao gồm các diềm bám dính kết

tập AAF (aggregative adhesion fimbriae), yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggR,

protein Pet và độc tố EAST – 1. AFF được xem là yếu tố quyết định độc lực. Ba loại

AAF đã được biết đến gồm AAF/I, AAF/II và AAF/III, trong đó loại I và loại II có cấu

trúc bó, loại III có cấu trúc dạng sợi riêng biệt. Các AAF tạo nên kiểu bám dính hình

chồng gạch lên tế bào Hep – 2. Yếu tố aggR có vai trò điều hòa sự biểu hiện của các

AAF. Protein Pet được tiết ra màng ngoài vi khuẩn gây ra sự tụ dịch và gây độc cho

biểu mô tiêu hóa. EAST – 1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô. Ngoài các yếu tố độc

lực nêu trên, EAEC còn tiết ra một protein làm tan máu và làm mất thăng bằng vận

chuyển protein qua màng. Các yếu tố độc lực nêu trên của EAEC chủ yếu được mã

hóa bởi các gen nằm trên plasmid có phân tử lượng 60 MDa. Một số yếu tố độc lực

được mã hóa trên các gen trên nhiễm sắc thể đang được nghiên cứu.

e) Nhóm EIEC

- EIEC gây bệnh chủ yếu do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng.

Khả năng xâm nhập được mã hóa bởi gen trên plasmid 140 MDa. Các gen trên

plasmid này mã hóa cho các kháng nguyên xâm nhập (IpaA đến IpaD, Ipa: Invasion

plasmid antigen). EIEC còn có khả năng sản xuất độc ruột giống một số Shigella. Gen

mã hóa cho độc tố này có tên là sen (Shigella enterotoxin), cơ chế gây bệnh giống vi

khuẩn lỵ. EIEC xâm nhập vào trong tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu các túi thực bào

và nhân lên trong bào tương, phá hủy tế bào và xâm lấn sang các tế bào khác.



2.1.1.5 Khả năng gây bệnh

- E.Coli là nguyên nhân gây ra các bệnh như tiêu chảy, viêm đường tiết

niệu, viêm đường mật. Là một trong những nguyên nhân chính gây ra bệnh nhiễm

khuẩn huyết, là căn nguyên thường gặp trong bệnh viêm màng não, viêm phổi ở trẻ

mới sinh. E.Coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng.

- Trong các loại độc tố của E.Coli, độc tố Shiga là nguy hiểm nhất được

biết đến trên người, làm hủy hoại các vi nhung mao hấp thu của tế bào biểu mô ruột.

Nó xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá trình tổng hợp protein làm chết

tế bào. Hậu quả là gây viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân như máu. Những

trường hợp họai tử nặng có thể gây thủng ruột.

2.1.1.6 Các thực phẩm liên quan

- Các trung tâm kiểm soát dịch bệnh (CDC) tính rằng có 85% nguồn gốc

E.Coli có nguồn gốc là thực phẩm. Trên thực tế, bất kỳ sự tiêu thụ thực phẩm nhiễm

phân (đặc biệt là phân gia súc) đều có thể dẫn đến việc nhiễm bệnh. Các thực phẩm

được xác định là nguồn gây bệnh bao gồm thịt bò xay, thịt nai, xúc xích sấy khô

(không nấu chín), sữa chưa tiệt trùng, phô mai, nước trái cây chưa tiệt trùng, cỏ linh

lăng, mầm củ cải, rau và nước.

2.1.1.7 Biện pháp phòng ngừa và kiểm soát

- Hiện nay chưa có biện pháp phòng ngừa đặc hiệu. Để đề phòng nhiễm

khẩn đường tiêu hóa do E.Coli, thực hiện các biện pháp phòng ngừa không đặc hiệu

giống các loại vi khuẩn đường ruột khác.

- Đề phòng nhiễm khuẩn đường tiết niệu do E.Coli : thực hiện về sinh

cùng hậu môn và bộ phận sinh dục ngoài. Điều trị loại trừ các yếu tố nguy cơ khác vì

E.Coli là vi khuẩn gây bệnh cơ hội quan trọng.

2.1.2 Listeria monocytogenes

2.1.2.1 Giới thiệu

- Năm 1924, Muray và cộng sự trong quá trình nghiên cứu một dịch

bệnh trên các động vật được thí nghiệm, đã phân lập được một chủng vi sinh vật từ các

hạch lympho của các động vật bị bệnh. Sau đó ông lấy chủng vi khuẩn này tiêm cho

các con vật khỏe mạnh thì thấy có hiện tượng tăng bạch cầu đơn nhân (monocytosis),

vì vậy ông đặ tên cho nó là Bacillus monocytogenes. Ba năm sau, tại Nam Phi, Pirie,



khi đó đang nghiên cứu sự mang Yersinina pestis trên chuột, đã phân lập được từ gan

chuột một chủng vi khuẩn và đặt tên cho nó là Listeria hepatolitica. Loại vi khuẩn này

hoàn toàn không thể phân biệt được với chủng vi khuẩn của Muray. Chính vì vậy,

Pirie đã đề xuất một tên mới cho các chủng vi khuẩn này, đó là Listeria

monocytogenes.

2.1.2.2 Phân loại

Giới: Bacteria

Ngành : Firmicutes

Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillales

Họ: Listeriaceae

Chi: Listeria

Loài : Listeria monocytogenes

2.1.2.3 Đặc điểm

- Các loài Listeria là trực khuẩn Gram dương, có kích thước ngắn (0,4 –

0,5 × 0,5 – 2,0 µm), chúng mọc trên các môi trường nuôi cấy không acid, không sinh

nha bào. Ở 20oC chúng di chuyển bằng lông mọc xung quanh thân (peritrichous

flagella), nhưng sự di động không quan sát được ở 37oC. Chúng là vi khuẩn kị khí

không bắt buộc và có thể sinh trưởng trong một khoảng nhiệt độ dao động rộng từ 3 –

45oC (tối ưu là 30 – 36oC), mặc dù tốc độ mọc ở nhiệt độ thấp là rất chậm. Chúng cũng

mọc trên một khoảng pH dao động rất rộng, một số chủng có thể mọc ở pH 9,6, nhưng

đạt điều kiện tối ưu ở pH hơi kiềm hoặc môi trường trung tính.

Hình 2.2: Vi khuẩn Listeria monocytomonogenes


http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=vi&sl=en&tl=vi&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Firmicutes&rurl=translate.google.com.vn&twu=1&anno=2&usg=ALkJrhgy6moCwHJ08igKDGWKpBLRG-6ZLg

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=vi&sl=en&tl=vi&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Listeriaceae&rurl=translate.google.com.vn&twu=1&anno=2&usg=ALkJrhgJ2IqFVueECaRW-8wVlk3QYpPJeA

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=vi&sl=en&tl=vi&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillales&rurl=translate.google.com.vn&twu=1&anno=2&usg=ALkJrhh0kww84Fk11FB9SVswy6GNan75Ng

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=vi&sl=en&tl=vi&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Bacilli&rurl=translate.google.com.vn&twu=1&anno=2&usg=ALkJrhhsXiKObn90uhiiO6f8fXaj6dcukA


2.1.2.4 Yếu tố độc lực

- Listeriolysin O (LLO) là yếu tố độc lực chính của Listeria

monocytigenes cho phép nó thoát khỏi sự thực bào. LLO có khối lượng phân tử 58,6

kDa, hình thành bởi một chuỗi polypeptide đơn gồm 529 amino acids. Trình tự đầu N

đại diện cho đặc điểm của trình tự dấu hiệu của vi khuẩn Gram dương điển hình: phần

đầu tiên có tính ái nước và mang điện tích dương được theo sau bởi 20 đầu kỵ nước.

Trình tự này mã hóa trực tiếp cho protein và được phân cắt sau vị trí lysine 25. Kết quả

là LLO được bắt đầu từ amino acid 26, là một phân tử protein dài 504 aa và có trọng

lượng phân tử 55,8 kDa.

- LLO thuộc về họ độc tố gắn cholesterol được hoạt bởi nhóm thiol được

tạo bởi hầu hết các vi khuẩn Gram dương. Hoạt tính ly giải của các độc tố này bởi

giảm bớt một số tác nhân và bị kìm hãm bởi sự oxy hóa và biểu hiện khi có cholesterol

hoặc kháng thể kháng streptolysin O. Cytolysin được hoạt hóa bởi thiol có một cystein

đơn ở vùng đầu C làm cho chúng dễ bị bất hoạt bởi sự oxy hóa mặc dù cystein này có

thể được thay thế bằng alanine mà không làm mất chức năng ly giải. Chúng tạo nên

những lỗ không liên tục với đường kính bên trong lên đến 30 nm trong những màng

chứa cholesterol. Cơ chế hoạt động của chúng dựa vào sự tương tác với cholesterol có

chức năng không chỉ là vị trí gắn kết mà còn như một tác nhân làm thay đổi hoạt động

của enzyme dẫn đến quá trình oligomer hóa của khoảng 20 – 80 toxin monomer thành

cấu trúc vòng hoặc giống vòng cung.

- Hoạt tính dung huyết của LLO có liên quan đến pH của môi trường: nó

hoạt động cao nhất ở pH 5,5 và gần như bị bất hoạt ở pH 7,0. Trái lại, các độc tố được

hoạt hóa ở gốc thiol có phổ pH hoạt động rộng hơn như pH 6.0 đối với pneumolysin,

pH 6.5 đối với perfringolysin O và alveolysin, pH 7.0 đối với streptolysin O. Sự phát

hiện này có thể giải thích vai trò của LLO trong quá trình xâm nhiễm của LM. Sau quá

trình thực bào, môi trường acid của không bào chứa tế bào vi khuẩn sẽ hoạt hóa LLO.

Chính độc tố này sẽ xúc tiến quá trình ly giải không bào và tế bào vi khuẩn xâm nhập

vào tế bào chất trong khi đó môi trương pH cao hơn sẽ làm giảm hoạt tính của LLO.

Sự hư hại của màng tế bào chủ cũng bị ngăn cản bởi sự phân hủy nhanh của LLO

trong tế bào chất do sự nhận biết của một trình tự giống PEST. Một trình tự amino acid

giàu Proline (P), glutamic acid (E), serine (S) và threonine (T) được gọi là PEST và



protein đích để phân hủy. Trong đầu N của LLO nằm ở vùng 19 aa (từ 32 – 50) chứng

minh đặc điểm này. Một điều thú vị khi loại bỏ motif giống PEST này không chỉ nâng

cao độc lực của LLO mà còn sửa đổi các yếu tố độc lực của vi khuẩn. LM bị đột biến,

thiếu trình tự PEST LLO, được chứng minh là việc thoát ra khỏi không bào thực bào

theo một con đường rất khó khăn. Điều này chứng tỏ rằng vùng này cũng rất quan

trọng cho quá trình phá hủy màng.

2.1.2.5 Khả năng gây bệnh

- Ngoài những trường hợp rất hiếm gặp nhiễm trực tiếp qua đường da

hoặc đường kết mạc, hầu hết ở người trưởng thành vi khuẩn xâm nhạp qua đường tiêu

hóa. Với thai nhi, nhiễm Listeria hầu hết xảy ra qua đường máu và một số ít trường

hợp xảy ra qua đường sinh đẻ. Các trường hợp khởi nhiễm Listeria muộn ở trẻ mới

sinh là do quá trình lây nhiễm trực tiếp hoặc gián tiếp từ người sang người.

2.1.2.6 Các thực phẩm liên quan

- Nguồn lây nhiễm Listeria chủ yếu là từ gia cầm, những kết quả theo

dõi gần đây cho thấy, hơn 62% mẫu thịt gà sống có khả năng bị nhiễm khuẩn. Tỷ lệ

nhiễm L.monocytogenes ở thịt chín ít hơn thịt sống nhưng cũng có khả năng gây ra

bệnh Listeriosis trên người.

- Listeria monocytogenes cũng đến từ các nguồn khác như patê, rau (kể

cả loại salad đóng sẵn), hải sản đặc biệt là thịt cua và cá hun khói, trong các sản phẩm

đông lạnh.

2.1.2.7 Biện pháp ngăn ngừa và kiểm soát

- Làm sạch bề mặt tiếp xúc với thực phẩm, có thể dùng cồn hoặc kết hợp

với amoni 4 để tăng hiệu suất khử trùng. Thực phẩm lưu trữ cần được giữ lạnh dưới

4oC để đảm bảo an toàn.

- Thực hiện các biện pháp vệ sinh an toàn vệ sinh thực phẩm cho cộng

đồng. Kiểm tra các cơ sở giết mổ cung cấp thịt cho thị trường. Đối với cá nhân, thực

hiên vệ sinh ăn uống, ăn chín, uống sôi, rửa tay trước khi ăn, diệt khuẩn, diệt ruồi

- Phát hiện người mang vi khuẩn, đặc biệt là những người có liên quan

trực tiếp đến ăn uống của tập thể như cấp dưỡng của các cơ quan, người chế biến thức

ăn, người phục vụ ở các nhà hàng ăn uống.



- Chuẩn đoán sớm và cách ly bệnh nhân kịp thời, xử lý chất thải của

bệnh nhân. Đối với súc vật bị bệnh cần chữa triệt để hoặc tiêu hủy.

2.2 Tổng quan về Salmonella sp.

2.2.1 Lịch sử phát hiện

- Năm 1885 Slamon và Smith (Mỹ) tìm được Salmonella từ lợn mắc

bệnh dịch tả và gọi tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella. Nhưng sau

đó Schweinittz và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do một loại vi rút gây

nên và đã xác định S.choleraesuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn.

- Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người

bệnh, ông gọi vi khuẩn này là Bacillus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi

là S.enteritidis. Vi khuẩn này cũng được gọi bằng nhiều tên khác như: Bacterium

enteritidis, Bacillus gartner…

- Năm 1889 Klein phân lập được S.gallinarum và Rettger cũng đã phân lập

được S.pullorum năm 1909. Trước đây người ta cho rằng đây là hai loại vi khuẩn gây ra

hai bệnh khác nhau lên đã gọi chung là bệnh phó thương hàn gà (Typhus avium) và căn

bệnh có tên chung là S.gallinarum –pullorum.

- Năm1896 C.Archard và Rbensauded đã phân lập được vi khuẩn

S.paratyphi equi và S.paratyphi bacilus. Ngày nay vi khuẩn này được gọi tên là

S.paratyphi B và đến năm 1898, S.paratyphi A đã tìm được do N.Guyn và H Keyser.

2.2.2 Phân loại

- Về phân loại khoa học Salmonella được xếp vào:

Giới : Bacteria

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gramma Proteobacteria

Bộ: Enterobacteriales

Họ: Enterobacteriaceae

Giống: Salmonella lignieres 1900

- Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng của

chúng như S.typhi hay S.paratyphi A, B, C (typhoid = bệnh thương hàn, para = phó),

hoặc theo vật chủ như S.typhimurium gây bệnh ở chuột (murine = chuột), về sau người

ta thấy rằng 1 loài Salmonella có thể gây ra nhiều hội chứng và có thể phân lập được ở



nhiều loài khác nhau. Vì những lý do đó mà các chủng Salmonella mới phát hiện

được đặt tên theo nơi mà nó được phân lập như S.teheran, S.congo, S.london.

- Salmonella đã từng được chia thành các chi phụ và nhiều loài, mỗi loài

lại có khả năng có chi phụ. Ví dụ như loài Salmonella enterica được chia thành 6 loài

phụ gồm S.enterica, S.salamae, S.arizonae, S.diarizonae, S.houtenae và S.indica.

- Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, những nghiên cứu sau này

cho phép xếp tất cả các loại Salmonella vào 1 loài duy nhất. Mặc dù ý kiến này đã

được nêu ra nhưng cách truyền thống đã được sử dụng quá quen và có ý nghĩa riêng

nên nó không được chấp nhận.

- Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, chủ yếu là kháng nguyên thân O và

kháng nguyên lông H, Salmonella được chia thành các nhóm và các type huyết thanh.

Hiện nay được xác định gồm trên 2500 type huyết thanh Salmonella.

2.2.3 Đặc điểm

2.2.3.1 Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy

- Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình từ 2 – 3 x 0,5

– 1 µm, di chuyển bằng tiên mao trừ S. gallimarum và S. pullorum, không tạo bào tử,

chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 60C – 420C, thích hợp nhất ở 350C – 370C, pH từ 6 – 9

và thích hợp nhất ở pH = 7,2. Ở nhiệt độ từ 180C – 400C vi khuẩn có thể sống đến 15

ngày.

- Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi. phát triển được trên các môi

trường nuôi cấy thông thường. Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau

24 giờ. Có thể mọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA

(deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate), trong đó môi trường

XLD ít chất ức chế hơn nên thường được dùng để phân lập Salmonella. Khẩn lạc đặc

trưng của Salmonella trên môi trường này là tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, đôi khi

tâm đen lớn bao trùm khẩn lạc,môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ.



Hình 2.3 : Vi

khẩn Salmonella

2.2.3.2 Tính chất hóa sinh

- Salmonella không lên men lactose, lên men đường glucose và sinh hơi.

Thường không lên men sucrose, salicin và inositol, sử dụng được citrate ở môn trường

Simmons.

- Tuy nhiên không phải loài Salmonella nào cũng có những tính chất

trên, các ngoại lệ được xác định là S.typhi lên men đường glucose không sinh hơi,

không sử dụng citrate trong môi trường Simmon, hầu hết các chủng S.paratyphi và

S.Cholerasuis không sinh H2S, khoảng 5% các chủng Salmonella sinh độc tố sinh

bacteriocin chống lại E.Coli, Shigella và ngay cả 1 số chủng Salmonella khác.

2.2.4 Cấu trúc của Salmonella

- Salmonella có ba loại kháng nguyên, đó là những chất khi xuất hiện

trong cơ thể thì tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với những sản

phẩm của sự kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và

kháng nguyên vỏ K. Vi khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên V (Virulence) là

yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch

cầu.

- Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O)

+ Thành phân cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạ p gồm 2

lớp. Trong cùng là một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và



tới lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein

và lipopolysaccharide.

+ Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B

(quyết định độc tố của Nội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide không mang tính

đặc hiệu. Kháng nguyên của nội độc tố có bản chất hóa học là lypopolysaccharide

(LPS). Tính đặc hiệu của kháng nguyên O và LPS là một, nhưng tính miễn dịch thì

khác nhau : kháng nguyên O ngoài LPS còn bao gồm cả lớp peptidoglycan nên tính

sinh miễn dịch của nó mạnh hơn LPS. Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất

nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là

lipopolysaccharide dày khoảng 8- 10 nm gồm 3 thành phần : Lipid A, polysaccharide

lõi, kháng nguyên O. Màng ngoài còn có thêm các protein: Protein cơ chất: porin ở vi

khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi

qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ. Protein màng ngoài: chức năng

vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng ngoài. Lipoprotein: đóng vai

trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài

- Kháng nguyên lông (kháng nguyên H)

+Kháng nguyên H: Chỉ có ở các Salmonella có lông. Hầu hết

Salmonella đều có lông chỉ trừ S.galilarum, S.pulorum gây bệnh cho gia cầm. Kháng

nguyên H là một loại kháng nguyên có bản chất là protit, kém bền hơn kháng nguyên

O. Kháng nguyên H rất dễ bị phá huỷ ở nhiệt độ cao hoặc xử lý bằng cồn, axit yếu.

+ Kháng nguyên H chia làm 2 phase :

Phase 1: Có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại kháng

nguyên lông được biểu thị bằng chữa số La tinh thường: a, b, c…

Phase 2: Không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể

ngưng kết với các loại khác đôi khi thành phần này có thể gặp ở E.coli. Pha 2 gồm có

6 loại được biểu thị bằng chữa số Ả Rập 1-6 hay chữa số La Tinh e, n, x…

- Kháng nguyên vỏ K

+ Kháng nguyên K: Không phức tạp, có một kháng nguyên vỏ là

kháng nguyên Vi và cũng có ở 2 type huyết thanh S.typhi và S.paratyphi. Kháng

nguyên Vi – angtigen được Felix và các cộng sự phát hiện năm 1935. Kháng nguyên

Vi gây hiện tượng ngưng kết chậm và xuất hiện các hạt vỏ, kháng nguyên Vi là kháng



nguyên vỏ bao bọc bên ngoài kháng nguyên O, khánh nguyên Vi không tham gia vào

quá trình gây bệnh.

2.2.5 Yếu tố độc lực

- Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội

độc tố.

+ Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung

huyết và mụn loét, độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật.

+ Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho

vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lại cấy

truyền như vậy từ 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng gây bệnh cho

động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ

khí. Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột.

2.2.5.1 Nội độc tố - Endotoxin

- Màng ngoài tế bào vi khuẩn gram âm nói chung và vi khuẩn

Salmonella nói riêng, được cấu tạo bởi thành phần cơ bản là lipopolysaccharide (LPS).

LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt với đặc tính và chức năng riêng

biệt: Vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipit A.

- Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi polysaccharide chứa các đơn vị cấu

trúc kháng nguyên O. Vùng lõi có bản chất là acid heterooligosaccharide, ở trung tâm

nối kháng nguyên O với vùng lipit A. Vùng lipit A đảm nhận chức năng nội độc tố của

vi khuẩn. Cấu trúc nội độc tố gần giống cấu trúc của kháng nguyên O. Cấu trúc nội

độc tố biến đổi sẽ dẫn đến sự thay đổi độc lực của Salmonella.

- Nội độc tố thường là lipopolysaccharide (LPS) được phóng ra từ vách

tế bào vi khuẩn khi bị dung giải. Trước khi thể hiện độc tính của mình, LPS cần phải

liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: Tế bào

lâm ba cầu B, lâm ba cầu T, tế bào đại thực bào, tiểu thực bào, tế bào gan, lách.Rất

nhiều các cơ quan trong cơ thể chịu sự tác động của nội độc tố LPS: Gan, thận, cơ, hệ

tim mạch, hệ tiêu hoá, hệ thống miễn dịch; với các biểu hiện bệnh lý: Tắc mạch máu,

giảm trương lực cơ thiếu oxy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hoá, mất tính thèm ăn…

- Nội độc tố tác động trực tiếp lên hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ,

kích thích hình thành kháng thể.



- LPS tác động lên các tế bào tiểu cầu, gây sốt nội độc tố, theo cơ chế :

+ Giải phóng các chất hoạt động mạnh như: Histamin.

+ Ngưng kết các tiểu cầu động mạch.

+ Đông vón, tắc mạch quản.

- LPS tác động lên quá trình trao đổi gluxit: LPS làm tăng cường hoạt

lực của các men phân giải glucoz, các men phân giải glycogen, làm giảm hoạt lực các

men tham gia quá trình tổng hợp glycogen…

2.2.5.2 Độc tố đường ruột

- Về cơ chế miễn dịch và di truyền các Enterotoxin của Salmonella có

quan hệ gần gũi với Choleratoxin, nên được gọi là Choleratoxin like enterotoxin (CT).

Còn về đặc tính sinh học Enterotoxin của Salmonella không chỉ với giống CT mà còn

giống với Enterotoxin của E.Coli.

- Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính:

Độc tố thẩm xuất nhanh Rapid permeability facto (RPF) và độc tố thẩm xuất chậm

Delayed permeability facto (DPF).

- RPF giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột, nó thực

hiện khả năng thẩm xuất sau 1-2 giờ và kéo dài 48 giờ và làm trương các tế bào CHO

(Chinese Hamster Ovary cell). Độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc, thành phần giống

với độc tố chịu nhiệt của E.Coli, được gọi là độc tố chịu nhiệt của Salmonella. ST có

khả năng chịu được nhiệt độ 1000C trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, có thể bảo

quản ở nhiệt độ -20oC. Cấu trúc phân tử gồm một chuỗi polysaccharide và một chuỗi

polypeptide.

- RPF kích thích co bóp nhu động ruột, làm tăng sự thẩm thấu thành

mạch, phá huỷ tổ chức tế bào biểu mô ruột, giúp vi khuẩn Salmonella xâm nhập vào tế

bào và phát triển tăng nhanh về số lượng. Vi khuẩn tích cực tăng cường sản sinh độc tố

làm rối loạn cân bằng trao đổi muối, nước và chất điện giải. Quá trình bệnh lý đường

ruột và hội chứng tiêu chảy càng thêm phức tạp và nghiêm trọng.

- DPF của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống độc tố không chịu

nhiệt của vi khuẩn E.Coli, nên được gọi là độc tố không chịu nhiệt của Salmonella. Nó

thực hiện chức năng phản ứng chậm từ 18-24 giờ. LT bị phá huỷ ở 700C trong vòng 30

phút và ở 560C trong vòng 4 giờ. LT có cấu trúc gồm 3 chuỗi polypeptid.



- DPF làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải, dẫn đến

tăng cường bài xuất nước và chất điện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu,

gây thoái hoá lớp tế bào villi của thành ruột, gây tiêu chảy.

2.2.5.3 Độc tố tế bào

- Khi cơ thể người và động vật bị tiêu chảy thì kèm theo hiện tượng mất

nước và mất chất điện giải là hiện tượng hàng loạt các tế bào biểu mô ruột bị phá huỷ

hoặc bị tổn thương ở các mức độ khác nhau. Sự phá huỷ hay tổn thương đó là do độc tố

tế bào của Salmonella gây nên, theo cơ chế chung là: Ức chế tổng hợp protein của tế

bào Eukaryotic và làm trương tế bào CHO.

- Ít nhất 3 dạng độc tố của tế bào:

+ Dạng thứ nhất: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với

trypsin. Dạng này được phát hiện ở rất nhiều serovar Salmonella; có trọng lượng phân

tử trong khoảng từ 56 đến 78 kDa; không bị trung hoà bởi kháng thể kháng độc tố

Shigella toxin hoặc Shigella - like. Độc tố dạng này tác động theo cơ chế là ức chế

tổng hợp protein của tế bào Hela và làm teo tế bào.

+ Dạng thứ hai: Có nguồn gốc từ protein màng ngoài tế bào vi

khuẩn có cấu trúc và chức năng gần giống các dạng độc tố tế bào do Shigella và các

chủng (ETEC) sản sinh ra. Dạng độc tố này cũng phổ biến ở hầu hết các serovar

Salmonella gây bệnh.

+ Dạng thứ ba: Có trọng lượng phân tử khoảng 62 kDa; có liên hệ

với độc tố Hemolysin. Hemolysin liên hệ với các độc tố tế bào có sự khác biệt với các

Hemolysin khác về trọng lượng phân tử và phương thức tác động lên tế bào theo cơ

chế dung giải các không bào nội bào.

2.2.6 Cơ chế gây bệnh

- Tất cả các kiểu huyết thanh Salmonella đều mang cụm gen inv

(invasion) giúp cho quá trình xâm nhiễm vào trong thành ruột của người và động vật,

mở đầu của tiến trình gây bệnh. Cụm gen này nằm trong hệ thống gen SPI - 1

(Salmonella pathogenicity island) có mặt trong tất cả các Salmonella, từ nhóm tiến hoá

thấp nhất là S.bongori đến nhóm tiến hoá cao nhất là S.enterica.

2.2.6.1 Cơ chế gây bệnh thương hàn



- Bệnh thương hàn do S.typhi và S.paratyphi A, B, C gây ra. Các yếu tố

độc lực chính của vi khuẩn thương hàn là khả năng bám và xâm nhập vào tế bào chủ,

khả năng nhân lên trong đại thực bào và nội độc tố. Kháng nguyên Vi có mặt ở S.typhi

và S.pararatyphi C là yếu tố độc lực quan trọng, những chủng vi khuẩn gây bệnh

thương hàn không có kháng nguyên Vi thì số lượng cần thiết để gây bệnh cao hơn rất

nhiều so với những chũng có kháng nguyên này.

- Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa do thức ăn hay nước

uống bị nhiễm bẩn, số lượng cần thiết để gây bệnh vào khoảng 105 đến 107

- Đầu tiên, vi khuẩn thương hàn phải vượt qua môi trường axit của dạ

dày, mặc dù chúng có khả năng đề kháng với axit nhờ có gen art (acid response

tolerance), nhưng ở người bình thường, vi khuẩn thương hàn không thể tồn tại lâu,

nuôi cấy dịch dạ dày âm tính sau 30 phút. Sau khi vượt qua được rào cản ở dạ dày, vi

khuẩn di chuyển xuống ruột non rồi nhân lên ở đó, nhưng trong tuần đầu sẽ có 1 ít vi

khuẩn đào thải theo phân, cấy phân dương tính trong 5 ngày không có nghĩa là bệnh

thương hàn sẽ xảy ra. Từ ruột non, vi khuẩn thương hàn đi vào hạch mạc treo ruột nhờ

tế bào M, một đại thực bào của mảng Peyer. Sau đó theo đường bạch huyết và máu

gây nhiễm trùng toàn thân. Sau khoảng một tuần, nhiễm khuẩn huyết thứ phát xuất

hiện. Vi khuẩn theo gan qua đường mật lại tiếp tục xâm nhập vào ruột non, tiếp tục

nhân lên ở các mảng Peyer. Từ máu, vi khuẩn tới lách và các cơ quan khác. Trong ruột

non, vi khuẩn chết và giải phóng ra nội độc tố. Nội độc tố kích thích dây thần knh giao

cảm ở ruột gây ra hoại tử chảy máu và có thể gây thủng ruột, vị trí gây tổn thương

thường nằm ở các mảng Peyer. Đây là biến chứng hay gặp ở cá bệnh nhân ăn sớm khi

chưa bình phục, nhất là ăn các thức ăn cứng. Nội độc tố theo máu lên hệ thần kinh và

kích thích trung tâm thần kinh thực vật ở não thất ba. Giai đoạn toàn phát bệnh, bệnh

nhân sốt cao, biểu đồ thân nhiệt tăng lên theo thởi gian. Thân nhiệt tăng những nhiệt

độ không tăng gây ra hiện tượng mạch và nhiệt độ phân ly.

- Thời kì chưa có điều trị bằng kháng sinh, khoản một tuần ủ bệnh, diễn

biến điển hình của bệnh thương hàn trải qua 4 giai đoạn, mỗi giai đoạn khoảng một

tuần, Tuần thứ nhất thân nhiệt tăng cao, tuần thứ hai thì đau bụng, gan và lách to dồng

thời có sự xuất hiện của các đốm hồng trên da, tuần thứ 3 có thể xuất hiện thêm các



biến chứng như xuất huyết, thủng ruột, tuần thứ 4 sẽ xuất hiện thêm các biến chứng

nguy hiểm dẫn đến tử vong, nếu không bệnh nhân sẽ bình phục.

- Bệnh nhân thường đau đầu, buồn nôn hoặc nôn, chướng bụng, tiêu

chảy, khoản 50% bệnh nhân sờ thấy gan và lá lách dưới sườn. Những trường hợp nặng

thường có dấu hiệu ly bì, hôn mê, trụy tim mạch, không chữa trị kịp thời có thể dẫn

đến tử vong. Những biến chứng khác như viêm phổi cấp,, viêm màng não, viêm gan,

viêm tủy xương cũng có thể gặp.

- Những bệnh nhân qua khỏi có khoảng 5 – 10% vẫn tiếp tục thải vi

khuẩn qua phân trong quá trình hồi phục và 1- 4% trở thành người mang vi khuẩn lâu

dài do vi khuẩn vẫn tồn tại trong túi mật. Tình trạng này có thể kéo dài đến nhiều năm

và họ trở thành nguồn mang bệnh rất nguy hiểm.

2.2.6.2 Cơ chế gây nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn

- Bênh thường xảy ra do ăn phải thức ăn bị nhiễm Salmonella, nhưng

cũng có thể lây truyền trực tiếp. Căn nguyên thường do vi khuẩn S.enteritidis và

S.typhimurium.

- Vi khuẩn xâm nhập qua ruột non nhờ các tế bào M của mảng Peyer.

Trên bộ gen của Salmonella có các tác nhân gây ức chế các chất kháng khuẩn có trong

lysosome, biến đổi tế bào chủ đảm bảo cho sự tồn tại của vi khuẩn, làm cản trở hoạt

động nội bào như giảm lượng NADH oxidase rất cần thiết cho việc sản xuất các hợp

chất kháng khuẩn.

- Sự hủy hoại của đại thực bào và các tế bào biểu mô lân cận, sự chết của

vi khuẩn giải phóng nội độc tố đã gây nên tổn thương cho cơ thể vật chủ và gây ra các

triệu chứng.

- Thời gian ủ bệnh trung bình từ 10 – 48 giờ. Sau thời gian ủ bệnh, người

nhiễm thường có biểu hiện như sốt, nôn, đau bụng và tiêu chảy. Mức độ sốt khác nhau

tùy vào thể trạng từng người, tiêu chảy phân thường không có máu. Ở người lớn

thường chỉ dẫn đến tình trạng rối loạn đường tiêu hóa, nhưng ở trẻ sơ sinh thường gây

ra nhiễm trùng rất nặng, có thể dẫn đến tình trạng nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não

và viêm xương. Ở những người khỏe mạnh, nhiễm trùng do nhiễm độc thức ăn thường

tự khỏi sau 2- 5 ngày rồi tự khỏi.

2.2.7 Nguồn gốc lây nhiễm



- Các sản phẩm thịt nói chung, nhất là thịt gia cầm và thịt lợn. Tất cả các

thức ăn tươi sống có nguồn gốc động vật đều có thể là nguồn vi khuẩn Salmonella. Vi

khuẩn này sống tự do trong ruột động vật và có trên lông. Gia cầm có nhiều

Salmonella nhất, tiếp theo là các động vật nuôi trong nhà và động vật hoang (vẹt, rùa,

chó, ếch, chim mông biển, loài gặm nhấm, rắn). Vi khuẩn này có thể có trong thành

phần dẫn xuất các chất từ động vật như gelatin hoặc nước bọt động vật, bởi côn trùng,

loài gặm nhấm, chim hoặc các sản phẩm thịt nhiễm khuẩn gây nhiễm vào thực phẩm.

Ngoài ra có thể bị nhiễm từ người khỏe mạnh có mang vi khuẩn này. Thực phẩm có

nguồn gốc thực vật ít có nguy cơ nhiễm khuẩn. Vì lí do bị ức chế bởi pH < 4 và có mặt

vi khuẩn lactic nên các sản phẩm lên men ít bị nhiễm. Trứng và các sản phẩm trứng ví

dụ như bột nhào, nước sốt mayonnaise, protit đông tụ tách từ sữa, gia cầm là nguồn

mang nhiều Salmonella, nên trứng của nó cũng bị nhiễm vì vi khuẩn này có thể xuyên

qua vỏ trứng và sinh sản trong lòng đỏ trứng.

- Các sản phẩm sữa như sữa không thanh trùng, phomát từ sữa tươi, kem

chất béo sữa, và các sản phẩm từ sữa nói chung được chế biến từ các nông trại, các

thiết bị đều có thể gây nhiễm vào nguyên liệu, tạo môi trường thuận lợi

choSalmonella, và từ đó gây nhiễm độc cho sản phẩm sữa. Nếu tiến hành axit hóa

chậm thì vi khuẩn dễ dàng sinh sản trong phomát nhưng nó bị phá hủy với pH < 4,5.

Những sản phẩm có sữa phải được giám sát chặt chẽ bởi chúng không được thanh

trùng nữa, vì vậy nếu cóSalmonella trong sữa bột thì chúng vẫn có thể sinh sản được

bởi chúng có khả năng tồn tại ở điều kiện khô hạn và lây nhiễm sang các sản phẩm

khác

2.2.8 Tình hình nhiễm Salmonella trong nước và trên thế giới

2.2.8.1 Trên thế giới

- Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở châu Âu giảm đều đặn từ những năm 1990

trở lại đây, trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella trên người được

phát hiện, sự sai lệch của báo cáo này là rất lớn, số lượng thực tế rất có thể gấp 10 lần

như thế. Ở Mỹ, tình trạng có khá hơn, ổn định ở mức 15 ca trên 100.000 người từ năm

2001 do kiểm soát tốt Salmonella trong thực phẩm từ năm 1990, bao gồm các thực

phẩm sữa, trứng, nước trái cây, sản phẩm tươi sống, rau, bánh kẹo, và đặc biệt là thịt.



Một đợt dịch gần đây ở Mỹ gây ra bởi S.typhimurium nhiễm trong bơ đậu phộng đã

gây ảnh hưởng đến hơn 700 người trên khắp nước Mỹ

- Từ tháng 7/2009 tới nay, số ca nhiễm khuẩn Salmonella được phát hiện

ở Mỹ đã tăng lên 184 người, thuộc 38 bang khác nhau. Cơ quan y tế của nước này vẫn

chưa xác định nguyên nhân chính xác khiến số ca nhiễm khuẩn Salmonella tăng nhanh

như vậy. Tuy nhiên, mới đây các chuyên gia y tế của bang Oregon cho rằng nguồn lây

lan vi khuẩn Salmonella từ các sản phẩm xúc xích. Vừa qua, các cơ quan điều tra Mỹ

đã thu hồi hơn 560 tấn xúc xích do nghi bị nhiễm vi khuẩn Salmonella, tất cả số lượng

này đều do Công ty Daniele International sản xuất.Tuy nhiên, ông Jason Maloni, phát

ngôn viên của công ty này khẳng định: “Chưa có bằng chứng nào chứng minh các sản

phẩm xúc xích của chúng tôi bị nhiễm vi khuẩn Salmonella”. Sự bùng nổ của số ca

nhiễm khuẩn Salmonella ở khu vực tây bắc Thái Bình Dương đã khiến các cơ quan

điều tra nghi ngờ rằng nguồn gây bệnh cho ổ dịch này là từ các sản phẩm xúc xích sau

khi họ phát hiện rất nhiều người ăn xúc xích mua tại các cửa hàng ở khu vực này bị

nhiễm khuẩn Salmonella. Các nhân viên điều tra tại bang Washington cũng cho biết 14

bệnh nhân bị nhiễm khuẩn Salmonella ở bang này, đã từng ăn xúc xích của hãng

Daniele. Ngoài ra, các chuyên gia y tế khẳng định họ đã kiểm tra và phát hiện khuẩn

Salmonella có trong các mẫu xúc xích của công ty này. Hiện tại, các nhân viên điều tra

liên bang Mỹ vẫn đang làm việc để tìm ra nguyên nhân chính xác gây ra dịch nhiễm

khuẩn Salmonella ở nước này. Vì thế, họ vẫn chưa thể kết luận sản phẩm xúc xích của

Công ty Daniele có phải là nguồn lây bệnh chính hay không. Vì thế, những sản phẩm

xúc xích của công ty này bị thu hồi là do kiểm tra bị nhiễm khuẩn Salmonella.

2.2.8.2 Trong nước

- Theo ông Nguyễn Công Khẩn, Cục trưởng Cục ATVSTP cho biết, hiện

nay, mạng lưới kiểm nghiệm ATVSTP đã được hình thành rộng khắp trong cả nước

nhưng thực tế năng lực kiểm nghiệm nhiều chỉ tiêu về an toàn thực phẩm tại các địa

phương vẫn rất hạn chế. Trong 330 mẫu hoa quả có tới 2,7% số mẫu có tỷ lệ tồn dư

thuốc bảo vệ thực vật cao, nhất là ở táo đỏ, quýt và lê. Đặc biệt, trong số 1.416 mẫu

thịt và sản phẩm từ thịt đã phát hiện tới 40,9% số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây ra

các bệnh về đường tiêu hóa. Hơn nữa, khu vực TP Hồ Chí Minh và Đồng Nai là những


http://vatgia.com/home/quicksearch.php?keyword=washington

http://vatgia.com/hoidap/quicksearch.php?keyword=c%C3%B4ng+ty&keyword_reject=&iCat=4491

http://vatgia.com/hoidap/quicksearch.php?keyword=ph%C3%A1t+ng%C3%B4n

http://vatgia.com/hoidap/quicksearch.php?keyword=ph%C3%A1t+ng%C3%B4n

http://vatgia.com/1244/xuc-xich-jambong.html


địa phương có tỷ lệ mẫu thực phẩm nhiễm Salmonella cao nhất, chiếm từ 84- 95%

mẫu được giám sát.

2.3 Các phương pháp phát hiện Salmonella

2.3.1 Phương pháp truyền thống

2.3.1.1 Nguyên tắc

- Salmonella có thể được phát hiện ( phân tích định tính ) bằng một quy

trình bao gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định.

Salmonella thường có mặt trong mẫu với một số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng

hiện diện chung với một số lượng lớn vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriaceae có tính

cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.

+ Bước tăng sinh : tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu

cần chọn quy trình tăng sinh phù hợp. Thông thường tỷ lệ giữa mẫu và môi trường

tăng sinh là 1 : 9, tuy nhiên tùy trường hợp mà tỷ lệ này có thể thay đổi

+ Bước tăng sinh chọn lọc : Các môi trường tăng sinh chọn lọc

thường dùng để phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm là Rappaport

Vassiliadis (RV), Selenite Cystein Broth,Tetrathionate Mueler Kauffmanm Broth

(TT )… Các nghiên cứu gần đây cho thấy môi trường RV có thể thay thế cho các môi

trường khác để phân tích nhiều mẫu khác nhau. Tuy vậy, môi trường TT thường được

dùng để phân tích các mẫu thịt tươi sống, các mẫu có mật độ nhiễm cao, các mẫu thức

ăn gia súc… Hiện nay người ta khuyến khích là nên dùng ít nhất hai loại môi trường

tăng sinh chọn lọc để phát hiện tất cả các serotype Salmonella nếu có hiện diện trong

mẫu.

+ Bước phân lập : nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các

quần thể vi sinh vật khác trong mẫu. Nhiều loại môi trường rắn khác nhau được sử

dụng để phân lập Salmonella, mỗi môi trường giúp nhận dạng các giống của nhóm này

dựa trên một vài đặc tính. Hiện nay, các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến

khích sử dụng ít nhất 2 loại môi trường phân lập khác nhau để tăng cường khả năng

phát hiện tất cả các dòng Salmonella, đặc biệt là môi trường XLD được khuyến khích

sử dụng

+ Bước khẳng định : nhằm xác định lại các khuẩn lạc đặc trưng

của Salmonella xuất hiện trên môi trường phân lập. Bước này dựa trên các thử nghiệm



sinh hóa và các thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salmonella. Các thử nghiệm

sinh hóa được khuyến khích sử dụng là KIA/TSI, indol, LDC (Lysine decarboxylase),

ODC ( Ornithine decarboxylase ), urea, manitol, sorbitol, các thử nghiệm huyết thanh

O và H đa giá.

- Môi trường và hóa chất

+ Buffered Pepton Water (BPW)

+ Rappaport Vassiliadis Soya Pepton (RV)

+ Malachite Green Magnesium Chloride

+ Tetrethionate Muller – Kauffmanm

+ Xylose Lysine Deoxycholate (XLD)

+ Hektoen Entric Agar (HE)

+ Bismuth Sulphite Agar (BS)

+ Brillian Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS)

+ Triple Sugar Iron (TSI)

+ Urea

+ Lysine Decarboxylase

+ Ornithine Decarboxylase

+ Manitol

+ Sucrose

+ Sorbitol

+ Tryptone

+ Thuốc thử Kovac’s

+ Kháng huyết thanh Salmonella đa giá

2.3.1.2 Phương pháp thực hiện

a) Tăng sinh

- Đối với các loại mẫu thông thường, tiến hành cân 25g mẫu vào túi PE

vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở

370C trong 18 – 24 giờ. Đối với một số loại mẫu có chứa các chất gây độc hoặc ức chế

sự phát triển của Salmonella cần tiến hành quy trình đặc biệt

+ Đối với thịt gia cầm tươi sống : Đặt gia cầm vào một túi PE lớn,

cho them 1 lít BPW, lắc bằng máy lắc 30 giây để môi trường thấm vào toàn bộ mẫu



+ Đối với mẫu sữa khô : Cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng, cho

thêm 225ml BPW, để yên ở nhiệt độ phòng khoảng 60 phút. Sau đó lắc cho tan hoàn

toàn

+ Đối với các mẫu gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia

vị : đồng nhất mẫu với tỷ lệ 1/100 trong BPW ( thay vì 1/10 như bình thường ) trước

khi tăng sinh. Biện pháp này nhằm giảm nồng độ các chất ức chế sự tăng trưởng của

Salmonella trong bước tăng sinh

+ Đối với các loại mẫu như casein, phomat, bơ và các sản phẩm

tương tự khác : thực hiện dồng nhất mẫu trong môi trường tăng sinh đã được làm ấm

đến 400C

+ Đối với các sản phẩm chứa coca: đồng nhất mẫu trong môi

trường Skim Milk Broth được làm ấm đến 400C

+ Đối với dừa, các sản phẩm từ dừa và các mẫu có hàm lượng

chất béo cao: đồng nhất mẫu trong môi trường BPW, sau đó cho thêm 2 – 3 giọt Triton

X – 100 trước khi ủ tăng sinh

b) Tăng sinh chọn lọc

+ Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, sau đó chuyển 0,1ml sang 10ml

môi trường tăng sinh chọn lọc RV đã được ủ ấm đến 420C. Ủ ở 420C trong 18 – 24

giờ, khi cần thiết có thể kéo dài ủ thêm 24 giờ

+ Một số môi trường tăng sinh chọn lọc khác cũng được sử dụng,

mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc dựa trên một đặc điểm phát triển của

Salmonella, một số dòng chỉ có thể tăng trưởng trong môi trường này mà không thể

tăng trưởng trong môi trường khác. Do vậy, để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng

Salmonella hiện diện trong thực phẩm cần phải dùng ít nhất hai loại tăng sinh chọn lọc

khác nhau cho cùng một mẫu. Ngoài ra mỗi môi trường cần được ủ ở các nhiệt độ

khác nhau

c) Phân lập và nhận diện

+ Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc

đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa môi trường phân lập đặc trưng cho

Salmonella như XLD, HE, BS… Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở

hình thái của khuẩn lạc Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau. Để chọn lọc



và nhận dạng tất cả các dòng Salmonella cần sử dụng ít nhất hai loại môi trường chọn

lọc phân biệt khác nhau cho cùng một mẫu. Các biểu hiện của Salmonella trên từng

môi trường khác nhau như sau

+ Môi trường XLD: khuẩn lạc tròn, lồi, trong suốt, có hay không

có tâm đen, đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh

chuyển sang màu hồng

Hình 2.4: Khẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD

+ Môi trường HE: khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến

xanh lục, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đén quá lớn bao trùm khuẩn lạc

Hình 2.5: Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường HE

+ Môi trường BS: khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh

thoảng có ánh kim tím, môi trường chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển sang màu

đen nếu kéo dài thời gian ủ



Hình 2.6: Khẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường BS

d) Khẳng định

+ Từ mỗi môi trường phân lập cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc đặc

trưng qua môi trường không chọn lọc như TSA. Ủ ở 370C trong 18 – 24 giờ. Các

khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường này được sử dụng cho các test sinh hóa và huyết

thanh

+ Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella

là: lên men glucose, urea, manitol, indol, H2S, VP, ODC, LDC, saccharose, sorbitol.

Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm như sau

+ Thử nghiệm H2S (KIA hay TSI): Salmonella chỉ lên men được

đường glucose trong môi trường, vì vậy phần nghiêng của môi trường có màu đỏ,

phần sâu có màu vàng. Đa số các chủng Salmonella đều có khả năng sinh H 2S nên có

các vạch màu đen trong môi trường. Có thể quan sát thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện

tượng làm vỡ thạch hoặc môi trường bị đẩy lên để lại một khoảng hở dưới đáy ống

nghiệm

+ Thử nghiệm LDC (+): sau khi nuôi cấy, môi trường bị kiềm

hóa, màu không đổi ( màu tím hay xanh )

+ Thử nghiệm urea (-): Salmonella không phân giải urea nên

không làm thay đổi pH của môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên

màu



+ Lên men manitol, sorbitol (+): môi trường sau khi nuôi cấy bị

acid hóa chuyển sang màu vàng.

+ Thử nghiệm indol và VP (-)

Thử nghiệm Môi trường Biểu hiện đặc trưng

H2S TSI/KIA Phần nghiêng đỏ, sâu vàng, nứt thạch và xuất

hiện vạch đen

LDC LDC Không đổi màu

Urea Urea Không đổ màu

Manitol,sorbitol Manitol, sorbitol Bị acid hóa,môi trường chuyển sang màu vàng

Indol Trypton Không xuất hiện vòng đỏ khi nhỏ thuốc thử

Kovac’s

VP VP Không đổi màu khi nhỏ α – napthol 5% và

KOH 40%

Bảng 2.1: Biểu hiện đặc trưng của Salmonella trong test sinh hóa

- Các thử nghiệm kháng nguyên cần được thử nghiệm song song với

mẫu đối chứng bằng nước muối sinh lý để tránh hiện tượng ngưng kết giả. Hai loại

huyết thanh đa giá cần dùng là Salmonella Polyvalent O và Salmonella Polyvalent H.

Phản ứng (+) khi chủng thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh nhưng không ngưng

kết với nước muối sinh lý

2.3.2 Phương pháp hiện đại

- Phương pháp truyền thống mất khá nhiều thời gian (5 ngày) để cho ra

kết quả, do đó người ta đã phát triển rất nhiều phương pháp thử nhanh để phát hiện

Salmonella trong các mẫu thực phẩm và mẫu nước trong thời gian ngắn, từ đó có biện

pháp xử lý kịp thời đối với các mẫu nhiễm. Xu hướng sử dụng PCR và IMS thường

đượ c sử dụ ng. Phương pháp PCR giúp phát hiện nhanh; tuy nhiên dễ xảy ra hiện

tượng âm tính giả, đòi hỏi các thao tác phải thành thạo. Multiplex PCR giúp tiết kiệm

thời gian, số lượng mẫu và chi phí; tuy nhiên lại có độ nhạy kém hơn. Người ta đã phát

triển thêm phương pháp Real Time PCR từ PCR truyền thống. Phương pháp này có độ

nhạy rất cao, cho kết quả sớm hơn, không cần phải chạy điện di sau phản ứng khuếch

đại. Phương pháp miễn dịch từ phân tách là một lựa chọn tốt hơn. Nó có độ nhạy cao

(< 104 CFU/ml), thời gian ngắn (thí nghiệm được thực hiện trong 4-5 giờ).



- Bên cạnh những kỹ thuật Sinh học phân tử cơ bản để phát hiện và định

danh Salmonella, còn có những phương pháp khác, như: phương pháp miễn dịch

(huyết thanh học, kỹ thuật ELISA, Western blot). Và đôi khi để tăng hiệu quả, độ tin

cậy cho xét nghiệm người ta c� n kết hợp nhiều phương pháp với nhau, ví dụ: IMS-PCR

assay (Immunomagnetic Separation and Polymerase Chain Reaction) để phát hiện

Salmonella trong thực phẩm.

2.3.2.1 Phương pháp PCR

- Nguyên tắc : Phương pháp định tính này dựa vào việc xác định đoạn

ADN đích có được khuếch đại hay không. Quá trình xác định được thực hiện bằng

cách điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agarose, nhuộm màu ADN bằng etyl

bromua và quan sát bằng đèn UV có bước sóng là 302 mm. Nếu trong mẫu có gen

đích, trên bảng gel điện di sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp

với độ dài của đoạn ADN đích đã định. Nếu trong mẫu không có gen đích, trên gel

diện di không xuất hiện sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm khuếch đại có kích thước

không phù hợp với đoạn ADN đích.

- Thiết bị, dụng cụ, hoá chất và môi trường

+ Thiết bị, dụng cụ

+ Tủ ấm 37oC.

+ Máy luân nhiệt.

+ Máy ly tâm dùng cho ống eppendorf 1,5 ml.

+ Máy lắc ống nghiệm.

+ Thiết bị điện di ngang và bộ nguồn điện di có điện thế hoạt

động từ 80 đế 150 volt.

+ Hộp đèn soi UV có kính lọc 302mm.

+ Bộ chụp ảnh trên đèn UV.

+ Ống Eppendorf 0,2. 0,5 ml; 1,5 ml chuyên dùng cho PCR.

+ Hoá chất, môi trường

- Mồi gồm hai mồi invA1 và invA2 được thiết lập cách nhau 520 bp trong

gen invA có vai trò trong quá trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật và

người. Trình tự của hai mồi như sau :

+ invA1 : 5' - TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3'



+ invA2 : 5' - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG - 3'

Nồng độ mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 6 pM trong đệm TE. Ðệm

TE có thành phần như sau : 10 mM Tris-HCl (pH = 8), 1 mM EDTA.

- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật và các loại hoá chất khác : Khuyến

khích sử dụng môi trường nuôi cấy dạng bột khô và các vật liệu dùng cho phản ứng

khuếch đại PCR được tổng hợp thành kit đang được lưu hành trên thị trường có thành

phần phù hợp như. Quá trình pha chế, bảo quản, sử dụng phải tuân thủ theo hướng dẫn

của nhà sản xuất. Trong trường hợp sử dụng các vật liệu hoá chất riêng lẻ, độ tinh

khiết của các thành phần và nước pha chế phải đảm bảo chất lượng dùng cho vi sinh

và sinh học phân tử.

- Thang DNA :Nên sử dụng thang đo phù hợp có thể ước lượng được

đoạn khuếch đại 520 bp. Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 520 bp đã

biết trước làm thang đo trong phương pháp này.

- Agarose : Sử dụng trong kỹ thuật này là loại dùng để điện di ADN có

kích thước nhỏ hơn 1000 bp.

- Phương pháp tiến hành

+ Lấy mẫu : Cân chính xác 25 g mẫu (hoặc một khối lượng chính

xác tuỳ theo yêu cầu) rồi cho vào bình tam giác hoặc bao PE vô trùng.

+ Tăng sinh : Nhằm làm tăng số lượng Salmonella trong mẫu, các

tế bào bị suy yếu hay tổn thương cũng được phục hồi và phát triển. Giai đoạn này

được tiến hành trong môi trường không chọn lọc và trên nguyên tắc cứ một phần khối

lượng mẫu sẽ bổ sung 9 phần khối lượng môi trường tăng sinh. Nếu lấy 25 g mẫu, phải

bổ sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch pepton đệm. Ủ mẫu có môi trường tăng

sinh ở nhiệt độ 37,0oC 1,0oC trong khoảng 18 giờ 2 giờ.

+ Xử lý mẫu giải phóng DNA : Giai đoạn này nhằm thu nhận sinh

khối sau khi tăng sinh, rửa sạch môi trường sau khi nuôi cấy, phá vỡ tế bào để giải

phóng DNA. Cách xử lý như sau:

Lắc đều canh khuẩn tăng sinh. Hút 0,5 ml vào trong ống

eppendorf có thể tích 1,5 ml, ly tâm với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút rồi loại

bỏ phần môi trường lỏng bên trên. Rửa sinh khối bên dưới với nước cất vô trùng rồi

tiếp tục ly tâm với chế độ như trên để loại bỏ phần nước.



Huyền phù sinh khối trong ống với 0,5 ml nước cất vô

trùng. Ðun sôi cách thuỷ trong 10 phút. Ly tâm huyền dịch sau khi đun với tốc độ 10

000 vòng/phút trong 5 phút để lắng các mảnh vỡ tế bào xuống đáy. Phần dịch trong

bên trên được coi là khuôn DNA để tiến hành phản ứng khuếch đại.

- Khuếch đại

+ Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn DNA đích

trên máy luân nhiệt (thermocycler) bằng hai mồi đặc trưng. Quá trình khuếch đại được

tiến hành trong khoảng 30 chu kỳ.

+ Chuẩn bị ống khuếch đại

Hút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào trong

ống nghiệm PCR có thể tích 0,2 hoặc 0,5 ml, thêm vào 1 ml mỗi mồi invA1 và invA2

có nồng độ 6 pM và 3 ml mẫu khuôn ADN. Tổng thể tích trong một ống khuếch đại là

50 ml.

Ðối chứng dương: thay dịch khuôn DNA mẫu bằng

dịch ADN của Salmonella chuẩn đã biết.

Ðối chứng âm: thay dịch khuôn DNA mẫu bằng nước

cất vô trùng.

+ Chương trình khuếch đại

Các ống khuếch đại được đặt vào trong máy luân nhiệt.

Chương trình khuếch đại như sau: Duy trì nhiệt độ 95oC trong 5 phút để làm biến tính

hoàn toàn các sợi DNA trong mẫu. Tiếp theo là 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước như

sau: 95oC/60 giây; 54oC/45 giây và 72oC/60 giây. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu

được giữ ở nhiệt độ 72oC trong 10 phút, sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ 20oC cho đến

khi điện di.

- Ðiện di sản phẩm khuếch đại

+ Chuẩn bị gel điện di agarose 1%

Gel agarose 1 % pha trong đệm TAE 1x được đun chảy

hoàn toàn và đổ vào khay điện di đã có sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải có

độ dày khoảng 3 - 4 mm. Gel sau khi chuẩn bị được ngâm chìm hoàn toàn trong đệm

TAE.

+ Chuẩn bị dịch điện di



Mẫu sau khi khuếch đại được nhuộm với 10 ml đệm tải

mẫu 6x rồi trộn thật đều.

+ Ðiện di

Một giếng trong gel điện di được sử dụng cho thang

DNA chuẩn hay mẫu đối chứng dương. Nạp 10 ml dịch điện di đã chuẩn bị vào trong

gel agarose. Tiến hành điện di trong 60 phút ở hiệu điện thế 100 vôn.

- Nhuộm DNA, quan sát sản phẩm khuếch đại

+ Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu

Pha dung dịch nhuộm DNA như sau: cho 0,2 ml etyl

bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào trong khay chứa có miệng rộng hơn bản

gel điện di.

+ Nhuộm gel

Ngâm bản gel đã điện di vào dung dịch nhuộm trong 10

phút. Rửa gel bằng nước trong khoảng 3 - 5 phút để loại bỏ phần etyl bromua dư.

+ Quan sát, chụp hình

Cho bản gel đã nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính

bảo vệ, bật đèn rồi quan sát các vạch sáng đỏ của DNA xuất hiện trên bản gel. Sau đó,

chụp hình để lưu trữ kết quả.

- Ðọc và giải thích kết quả

+ Kết quả phân tích chỉ được xem xét kết luận khi mẫu đối chứng

dương tính có sản phẩm khuếch đại DNA với kích tước 520 bp và mẫu đối chứng âm

không có sản phẩm này.

+ Mẫu được kết luạn là dương tính Salmonella khi có sản phẩm

khuếch đại 520 bp trên bản gel.

+ Mẫu được kết luận là âm tính khi không có sản phẩm khuếch

đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác hơn 520 bp.

2.3.2.2 Phương pháp ELISA

- ELISA được sử dụng rộng rãi dưới dạng các kit thương mại và có thể

cải tiến để tự động hóa. ELISA có thể sử dụng để phát hiện và định lượng vi sinh thực

phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh. Kĩ thuật này có độ nhạy khoảng



106CFU/ml. tuy nhiên vẫn phải thực hiện bước tăng sinh và tăng sinh chọn lọc trước

khi thực hiện các phản ứng miễn dịch

- Transia Salmonella (Diffchamb AB, Sweden) là 1 bộ kit phát hiện

nhanh Salmonella spp. dựa trên nguyên tắc E sanwich. Khi hỗn hợp tăng sinh chọn lọc

được cho vào giếng, nếu có sự hiện diện của vi sinh vật mục tiêu, kháng nguyên tiêm

mao của vi sinh vật sẽ tạo phức hợp với kháng thể cố định trên giếng và kháng thể tự

do có gắn enzyme peroxydase tạo thành 1 phức hợp kép (sanwhich). Sau đó các kháng

thể có gắn enzyme ở dạng tự do không tạo phức hợp sanwhich sẽ bị rửa khỏi phản

ứng. Phức hợp sanwihch sẽ được phát hiện nhờ sự bổ sung cơ chất của phản ứng (ure

peroxide và teramethylbenzidine). Enzyme peroxide sẽ thủy phân cơ chất tạo phản ứng

màu xanh dương. Phản ứng kết thúc bằng cách bất hoạt enzyme bằng dung dịch kết

thúc làm acid hóa môi trường và lầm môi trường chuyển từ màu xanh sang màu vàng.

Sự hình thành màu vàng chứng minh sự hiện diện của kháng nguyên hay vi sinh vật

mục tiêu và mật độ màu của vi sinh vật có thể xác định được bằng cách đo cường độ

màu bằng máy so màu

2.4 Các biện pháp kiểm soát Salmonella trong thực phẩm

- Đối với gia súc và gia cầm: Trong chăn nuôi cần chú ý đề phòng bệnh

tật cho chúng. Phải kiểm tra thú y khi giết súc vật, điều này càng làm tốt thì càng ít có

cơ hội bán hoặc xuất ra các loại thịt đã nhiễm Salmonella. Trong khi giết thịt phải đảm

bảo tính riêng rẽ, tránh sự lây lan của vi khuẩn, chú ý tới các loại dụng cụ dùng khi

giết thịt .

- Trong bảo quản thực phẩm, đảm bảo thời gian cất giữ thực phẩm đã

chế biến và các nguyên liệu. Chú ý thịt băm, patê... thịt nghiền mà không ướp lạnh

ngay sau đó sẽ tạo điều kiện cho toàn bộ khối nguyên liệu đó nhiễm trùng mau chóng.

- Đun sôi thực phẩm trước khi ăn là biện pháp tốt nhất. Thịt đã ướp lạnh

thời gian đun nấu phải kéo dài hơn bình thường, khi đun phải đảm bảo nhiệt độ sôi cả

bên trong miếng thịt (ít nhất là 5 phút). Thực phẩm còn thừa, thực phẩm dự trữ phải

đun lại trước khi ăn. Với trứng có thể bị nhiễm Salmonella rất sớm ngay khi mới đẻ

(trứng vịt, ngan, ngỗng...), vì vậy phải chế biến chín hoàn toàn, tuyệt đối không ăn

sống hoặc hồng đào.Bảo đảm vệ sinh nơi ăn, tránh ruồi, nhặng, chuột.



- Thực hiện nghiêm ngặt chế độ khám tuyển trước khi vào và khám định

kỳ (1 năm/1 lần) đối với người tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm nhất là thực phẩm đã

nấu chín.

Chương III : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian

- Thời gian: Từ ngày 31/05/2010 đến ngày 12/06/2010.



- Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Khoa Môi trường và Công nghệ

Sinh học, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.

- Địa chỉ: 144/24 Điện Biên Phủ, P25, Q. Bình Thạnh, TP. Hồ Chí Minh.

3.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu và phát hiện Salmonella trên một số mẫu thịt gà tươi sống

trên địa bàn hai quận Phú Nhuận và Bình Thạnh thành phố Hồ Chí Minh.

3.3 Vật liệu thí nghiệm

3.3.1 Các dụng cụ và hóa chất tiến hành thí nghiệm

- Kéo cắt mẫu.

- Pipet 1ml, 5ml, 10ml.

- Đĩa petri.

- Micropipet 10µl-200µl.

- Túi PE vô trùng.

- Que cấy thẳng, que cấy vòng

- Cân điện tử.

- Ống nghiệm khử trùng.

- Tủ ấm 37oC, 42oC.

- Nồi hấp khử trùng 121oC.

- Đèn cồn.

- Quả bóp cao su.

- Chai chịu nhiệt dung tích 500ml, 1000ml.

- Gía ống nghiệm inox.

- Tủ cấy.

- Bông không thấm.

- Que cấy.

- Cồn 96o, 70o

- Nước cất khử trùng

3.3.2 Các môi trường sử dụng

- Môi trường BPW (Ấn Độ)

- Môi trường RV (Ấn Độ)

- Môi trường XLD (Ấn Độ)



- Môi trường dùng để test sinh hóa :

+ LDC (Ấn Độ)

+ Manitol (Ấn Độ)

+ Urea (Merck)

+ VP (Ấn Độ)

+ TSI (Ấn Độ)

+ Trypton (Ấn Độ)

3.4 Nội dung thực hiện

Hình 3.1: Nội dung thực hiện thí nghiệm

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Quy trình phân tích


Thu mẫu tại các địa điểm khảo sát

Mẫu thịt gà

Đánh giá các chỉ tiêu

Cảm quan Salmonella

Nhận xét, Kết luận

25 g mẫu + 225 ml BPW, đồng nhất mẫu trong 30 giây độ pha loãng 10-1

Đem ủ ở 37oC trong 24 giờ

Lấy 0.1ml canh trường cho vào môi trường RV

Ủ ở 42oC ± 0,5 trong 24 giờ

Cấy chuyển trên môi trường XLD và ủ ở nhiệt độ 37 oC trong 24 giờ

KL đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD : tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn

lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ

Cấy chuyển vào môi trường test sinh hóa : môi trường TSI, Manitol phenol red, Urea, LDC, Trypton, VP

Biểu hiện đặc trưng của Salmonella : trên TSI: đỏ/vàng/H2S(+)/gas(+)/; Manitol(+); Urea(-); LDC(+); Indol(-);

VP(-)

Ủ ở 37oC trong 24 giờ


Hình 3.2: Quy trình phân tích Salmonella trong thí nghiệm

3.5.2 Thuyết minh quy trình

a) Chuẩn bị mẫu.



- Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu (không lấy mỡ, lấy cả chất lỏng nếu

có), cho vào bao nilong vô khuẩn. Thêm vào 225ml môi trường PBW đã hấp khử trùng

để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1. Đem ủ ở nhiệt độ 370C

trong 24 giờ.

b) Cấy mẫu.

- Tăng sinh: Cấy 0,1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có

chứa 10ml môi trường tăng sinh chọn lọc RV, Ủ ở 42 ± 0,5 oC trong 24 giờ.

- Phân lập: Cấy mẫu từ môi trường RV sang môi trường thạch đĩa XLD

và ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng của salmonella trên

môi trường XLD: tròn, lồi, trong suốt , có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm cả

khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ (hồng)….

- Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa

TSA, tăng sinh không chọn lọc và ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ

c) Thử nghiệm khẳng định.

- Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm

sinh hóa. Thực hiện như sau:

Thư nghiêm trên môi trương TSI:

- Hấp khử trùng môi trường TSI ở 1210C trong 15 phút và phân phối môi

trường vào các ống vô trùng để làm ống thạch nghiêng.


Hình 3.3: Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella


- Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của giống thuần sâu vào

đáy của ống thạch nghiêng.

- Sau khi cấy xong thì ủ ở 370C trong vòng 24h – 48h.

- Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong môi trường TSI

phần nghiêng của môi trường TSI có màu đỏ, phần sâu có màu vàng.

- Salmonella có khả năng H2S xuất hiện các vệt màu đen trong môi

trường TSI.

- Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch

môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo ra một khoảng không bên dưới ống

nghiệm.

Thư nghiêm Urea Broth:

- Cấy VSV vào môi trường canh urea có chứa chất chỉ thị là

bromocresol purple

- Ủ ở 370C trong khoảng 12h – 18h

- Thử nghiệm (+): môi trường chuyển sang màu vàng.

- Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu.


PositiveNegative

Hình 3.4: Thử nghiệm trên môi trường thạch TSI

Negative


Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi

trường. Sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu tím.

Lên men mannitol:

- Môi trường sử dụng là môi trường phenol red broth base có pH 7.4, chỉ

thị môi trường này là phenol red có màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH < 6.8.

- Tiến hành cấy vào các ống môi trường các chủng VSV cần khẳng định.

- Ủ 370C trong 18 – 24h.

- Khả năng lên men của chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid và

sinh hơi

- Sinh acid (+): môi trường màu cam chuyển sang vàng.

- Sinh hơi (-): có bọt khí trong ống Durnham.

Môi trường sau khi nuôi cấy salmonella bị acid hóa và chuyển thành

màu vàng.


Negative NegativeNegative

Hình 3.5: Thử nghiệm Urea Broth


Thư nghiêm LDC (Lysine Decarboxylase):

- Sử dụng môi trường Falkow.

- Tiến hành cấy vào các ống môi trường các chủng VSV cần khẳng định.

- Chất chỉ thị màu trong môi trường là Bromocresol purple.

- Phản ứng (+): môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu, canh khuẩn

đục.

- Phản ứng (-): môi trường từ tím chuyển sang vàng.

Sau khi nuôi cấy salmanella môi trường chuyển thành kiềm, môi

trường giữ nguyên màu tím ban đầu.


Negative NegativePositive

Hình 3.6: Lên men Mannitol


Thư nghiêm khả năng sinh Indol:

- Cấy VSV thử nghiệm qua môi trường canh trypton ủ khoảng 24 giờ ở

37oC.

- Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt môi trường, thêm vài giọt

thuốc thử Kovac’s

- Quan sát sau vài phút.

- Thử nghiệm (+): trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng màu đỏ cánh

sen.

- Thử nghiệm (-): không xuất hiện vòng đỏ.


Negative

Hình 3.7: Thử nghiệm LDC


Thư nghiêm Voges – Proskauer:

- Cấy vi sinh vật vào trong môi trường glucose phosphate (MR-VP

Broth)

- Ủ ở nhiệt độ 370C trong vòng từ 2-5 ngày

- Thêm vào canh khuẩn dung dịch thuốc thử anpha- naphtol 5% trong

cồn và dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 %. với tỷ lệ 3:1.

- Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút.

- Thử nghiệm (+):xuất hiện màu đỏ hay hồng sáng trên mặt môi trường.

- Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu.


NegativeNegativePositive

Hình 3.8: Thử nghiệm Indol


3.4.5. Nhận định tính sinh hoá đặc hiệu:

Tính chất sinh hoá Dương hoặc âm tính Tỷ lệ % với vi khuẩn Salmonella

TSI lactose - 99,2

TSI sucrose - 99,5

TSI glucose + 100

TSI glucose sinh hơi + 91,2

TSI hydro-sulfua + 91,6

Phân giải urê - 100,0

Lên men mannitol +

Phản ứng Indol - 98,2

Phản ứng V.P - 100,0

Bảng 3.1: Phát hiện hay không phát hiện Salmonella trong 25g mẫu

3.6 Kết quả

3.6.1 Kết quả cảm quan

- Về màu sắc, thịt gà có màu đặc trưng, phần thịt hồng, phần mỡ màu

vàng tươi và da màu vàng hoặc trắng

- Về mùi, thịt có mùi đặc trưng, không có mùi lạ


Negative

Hình 3.9: Thử nghiệm Voges – Proskauer


- Về tính chất, bề mặt thịt có nước, có độ đàn hồi tốt

- Về cảm quan nhìn chung là tốt, thịt nhìn còn tươi, tính chất, màu sắc,

mùi vị không có gì lạ. Nhưng đánh giá cảm quan không đủ để xem xét mức độ sạch

của thịt

3.6.2 Kết quả đánh giá mức độ nhiễm Salmonella

- Đánh giá theo TCVN 4829:2001 (ISO 6579:1993) với quy đinh mức

độ nhiễm Salmonella là 0 CFU/25g

Hình 3.10 : Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên các mẫu khảo sát

- Theo bảng trên, mẫu 3 và mẫu 5 đã nhiễm Salmonella với tỷ lệ

33.33%. Việc tạp nhiễm Salmonella có thể do thao tác của người phân phối thịt không

hợp vệ sinh, không dùng các dụng cụ bảo hộ. Hoặc cũng có thể thịt bị tạp nhiễm do

không khí, vì vệ sinh khu buôn bán cũng có thể là do nhiễm ở trung tâm giết mổ. Hai

mẫu nhiễm có thể nói lên tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm ở hai khu vực này là rất

thấp, vì tỷ lệ tạp nhiễm trong quy định của TCVN là 0 CFU/25g

- Tóm lại, ba mẫu 1, 2 và 4 âm tính với Salmonella có thể sử dụng được,

nhưng cũng phải đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, vì không chỉ có Salmonella mới

gây ra những ca ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng, không nhiễm Salmonella không có

nghĩa là không nhiễm các vi sinh vật khác.

- Hai mẫu 3 và 5 không thể sử dụng được, cơ sở phân phối cần có biện

pháp vệ sinh tốt hơn, đổi khu vực lấy thực phẩm khác để tránh tình trạng lây nhiễm



Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận

- Sau quá trình nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy

rằng Salmonella là một loài vi khuẩn khá nguy hiểm, chúng gây ra bệnh thương hàn,

nhiễm trùng huyết và một số bệnh khác. Đáng nói là loài này thường tạp nhiễm vào

thực phẩm, điều này vô cùng nguy hiểm vì theo TCVN, mức độ nhiễm Salmonella là 0

CFU/25 g.

- Mạng lưới kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm tuy trải rộng khắp cả

nước, nhưng năng lực kiểm dịch chưa được cao ở các địa phương , nhất là ở các thành

phố lớn như Tp. Hồ Chí Minh

4.2 Kiến nghị

- Trong thực nghiệm trên, có một số phần do thời gian quá gấp mà tôi

chưa thể thực hiện được

+ Khảo sát tình trạng vi sinh của khu buôn bán

+ Khảo sát qua tình hình giết mổ gia cầm trên địa bàn thành phố

Hồ Chí Minh

- Lập các trung tâm kiểm dịch trên địa bàn các quận và yêu cầu thịt trước

khi bán cần phải qua kiểm dịch và sử dụng các dụng cụ phân phối hợp vệ sinh

- Nên lập các địa điểm bán thực phẩm tập trung để dễ dàng kiểm tra vệ

sinh khu buôn bán. Thường xuyên tổ chức các đợt kiểm tra khu chăn nuôi và giết mổ

để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm



TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Bộ môn vi sinh vật trường đại học y Hà Nội (2007), vi sinh vật y học, Nxb y học,

Hà Nội.

2. Bộ môn vi sinh vật trường đại học y khoa Huế (2004), bài giảng vi sinh y học.

3. Bộ y tế (2008), vi sinh vật y học, Nxb y học, Hà Nội.

4. Trần Linh Phước (2009), phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực

phẩm và mỹ phẩm, Nxb Giáo Dục, Hà Nội

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI

5. Bibek Ray (2009), FUNDAMENTAL FOOD MICROBIOLOGY, ,Boca Raton

London New York Washington, D.C, USA.

6. Camilla Giammarini and Mauro Magnani, Listeriolysin O from Listeria

monocytogenes, Diatheva, Centre for Biotechnology, University of

Urbino, Italy

7. Cynthia L.Sears and James B.Kaper (1996), Enteric Bacterial Toxins:

Mechanisms of Action and Linkage to Intestinal Secretion, American Society for

Microbiology

8. FAO and WHO (2009), Salmonella and Campylobacter in chicken meat

9. Jame M.Jay (2000), Modern Food Microbiology

10. WHO, Risk assessments of Salmonella in eggs and broiler chickens


Tim Hieu Ve Vi Khuan Salmonella CvEbb9ZTTe 20130427110121 11208

Documents

Transcript of Tim Hieu Ve Vi Khuan Salmonella CvEbb9ZTTe 20130427110121 11208