Thủy phân rơm rạ - Lên men cồn

i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ETHANOL NHIÊN LIỆU TỪ RƠM RẠ

SVTH : TRẦN DIỆU LÝ MSSV : 60301608

CBHD : PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN BỘ MÔN: KỸ THUẬT HỮU CƠ

TP. HỒ CHÍ MINH, 01/2008

ii

Đại Học Quốc Gia Tp.HCM. CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM.

TRƯỜNG ĐH BÁCH KHOA. Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc.

--------------- -------------

Số: ________/ BKĐT

NHIỆM VỤ LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP KHOA: KỸ THUẬT HÓA HỌC.

BỘ MÔN: KỸ THUẬT HỮU CƠ.

HỌ VÀ TÊN: TRẦN DIỆU LÝ MSSV: 60301608

NGÀNH: KỸ THUẬT HỮU CƠ LỚP: HC03KSTN

1. Đầu đề luận án: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ETHANOL NHIÊN LIỆU TỪ RƠM RẠ

2. Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu):

Nghiên cứu quá trình thuỷ phân rơm rạ đã qua tiền xử lý, sử dụng enzyme cellulase.

Nghiên cứu quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời rơm rạ đã qua tiền xử lý,, sử dụng enzyme cellulase và nấm men saccharomyces cerevisiae.

3. Ngày giao nhiệm vụ luận án: 15/9/2007.

4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 15/12/2007.

5. Họ tên người hướng dẫn: Phần hướng dẫn

PGS TS. PHAN ĐÌNH TUẤN Toàn bộ.

Nội dung và yêu cầu LATN đã được thông qua Bộ môn.

Ngày 15 tháng 9 năm 2007

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN. NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH.

(Ký và ghi rõ họ tên) ( Ký và ghi rõ họ tên)

PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN:

Người duyệt (chấm sơ bộ):

Đơn vị:

Ngày bảo vệ:

Điểm tổng kết:

Nơi lưu trữ luận án:

iii

LỜI CẢM ƠN

Luận văn là tác phẩm của một sinh viên trước khi rời khỏi trường đại học. Để hoàn

thành luận văn, sinh viên cần phải áp dụng tất cả các kiến thức và hiểu biết mà mình đã

tích luỹ được trong suốt những năm học ở trường. Chính vì vậy những kiến thức mà em

đã tiếp thu được trong 5 năm học tại trường Bách Khoa là nền tảng vững chắc giúp em

hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa KỸ THUẬT

HOÁ HỌC nói chung và các thầy cô trong bộ môn KỸ THUẬT HỮU CƠ nói riêng vì đã

tận tình giảng dạy, giúp đỡ em trong suốt những năm vừa qua.

Em xin chân thành cảm ơn thầy Phan Đình Tuấn, thầy là người đã giúp em đến với

hướng nghiên cứu này, đồng thời cũng là người tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức,

kinh nghiệm và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành tốt luận văn.

Em cũng xin cảm ơn anh Ngô Đình Minh Hiệp vì đã nhiệt tình giúp đỡ em cả về

kiến thức chuyên môn lẫn thực nghiệm trong suốt những ngày hoàn thành luận văn tại

Tung tâm Lọc Hoá Dầu.

Cuối cùng, em xin cảm ơn bạn bè và người thân trong gia đình, những người luôn là

chỗ dựa vững chắc và luôn ủng hộ em trong mọi việc.

Sinh viên thực hiện

Trần Diệu Lý

iv

MỤC LỤC

Chương 1 MỞ ĐẦU......................................................................................................1

1.1 CÂY LÚA Ở VIỆT NAM .......................................................................................1

1.2 RƠM RẠ................................................................................................................2 1.2.1 Nguồn rơm rạ ở Việt Nam................................................................................2 1.2.2 Hiện trạng sử dụng năng lượng từ rơm rạ ở Việt Nam ....................................3

1.3 BIOETHANOL TỪ RƠM RẠ................................................................................3

1.4 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU........................................................4

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................5

2.1 NGUYÊN LIỆU LIGNOCELLULOSE .................................................................5 2.1.1 Cấu trúc lignocellulose .....................................................................................5 2.1.2 Cellulose ...........................................................................................................6 2.1.3 Hemicellulose ...................................................................................................8 2.1.4 Lignin .............................................................................................................10 2.1.5 Các chất trích ly..............................................................................................12 2.1.6 Tro ..................................................................................................................13

2.2 QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RƠM RẠ ...........................................13 2.2.1 Tổng quát........................................................................................................13 2.2.2 Tiền xử lý........................................................................................................14 2.2.3 Thủy phân.......................................................................................................20 2.2.4 Lên men ..........................................................................................................33 2.2.5 Thủy phân và lên men đồng thời ....................................................................38

2.3 SƠ LƯỢC VỀ BIOFUEL VÀ ETHANOL NHIÊN LIỆU ....................................44 2.3.1 Biofuel ............................................................................................................44 2.3.2 Ethanol nhiên liệu...........................................................................................45

Chương 3 THỰC NGHIỆM ......................................................................................48

3.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ........................................................................48 3.1.1 Rơm rạ ............................................................................................................48 3.1.2 Enzyme ...........................................................................................................48 3.1.3 Giống nấm men ..............................................................................................49

3.2 CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG .................................................................................49

3.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG.....................................................................52 3.3.1 Phương pháp phân tích thành phần xơ sợi trong biomass – rơm rạ ...............52 3.3.2 Phương pháp đo nồng độ glucose và ethanol .................................................56 3.3.3 Phương pháp xác định độ ẩm của nguyên liệu...............................................63

v

3.3.4 Phương pháp nuôi cấy và đếm nấm men........................................................64

3.4 TRÌNH TỰ NGHIÊN CỨU.................................................................................66 3.4.1 Sơ đồ quy trình ...............................................................................................67 3.4.2 Quá trình nổ hơi – tiền xử lý rơm rạ...............................................................67 3.4.3 Quá trình thủy phân ........................................................................................68 3.4.4 Quá trình thủy phân và lên men đồng thời .....................................................69

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .....................................................................71

4.1 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN RƠM RẠ ..............................................................71 4.1.1 Thành phần rơm rạ trước nổ hơi.....................................................................71 4.1.2 Thành phần rơm rạ sau nổ hơi........................................................................72 4.1.3 So sánh rơm rạ trước và sau nổ hơi ................................................................72 4.1.4 Thành phần dịch nổ hơi. .................................................................................74

4.2 QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN.................................................................................76 4.2.1 Thành phần dịch thủy phân ............................................................................76 4.2.2 Ảnh hưởng của phần trăm bã rắn ...................................................................77 4.2.3 Ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào..........................................................79 4.2.4 Ảnh hưởng của pH .........................................................................................84 4.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................................87 4.2.6 Hiệu suất thủy phân , nồng độ đường tạo thành theo thời gian......................92

4.3 QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI ..................................94 4.3.1 Thành phần dịch thủy phân và lên men đồng thời .........................................94 4.3.2 Ảnh hưởng của lượng emzyme cho vào.........................................................95 4.3.3 Ảnh hưởng của mật độ nấm men ban đầu......................................................98 4.3.4 Hiệu suất toàn quá trình theo thời gian ........................................................101

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................104

5.1 KẾT LUẬN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN...........................................................104

5.2 KẾT LUẬN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI.............104

5.3 SO SÁNH HIỆU SUẤT TOÀN QUÁ TRÌNH CỦA THỦY PHÂN VỚI THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI .............................................................................105

5.4 ĐỀ NGHỊ .........................................................................................................105

TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................106

PHỤ LỤC ........................................................................................................................108

vi

DANH MỤC HÌNH Hình 1-1 Tỉ lệ % trong tổng giá trị sản lượng nông nghiệp .................................................1 Hình 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000.................................................3 Hình 2-1 Cấu trúc của lignocellulose ...................................................................................6 Hình 2-2 Mối quan hệ cellulose – hemicellulose trong cấu trúc lignocellulose ..................6 Hình 2-3 Công thức hóa học của cellulose...........................................................................7 Hình 2-4 Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain ........................................................7 Hình 2-5 Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan.......................................................................9 Hình 2-6 Glucomannan ........................................................................................................9 Hình 2-7 Galactoglucomannan.............................................................................................9 Hình 2-8 Arabinoglucuronoxylan.......................................................................................10 Hình 2-9 Các đơn vị cơ bản của lignin...............................................................................10 Hình 2-10 Cấu trúc lignin trong gỗ mềm với các nhóm chức chính..................................11 Hình 2-11: Một số ví dụ về chất trích ly (a) abietic acid (oleoresin); (b) cathechin

(flavonoid); (c) palmitic acid (acid béo).....................................................................13 Hình 2-12 Mô tả cơ chế quá trình nổ hơi ...........................................................................17 Hình 2-13 Fufural ...............................................................................................................18 Hình 2-14 Hydroxymethyl fufural......................................................................................18 Hình 2-15: Cấu trúc sợi trước và sau khi nổ hơi, bó sợi cellulose được giải phóng ra khỏi

lớp lignin bảo vệ sau khi nổ hơi .................................................................................19 Hình 2-16: (d) sợi lignocellulose không nổ hơi có cấu trúc sít chặt ngăn cản sự tấn công

của enzyme, (e) nổ hơi ở 4atm, (f) nổ hơi ở 8atm......................................................19 Hình 2-17 Tác dụng của từng enzyme trong cellulase .......................................................21 Hình 2-18 Quá trình tác động của cellobiohydrolase lên đầu vùng kết tinh của cellulose.

....................................................................................................................................25 Hình 2-19 Cơ chế tác động hiệp đồng của enzyme exo-endo và endo-endo. Enzyme

endoglucanase tấn công ngẫu nhiên vào cellulose và tạo cơ chất thích hợp cho enzyme exoglucanase và sau đó khuếch tán nhanh ra khỏi bề mặt. Exoglucanse có thể tấn công từ đầu đường khử và không khử. ...........................................................26

Hình 2-20 Cơ chế quá trình thủy phân ...............................................................................27 Hình 2-21 Tốc độ phản ứng enzyme theo nhiệt độ ............................................................29 Hình 2-22 Ảnh hưởng của pH ............................................................................................30 Hình 2-23 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme.......................................................................30 Hình 2-24 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất .......................................................................31

vii

Hình 2-25 Chất kìm hãm cạnh tranh ..................................................................................32 Hình 2-26 Chất kìm hãm không cạnh tranh .......................................................................32 Hình 2-27: Quá trình đường phân ......................................................................................34 Hình 2-28 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm men..................................35 Hình 2-29: Giống nấm men Pichia stiptis và Saccharomyces cerevisiae...........................38 Hình 2-30 Nồng độ glucose (ô vuông không màu) và celllobiose (ô vuông màu đen) theo

thời gian của quá trình thủy phân và lên men đồng thời. ...........................................41 Hình 2-31 Nồng độ ethanol theo thời gian trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời.

....................................................................................................................................42 Hình 3-1 Rơm chưa nổ hơi .................................................................................................48 Hình 3-2 Saccharomyces serevisiae chủng turbo yeast extra nhìn dưới kính hiển vi........49 Hình 3-3 Thiết bị nổ hơi quy mô pilot................................................................................50 Hình 3-4 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)..............................................................50 Hình 3-5 Hình dạng buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi .............................................51 Hình 3-6 Buồng đếm hồng cầu...........................................................................................51 Hình 3-7 Bộ dụng cụ soxhlet..............................................................................................54 Hình 3-8 Hệ thống phân tích NDS và ADS .......................................................................54 Hình 3-9 Grooch Crucible ..................................................................................................54 Hình 3-10 Đường chuẩn glucose........................................................................................60 Hình 3-11 Đường chuẩn ethanol ........................................................................................61 Hình 3-12 Đường chuẩn cellobiose....................................................................................62 Hình 3-13 Bộ dụng cụ thủy phân và lên men đồng thời ....................................................70 Hình 4-1 Thành phần rơm rạ trước nổ hơi .........................................................................71 Hình 4-2 Thành phần rơm rạ sau nổ hơi. ...........................................................................72 Hình 4-3 So sánh kết quả các thành phần rơm rạ trước và sau nổ hơi. ..............................73 Hình 4-4 Rơm trước nổ hơi ................................................................................................74 Hình 4-5 Rơm sau nổ hơi ...................................................................................................74 Hình 4-6 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất thu được theo % bã rắn cho vào .......78 Hình 4-7 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian tương ứng với các % enzyme khác

nhau ............................................................................................................................80 Hình 4-8 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian ứng với các % enzyme .................81 Hình 4-9 Nồng độ glucose, cellobiose thu được và hiệu suất theo % enzyme ..................82 Hình 4-10 Tốc độ phản ứng ban đầu theo % enzyme cho vào...........................................83 Hình 4-11 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị pH khác nhau ...85 Hình 4-12 Hiệu suất, nồng độ glucose và nồng độ cellobiose theo pH dung dịch ............86

viii

Hình 4-13 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị nhiệt độ: nhiệt độ phòng khác nhau.........................................................................................................88

Hình 4-14 Nồng độ cellobiose theo thời gian ứng với các điều kiện nhiệt độ khác nhau. 89 Hình 4-15 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất tại 24 giờ theo nhiệt độ.......................90 Hình 4-16 Tốc độ phản ứng ban đầu theo nhiệt độ. ...........................................................91 Hình 4-17 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất theo thời gian. .................................93 Hình 4-18 Nồng độ ethanol, glucose và hiệu suất theo % enzyme, tại 24 giờ...................96 Hình 4-19 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo % enzyme cho vào tại

48 giờ ..........................................................................................................................97 Hình 4-20 Nồng độ ethanol, glucose và hiệu suất theo tỉ lệ mật độ nấm men cho vào tại 24

giờ ...............................................................................................................................99 Hình 4-21 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo tỉ lệ mật độ nấm men

cho vào tại 48 giờ .....................................................................................................100 Hình 4-22 Nồng độ cellobiose, glucose và ethanol tạo thành theo thời gian trong quá trình

thủy phân và lên men đồng thời. ..............................................................................102

ix

DANH MỤC BẢNG Bảng 1-1 Cơ cấu giá trị sản lượng nông ngư nghiệp Việt Nam năm 2002 [7] ...................1 Bảng 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000 [8]...........................................2 Bảng 2-1 Thành phần của vài loại lignocellulose theo [10].................................................5 Bảng 2-2 Các thông số vận hành và kết quả quá trình thủy phân và lên men đồng thời

được thực hiện trên nhiều nước[9] .............................................................................39 Bảng 2-3 Ảnh hưởng của ethanol, glucose và cellobiose lên enzyme cellulase và β-

glucosidase..................................................................................................................39 Bảng 2-4 Kết quả quá trình thủy phân và lên men đồng thời tiến hành với rơm đã qua tiền

xử lý bằng acid loãng, quá trình được tiến hành trong điều kiện kỵ khí....................40 Bảng 2-5 Ảnh hưởng của việc thêm các thành phần mới vào dịch thủy phân và lên men

đồng thời lúc 80 giờ....................................................................................................43 Bảng 3-1 Thành phần dung dịch NDS ...............................................................................52 Bảng 3-2 Kết quả chạy chuẩn.............................................................................................58 Bảng 3-3 Kết quả chuẩn glucose ........................................................................................59 Bảng 3-4 Kết quả cho chuẩn ethanol.................................................................................60 Bảng 3-5 Kết quả chuẩn cellobiose ....................................................................................62 Bảng 3-6 Thành phần môi trường Hansen dùng cho việc nuôi cấy, bảo quản gống nấm

men. ............................................................................................................................64 Bảng 3-7 Thành phần chất dinh dưỡng bổ sung cho dung dịch thủy phân và lên men đồng

thời. .............................................................................................................................69 Bảng 4-1 Thành phần rơm rạ khô trước nổ hơi ..................................................................71 Bảng 4-2 Thành phần rơm rạ theo Hồ Sĩ Tráng [3] ...........................................................71 Bảng 4-3 Thành phần rơm rạ khô sau nổ hơi .....................................................................72 Bảng 4-4 So sánh thành phần rơm rạ trước và sau nổ hơi .................................................72 Bảng 4-5 Thành phần dịch nổ hơi ......................................................................................74 Bảng 4-6 Thành phần dịch thủy phân.................................................................................76 Bảng 4-7 Kết quả ảnh hưởng của phần trăm bã rắn ...........................................................77 Bảng 4-8 Nồng độ glucose theo thời gian ứng với các % enzyme khác nhau ...................79 Bảng 4-9 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian ứng với % enzyme khác nhau......80 Bảng 4-10 Hiệu suất quá trình thủy phân theo thời gian ứng với các % enzyme khác nhau

....................................................................................................................................81 Bảng 4-11 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất và tốc độ ban đầu theo lượng enzyme

cho vào........................................................................................................................82

x

Bảng 4-12 Nồng độ glucose theo thời gian ứng với các giá trị pH ban đầu khác nhau. ....84 Bảng 4-13 Hiệu suất thủy phân theo thời gian ứng với các giá trị pH ban đầu khác nhau 85 Bảng 4-14 Hiệu suất và nồng độ glucose, cellobiose theo pH dung dịch ..........................86 Bảng 4-15 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị nhiệt độ khác

nhau. ...........................................................................................................................87 Bảng 4-16 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian tương ứng các chế độ nhiệt độ

khác nhau....................................................................................................................88 Bảng 4-17 Hiệu suất quá trình thủy phân theo thời gian tương ứng các nhiệt độ khác nhau

....................................................................................................................................89 Bảng 4-18 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất và tốc độ ban đầu đạt được theo nhiệt

độ ................................................................................................................................90 Bảng 4-19 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất theo thời gian..................................92 Bảng 4-20 Thành phần dịch thủy phân và lên men đồng thời............................................94 Bảng 4-21 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất toàn quá trình theo %

enzyme cho vào tại 24 giờ và 48 giờ. .........................................................................96 Bảng 4-22 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo mật độ nấm men cho

vào ..............................................................................................................................99 Bảng 4-23 Nồng độ cellobiose, glucose và ethanol tạo thành theo thời gian trong quá trình

thủy phân và lên men đồng thời ...............................................................................101

xi

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Rơm rạ chiếm tỉ lệ lớn trong các phụ phẩm nông nghiệp ở Việt Nam. Với thành phần chứa hơn 40% là cellulose, rơm rạ là nguồn nguyên liệu thích hợp cho quá trình sản xuất ethanol. Luận văn này nghiên cứu quá trình sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ và được chia làm hai phần. Phần đầu nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố :% bã rắn, % enzyme, nhiệt độ, pH lên quá trình thuỷ phân và phần hai nghiên cứu quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời.

Rơm rạ được cắt nhỏ và được tiền xử lý bằng phương pháp nổ hơi để phá vỡ cấu trúc. Sau đó được tiến hành thuỷ phân bằng enzyme cellulase hoặc thuỷ phân và lên men đồng thời bằng enzyme cellulase và nấm men saccharomyces cerevisiae chủng turbo yeast extra.

Kết quả cho thấy rằng, quá trình thuỷ phân diễn ra tốt nhất trong điều kiện: 11% bã rắn, 5% enzyme, 50oC và pH 4,8, tương ứng nồng độ glucose thu được là 55,08g/l và hiệu suất đạt 81%.

Quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời đạt được kết quả tốt ở 11% bã rắn, 5% enzyme, 23,6 triệu tế bào nấm men/ml, 50oC và pH 4,8. quá trình này thu được 30,86g/l ethanol tương ứng hiệu suất là 86,61%. Kết quả này cho thấy quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời rất thích hợp cho việc sản xuất ethanol từ rơm rạ.

xii

ABSTRACT

In Viet Nam, rice straw composes the main portion in agricultural byproducts. Containing above 40% of cellulose, rice straw is such a potential feedstock for ethanol production. This thesis does research on producing ethanol form rice straw and can be divided into 2 parts. The first part studies the effects of the dry solid concentration, enzyme loading, temperature and pH on the saccharification. The second part explores the simultaneous saccharification and fermentation (SSF) process.

Rice straw was pretreated by steam explosion method in order to be more accessible to enzyme. Then, the residue was introduced to hydrolyzed step or to SSF step. These steps were taken place during 2 to 3 days. The former utilized enzyme cellulase to hydrolyze cellulose in rice straw. In the latter, both the yeast saccharomyces cerevisiae and emzyme cellulase were employed.

The result indicated that the optimized condition for saccharification is 11% of dry solid, 5% of enzyme, 50oC and pH 4,8. With this condition, 55,08 g/l glucose was formed and the yield of 81% was obtained.

The experiments in SSF showed that the best condition for this process includes 11% of dry solid; 5% of enzyme; 23,6 million cell/ml; 37oC and pH 4,8. 30,86g/l ethanol was formed with the yield of 86,61%. This result indicates that SSF is such a suitable process for producing ethanol from rice straw.

Chương 1: MỞ ĐẦU

1

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 CÂY LÚA Ở VIỆT NAM

Cây lúa luôn giữ vị trí trung tâm trong nông nghiệp và kinh tế Việt Nam. Hình ảnh đất Việt thường được mô tả như là một chiếc đòn gánh khổng lồ với hai đầu là hai vựa thóc lớn là Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) và Đồng bằng sông Hồng (ĐBSH). Khoảng 80% trong tổng số 11 triệu hộ nông dân tham gia sản xuất lúa gạo, chủ yếu đựa vào phương thức canh tác thủ công truyền thống.

Bảng 1-1 Cơ cấu giá trị sản lượng nông ngư nghiệp Việt Nam năm 2002 [7]

Tỉ lệ % trong tổng giá trị sản lượng Nông-Lâm-Ngư nghiệp

Nông nghiệp

GTSL Nông-

Lâm-Ngư (tỉ đồng) Tổng số Lúa Các nguồn

khác

Lâm nghiệp

Ngư nghiệp

Cả nước 154478 78,3 38,0 40,3 3,9 17,8

ĐBSH 24415 91,6 46,3 45,3 1,0 7,4

ĐBSCL 59663 69,9 53,5 16,4 2,1 18,5

Tæ leä % trong toång giaù trò saûn löôïng noâng nghieäp

Các nguồn khác40%

Lâm nghiệp4%

Ngư nghiệp18% Cây lúa

38%

Hình 1-1 Tỉ lệ % trong tổng giá trị sản lượng nông nghiệp


2

Ghi chú: Các nguồn khác: % giá trị sản lượng của cây hoa màu lương thực, rau đậu, cây ăn quả, cây công nghiệp, chăn nuôi và dịch vụ nông nghiệp.

Bảng số liệu và đồ thị trên cho ta thấy vai trò quan trọng của cây lúa chiếm 38% trong tổng giá trị sản lượng nông – lâm - ngư nghiệp cả nước.

1.2 RƠM RẠ

Việc sản xuất lúa gạo đã tạo ra một lượng lớn phế phẩm từ cây lúa bao gồm rơm và trấu. Rơm và trấu là hai trong số nhiều nguồn biomass phổ biến và có nhiều tiềm năng ở Việt Nam.

1.2.1 Nguồn rơm rạ ở Việt Nam

Rơm rạ chiếm một phần rất lớn trong các nguồn biomass ở Việt Nam.

Bảng 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000 [8]

STT Biomass Lượng (triệu tấn) Năng lượng chứa

đựng (GJ) Phần trăm(%)

1 Gỗ thải từ nhà

máy cưa 3,1 35,960 2,6

2 Gỗ đốt 12,4 186,000 13,4

3 Rác thải rắn 0,015 57 0

4 Rơm 61,9 866,600 62,6

5 Trấu 5,6 63,840 4,6

6 Vỏ bắp 4,8 60,000 1,3

7 Bã khoai mì 0,6 7,500 0,5

8 Phế phẩm cây mía 1,5 18,750 1,4

9 Bã mía 5,0 36,050 2,6

10 Vỏ đậu 0,1 1,250 0,1

11 Xơ và lá dừa 5,8 104,400 7,5

12 Vỏ hạt cafe 0,3 4,670 0,3

Tổng 101,1 1,385,077 100


3

Caùc nguoàn biomass chính ôû Vieät Nam naêm 2000

4.6

62.6

goã thaûi töø nhaømaùy cöagoã ñoát

raùc thaûi raén

rôm

traáu

voû baép

baõ khoai mì

Pheá phaåmcaây míabaõ mía

voû ñaäu

xô vaø laù döøa

voû haït cafe

Hình 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000

Bảng số liệu và đồ thị trên cho thấy vị trí và tiềm năng rất lớn của rơm trong viêc sử dụng làm nguồn nguyên liệu. Rơm chiếm 62,6% trong tổng khối lượng biomass ở Việt Nam năm 2000 với lượng năng lượng chứa đựng là 866.600 GJ. Rơm hứa hẹn là một nguồn năng lượng lớn cho nước ta.

1.2.2 Hiện trạng sử dụng năng lượng từ rơm rạ ở Việt Nam

Mặc dù rơm rạ là một nguồn năng lượng lớn, rơm rạ nói riêng và từ biomass nói chung không dược sử dụng một cách hiệu quả ở Việt Nam. Phần lớn rơm rạ được bón trở lại ruộng sau khi thu hoạch, sử dụng làm chất đốt cho các hộ nhà nông, làm thức ăn cho gia súc …

Theo [8], biomass chỉ chiếm 3,8% trong tổng năng lượng sử dụng của thành phố Hồ Chí Minh năm 2003, trong khi đó, nguồn năng lượng này chiếm 89% trong tổng năng lượng sử dụng ở nông thôn năm 2001. Ở nông thôn, biomass chủ yếu được dùng làm chất đốt và hiệu suất sử dụng năng lượng của quá trình này chỉ được 10%.

1.3 BIOETHANOL TỪ RƠM RẠ

Ngày nay sức ép từ khủng hoảng dầu mỏ và nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề nan giải của bất cứ quốc gia nào trên thế giới. Mỹ và Brazil đã thành công trong việc sản xuất


4

ethanol từ nguồn sinh học là bắp và mía. Điều này đã khích lệ các nước khác đầu tư nghiên cứu vào lĩnh vực nhiên liệu sinh học.

Bên cạnh sản xuất ethanol từ nguồn tinh bột (bắp) và đường (mía), ethanol có thể được sản xuất từ lignocellulose. Lignocellulose là loại biomass phổ biến nhất trên thế giới. Vì vậy sản xuất ethanol từ biomass cụ thể là từ nguồn lignocellulose là một giải pháp thích hợp đặc biệt là với các quốc gia nông nghiệp như Việt Nam.

Nền nông nghiệp Việt Nam hằng năm tạo ra một lượng lớn phế phẩm nông nghiệp, chủ yếu là lignocellulose từ các vụ mùa. Tận dụng nguồn nguyên liệu này, cụ thể là rơm rạ để sản xuất bioethanol là phương pháp sử dụng rơm rạ một cách hiệu quả đồng thời góp phần giải quyết vấn đề năng lượng cho nước ta.

1.4 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Mục đích chính của đề tài là nghiên cứu khả năng xử lý rơm rạ để lên men ethanol. Các mục tiêu chính trong đề tài là:

• Nghiên cứu quá trình thủy phân rơm đã qua tiền xử lý nổ hơi bằng enzyme cellulase, tạo ra dịch đường.

• Nghiên cứu quá trình thủy phân và lên men đồng thời để chuyển hóa cellulose trong nguồn rơm rạ ban đầu thành ethanol.

Các nội dung chính cần phải thực hiện để đạt được mục tiêu trên:

Đối với quá trình thủy phân:

• Khảo sát ảnh hưởng của lượng bã rắn đối với quá trình thủy phân.

• Khảo sát ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào đối với quá trình thủy phân.

• Khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch đến quá trình thủy phân.

• Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân.

• Khảo sát nồng độ đường tạo thành theo thời gian.

Đối với quá trình thủy phân và lên men đồng thời

• Khảo sát ảnh hưởng của lượng enzyme đến quá trình.

• Khảo sát ảnh hưởng của lượng nấm men cho vào lên quá trình.

• So sánh hiệu suất chuyển hóa quá trình thủy phân với quá trình thủy phân và lên men đồng thời.

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

5

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 NGUYÊN LIỆU LIGNOCELLULOSE

Lignocellulose là vật liệu biomass phổ biến nhất trên trái đất. Lignocellulose có trong phế phẩm nông nghiệp, chủ yếu ở dạng phế phẩm của các vụ mùa; trong sản phẩm phụ của công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy; có trong rác thải rắn của thành phố... Với thành phần chính là cellulose, lignocellulose là một nguồn nguyên liệu to lớn cho việc sản xuất bioethanol. Rơm rạ là một dạng vật liệu lignocellulose.

2.1.1 Cấu trúc lignocellulose

Thành phần chính của vật liệu lignocellulose là cellulose, hemicellulose, lignin, các chất trích ly và tro.

Bảng 2-1 Thành phần của vài loại lignocellulose theo [10]

Hemicellulose Nguồn/% Cellulose

Xylane Mannan Galactan Arabianan Lignin

Chất trích ly

Gỗ vân sam 41,9 6,1 14,3 - 1,2 27,1 9,6

Gỗ thông 37,7 4,6 7,0 - - 27,5 10,8

Gỗ cây bulô 38,2 18,5 1,2 - - 22,8 4,8

Gỗ dương 49,9 17,4 4,7 1,2 1,8 18,1 -

Phế phẩm cây bắp

36,4 18,0 0,6 1,0 3,0 16,6 7,3

Rơm lúa mì 38,2 21,2 0,3 2,5 23,4 13,0

Rơm lúa(*) 34 – 38 32 – 40 12

(*) theo Hồ Sĩ Tráng [3]

Theo [10 ] về cơ bản, trong lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính và được bao bọc bởi những chất có chức năng tạo mạng lưới như hemicellulose và kết dính như lignin. Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau và liên kết cộng hóa trị với nhau. Các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin.


6

Hình 2-1 Cấu trúc của lignocellulose

Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản. Các sợi này được gắn lại với nhau nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi, với chiều rộng khoảng 25nm. Các vi sợi này được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công của ezyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân. [9]

Hình 2-2 Mối quan hệ cellulose – hemicellulose trong cấu trúc lignocellulose

2.1.2 Cellulose

Cellulose là một polymer mạch thẳng của D-glucose, các D-glucose được liên kết với nhau bằng liên kết β 1-4 glucosid. Cellulose là loại polymer phổ biến nhất trên trái đất, độ trùng hợp đạt được 3.500 – 10.000 DP [9]. Các nhóm OH ở hai đầu mạch có tính chất


7

hoàn toàn khác nhau, cấu trúc hemiacetal tại C1 có tính khử, trong khi đó OH tại C4 có tính chất của rượu. [2]

Hình 2-3 Công thức hóa học của cellulose

Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định hình. Trong vùng kết tinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tấn công [9]. Có hai kiểu cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng kết tinh và vô định hình. [10]

Hình 2-4 Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain

1/ Kiểu Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định hướng theo chìều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với vùng vô định hình.


8

2/ Kiểu Folding chain: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b như trên hình vẽ. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên kết β - glucosid giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180o cho toàn mạch. Vùng vô định hình sẽ dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β - glucosid) sẽ làm giảm độ bền nhiệt động của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro. [4]

Cellulose được bao bọc bởi hemicellulos và lignin, điều này làm cho cellulose khá bền vững với tác động của enzyme cũng như hóa chất.

2.1.3 Hemicellulose

Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 đến 200 DP. Hemicellulose chứa cả đường 6 gồm glucose, mannose và galactose và đường 5 gồm xylose và arabinose. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β - D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β -(1,4).

Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung gồm:

• Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(1,4).

• Xylose là thành phần quan trọng nhất.

• Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3.

• Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này. Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định hình và vì thế dễ bị thủy phân.

Gỗ cứng, gỗ mềm và nguyên liệu phi gỗ có các đặc điểm hemicellulose khác nhau:

Gỗ cứng chủ yếu có hai loại hemicellulose:

• Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan, là một loại polymer có mạch chính gồm β-D-xylopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-D (1,4). Trong đó 70% các nhóm OH ở vị trí C2 và C3 bị acetyl hóa, 10% các nhóm ở vị trí C2 liên kết với acid 4-


9

O-methyl-D-glucuronic. Gỗ cứng còn chứa glucomannan, polymer này chứa một tỉ lệ bằng nhau β-D-glucopyranose và β-D-mannopyranose. [9]

Hình 2-5 Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan

Hình 2-6 Glucomannan

• Loại thứ hai có mạch chính là β-D-galactopyranose, phân nhánh. Loại hemicellulose này tạo liên kết –O tại nhóm OH ở vị trí C6 với α-L-arabinose, β-D-galactose hoặc acid β-D-glucoronic. [9]

Gỗ mềm cũng bao gồm hai loại hemicellulose chính:

• Loại quan trọng nhất là galactoglucomannan, đây là polymer cấu thành từ các phân tử D-mannopyranose liên kết với D-glucopyranose bằng liên kết β-(1,4) với tỉ lệ hai monomer tương ứng là 3:1. Tuy nhiên, tỉ lệ này thay đổi tùy theo loại gỗ[9].

Hình 2-7 Galactoglucomannan


10

• Arabino-4-O-methylglucuronoxylan, cấu tạo từ các D-xylopyranose, các monomer này bị thế ở vị trí 2 bằng acid 4-O-methyl-glucuronic, ở vị trí 3 bằng α-L-arabinofuranose. [9]

Đối với cỏ, 20 – 40% hemicellulose là arabinoxylan. Polysaccharide này cấu tạo từ các D-xylopyranose, OH ở C2 bị thế bởi acid 4-O-methylglucuronic. OH ở vị trí C3 sẽ tạo mạch nhánh với α-L-arabinofuranose. [9]

Hình 2-8 Arabinoglucuronoxylan

Cấu tạo phức tạp của hemicellolose tạo nên nhiều tính chất hóa sinh và lý sinh cho cây.

2.1.4 Lignin

Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở. Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose. Rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn.

Lignin là polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình được đề nghị là: guaiacyl (G), chất gốc là rượu trans-coniferyl; syringly (S), chất gốc là rượu trans-sinapyl; p-hydroxylphenyl (H), chất gốc là rượu trans-p-courmary.

Hình 2-9 Các đơn vị cơ bản của lignin


11

Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của nó trong gỗ. Ngoài việc được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể được phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringly lignin.

Gỗ mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringyl. Nghiên cứu chỉ ra rằng guaiacyl lignin hạn chế sự trương nở của xơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu đó sẽ khó bị tấn công bởi enzyme hơn syringyl lignin. [10]

Hình 2-10 Cấu trúc lignin trong gỗ mềm với các nhóm chức chính

Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lignin hoàn toàn không đồng nhất trong cấu trúc. Lignin dường như bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình thuôn hoặc hình cầu. Lignin trong tế bào thực vật bậc cao hơn không có vùng vô định hình. Các vòng phenyl trong lignin của gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế bào. Ngoài ra, cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin đều bị ảnh hưởng bởi mạng polysaccharide. Việc mô hình hóa động học phân tử cho thấy rằng nhóm hydroxyl


12

và nhóm methoxyl trong các oligomer tiền lignin sẽ tương tác với vi sợi cellulose cho dù bản chất của lignin là kỵ nước.

Nhóm chức ảnh hưởng đến hoạt tính của lignin là nhóm phenolic hydroxyl tự do, methoxy, benzylic hydroxyl, ether của benzylic với các rượu thẳng và nhóm carbonyl. Guaicyl lignin chứa nhiều nhóm phenolic hydroxyl hơn syringyl.

Lignin có liên kết hóa học với thành phần hemicellulose và ngay cả với cellulose (không nhiều) độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết và cấu trúc hóa học của lignin và những đơn vị đường tham gia liên kết [4]. Carbon alpha (Cα) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên kết cao nhất với khối hemicellulose. Ngược lại, các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin. Các liên kết có thể là ether, ester (liên kết với xylan qua acid 4-O-methyl-D-glucuronic), hay glycoxit (phản ứng giữa nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin)

Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước. Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn 200oC, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose. Những nghiên cứu trước đây cho thấy đối với gỗ cứng, nhóm ether β-O-4 aryl bị phá trong quá trình nổ hơi. Đồng thời, đối với gỗ mềm, quá trình nổ hơi làm bất hoạt các nhóm hoạt động của lignin ở vị trí α như nhóm hydroxyl hay ether, các nhóm này bị oxy hóa thành carbonyl hoặc tạo cation benzylic, cation này sẽ tiếp tục tạo liên kết C-C.[10]

2.1.5 Các chất trích ly

Có rất nhiều chất thuộc nhóm thành phần này, chủ yếu là các chất dễ hòa tan. Theo định nghĩa khái quát trong sách “Kĩ thuật cellulose và giấy” ở trang 64, các chất trích ly là những chất hoặc có khả năng hòa tan trong những dung môi hữu cơ (như dietyl ether, methyl terbutyl ether, ether dầu hỏa, diclormethene, acetone, ethanol, methanol, hexan, toluen, terahydrofuran) hoặc trong nước. Chính vì thế phương pháp thông dụng nhất để tách nhóm chất này trong việc phân tích thành phần sơ xợi lignocellulose là dùng trích ly với dung môi ethanol-benzene tỉ lệ 1:2. Những chất này có thể có cả tính ưa dầu và ưa nước và không được xem là thành phần cấu trúc của gỗ. Chất nhựa là những chất ưa dầu, có lẽ thường chiếm tỉ lệ ưu thế trong chất trích ly, nên thường chất trích ly hay được gọi là nhựa (resin).

Các chất trích ly thường có màu, mùi và vị khá đặc trưng. Chúng rất quan trọng để giữ lại những chức năng sinh học của cây. Đa phần các chất nhựa bảo vệ gỗ khỏi những


13

tổn thương gây ra bởi vi sinh vật hay côn trùng. Terpenoid, steroid, chất béo, và những phần tử phenolic như stilbene, lignan, tanmin và flavonoid đều là những chất trích ly. Các phenolic có thuộc tính diệt nấm và ảnh hưởng đến màu của gỗ. Chất béo và sáp, trong nhiều hệ thống sinh học được tận dụng như là nguồn năng lượng trong khi terpenoid và steroid được biết đến là nhựa dầu. Nhóm cuối cùng cũng có hoạt tính kháng vi sinh vật và côn trùng. Một số chất trích ly là những dược phẩm quan trọng. Ví dụ, flavonoid được sử dụng như là chất chống tác nhân oxy hóa và chống virus. Một số cấu trúc chất trích ly được thể hiện ở những hình sau:

Hình 2-11: Một số ví dụ về chất trích ly (a) abietic acid (oleoresin); (b) cathechin

(flavonoid); (c) palmitic acid (acid béo)

2.1.6 Tro

Trong các loại gỗ của xứ ôn đới, các nguyên tố khác so với carbon, hydro, oxy và nito – chiếm khoảng 0,1-0,5% (so với lượng rắn khô trong gỗ). Với loại gỗ xứ nhiệt đới con số này có thể là 5%. Hàm lượng chất vô cơ được đo bằng hàm lượng tro của mẫu và nó trong khoảng 0,3-1,5% cho hai loại gỗ mềm và gỗ cứng. Hàm lượng này phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi trường tăng trưởng của cây và vào vị trí trong cây.

Tương tự chất trích ly, thành phần vô cơ của biomass thường thực hiện chức năng trong một vài con đường sinh học ở thực vật. Kim loại vết thường tồn tại ở dạng phức hợp như magnesium trong chlorophyll. Một số chất vô cơ từ muối kim loại tồn tại trong vách tế bào thực vật. Calcium thường là kim loại phong phú nhất, sau đó là kali và magnesium.

2.2 QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RƠM RẠ

2.2.1 Tổng quát

Sơ đồ quá trình sản xuất ethanol từ rơm rạ


14

2.2.2 Tiền xử lý

Để chuyển hóa các carbohydrate (cellulose và hemicellulose) trong lignocellulose thành ethanol, các polymer phải bị bẻ gãy thành những phân tử đường nhỏ hơn trước khi vi sinh vật có thể hoàn tất quá trình chuyển hóa. Tuy nhiên, bản chất của cellulose lại là rất bền vững trước sự tấn công của enzyme, nên bước tiền xử lý là bắt buộc để quá trình đường hóa glucose có thể diễn ra tốt. Cellulose ban đầu có thể bị phá hủy bởi acid mà không cần được tiền xử lý. Tuy nhiên, trong luận văn này chỉ đề cập đến việc thủy phân lignocellulose bằng enzyme.

Những yếu tố về cấu trúc và thành phần ảnh hưởng đến khả năng chống lại sự tấn công của enzyme của lignocellulose gồm có:

• Cấu trúc tinh thể của cellulose: cellulose tự nhiên hình thành cấu trúc tinh thể chống lại được sự tấn công của enzyme. Trong một bài báo của mình, Fan et al [9] ước tính rằng tỉ lệ cellulose tinh thể là 50-90%. Tuy nhiên, không có sự liên quan giữa mức độ tinh thể của cellulose và khả năng phân hủy enzyme đối với rơm rạ và bã mía.

Rơm rạ

Tiền xử lý

Thủy phân

Lên men

Chưng cất

Ethanol

Thủy phân và lên men đồng thời


15

• Sự bao bọc của lignin quanh cellulose: lignin cùng với hemicellulose tạo thành cấu trúc mô vững chắc cực kì. Những mô được bền hóa với lignin tương tự như nhựa được gia cố bằng sợi, trong đó lignin đóng vai trò kết dính những sợi cellulose. Trong thiên nhiên, lignin bảo vệ cellulose khỏi những tác động của môi trường và khí hậu. Lignin là yếu tố ngăn cản sự tấn công của enzyme đến cellulose được công nhận nhiều nhất. Theo [9] có nhà nghiên cứu cho rằng khả năng thủy phân của enzyme tăng khi 40-50% lignin bị tách. Tuy nhiên, phải thừa nhận rằng, không có nghiên cứu nào tiến hành loại bỏ lignin mà không kèm theo sự phân hủy hemicellulose. Ngay cả trong phương pháp tiền xử lý nguyên liệu bằng kiềm ở nhiệt độ thấp, loại bỏ được 70% lignin thì cũng có 5% hemicellulose bị hòa tan. Vì vậy, những thí nghiệm trên cũng không hoàn toàn cho thấy ảnh hưởng của việc loại bỏ lignin riêng lẻ.

• Bề mặt tiếp xúc tự do của cellulose: liên quan đến bề mặt tiếp xúc của cellulose với enzyme, và thể tích xốp. Stone et al [9] giả thiết rằng tốc độ đầu của quá trình thủy phân là hàm của bề mặt tiếp xúc tự do. Grethlein et al [9] cho rằng thể tích lỗ xốp chứ không phải độ kết tinh của cellulose mới ảnh hưởng đến tốc độ đầu. Tuy nhiên, bề mặt tiếp xúc tự do này có liên quan đến độ kết tinh và sự bảo vệ của lignin.

• Sự hiện diện của hemicellulose: cũng như lignin, hemicellulose tạo thành lớp bảo vệ xung quanh cellulose. Knappert et al [9], trong nghiên cứu xử lý bằng acid sulfuric với gỗ dương cho thấy khả năng thủy phân tăng theo tỉ lệ hemicellulose bị loại bỏ. Grohman, thí nghiệm tiền xử lý rơm lúa mì bằng acid, kết quả cho thấy việc loại bỏ hemicellulose sẽ gia tăng đáng kể khả năng thủy phân rơm rạ. Họ cho rằng, việc loại bỏ lignin là không cần thiết, tuy rằng nếu đạt được thì rất tốt. Trong khi đó, hemicellulose được chứng minh là ngăn cản quá trình tấn công của enzyme vào rơm rạ [9]. Tuy nhiên, trong những thí nghiệm này, lignin tuy không bị loại bỏ nhưng lại có thể bị đông hoặc chảy ra một phần, làm giảm khả năng bao bọc cellulose của nó. Vì thế những thí nghiệm trên chưa cho thấy được hiệu quả của việc loại bỏ riêng lẻ hemicellulose.

• Mức độ acetyl hóa của hemicelluloses: Đây là yếu tố ít được quan tâm, xylan, loại hemicellulose chính trong gỗ cứng và cây thân cỏ bị acetyl hóa với tỉ lệ rất cao. Grohmann et al [9], nghiên cứu với rơm lúa mì và cây dương, cho thấy rằng khi xylan bị deacetyl hóa, tỉ lệ cellulose bị thủy phân tăng lên 2-3 lần. Ảnh hưởng này tồn tại đến khoảng 75% hemicellulose bị deacetyl hóa.

Nói tóm lại, quá trình tiền xử lý nhằm:


16

• Tăng vùng vô định hình của cellulose

• Tăng kích thước lỗ xốp trong cấu trúc sợi biomass

• Phá vỡ sự bao bọc của lignin và hemicellulose đối với cellulose.

Sau đây là một số công nghệ tiền xử lý phổ biến:

2.2.2.1 Các phương pháp tiền xử lý hóa học:

Sử dụng tác động của hóa chất trong quá trình. Gồm có các quá trình chính:

• Với acid: gồm các phương pháp xử lý với acid loãng, bơm hơi nước có acid và nổ hơi có acid. Trong đó, acid sulfuric đã được nghiên cứu kĩ lưỡng nhất, hiển nhiên vì nó rẻ và hiệu quả. Tuy nhiên, vấn đề gặp phải trong xử lý acid là thiết bị phải chịu được ăn mòn cao và lượng thạch cao (CaSO4) sinh ra nhiều từ quá trình trung hòa acid với CaOH.

• Với kiềm: đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan, chủ yếu là về xút hoặc xút cùng các hóa chất khác. Tuy nhiên, nhiều nhà khoa học cho rằng, dựa trên chi phí hóa chất, thì vôi tôi là hóa chất thích hợp. Detroy et al cho thấy rằng amonia lỏng có phần hiệu quả trong việc tăng khả năng thủy phân bã rắn, nhưng ethylenediamine có thể còn hiệu quả hơn.

• Ngoài ra còn có những phương pháp như xử lý với dung môi hữu cơ: dùng dung môi như ethanol, methanol, acetone để hòa tan lignin; xử lý bằng khí SO2, khí CO2, NH3 … Các quy trình này hiện nay chỉ được sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm.

2.2.2.2 Các phương pháp tiền xử lý cơ học

Các phương pháp thuộc nhóm này không sử dụng hóa chất trong quá trình xử lý. Gồm các phương pháp như: nghiền nát, rọi bằng những bức xạ năng lượng cao, xử lý thủy nhiệt và nổ hơi. Trong đó phương pháp nổ hơi là phương pháp quan trọng nhất, đã được phát triển, áp dụng trên quy mô pilot và được sử dụng trong đề tài nghiên cứu này.

2.2.2.3 Nổ hơi nước (Steam explosion)

Nổ hơi nước được phát triển vào năm 1925 bởi W. H. Mason trong sản xuất gỗ ép[1]. Tiền xử lý biomass bằng nổ hơi nước được giới thiệu từ năm 1980[1]. Công ty Iotech Corporation đã tiến hành một vài thí nghiệm tiên phong để tìm hiểu ảnh hưởng của nổ hơi nước lên gỗ cây dương[1]. Iotech đã báo cáo lên bộ năng lượng Mỹ trong đó mô tả ảnh hưởng của thời gian phản ứng và áp suất lên sản lượng xylose và glucose. Iotech cho rằng ở một áp suất nhất định, với thời gian lưu khác nhau sản lượng cực đại của glucose


17

và xylose cũng khác nhau, và xylose thường đạt cực đại trước glucose. Tương tự như vậy, sản lượng cực đại của xylose và glucose được tìm thấy lớn nhất ở những áp suất khác nhau. Điều kiện phản ứng tối ưu của holocellulose (xylose + glucose) là 500 – 550 psi trong thời gian 40 giây.[1]

Đã có vài nghiên cứu ứng dụng nổ hơi cho các loại nguyên liệu biomass sau khi báo cáo của Iotech được trình bày. Shultz et al [1] so sánh hiệu quả của nổ hơi lên hỗn hợp các mảnh gỗ cứng, vỏ trấu, rơm bắp, và bã mía. Nổ hơi ở 240 – 2500C và 1 phút sẽ làm gia tăng tốc độ thủy phân enzyme của các mảnh gỗ cứng, vỏ trấu, và bã mía lên ngang bằng với tốc độ thủy phân giấy lọc. Nghiên cứu cũng tìm thấy không có sự khác nhau về tốc độ thủy phân của mẫu đã trữ trong 8 tháng trước với tốc độ thủy phân của mẫu được trữ trong thời gian ngắn hơn.

Martinez et al [1] sử dụng Onopordum nervosum và Cyanara cardunculus làm nguyên liệu. Hiệu quả đường hóa (lượng glucose giải phóng ra sau 48 giờ thủy phân enzyme/lượng glucose cực đại trên cơ chất) đạt được trên 90% đối với O. nervosum ở 2300C, 1 – 2 phút và C. cardunculus ở 2100C, 2 – 4 phút.

Theo luận văn cao học của thầy Trịnh Hoài Thanh [6], thời gian xử lý và nhiệt độ xử lý đối với rơm rạ càng tăng thì lượng bã thu hồi được càng giảm. Khi xem xét ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý đối với lượng đường có khả năng lên men, nhiệt độ xử lý ở mức độ vừa phải sẽ làm tăng khả năng thủy phân, tăng lượng đường và do đó sẽ làm tăng lượng cồn thu được. Điều này có thể được giải thích là do sự đề – lignin hóa do tác động của nhiệt độ và sự phân hủy của hemicellulose làm giải phóng và gia tăng kích thước lỗ xốp. Tuy nhiên khi nhiệt độ xử lý cao hơn 210oC, lượng đường thu được do thủy phân có xu hướng giảm xuống vì cellulose bị phân hủy. Theo [6], khi thời gian xử lý tăng thì lượng đường có khả năng lên men được tăng do khả năng tấn công vào cellulose đã được cải thiện.

Cơ chế quá trình nổ hơi nước

Hình 2-12 Mô tả cơ chế quá trình nổ hơi


18

Quá trình nổ hơi nước là một quá trình cơ – hóa – nhiệt. Đó là phá vỡ cấu trúc các hợp phần với sự giúp đỡ của nhiệt ở dạng hơi (nhiệt), lực cắt do sự giãn nở của ẩm (cơ), và thủy phân các liên kết glycosidic (hóa).

Trong thiết bị phản ứng, nước dưới áp suất cao thâm nhập vào cấu trúc lignocellulosic bởi quá trình khuếch tán và làm ẩm nguyên liệu. Ẩm trong biomass thủy phân các nhóm acetyl của hemicellulose hình thành nên các acid hữu cơ như acetic và uronic acid. Các acid này lần lượt xúc tác quá trình depolymer hóa hemicellulose, giải phóng xylan và một phần glucan. Dưới điều kiện khắc nghiệt, vùng vô định hình của cellulose có thể bị thủy phân đến một mức độ nào đó. Dưới điều kiện khắc nghiệt hơn, ví dụ như nhiệt độ cao và áp suất cao, có thể thúc đẩy sự phân hủy xylose thành furfural và glucose thành 5-hydroxymethyl furfural. Furfural và 5-hydroxylmethyl furfural kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật, do đó nó không thuận lợi cho quá trình lên men [12].

Hình 2-13 Fufural

Hình 2-14 Hydroxymethyl fufural

Ẩm trong biomass sẽ hóa hơi đột ngột ra khi áp suất trong thiết bị phản ứng được giải phóng và hạ đột ngột từ rất cao khoảng vài chục atm xuống còn áp suất khí trời. Hiện tượng này cũng giống như hiện tượng nổ. Nguyên liệu được tống mạnh khỏi thiết bị qua một lỗ nhỏ bởi lực ép. Một vài hiện tượng xảy ra tại thời điểm này. Đầu tiên, ẩm ngưng tụ trong cấu trúc biomass bốc hơi tức thời do giảm áp đột ngột. Sự giãn nở của hơi nước gây ra lực cắt bao quanh cấu trúc nguyên liệu. Nếu lực cắt này đủ lớn, hơi nước sẽ gây ra sự phá hủy cơ học lên cấu trúc lignocellulosic. Hình 2-14 mô tả cơ chế quá trình nổ hơi. Hình 2-15 mô tả sự giải phóng cellulose khỏi vỏ bọc lignin. Hình 2-16 mô tả khả năng làm tăng kích thước lỗ xốp trong xơ sợi. Sự mô tả quá trình làm nổi bật tầm quan trọng của việc tối ưu hai yếu tố: thời gian lưu và nhiệt độ. Thời gian biomass lưu lại trong thiết bị phản ứng giúp xác định phạm vi thủy phân hemicellulose bởi các acid hữu cơ. Việc thủy phân hemicellulose giúp cho quá trình lên men thuận lợi hơn. Tuy nhiên, thời gian lưu dài cũng làm gia tăng sự phân hủy sản phẩm.


19

Hình 2-15: Cấu trúc sợi trước và sau khi nổ hơi, bó sợi cellulose được giải phóng ra khỏi

lớp lignin bảo vệ sau khi nổ hơi

Hình 2-16: (d) sợi lignocellulose không nổ hơi có cấu trúc sít chặt ngăn cản sự tấn công

của enzyme, (e) nổ hơi ở 4atm, (f) nổ hơi ở 8atm

Nhiệt độ có liên quan đến áp suất hơi trong thiết bị phản ứng. Nhiệt độ càng cao thì áp suất càng cao, do đó càng làm gia tăng sự khác nhau giữa áp suất trong thiết bị phản ứng so với áp suất khí quyển. Sự chênh lệch về áp suất tỷ lệ với lực cắt của ẩm hóa hơi.

Ưu nhược điểm của quá trình nổ hơi nước:

Tóm tắt lại, theo quá trình nổ hơi nước có mấy tác động sau lên cấu trúc nguyên liệu lignocellulose

1. Tăng sự kết tinh của cellulose bằng cách thúc đẩy sự kết tinh của vùng vô định hình.

2. Hemicellulose bị thủy phân trong quá trình nổ hơi.

3. Sự nổ hơi thúc đẩy việc khử lignin.


20

Cùng với việc gia tăng kích thước lỗ xốp, tác động (2) và (3) là 3 ưu điểm của quá trình nổ hơi. Tuy nhiên, tác động (1) lại gây ra khó khăn cho quá trình thủy phân. Ngoài ra những nhược điểm chính của quá trình nổ hơi là:

• Tốn chi phí, năng lượng vận hành.

• Đòi hỏi thiết bị chịu được nhiệt độ, áp suất rất cao.

• Có thể làm phân hủy cellulose.

• Mất đi đường từ hemicellulose.

• Làm sinh ra fufural và 5-hydroxymethyl fufural gây ức chế quá trình lên men [12]

2.2.3 Thủy phân

Phương trình phản ứng

612625106 )( OHnCOnHOHC enzymen ⎯⎯ →⎯+

2.2.3.1 Ezyme cellulase

a) Khái niệm

Cellulase là một loại enzyme, có thể được sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn hoặc sinh vật đơn bào; có khả năng thủy phân cellulose và cả hemicellulose. Ký hiệu là EC 3.2.1.4

b) Yêu cầu đối với cellulase

Sự phát triển của quá trình chuyển hóa biomass – một nguồn nguyên liệu thô, ít giá trị, thành ethanol thông qua quá trình lên men đặt ra yêu cầu một số bước đặc biệt là việc sản xuất enzyme cellulase cần phải được tối ưu. Sản xuất cellulase quan trọng vì việc thủy phân cellulose có hiệu quả cần một lượng lớn enzyme cellulase (1kg cellulase cho 50 kg cellulose). Giá của enzyme này khá cao từ 0,3 đến 0,81 dollar/gam [9]. Quá trình sản xuất cellulase gặp hai vấn đề chính: sự sinh trưởng và phát triển chậm của nấm mốc và quá trình tách cellulase ra khỏi nấm mốc tốn rất nhiều thời gian. Để quá trình sản xuất ethanol có thể được xây dựng với quy mô lớn, vấn đề được đặt ra là hoạt tính của enzyme cellulase phải cao hơn loại enzyme đang được sản xuất từ nấm mốc. Hiện nay, yêu cầu cụ thể đặt ra với enzyme là cellulase phải có giá thành rẻ, hoạt tính đặc hiệu cao, độ ổn định cao, chịu được pH và nhiệt độ.

netbook

Highlight


21

c) Nhóm enzyme cellulase

Mặc dù phổ biến trên trái đất, cellulose lại rất bền vững và khó bị phá vỡ vì cellulose có độ kết tinh cao, không tan trong nước, có khả năng chống lại các quá trình depolymer hóa. Quá trình thủy phân cellulose tạo thành glucose được thực hiện nhờ sự tác dụng hiệp đồng của 3 enzyme khác nhau

• “Endo-1,4-β-glucanases” (EG) hay 1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolases (EC 3.2.1.4), enzyme này sẽ tấn công ngẫu nhiên vào các cơ chất 1,4-β-glucan cả tan và không tan.

• “Exo -1,4-β-D-glucanases” bao gồm 1,4-β-D-glucan glucohydrolase (EC 3.2.1.74), enzyme này có tác dụng giải phóng D-glucose từ 1,4-β-D-glucan và thủy phân chậm D-cellobiose; ngoài ra còn có enzyme 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) (CBH), enzyme này sẽ giải phóng cellobiose từ 1,4-β-glucan.

• “β-D-glucosidase” hay còn gọi là β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) có tác dụng tạo thành D-glucose từ celobiose là cellodextrin, cũng như các olygomer của glucose.

Hình 2-17 Tác dụng của từng enzyme trong cellulase


22

Nhóm enzyme endo và exo thường được gọi chung là enzyme cellulase, còn β-glucosidase do có cấu trúc khác và cơ chế khác nên được tách thành nhóm riêng. Tuy nhiên trong luận văn này, để tiện việc trình bày nên gọi chung nhóm 3 enzyme này là cellulase.

d) Các nguồn sản xuất cellulase.

Người ta thống kê được có hơn 60 loại nấm mốc có khả năng tạo cellulase, gồm có các loại chính là soft-rot, brown-rot và white-rot. Các loại nấm mốc thuộc nhóm cuối cùng (white-rot) có thể phân hủy cả cellulose và lignin. Nhiều nghiên cứu vẫn đang được tiến hành đối với việc sản xuất cellulase từ vi khuẩn. Gần đây, Coughlan và Ljungdahl trong nghiên cứu của mình [9] đã tìm được 46 loại vi khuẩn có khả năng sản xuất cellulase . Các vi khuẩn này có khả năng phân hủy cellulose cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Nhóm kỵ khí điển hình bao gồm các giống acetivibrio, bacteroides, clostridium, micromonospora và ruminococcus. Nhóm hiếu khí bao gồm các giống Acidothermus, Bacillus, cellulomonas, cellvibrio, cytophaga, Microbispora, Pseudomonas và Thermomonospora.

e) Cấu trúc enzyme cellulase

Trong những năm 1970, nhờ những phát triển trong lĩnh vực hóa sinh và sinh học phân tử, người ta có thể nghiên cứu được cấu trúc của cellulase thông qua giống nấm mốc Trichoderma reesi. Đây là chủng nấm mốc phổ biến sản sinh ra enzyme cellulase.

Vào cuối những năm 1980, Abuja et al [17,18] đã đề nghị cấu trúc bậc 3 của Trichoderma reesei CBH I (enzyme thủy phân cellobiose I – cellobiohydrolase I) và CBH II. Trong đó, enzyme gồm:

• Trung tâm xúc tác (CD: catalytic domain) với kích thước lớn

• Trung tâm tạo liên kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain) có kích thước nhỏ hơn. Nghiên cứu cấu trúc của trung tâm tạo liên kết với cellulose CBD của CBH I cho thấy đây là một chuỗi polypeptide gồm có 36 amino acid và có một mặt thể hiện tính chất kỵ nước mạnh. Về mặt lý thuyết, có thể kết luận rằng CBD có vai trò quan trọng trong việc ổn định sự liên kết tạm thời giữa cellulase và bề mặt cellulose. Trên bề mặt cellulose có vùng kỵ nước là do sự sắp xếp chặt chẽ và do liên kết hydrogen mạnh giữa các mạch cellulose, góp phần ngăn cản, không cho các phân tử lớn như nước xâm nhập vào cấu trúc này. Chính tương tác giữa hai


23

vùng có tính chất kỵ nước của cellulose và CBD mà enzyme được liên kết với cellulose.

• Cầu nối peptide: có tác dụng liên kết hai trung tâm này lại với nhau. Đối với enzyme cellulase, cầu nối peptide là một vùng ái đường, được cấu tạo bởi các amino acid serine, threonin và proline.

Serine Threonine Proline Đối với T. reesei CBH II, lõi protein có tác dụng phá vỡ cấu trúc vi sợi của cellulose.

Sản phẩm thủy phân của CHB I giữ nguyên cấu trúc lập thể của C1(C chứa nhóm OH hemiacetal), trong khi đó CBH II tạo sự nghịch đảo cấu hình của C1 thành đồng phân α.

Cellulase có nguồn gốc từ các giống nấm mốc khác cũng như từ vi khuẩn đều có cấu trúc tương tự.

2.2.3.2 Cơ chế quá trình thủy phân

Quá trình tác dụng thủy phân của cellulase có thể chia thành những giai đoạn sau

a) Quá trình hấp phụ enzyme lên xơ sợi

Có hai yếu tố quyết định năng lượng hấp phụ của protein lên bề mặt phân pha rắn/lỏng là bản chất của bề mặt và lực liên kết giữa các phân tử. Những tương tác này thường không mang bản chất cộng hóa trị, nói cách khác, các tương tác này thường tạo thành do liên kết hydro, lực tĩnh điện hoặc là tương tác giữa các nhóm kỵ nước. Các phân tử protein hay các ion khối lượng phân tử thấp đã hấp phụ trước trên bề mặt sẽ có ảnh hưởng đến sự hấp phụ mới. Lực tĩnh điện góp phần vào việc hấp phụ của protein (enzyme) lên bề mặt phân pha, tuy nhiên không phải là yếu tố quyết định quá trình hấp phụ của protein.

Protein là một polymer lưỡng cực, chứa cả điện tích dương và âm, điều này làm cho protein có bản chất của một phân tử hoạt động bề mặt. Phần kỵ nước trong phân tử protein là những nhóm chứa nhân thơm như trong tryptophane, phenylalanine và tyrosine.


24

Thông thường, khi phân tử protein bị gấp khúc, các aminoacid mang nhóm kỵ nước sẽ được giấu vào bên trong. Tuy nhiên, cũng có một vài phần kỵ nước được sắp xếp tại bề mặt ngoài của phân tử protein. Chính các phần này tạo liên kết với các cơ chất mang bản chất kỵ nước nhờ vào tương tác giữa các phần kỵ nước và liên kết hydro. Ái lực của protein sẽ tăng khi bản chất kỵ nước trong phân tử protein tăng mặc dù điều này sẽ ảnh hưởng tới tương tác tĩnh điện. Một cách tổng quát, sự hấp phụ của phân tử protein lên bề mặt kỵ nước là bất thuận nghịch hơn sự hấp phụ lên bề mặt ưa nước. Điều này bởi vì phân tử protein sẽ có một vài thay đổi một khi đã hấp phụ lên bề mặt kỵ nước.

Bề mặt cellulose mang bản chất kỵ nước do giữa các mạch tạo liên kết hydro (không còn nhóm phân cực tự do). Cellulose tinh khiết không chứa nhóm mang điện. Trong thực tế, điện tích bề mặt của các chất sẽ được tạo thành khi có sự phân bố các ion từ bề mặt đó. Ví dụ các bề mặt tiếp xúc với nước thường mang điện âm. Các nghiên cứu về quá trình tiền xử lý – nổ hơi cho thấy sau quá trình này, tính chất kỵ nước của cơ chất (được đo bằng thời gian giọt nước thấm vào vật liệu Water drop penetration time WDPT) tăng.

Tùy thuộc vào tính chất của protein và bề mặt hấp phụ mà tương tác điện tích – địên tích hay tương tác của các nhóm kỵ nước sẽ đóng vai trò quyết định cho quá trình . Ví dụ trong một nghiên cứu về enzyme protease, khi thay đổi một nhóm ưa nước mang điện tích dương - lysine bằng một amino acid kỵ nước, không mang điện – phenylalanine, người ta nhận thấy khả năng hấp phụ của enzyme này lên bề mặt ưa nước cũng như kỵ nước đều giảm. Điều này cho phép kết luận, trong trường hợp của protease, lực tương tác tĩnh điện có tác dụng chủ yếu đối với quá trình hấp phụ của enzyme.

Điện tích của cellulase và sự hiện diện của nhóm không phân cực có thể dẫn đến sự hấp phụ không chọn lọc lên cả cellulose và lignin. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cellulase hấp phụ lên cả lignin trong vật liệu lignocellulose. Ngoài ra, đối với β-glucosidase không giống các enzyme cellulase khác, không có trung tâm tạo liên kết CBD, enzyme này hấp phụ khá mạnh lên lignin đã được tách riêng.

Rất cần thiết hạn chế tối đa việc hấp phụ không chọn lọc của cellulase lên lignin nếu muốn ứng dụng quá trình thủy phân enzyme một cách kinh tế. Về mặt lý thuyết, công nghệ protein có thể làm thay đổi cấu trúc của cellulase để làm cho enzyme này hấp phụ chọn lọc hơn. Tuy nhiên, khả năng hấp phụ của cellulase lên vùng cellulose kết tinh là yếu tố quan trọng trong quá trình thủy phân, vì vậy các tác động lên cấu trúc cần được tránh. Hiện tại, vẫn chưa có nghiên cứu nào thành công trong việc thay đổi chuỗi amino acid của cellulase để làm cho enzyme này thủy phân vật liệu lignocellulose hiệu quả hơn.


25

b) Quá trình tạo liên kết giữa cellulase và cellulose

Hình 2-18 Quá trình tác động của cellobiohydrolase lên đầu vùng kết tinh của cellulose.

Hình 2-18 mô tả liên kết của CBH với cellulose. Trung tâm tạo liên kết của cellulase làm phá hủy một phần cấu trúc chặt chẽ của các mạch cellulose. Sau đó, các mạch này sẽ được dẫn vào vùng trung tâm hoạt động của cellulase. Quá trình dẫn này xảy ra nhờ sự hiện diện của mạch peptide ưa nước, khu vực này sẽ tạo các liên kết hydro bao bọc sợi cellulose, nhằm tránh sự xâm nhập quá sâu của CBD vào bề mặt cellulose.

Cellulase tương tác với bề mặt cellulose thông qua trung tâm liên kết cellulose CBD và trung tâm hoạt động chính CD. Cellulase tạo được liên kết với cellulose là nhờ vào trung tâm tạo liên kết CBD. Đối với các chủng T. reesi, CBD là trung tâm gồm các phân tử nhỏ, gồm 36 amino acid. Thông thường, trung tâm liên kết có 3 amino acid tyrosine, chịu trách nhiệm cho việc liên kết với cellulose. Trong CBH I, một tyrosine bị thay bằng tryptophane.

Khác biệt trong cấu trúc của các loại enzyme (CBH I, CBH II, EG …) sẽ dẫn đến ái lực khác nhau trong quá trình hấp phụ của các enzyme này lên cơ chất. Đã có nhiều nghiên cứu về cấu trúc của các enzyme và sự liên hệ đến khả năng tạo liên kết với cellulose. Cụ thể số lượng các amino acid có tính không phân cực cao (tyrosine, phenylalanine, tryptophan) nằm trong trung tâm hoạt động là bằng nhau đối với CBH I và CBH II ( 5 và 6 nhóm). Trong khi đó, số lượng các amino acid không phân cực trong trung tâm hoạt động của CBH II cao hơn. Điện tích bề mặt của các enzyme cũng rất khác biệt. Ví dụ, đối với trung tâm tạo liên kết CBD, CBH II có thể có tương tác tĩnh điện vì có


26

aspartic acid ở vị trí 30, trong khi đó CBH I và EGII không có tính chất này vì ở vị trí 30 là proline

Tyrosine Phenylalanin Tryptophan Acid aspartic

Quá trình hấp phụ của CBH I không bị ảnh hưởng của liên kết tĩnh điện giữa bề mặt cơ chất và enzyme. Ngược lại, CBH II có chịu ảnh hưởng của lực tĩnh điện.

c) Cơ chế tác động hiệp đồng của các enzyme.

Từ những năm 1954, Gilligan và Reese đã chỉ ra rằng việc pha trộn cellulose từ các nguồn nấm mốc khác nhau có thể làm tăng lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy phân. Từ lúc đó, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm mô tả quá trình tác động hiệp đồng của các enzyme endo, exo cellulase.

Hình 2-19 Cơ chế tác động hiệp đồng của enzyme exo-endo và endo-endo. Enzyme

endoglucanase tấn công ngẫu nhiên vào cellulose và tạo cơ chất thích hợp cho enzyme exoglucanase và sau đó khuếch tán nhanh ra khỏi bề mặt. Exoglucanse có thể tấn công từ

đầu đường khử và không khử.


27

Nghiên cứu về tác động hiệp đồng của endo-exo công bố đầu tiên vào năm 1980. Khái niệm endo-exo được mô tả trong hình 2-19. Sự tác động hiệp đồng của endo-exo có thể nói là nhằm mục đích tạo bề mặt tấn công mới cho exoglucanse. Enzyme exo thường tấn công vào những cellulose đã bị cắt mạch (cellodextrin) có đầu là nhóm khử (C chứa OH hemiacetal) hoặc không khử. Trong khi đó, enzyme endo lại tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cellulose, tạo thành các cellodextrin, là các cơ chất thích hợp của enzyme exo. Exoglucanase có những loại enzyme tấn công đặc trưng tùy theo tính chất khử được hay không khử được của nhóm đầu mạch. Thật vậy, theo những nghiên cứu của Teeri và cộng sự, nhóm khử đầu mạch của cellodextrin sẽ được định hướng vào trung tâm xúc tác của CBH I. Trong khi đó, CBH II lại ưu tiên tấn công vào đầu không có nhóm khử của cellodextrin.

Ngoài ra, cũng có nhiều nghiên cứu về sự tác động hiệp đồng của các enzyme endo, exo có nguồn gốc nấm mốc và vi khuẩn. Dựa trên các nghiên cứu này, enzyme celluase có thể được pha trộn với các thành phần từ các nguồn khác nhau nhằm tạo được một hệ enzyme có tác động mong muốn.

TÓM TẮT Quá trình thủy phân có thể được tóm tắt trong hình sau

Hình 2-20 Cơ chế quá trình thủy phân


28

• Enzyme endo-cellulase tấn công ngẫu nhiên vào mạch cellulose nhờ tạo liên kết bằng tương tác giữa CBD với cellulose, tạo thành các oligosaccharide.

• Enzyme exo – cellulase tấn công vào cellulose và cả oligomer từ đầu đường khử và không khử thông qua tường tác của CBD với cellulose, tạo thành cellobiose, cả glucose.

• β-glucosidase tấn công cellobiose và oligosaccharide tan, tạo glucose.

2.2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng quá trình thủy phân.

a) Ảnh hưởng của cấu trúc nguyên liệu

Cấu trúc tự nhiên của lignocellulose tạo ra nhiều cản trở đến quá trình tấn công của các tác nhân thủy phân. Ngay cả quá trình thủy phân cellulose tinh khiết, tốc độ thủy phân cũng giảm theo thời gian. Tốc độ phản ứng giảm dần theo thời gian vì một số lý do sau: sự ức chế enzyme do sản phẩm, sự giảm của các phần cơ chất dễ thủy phân, enzyme bị bất hoạt hoặc bị giữ lại trong các lỗ xốp của cellulose.

Hiệu suất quá trình thủy phân bị ảnh hưởng mạnh bởi tính chất của nguồn nguyên liệu. Một cách tổng quát, gỗ mềm thường khó thủy phân hơn gỗ cứng. Cấu trúc của nguyên liệu và cơ chế tác động của enxyme và cơ chất là hai yếu tố chính làm hạn chế hiệu suất quá trình thủy phân.

Khả năng tiếp cận vật liệu lignocellulosic của cellulase đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân. Cellulose có bề mặt trong và ngoài, bề mặt ngoài bao gồm bề mặt bao quanh các xơ sợi, bề mặt trong là bề mặt do các mao quản bên tron xơ sợi tạo thành. Nếu cellulose không được tiền xử lý, hiệu quả thủy phân thấp. Xử lý loại bỏ hemicelluose (bằng tiền xử lý acid) sẽ làm tăng khả năng thủy phân cellulose (theo nghiên cứu của Grohmann). Grethlein đã giải thích rằng loại bỏ hemicellulose sẽ làm tăng cấu trúc xốp đồng thời tăng bề mặt cellulose, làm cho enzyme dễ tấn công hơn. Kích thước của các lỗ xốp lại liên quan đến độ trương nở của vật lịêu. Thật vậy, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, khi làm khô vật liệu lignocellulose, các mao quản sẽ bị mất đi, điều này làm giảm kích thước lỗ xốp và vì vậy hiệu suất quá trình thủy phân giảm rõ rệt. Hàm lượng và sự phân bố của lignin trong cấu trúc vật liệu có ảnh hưởng tới khả năng thủy phân của vật liệu đó. Hiệu suất thủy phân thu được khá cao đối với các nguyên lịêu đã được loại bỏ gần hết lignin.


29

b) Ảnh hưởng của nhiệt độ

Giống như nhiều phản ứng enzyme khác, phản ứng thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt độ. Tốc độ phản ứng thủy phân tăng theo nhiệt độ, tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất định, tốc độ phản ứng sẽ giảm dần và đến mức triệt tiêu.

Hình 2-21 Tốc độ phản ứng enzyme theo nhiệt độ

Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 – 50 oC. Riêng đối với enzyme cellulase, nhiệt độ tối ưu là 50oC. Những enzyme khác nhau đều có nhiệt độ tối ưu khác nhau.

Nếu đưa nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi hoạt tính.

Ngược lại khi ở nhiệt độ 0oC, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ, hoạt tính của enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu.

Khi nhiệt độ cao thường gây cho enzyme mất hoạt tính. Phản ứng vô hoạt của enzyme dưới tác dụng của nhiệt thường biểu diễn là phản ứng bậc một.

ktEE

o

−==][][ln

Trong đó – k – hằng số vận tốc phản ứng.

E – nồng độ enzyme hoạt động ở thời điểm t

Eo – nồng độ ban đầu của enzyme hoạt động


30

c) Ảnh hưởng của pH

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme. Ảnh hưởng đó được trình bày trong hình

Hình 2-22 Ảnh hưởng của pH

Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở môi trường acid yếu. Một số enzyme khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid. Đối với enzyme cellulase, khoảng pH thích hợp là 4-5, trong đó tốt nhất là 4.8.

d) Nồng độ enzyme

Hình 2-23 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Khi nồng độ enzyme tăng, tốc độ phản ứng tăng theo đường thẳng. Tuy nhiên, khi nồng độ enzyme đạt đến một ngưỡng nào đó, nồng độ cơ chất sẽ trở thành yếu tố hạn chế tốc độ phản ứng. Khi đó, tốc độ phản ứng sẽ không tăng nữa mà là một đường nằm ngang như trong hình vẽ.


31

e) Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Hình 2-24 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng enzyme tăng, vì sẽ có nhiều cơ chất va chạm với enzyme tiến hành phản ứng. Khi nồng độ cơ chất đủ lớn, các enzyme bị bão hòa cơ chất, vì vậy, tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng sẽ không thay đổi đáng kể.

f) Ảnh hưởng của các chất kìm hãm

Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng.

Các chất gây kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm các ion, các phần tử vô cơ, các chất hữu cơ và cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào sinh vật.

Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng giữa enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được cân bằng.

EIIEk

k↔+

1

2

trong đó E – enzyme, I – chất kìm hãm

k1, k2 hằng số vận tốc phản ứng thuận nghịch.

Trong trường hợp phản ứng ức chế là không thuận nghịch, hằng số k2 sẽ rất nhỏ và không đáng kể. Ở đây, các chất kìm hãm kết hợp với enzyme bằng liên kết cộng hóa trị. Ngoài ra các chất kìm hãm còn kết hợp với enzyme bằng một cơ chế khác mà đến nay các


32

nhà khoa học vẫn chưa giải thích một cách trọn vẹn. Theo đó, các chất kìm hãm gắn rất chặt vào enzyme, tạo thành phức hợp EI. Phức hợp này bị phân rã rất chậm.

Tùy thuộc vào bản chất phức EI, bản chất chất kìm hãm người ta chia ra những chất kìm hãm:

• Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch. Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Khi đó chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động và vì vậy, cơ chất không còn cơ hội tiếp cận với trung tâm này. Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm hoạt động làm giảm số lượng các enzyme kết hợp với cơ chất. Kết quả là hoạt động của enzyme sẽ giảm.

• Chất kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt động của enzyme mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả sự kết hợp này, chất kìm hãm làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác. Vì thế các chất kìm hãm làm giảm hoạt động của enzyme.

Các chất kìm hãm không cạnh tranh thường gồm hai loại: kìm hãm do sản phẩm phản ứng và kìm hãm do thừa cơ chất.

Hình 2-25 Chất kìm hãm cạnh tranh

Hình 2-26 Chất kìm hãm không cạnh tranh

Đối với enzyme cellulase, người ta nhận thấy, sản phẩm của phản ứng thủy phân, bao gồm cả cellobiose và glucose đều có tác động kìm hãm hoạt tính của cellulase, đặc biệt là cellobiose.


33

2.2.4 Lên men

2.2.4.1 Cơ sở lý thuyết

Lý thuyết quá trình lên men đã được nhiều nhà sinh học nghiên cứu từ rất lâu. Năm 1769, Lavoisier phân tích sản phẩm lên men rượu và nhận thấy khi lên men, đường không chỉ tạo thành ethanol và CO2 mà còn tạo ra acid acetic.

Năm 1810, Gay-Lussac nhận thấy rằng cứ 45 phần khối lượng đường sẽ chuyển thành 23 phần ethanol và 22 phần khí carbonic. Trên cơ sở đó ông đưa ra phương trình tổng quát như sau:

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + Q

Năm 1857, Louis Pasteur tiếp tục nghiên cứu và thu nhận kết quả sau: cứ 100 phần đường saccharose khi lên men sẽ tạo ra 51.1 phần ethanol, 48.4 phần CO2, 32.0 phần glycerin, 0.7 phần acid succinic và hai phần các sản phẩm khác. Từ đó suy ra cứ 45 phần khối lượng glucose khi lên men sẽ tạo ra 21.8 phần ethanol chứ không phải 23 phần như Gay-Lussac đã tính. Tuy nhiên phương trình lên men do Gay-Lussac đưa ra vẫn đúng và dùng làm cơ sở lý thuyết để tính hiệu suất thu hồi rượu theo lý thuyết. Gay-Lussac còn kết luận sự lên men là quá trình sinh học có liên hệ mật thiết đến sự hoạt động của tế bào nấm men.

Vào khoảng 1871-1872 Manaxemi đem nghiền tế bào nấm men với cát thạch anh rồi mới cho vào lên men dịch đường thì hiện tượng lên men vẫn xảy ra.Năm 1879, Buchuer tiến hành nghiền nát tế bào nấm men rồi chiết lấy dịch trong không chứa xác nấm men rồi cho vào dịch đường thì thấy dịch chiết vẫn có khả năng lên men. Từ đó người ta gọi các chất trong dịch tế bào nấm men là zymase. Đây chính là hợp chất của nhiều enzyme cùng tham gia chuyển hóa đường thành ethanol và khí carbonic [1].

Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử. Quá trình oxy hóa này lại xảy ra trong cơ thể sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme, cho nên người ta gọi quá trình lên men là quá trình oxy hóa sinh học.

Sự tạo thành rượu từ glucose phải trải qua nhiều giai đoạn, sơ đồ hình thành rượu từ glucose được biễu diễn ở hình 2.27


34

Hình 2-27: Quá trình đường phân


35

Sau đó, pyruvate sẽ chuyển thành ethanol theo các phương trình sau:

CH3 C COOH

OCH3CHO

-CO2

pyruvat decarbonxylase

CH3CHO C2H5OHalcol- dehydrogenase

NADH + H+NAD+

2.2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

a) Nhiệt độ

Mỗi vi sinh vật đều có một khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 28-320C. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm vi sinh vật như vi khuẩn lactic và nấm men hoang dại. Ở nhiệt độ 30oC, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn Saccharomyces 2-3 lần, còn ở nhiệt độ 35-38oC chúng phát triển nhanh gấp 6-8 lần. Mặt khác, khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều sản phẩm phụ như ester, aldehyd và tổn thất ethanol theo CO2 sẽ tăng.

Hình 2-28 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm men

b) pH

Nồng độ ion H+ trong canh trường ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định, trạng thái này phụ thuộc vào pH của canh truờng.


36

Trong điều kiện lên men ethanol, pH tối ưu để tạo ethanol là 4.5-5.0. Nếu pH thấp khoảng 3.0-4.0 nấm men còn hoạt động được và vi khuẩn bị ức chế. pH hơi cao hơn thì sẽ tạo ra sản phẩm có độ chua thấp, sản phẩm dễ bị nhiễm khuẩn và các sản phẩm phụ trong quá trình lên men sẽ tạo nhiều hơn, lên men có hiệu suất thấp.

c) Nồng độ của dịch lên men

Nếu nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là ethanol nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men. Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn hao nguồn nguyên liệu và phải kéo dài thời gian lên men. Mặt khác nếu nồng độ đường của dịch lên men thấp thì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men và làm cho nấm men không đủ chất dinh dưỡng để phát triển. Thông thường nồng độ dịch đường được giới hạn ở 22% khối lượng hoặc ít hơn (nếu cao hơn thành tế bào có thể bị vỡ).

d) Thời gian

Thời gian cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm. Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men,… Thời gian lên men được tính bắt đầu từ khi cấy chủng nấm men vào môi trường lên men, nhưng thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng môi trường lên men cụ thể và tùy thuộc vào mục đích lên men mà ta dừng quá trình lên men.

Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men phải cho dịch đường tiếp xúc với oxy. Lúc này nấm men cần oxy để tích lũy một lượng sinh khối cần thiết cho quá trình lên men. Tiếp theo, để chuyển hóa đường thành ethanol, nấm men phải được phát triển trong điều kiện yếm khí hoàn toàn. Vì trong môi trường này, sự hô hấp của nấm men bị ức chế và bắt đầu phải tìm năng lượng cần thiết bằng con đường lên men. Để đáp ứng năng lượng cần thiết thì nấm men cần phân hủy một lượng đường lớn và đường sẽ chuyển hóa thành ethanol và CO2. Đó là nguyên nhân muốn có ethanol nhiều thì không được thoáng khí môi trường. Nếu có oxy thì trong giai đoạn này rượu sẽ tiếp tục chuyển hóa thành acid acetic làm sản phẩm bị chua.

e) Nồng độ CO2 trong môi trường

CO2 được hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường. Một phần sẽ tồn tại trong môi trường; một phần tách lên trên bề mặt môi trường; phần còn lại tích tụ lại thành một lớp ngăn cách giữa không khí và môi trường. CO2 tích tụ lại trong môi trường chỉ làm


37

giảm khả năng sinh sản của nấm men, nhưng không thể làm cho khả năng lên men của nấm men yếu đi.

Trong môi trường có hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thoát ra ngoài, dẫn đến ức chế sinh sản của nấm men và sự lên men có hiệu suất thấp. CO2 nằm trong khoảng không giữa bề mặt môi trường và không khí có tác dụng kiềm chế sự phát triển của những vi sinh vật hiếu khí gây hại. Do vậy, các thùng lên men phải có nút đặc biệt chỉ cho phép CO2 bay ra mà không cho không khí vào.

f) Thành phần các chất dinh dưỡng của môi trường lên men

Môi trường nuôi cấy cần phải có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng chủ yếu là glucid ở dạng monosaccharide và disaccharide, nitơ ở dạng acid amin, các muối vô cơ, trừ dạng muối nitrit, nitrat, các vitamin và muối khoáng.

g) Hàm lượng giống nấm men

Nấm men là nhân tố tạo ra quá trình lên men, chuyển hóa đường thành ethanol và khí carbonic. Mỗi loài nấm men có khả năng lên men khác nhau. Cùng loài nấm men, nhưng ở những điều kiện lên men khác nhau thì khả năng lên men khác nhau và sản phẩm của quá trình lên men cũng khác nhau.

Việc bổ sung tỷ lệ giống lên men cũng phải được lựa chọn. Thông thường lượng men giống cấy vào 15 triệu tế bào/ml dịch lên men.

2.2.4.3 Các loại giống nấm men

Nấm men tiến hành lên men đường tạo thành ethanol. Lignocellulose được cấu tạo từ đường 5 và đường 6. Nấm men Saccharomyces Cerevisiae có thể lên men đường 6 (glucose) hiệu quả nhưng vẫn chưa tìm được chủng nấm men thích hợp để lên men đường 5 (xylose).

Nấm men thích hợp cho quá trình lên men cần có một số tính chất sau: hiệu suất lên men cao; chịu được ethanol; chịu được các sản phẩm phụ của quá trình thuỷ phân; lên men ở pH thấp, có thể tiêu thụ nhiều cơ chất khác nhau. Có hai chủng nấm men đang được sử dụng phổ biến:

Saccaromyces Cerevisiae là loại nấm men được sử dụng phổ biến cho lên men glucose. S.cerevisiae có các ưu điểm như: chịu được nồng độ ethanol cao, ít sản phẩm phụ, tốc độ lên men cao trong môi trường acid, chịu được acid acetic. Tuy nhiên, nấm men này không có khả năng lên men đường 5 cụ thể là không thể lên men xelose.


38

Pichia stipitis: là loại nấm men phổ biến nhất trong các chủng nấm men có thể lên men đường 5. Pichia stipitis có các ưu điểm như cho hiệu suất tiêu thụ xylopse cao, chịu được nhiệt độ và nồng độ cơ chất cao. Tuy nhiên lại bị ức chế bởi ethanol nồng độ cao.

Hình 2-29: Giống nấm men Pichia stiptis và Saccharomyces cerevisiae

Ngày nay, thế giới có xu hướng sử dụng công nghệ gene để kết hợp các chủng nấm men vừa có khả năng lên men đường 6, vừa có khả năng lên men đường 5.

Trong nghiên cứu này, chỉ nghiên cứu quá trình lên men đường 6 (hexose) nên chúng tôi chỉ sử dụng nấm men saccharomyces cerevisiae.

2.2.5 Thủy phân và lên men đồng thời

2.2.5.1 Tổng quát

Quá trình thủy phân và lên men đồng thời (còn gọi là quá trình đường hóa và lên men đồng thời) tiến hành cả thủy phân và lên men trong cùng một bước. So với quá trình thông thường (thủy phân rồi mới lên men), quá trình thủy phân và lên men đồng thời có nhiều ưu điểm:

• Glucose tạo thành trong quá trình thủy phân được tiêu thụ ngay lập tức bởi nấm men vì vậy, lượng cellobiose và glucose tích tụ trong hệ thống là rất ít. Điều này sẽ giải quyết vấn đề ức chế enzyme nhờ đó tốc độ tạo glucose sẽ được tăng đáng kể, lượng enzyme cần dùng cũng nhỏ đi.

• Số thiết bị cần cho quá trình thủy phân và lên men đồng thời cũng ít hơn số cần cho phương pháp truyền thống vì cả quá trình thủy phân và lên men được tiến hành trong cùng một thiết bị. Điều này giúp giảm vốn đầu tư.

• Việc ethanol tạo thành trong suốt quá trình sẽ làm giảm khả năng phát triển của vi sinh vật cũng như tạp chất, rất có lợi cho các quy trình liên tục.

Chính vì những ưu điểm trên mà quá trình thủy phân và lên men đồng thời được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới với các nguồn nguyên liệu khác nhau.


39

Bảng 2-2 Các thông số vận hành và kết quả quá trình thủy phân và lên men đồng thời được thực hiện trên nhiều nước[9]

Nồng độ glucose

Nồng độ cellulase

Ethanol Thời gian

lưu Biomass

g/l IFTU/g

cellulose Hiệu suất

% g/l Ngày

Bột cellulose 100 - 62 35 3

Bột sulfate 100 - 48 27 3

Rác thải nhà máy bột giấy 70 - 56 22 1

Rơm lúa mì 51 28 49 14 1

Bã mía 50 28 53 15 1

Rơm lúa mì 75 7 66 28 4-7

Rơm lúa mì 75 13 73 31 4-7

Rơm lúa mì 75 26 75 32 4-7

Nhiệt độ tối ưu cho quá trình là 37-38oC, nhiệt độ này là sự kết hợp của nhiệt độ tốt nhất cho quá trình thủy phân (45-50oC) và nhiệt độ tốt nhất cho hoạt động của nấm men (30oC).

Khi % bã rắn (cellulose) tăng, lượng ethanol tạo thành sẽ giảm. Mặc dù nồng độ đường luôn duy trì ở một mức thấp trong suốt quá trình, hiệu suất giảm là do khả năng khuếch tán của enzyme bị giảm và ethanol sẽ gây ức chế lên cả enzyme và nấm men. Trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời, enzyme cellulase (endo và exoglucan) và β-glucosidase bị ức chế bởi cellobiose, glucose và ethanol. Bảng sau thể hiện mức độ ức chế của các chất trên với từng enzyme cụ thể.

Bảng 2-3 Ảnh hưởng của ethanol, glucose và cellobiose lên enzyme cellulase và β-glucosidase

Mức độ ức chế Enzyme

Cellobiose Glucose Ethanol

Cellulase K1B=5.85 g/l K1G=53.16 g/l K1E=50.35 g/l


40

(ức chế mạnh ) (ức chế yếu) (ức chế trung bình)

β-glucosidase Km=10.56 g/l

(cơ chất)

K2G=0.62g/l

(ức chế rất mạnh) Không ức chế

Cellobiose là sản phẩm trực tiếp của enzyme cellulase và có ức chế mạnh đối vối enzyme này. Hoạt tính của enzyme cellulase sẽ bị giảm 60% khi nồng độ cellobiose đạt mức 6g/l. Khi nồng độ glucose đạt 20g/l, hoạt tính của cellulase sẽ giảm khoảng 20%. Ngược lại, glucose lại có ức chế rất mạnh đối với β-glucosidase: khi glucose đạt nồng độ khoảng 3g/l, giá trị này nằm trong khoảng nồng độ glucose tạo thành trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời, 75% hoạt tính của enzyme này bị mất. Ngược lại, ethanol không ức chế đáng kể β-glucosidase.

Cellulase và β-glucosidase thể hiện những tính chất động học khác nhau. Điều này là do hai enzyme này thực hiện hai cơ chế khác nhau: cellulase xúc tác cho phản ứng dị thể dựa trên sự tác động hiệp đồng của một nhóm các enzyme, trong khi đó β-glucosidase xúc tác cho phản ứng đồng thể.

Keikhosro Karimi et al [13] nghiên cứu quá trình thủy phân và lên men đồng thời cho rơm rạ được tiền xử lý bằng acid loãng, sử dụng chủng nấm men saccharomyces cerevisiae; mucor indicus và rhizopus.

Kết quả của nghiên cứu này đối với chủng saccaromyces cerevisiae được trình bày trong bảng sau.

Bảng 2-4 Kết quả quá trình thủy phân và lên men đồng thời tiến hành với rơm đã qua tiền xử lý bằng acid loãng, quá trình được tiến hành trong điều kiện kỵ khí.

Chủng nấm men

EnzymFPU/g

Cơ chất

Ethano-l (g/l)

Hiệu suất (%)

Glycer--ol

(mg/g)

Succini-c acid (mg/g)

Pyvuri-c acid (mg/l)

Acetic acid

(mg/g)

S. cerevisiae

15 Avicel 12,64 ± 0,46

44,62±1,62

62,6 0,3 1,1 1,2

S. cerevisiae

30 Avicel 15,20±0,55

53,65±1,94

79,4 0,8 1,5 1,9

S. cerevisiae

15 Rơm 6,83±0,25

40,69±1,49

83,9 0,5 2,0 3,9


41

Ghi chú : avicel là loại cellulose tinh khiết. Các sản phẩm phụ được tính theo mg sản phẩm phụ/g cellulose có trong nguyên liệu.

Đối với nấm men saccharomyces cerevisiae, glycerol là sản phẩm phụ lớn nhất, ngoài ra còn có các sản phẩm phụ như acid acetic, pyvuric, succinic với nồng độ nhỏ hơn, có thể xem là không đáng kể. Glycerol tạo thành tăng theo nhiệt độ của quá trình và sẽ có ảnh hưởng đến nồng độ ethanol trong dung dịch. Nồng độ ethanol và hiệu suất quá trình là không cao.

Nghiên cứu này còn cho thấy tốc độ tạo thành ethanol đạt lớn nhất trong khoảng 24 giờ đầu của quá trình thủy phân và lên men đồng thời sử dụng nấm men saccaromyces cerevisiae. Thí nghiệm được thực hiện trong 1 tuần, tuy nhiên nồng độ ethanol hầu như không đổi trong 4 ngày cuối và đôi khi còn giảm nhẹ. Có thể kết luận rằng, quá trình sản xuất ethanol có thể kết thúc trong vòng 1 đến 2 ngày, tuy nhiên,cần thêm 2 ngày nữa để có thể tạo thành lượng ethanol tối đa.

2.2.5.2 Các hạn chế trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời

Theo nghiên cứu được trình bày trong sách Sổ tay quy trình sản xuất bioethanol [9], người ta tiến hành thí nghiệm với nguyên liệu là gỗ Populus eugenii được qua quá trình tiền xử lý acid. Thành phần ban đầu gồm 60g/l bã rắn, cellulase : 25 IFPU/g cellulose, nấm mem saccharomicyes cerevisiae, nhiệt độ 38oC, pH 5,0; thu số liệu theo thời gian và tiến hành phân tích số liệu.

Hình 2-30 Nồng độ glucose (ô vuông không màu) và celllobiose (ô vuông màu đen) theo

thời gian của quá trình thủy phân và lên men đồng thời.


42

Như mô tả trong hình, glucose sẽ tích tụ trong 6-12 giờ đầu tiên của quá trình, vì nấm men không thể tiêu thụ glucose với tốc độ mà enzyme thủy phân ra sản phẩm này trong giai đoạn đầu của quá trình. Việc glucose tích tụ lại gây ảnh hưởng lên hoạt tính của enzyme β-glucosidase, tiếp theo sẽ tạo sự tích tụ cellobiose. Khi sinh khối của nấm men tăng lên, tỉ lệ glucose được tiêu thụ tăng lên và nồng độ glucose trong thiết bị phản ứng giảm xuống. Kết quả là β-glucosidase không còn bị ức chế, enzyme này sẽ tiến hành thủy phân cellobiose, thiết lập cân bằng hóa học giữa tốc độ đường (bao gồm cellobiose và glucose) tạo thành và mất đi.

Hình 2-31 Nồng độ ethanol theo thời gian trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời.

Sau 40-60h, tốc độ tạo ethanol giảm đáng kể và sau 80h dường như không đổi mặc dù lúc đó chỉ có 65% cellulose là đã bị thủy phân. Hiện tượng này được quan sát thấy trong nhiều nghiên cứu, tuy nhiên đến nay vẫn chưa có một giải thích hợp lý được đưa ra. Có giải thích cho rằng do tính chất chống thủy phân của cellulose tăng lên, sự giảm tác động hiệp đồng của các thành phần enzyme cellulase, khả năng chuyển động của enzyme và kích thước của xơ sợi đều bị giảm trong suốt quá trình thủy phân.

Để làm tăng hiệu suất cho quá trình, người ta làm thí nghiệm đưa thêm các thành phần mới vào quá trình lúc 80h. Các thí nghiệm được tiến hành với việc thêm các thành phần riêng biệt: (1) 20g/l bã rắn vừa qua tiền xử lý; (2) cellulase 10FIPU cho mỗi gram bã cellulose còn lại trong dung dịch; (3) 1g/l nấm men tính dựa trên khối lượng khô, (4) thêm thành phần dinh dưỡng cho nấm men.


43

Bảng 2-5 Ảnh hưởng của việc thêm các thành phần mới vào dịch thủy phân và lên men đồng thời lúc 80 giờ

Các thành phần thêm vào Nồng độ ethanol

(g/l) Điều chỉnh Cơ chất (20g/l)

Enzyme 10 IFPU/g

Nấm men 1g/l

Môi trường dinh dưỡng

Trước khi thêm vào

10.95 9.17 9.95 10.28 10.14

6h sau khi thêm

10.95 10.64 10.00 10.93 10.26

% thay đổi 0.0 16.0 0.5 6.3 1.2

Kết quả cho thấy chỉ có thêm nguồn nguyên liệu mới mới tạo sự thay đổi khác biệt nhất lên hiệu suất toàn quá trình 16%. Kết quả này cho thấy enzyme vẫn giữ được hoạt tính ngay cả sau 80 giờ trong quá trình SSF, vấn đề nằm ở chỗ lượng cellulose còn lại trong dung dịch. Enzyme không thể tiếp cận các cellulose này làm cho enzyme không thể tiếp tục quá trình thủy phân. Trong quá trình này, khi mà không có glucose được sinh ra, nấm men sẽ thiếu chất dinh dưỡng và có thể chết. Khi cellulose mới được thêm vào ở 80h, nấm men ngay lập tức tiêu thụ glucose tạo thành và tạo ra ethanol, điều này cho thấy nấm men vẫn duy trì quá trình sinh tổng hợp của mình ngay cả khi lượng glucose trong dung dịch giảm.

Nghiên cứu này chỉ ra rằng sự chuyển hóa cellulose thành glucose bao gồm hai giai đoạn chính (1) giai đoạn ban đầu (thời gian ngắn) sự lên men glucose là bước quyết định tốc độ phản ứng vì lượng nấm men trong giai đoạn ban đầu này ít; (2) giai đoạn tiếp theo dài hơn, trong giai đoạn này, quá trình thủy phân là quá trình quyết định tốc độ phản ứng, lúc này khả năng tiếp cận của enzyme với cơ chất trở nên quan trọng. Bằng cách cho nhiều nấm men ban đầu sẽ rút ngắn được giai đoạn một, tuy nhiên sẽ khó khăn hơn nếu muốn giải cải thiện giai đoạn sau, cụ thể là quá trình tiền xử lý phải tạo khả năng tiếp cận với cellulose tốt.


44

2.3 SƠ LƯỢC VỀ BIOFUEL VÀ ETHANOL NHIÊN LIỆU

2.3.1 Biofuel

Nhiên liệu sinh học (còn được gọi là nhiên liệu từ nông nghiệp – agrofuel) theo định nghĩa rộng là những nhiên liệu rắn, lỏng hay khí được chuyển hóa từ sinh khối. Tuy nhiên, phần này chỉ đề cập chính đến nhiên liệu sinh học dạng lỏng được sản xuất từ sinh khối.

Nói chung, nhiên liệu sinh học mang lại những lợi ích sau: giảm khí thải nhà kính, giảm gánh nặng lên nhiên liệu hóa thạch, tăng sự an toàn về năng lượng quốc gia, góp phần phát triển nông thôn và là một nguồn năng lượng bền vững trong tương lai. Ngược lại, nhiên liệu sinh học cũng có một số hạn chế: nguồn nguyên liệu phải được tái tạo nhanh, công nghệ sản xuất phải được thiết kế và tiến hành sao cho cung cấp lượng nhiên liệu lớn nhất với giá thấp nhất và mang lại lợi ích về môi trường nhất.

Nhiên liệu sinh học và những dạng nhiên liệu tái tạo khác nhắm đến tính chất trung tính về carbon. Điều này có nghĩa là carbon được thải ra trong quá trình đốt cháy nhiên liệu để cung cấp năng lượng vận chuyển hay sinh điện năng được tái hấp thụ và cân bằng với lượng carbon hấp thụ bởi cây cối. Những cây này sau đó lại được thu hoạch để tiếp tục sản xuất nhiên liệu. Những nhiên liệu trung tính về carbon không gây ra sự tăng carbon trong khí quyển, vì thế không góp phần vào hiệu ứng trái đất nóng lên.

Sau đây là một số các loại nhiên liệu sinh học thế hệ đầu tiên theo phân loại của tự điển bách khoa toàn thư trực tuyến Wikipedia.org:

• Dầu thực vật: dầu thực vật có thể dùng để làm nhiên liệu sử dụng cho rất nhiều những loại động cơ diesel đời cũ, và chỉ ở điều kiện khí hậu ấm áp. Trong đa số trường hợp, dầu thực vật được sử dụng để sản xuất biodiesel.

• Biodiesel: được sản xuất từ dầu hoặc chất béo qua quá trình tranesterification và là một chất lỏng giống như diesel từ dầu mỏ.

• Bioalcohols: là những rượu được sản xuất từ quá trình lên men sinh học. Bioalcohols phổ biến là ethanol, rồi đến propanol và butanol.

• Biogas: biogas được sinh ra từ quá trình tiêu hủy kỵ khí các chất hữu cơ bởi các vi sinh vật kỵ khí. Sản phẩm phụ dạng rắn từ quá trình này có thể được sử dụng làm nhiên liệu hoặc phân bón. Biogas chứa chủ yếu là methane.

• Nhiên liệu sinh học dạng rắn: ví dụ như: gỗ, than hoặc phân khô

Cũng theo tự điển Wikipedia.org, nhiên liệu sinh học thế hệ thứ 2 bao gồm:


45

• BioHydrogen: là khí Hydro được sản xuất từ nguồn nguyên liệu sinh khối. BioHydrogen được dùng trong pin nhiên liệu (fuel cell).

• DMF: được sản xuất DMF từ fructose và glucose sử dụng công nghệ sinh khối-nhiên liệu lỏng có xúc tác.

• Bio-DME: là DME được sản xuất từ biomethanol qua quá trình dehydration có xúc tác, được sử dụng trong động cơ khí nén.

• Biomethanol: methanol được sản xuất từ sinh khối, có thể được pha vào dầu đến 10-20% mà không làm thay đổi tính chất cơ bản của dầu.

Để đảm bảo an ninh năng lượng bảo vệ môi trường phát triển bền vững, nhiều quốc gia và các tổ chức quốc tế trong vài thập kỉ qua đã tập trung nghiên cứu sử dụng nhiên liệu sinh học thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch, tiến tới xây dựng ngành “nhiên liệu sạch” ở quốc gia mình. Các nước đã có thành công nghiên cứu và sử dụng nhiên liệu sinh học là Brazil, Mỹ, Canada, Mexico, Châu Âu có Anh, Pháp, Đức, Tây Ban Nha, Bỉ, Áo… Châu Á có Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Nhật. Sở dĩ nhiều nước đẩy nhanh chương trình nghiên cứu và sử dụng nhiên liệu sinh học vì đã cam kết thực hiện nghị định Kyoto về cắt giảm khí nhà kính và để đảm bảo an ninh năng lượng khi nguồn dầu mỏ trở nên đắt đỏ và sẽ cạn dần cuối thế kỷ này.

2.3.2 Ethanol nhiên liệu

2.3.2.1 Lịch sử ethanol nhiên liệu

Nguyên mẫu đầu tiên của động cơ đốt trong được đưa ra bởi Samuel Morey. USA. 1826. Điều này được xem là sự bắt đầu của động cơ gasoline nhưng thực tế ông sử dụng ethanol để cấp nguồn năng lượng cho động cơ. Năm 1908, Henry Ford xây dựng mô hình nổi tiếng về xe ô tô chạy bằng ethanol. Cuối cùng, công nghiệp dầu mỏ “chiến thắng” trong sự cạnh tranh với ethanol. Sự thúc đẩy “thương mại hóa” ethanol trong giao thông vận tải phát triển trong suốt thập niên 1970. Cuộc khủng hoảng dầu mỏ vào năm 1973 và cuộc cách mạng của người Iran vào năm 1978 làm cho giá của dầu gia tăng một cách nhanh chóng, ảnh hưởng lớn đến vấn đề an ninh năng lượng quốc gia. Ethanol nhiên liệu trở nên có giá trị. Tại thời điểm này, cơ quan bảo vệ môi trường (EPA) đã tìm kiếm một chất thay thế cho chì trong gasoline để gia tăng chỉ số octane. Ethanol sớm thiết lập một chỗ đứng vững mạnh trong việc gia tăng chỉ số octane. Một động cơ khác thúc đẩy công nghệ sản xuất ethanol ở Mỹ trong suốt những năm 80, đó là khi giá bắp hạ thấp. Các nhà


46

lập pháp Mỹ xem ethanol từ bắp là một phương tiện để ổn định thu nhập của nông nghiệp(1).

2.3.2.2 Ứng dụng của ethanol nhiên liệu

Gasohol còn gọi là xăng sinh học được chế tạo từ hỗn hợp ethanol khan 99,5% pha xăng tỷ lệ 5, 10, 20 hoặc 40% ethanol khan, với hỗn hợp ethanol trong gasohol khoảng 10-20% thì không cần cải tạo động cơ.

Khi xem xét ứng dụng hiện nay của bioethanol, hiển nhiên cần bắt đầu từ Brazil. Brazil đã thành công trong việc sản xuất bioethanol theo quy mô công nghiệp từ những năm 1970 khi nước này phụ thuộc nặng nề vào dầu nhập khẩu. Lệnh cấm vận dầu mỏ của Trung Đông đã bắt buộc Brazil phải tìm kiếm những những nguồn nhiên liệu vững bền hơn cho nhu cầu năng lượng của đất nước. Tuy rằng có những vấn đề nảy sinh, nhưng chương trình này của Brazil được xem như một mô hình thành công trong việc phát triển bền vững. Ngày nay, toàn bộ xe hơi ở Brazil sử dụng xăng có pha ít nhất 25% ethanol, và 60% số xe có khả năng “linh động về nhiên liệu” (có thể sử dụng 100% ethanol làm nhiên liệu).

Brazil sản xuất bioethanol hầu như chỉ từ cây mía. Trong mô hình này, mỗi tấn mía cho năng suất 72 lít ethanol. Loại ethanol này có thể được tinh lọc thêm để pha vào xăng, hoặc dùng làm ethanol nhiên liệu tinh. Rõ ràng con số này cho thấy có rất nhiều thành phần không được sử dụng trong quá trình chuyển hóa biomass thành ethanol. Hầu hết những thành phần này là hemicellulose và cellulose.

Nước Mỹ đang bám theo Brazil và đầu tư mạnh vào sản xuất nhiên liệu sinh học. Hiện tại Mỹ đang sử dụng toàn bộ xăng có pha 10% ethanol, với những cải tiến nhằm tăng tỉ số này. Đa phần mọi phương tiện bán ở Mỹ đều phải có động cơ linh hoạt về nhiên liệu. Liên minh Châu Âu cũng đã tiến đến việc khuyến khích năng lượng tái sinh cho tương lai với những đạo luật về điều khoản sử dụng phương tiện giao thông tối thiểu cho các nước thành viên.

Trong tương lai, Colombia bắt buộc những thành phố có dân số trên 500.000 dân phải bán xăng có pha 10% ethanol. Ở Venezuela, công ty dầu quốc gia đang hỗ trợ dự án xây dựng 15 nhà máy chế cồn từ mía trong 5 năm tới khi chính phủ sắp ban hành đạo luật bắt buộc sử dụng xăng E10 (pha 10% ethanol). Chính phủ Canada nhắm đến việc 45% xăng trong cả nước có pha 10% ethanol vào năm 2010. Ở Đông Nam Á, Thái Lan đã ban hành luật cho việc sử dụng xăng pha 10% ethanol bắt đầu từ 2007. Ở Ấn Độ, một chương


47

trình bioethanol đã kêu gọi người dân sử dụng xăng E5 trên cả nước, tiến tới việc sử dụng xăng E10 và E20.

2.3.2.3 Tình hình ethanol nhiên liệu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, công nghiệp sản xuất ethanol đã được hình thành từ rất lâu. Phần đông ethanol sản xuất từ rỉ đường mía, dùng làm ethanol cho thực phẩm và công nghiệp. Tổng cộng năng suất là 25 triệu Lit/năm, trong đó có 3 nhà máy sản xuất 15000 – 30000 Lit/ngày là nhà máy đường Lam Sơn, nhà máy đường Hiệp Hoà và nhà máy rượu Bình Tây và hàng trăm cơ sở sản xuất 3000 – 5000 Lit/ngày.

Cho đến thời điểm này, ethanol nhiên liệu vẫn chưa được tiêu thụ trên thị trường. Tuy nhiên, có rất nhiều nghiên cứu được thực hiện trong lĩnh vực này. Điển hình là sự hợp tác giữa Công ty rượu Bình Tây, Saigon Petro và Công ty Nguyễn Chí từ năm 2005. Các doanh nghiệp này đã triễn khai 5 đề tài: gasohol từ cồn công nghiệp (cồn 96%), gasohol từ cồn khan (cồn 99,5%), đầu tư nhà máy sản xuất gasohol, đầu tư nhà máy sản xuất cồn công nghiệp, đầu tư nhà máy sản xuất cồn khan. Tất cả nhằm mục đích đưa xăng sinh học với tỉ lệ 10-12% vào thị trường năng lượng.

2.3.2.4 Triển vọng ethanol tương lai

Cần có những nghiên cứu để tăng hiệu quả của bioethanol cũng như của quá trình chuyển hóa biomass thành nhiên liệu bền vững để thay thế xăng dầu. Điều này có liên quan đến việc giảm chi phí chuyển hóa, tăng năng suất và tăng sự đa dạng của các nguồn nguyên liệu có thể sử dụng. Hướng đi cho những nghiên cứu để phát triển và cải tiến bioethanol là tìm những phương pháp chuyển hóa hemicellulose thành đường để lên men. Một khía cạnh rất thú vị, và cũng được nghiên cứu trong đề tài này, là quá trình đường hóa và lên men đồng thời (SSF). Những phương pháp hiện nay có thể đạt được hiệu suất 50 – 72% ethanol cho mỗi gam glucose, giới hạn bởi khả năng chịu ảnh hưởng của nấm men đối với ethanol. Điều này dẫn đến hướng khả thi nghiên cứu những chủng nấm men có khả năng chịu ức chế tốt hơn. Ở khía cạnh này, công nghệ sinh học và vi sinh sẽ đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ gene, không chỉ ở việc phát triển nấm men, mà còn ở việc phát triển những giống vi sinh vật khác có khả năng chuyển hóa cellulose và lignin tạo thành đường và lên men ethanol. .

Chương 3: THỰC NGHIỆM

48

Chương 3 THỰC NGHIỆM

3.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT

3.1.1 Rơm rạ

Rơm rạ sử dụng trong nghiên cứu này được lấy từ xã Thái Mỹ, huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh.

Hình 3-1 Rơm chưa nổ hơi

3.1.2 Enzyme

Enzyme được sử dụng là enzyme cellusoft L có nguồn gốc từ Novo Nordisk – Đan Mạch.

Enzyme này được chúng tôi mua tại công ty TNHH Nam Giang, 133/11 Hồ Văn Huê, quận Phú Nhuận với tên thương mại là Cellusoft L, có dạng lỏng, màu nâu đỏ. Đây là một chế phẩm cellulase điều chế bằng phương pháp lên men chìm với hoạt tính biểu thị 1500 NCU/g. Hoạt tính biểu thị này được xác định theo phương pháp phân tích của Novo Nordisk, AF 187.2.

Các thông số của enzyme Cellusoft L:

Nhiệt độ hoạt động tối ưu 500C

pH hoạt động tối ưu 4.8


49

3.1.3 Giống nấm men

Giống nấm men được sử dụng là saccharomyces cerevisiae với chủng Turbo yeast extra do hãng Fermtech Wholasale của Anh cung cấp.

Hình 3-2 Saccharomyces serevisiae chủng turbo yeast extra nhìn dưới kính hiển vi

Chủng này đã được hoạt hóa và cấy truyền trên thạch nghiêng, bảo quản ở 4oC và được cấy truyền hàng tháng để giữ giống.

3.2 CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG

• Thiết bị nổ hơi hiện có tại trung tâm nghiên cứu công nghệ lọc hóa dầu. Thiết bị gồm có:

Bộ phận nạp liệu và gia nhiệt: có thể tích 5l. Biomass và nước được nạp liệu vào bộ phận này. Bộ phận là một thiết bị hình trụ. Xung quanh thành có các điện trở để gia nhiệt cho nguyên liệu bên trong. Phía dưới bộ phận có van xả áp để tạo sự giảm áp đột ngột, giúp phá vỡ cấu trúc nguyên liệu.

Bộ phận xả: thiết bị hình trụ, có thể tích 1m3 nhằm tạo sự giảm áp đột ngột. Đồng thời là bộ phận chứa nguyên liệu sau nổ hơi. Hai nên bộ phận có hai cửa tròn, phía dưới có một cửa tháo liệu.

Hộp điều khiển: điều khiển quá trình gia nhiệt cho bộ phận nạp liệu.


50

Hình 3-3 Thiết bị nổ hơi quy mô pilot

• Bể lắc điều nhiệt : sử dụng nước làm chất tải nhiệt

• Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) của hãng SHIMADZU

Hình 3-4 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Gồm có các bộ phận


51

- Đầu dò RID – 10A

- Bơm cao áp LC – 20AD

- Bộ phận tách khí DGU – 20 A3

- Bộ phận lò cột CTO – 20A

Cột sử dụng phân tích là SUGAR SH101, H312039. Thành phần chính của cột là copolymer của styrene divinylbenzene.

Kích thước cột: 8mmID×300mml

Pha động có thể sử dụng là nước, acetonitril, ethanol ở dạng đơn chất hoặc là hỗn hợp. Pha động thường hay được sử dụng là H2SO4 0.01N

- Bộ xử lý và máy in C – R8A

• Nồi hấp tiệt trùng y tế

• Kính hiển vi

• Buồng đếm hồng cầu

Hình 3-5 Hình dạng buồng đếm

hồng cầu dưới kính hiển vi

Hình 3-6 Buồng đếm hồng cầu

• Máy đo pH 220K METTER TOLEDO

• Máy sục oxy

• Máy ly tâm MIKRO 120

• Cân phân tích

• Cân kỹ thuật Shimadzu BX420H, max 420g

• Tủ sấy


52

• Lò nung

3.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG

3.3.1 Phương pháp phân tích thành phần xơ sợi trong biomass – rơm rạ

3.3.1.1 Nguyên lý

Xử lý biomass với lần lượt với các loại hóa chất khác nhau nằm loại bỏ lần lượt các thành phần trong biomass. Thông qua đó, giúp xác định các thành phần xơ sợi chính trong biomass gồm cellulose, hemicellulose và lignin.

3.3.1.2 Hóa chất sử dụng

a) Tách chất béo

Dung dịch ethanol/benzene với tỷ lệ 1:2

b) Dung dịch NDS ( Neutral detergent solution)

Bảng 3-1 Thành phần dung dịch NDS

STT Hóa chất Lượng

1 Nước cất 1L

2 EDTA 18,61 g

3 Natri tetraborat decahydrate 6.81 g

4 Natri dodecyl Sulfate 30 g

5 2 – ethoxyethanol 10 ml

6 Dinatri hydrophosphate 4,56 g

Trước tiên hòa tan 2 và 3 vào 1; sau đó hòa tan 4 và 5 vào dung dịch vừa pha, cuối cùng hòa tan 6 vào dung dịch. Dung dịch thu được có pH trung tính (6.9-7.1)

c) Dung dịch ADS

Gồm có

• Acid sulfuric (96∼98%) : 49,04g

• CTAB (cetyl trimethylammonium bromide) : 20g

Hòa tan hai chất trên vào nước, sau đó định mức đến 1L, sử dụng bình định mức.


53

d) Các hóa chất khác

• Decahydronaphtalene (hỗn hợp của cis và trans)

• Natri sulfite

• Acetone

3.3.1.3 Trình tự tiến hành

a) Chuẩn bị mẫu

Sấy khô biomass trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC.

Cắt nhỏ mẫu, sử dụng máy nghiền. Trong đề tài này, rơm rạ được cắt nhỏ đến kích thước cần thiết bằng cối xay thịt.

Rây mẫu đã qua nghiền, sử dụng rây có kích thước 250μm.

Chiết tách các chất béo có trong mẫu, sử dụng soxhlet với hệ dung môi Ethanol/Benzene.

Làm khô dung môi.

Sấy mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC

b) Tách chất béo bằng dung môi ethanol/benzene

Cân 10g mẫu đã được cắt nhỏ và sấy khô, cho vào Glass fiber filter (GFF), cân khối lượng GFF có mẫu W’1 = (các thành phần khác của biomass + GFF + chất béo)

Chuẩn bị 300 ml hệ dung môi Ethanol/Benzene với tỷ lệ 1:2. Cho vào bình cầu có dung tích 500ml

Đặt bộ lọc sợi thủy tinh vào soxhlet, lắp bộ soxhlet (như hình 3.7)

Đun cho dung môi sôi (80oC) trong vòng 6 giờ.

Lấy GFF ra khỏi soxhlet, sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC trong vòng 8 giờ.

Cân lại khối lượng GFF, W’2 = (các thành phần khác của biomass + GFF)

Tính lượng chất béo đã tách ra

W’ = W’1 – W’2

c) Phân tích thành phần NDS


54

Bước phân tích này nhằm đo tổng lượng xơ sợi (hemcellulose, cellulose và lignin) trong biomass. Bằng cách cho biomass phản ứng với NDS, NDS là một hệ chất có tác dụng tẩy rửa, hòa tan các chất trích ly, còn lại xơ sợi và tro.

Các bước thực hiện:

Cho 100ml dung dịch NDS, 2ml decahydronaphtalene và 0,5g natri sulfite vào 0,5g mẫu. (cân chính xác khối lượng mẫu m1)

Lắp hệ thống gồm sinh hàn như hình 3.8

Hình 3-7 Bộ dụng cụ soxhlet

Hình 3-8 Hệ thống phân tích

NDS và ADS Hình 3-9 Grooch

Crucible Đun hỗn hợp sôi (thường cần 5 – 10 phút ban đầu để chỉnh bếp đun) giữ cho hỗn

hợp sôi trong vòng 60 phút.

Lọc dung dịch bằng phễu Gooch Crucible, sau đó rửa bằng nước sôi (vài lần) và bằng acetone (2 lần)

Sấy khô Crucible ở nhiệt độ 105oC trong vòng 8h sau đó cân khối lượng crucible (W1)

W1 = xơ sợi (cellulose + cellulose + lignin) + tro + crucible

Nung Crucible trong lò nung (500∼550oC) trong 3 giờ, sau đó để nguội lò nung và cân lại khối lượng Crucible (W2)

W2 = tro + crucible.


55

Tính khối lượng xơ sợi: xơ sợi(cellulose + hemicellulose + lignin) = W1 – W2

d) Phân tích thành phần ADS

Bước này nhằm xác định phần cellulose và lignin trong biomass. Bằng cách cho biomass phản ứng với dung dịch ADS, acid trong ADS sẽ thủy phân hemicellulose, CTAB và acid sẽ hòa tan các chất trích ly, phần còn lại là cellulose, lignin, tro.

Cho 100ml dung dịch ADS, 2ml decahydronaphtalene vào 1g mẫu. Cân chính xác lại khối lượng mẫu m2.

Lắp dụng cụ giống với bước làm NDS.

Đun nóng hỗn hợp đến sôi , giữ ở trạng thái sôi trong 60 phút.

Lọc hỗn hợp bằng phễu Gooch Crucible, đồng thời nghiền bã trên phễu lọc bằng đủa thủy tinh và rửa bã bằng nước sôi 2 lần. Sau đó rửa bằng acetone đến khi acetone sau rửa không màu.

Sấy khô Crucible ở 105oC, sau 8h, cân khối lượng bã W4

W4 = cellulose + lignin + tro + crucible.

e) Phân tích thành phần ADL

Bước này nhằm xác định thành phần lignin trong biomass. Bằng cách xử lý bã sau ADS bằng H2SO4 72%, acid này sẽ hòa tan cellulose, chỉ còn lại lignin và tro.

Sau khi xác định khối lượng phần ADF (W4), thêm 10ml H2SO4 72% khối lượng vào phễu crucible, đảo trộn và nghiền bằng đủa thủy tinh tạo dạng paste. Sau đó tiếp tục khuấy trộn trong vòng 1 giờ. Để acid và dung dịch H2SO4 và các chất hòa tan chảy tự do xuống, nếu tất cả acid đều chảy xuống trước 1 giờ, cho thêm 10ml acid.

Sau khi tất cả acid đã chảy xuống sau 1 giờ, cho thêm 10ml H2SO4. Tiếp tục bước trên 3 lần nữa (3 giờ).

Sau đó rửa bã trên crucible với lượng dư nước sôi.

Sấy khô crucible trong tủ sấy ở 105oC trong vòng 8 giờ, sau đó cân khối lượng crucible W6

W5 = lignin + tro + crucible

Đun crucible trong lò nung, nhiệt độ 500 – 550oC, trong 3 giờ, sau đó cân lại crucible


56

W6 = tro + crucible

f) Phân tích tro

Cân 1g mẫu đã qua cắt nhỏ, rây, sấy khô ở 105oC đến khối lượng không đổi. Cân chính xác khối lượng mẫu và ghi lại (m3)

Cho mẫu vào cốc nung và cân khối lượng cốc nung m4.

Đem cốc nung ở 500 – 550oC trong 3 giờ, sau đó cân lại khối lượng cốc m5

3.3.1.4 Tính kết quả

% chất béo %100'×=

maumW

với mmau là khối lượng mẫu chính xác cân được.

% các thành phần xơ sợi

% lignin = ADL =(1-%chất béo) %1002

65 ×−

×m

WW

% cellulose = ADF - ADL = (1-%chất béo) %1002

54 ×−

×m

WW

% hemicellulose = NDF – ADF

=(1-%chất béo)lignincellulose

mWW %%%100

1

21 −−×−

×

% tro = %1003

54 ×−

mmm

% chất trích ly = 100% - % xơ sợi - % tro

3.3.2 Phương pháp đo nồng độ glucose và ethanol

3.3.2.1 Nguyên lý

Glucose và ethanol được đo nồng độ bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng pha động là acid sulfuric 0,01N. Mẫu và chuẩn được chạy ở chế độ: nhiệt độ cột: 60oC, tốc độ pha động 1ml/phút.

Dựa trên khả năng phân bố khác nhau của các cấu tử khác nhau trên cột, khi dung môi rửa giải đi qua, các cấu tử sẽ lần lượt được rửa giải ra khỏi cột theo thứ tự tùy thuộc


57

vào bản chất của các cấu tử. Những cấu tử như nhau (thuộc cùng một chất) sẽ có thời gian lưu như nhau, nhờ vào đó máy HPLC có thể tách hỗn hợp nhiều chất ra khỏi nhau. Do diện tích bề mặt tiếp xúc của pha tĩnh lớn, HPLC có độ phân tách khá cao.

Cột được sử dụng là SH1011, cột này có thể đo đường, acid hữu cơ, fufural và các dẫn xuất, các aldehyde và rượu.

3.3.2.2 Chuẩn bị máy HPLC

a) Chuẩn bị pha động

• Hóa chất gồm acid H2SO4 95% tinh khiết 400μl

Nước cất 1000 ml

• Lọc nước cất bằng màng lọc cellulose acetate, kích thước lỗ là 0.45μm.

• Cho 1000ml nước cất đã được lọc vào bình chứa, cho 400 μl H2SO4 95% vào và khuấy kĩ.

• Loại khí trong pha động, bằng cách hút chân không bình chứa pha động, vừa hút vừa khuấy trộn kĩ. Thực hiện quá trình này trong 20 – 30 phút đến khi không còn thấy bọt khí trong bình.

b) Start – up hệ thống

• Kiểm tra lại thể tích pha động trong bình.

• Đặt bình chứa pha động vào vị trí, nhúng đầu hút vào bình.

• Bật các công tắc nguồn của đầu dò RID, lò, bơm, máy in.

• Đổi hết dung môi cũ còn trong ống, thay bằng dung môi mới. Bằng cách mở van tháo (drain valve) của bơm và nhấn nút purge. Lặp lại bước này 2 – 3 lần .

• Đóng van tháo lại.

• Đặt tốc độ pha động ở 0,2 ml/phút và bấm nút pump để bắt đầu bơm.

• Đặt nhiệt độ cột ở 60oC, nhấn nút oven để lò bắt đầu nâng nhiệt độ cột.

• Nâng dần tốc độ pha động từ 0,2 → 0,5 → 0,8 → 1,0 ml/phút.

• Sau khi đạt đến các thông số mong muốn (nhiệt độ cột là 60oC, tốc độ pha động là 1ml/phút) thay đổi đường biểu diễn của đầu dò RI từ “mẫu” (sample) sang dạng đường nền (reference).


58

• Giữ đường biểu diễn ở dạng đường nền trong hơn 30 phút.

• Đổi đường đường biểu diễn từ đường nền về lại dạng đường biểu diễn mẫu.

• Nếu giá trị balance trên máy không nằm trong khoảng ±50, nhấn nút balance để cân bằng lại cho đầu dò RI.

• Nhấn zero để đưa đường nền về 0 và có thể đo mẫu.

• Dung dịch mẫu và chuẩn trước khi đo cần được lọc qua phễu lọc có kích thước lỗ là 20μm.

3.3.2.3 Đo dung dịch chuẩn

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn ethanol, glucose và các chất khác để khảo sát quan hệ chất – thời gian lưu, nồng độ – diện tích peak.

a) Thời gian lưu của các chất

Các chất chuẩn được pha chính xác theo nồng độ định trước, đo bằng máy HPLC để xác định thời gian lưu. Kết quả thu được, được trình bày trong bảng sau.

Bảng 3-2 Kết quả chạy chuẩn

STT Chuẩn Nồng độ (g/l) Thời gian lưu (phút) Diện tích

1 Acid oxalic 3,856 5,958 2.541.980,00

2 Cellobiose 5,96 6,506 3.088.465,00

3 Glucose 0,96 7,558 786.892,00

4 Saccharose 4,825 7,722 7.695.230,00

5 Mannose 7,36 7,878 5.172.249,00

6 Galactose 5,086 7,97 2.958.850,00

7 Xylose 5,86 7,993 3.799.992,00

8 Acid maleic 7,058 8,111 2.504.161,00

9 Arabinose 5,345 8,525 3.414.149,00

10 Acid citric 9,85 9,689 2.913.131,00

11 Acid lactic 16,168 9,759 7.721.543,00

12 Acid acetic 6,74 11,108 1.992.774,00


59

13 Ethanol 10,55 15,565 3.656.818,00

b) Chuẩn glucose

Các dung dịch chuẩn glucose được pha theo nồng độ định trước, đo bằng máy HPLC. Kết quả được trình bày trong bảng sau

Bảng 3-3 Kết quả chuẩn glucose

STT Ký hiệu Nồng độ (g/l) Diện tích

1 C4 0,2 138.571,00

2 C5 0,39 139.076,00

3 C6 0,597 421.409,00

4 C7 0,797 562.458,00

5 C3 1 709.680,00

6 C8 1,18 917.332,00

7 C9 1,38 1.066.170,00

8 C10 1,57 1.217.408,00

9 C11 1,8 1.400.696,00

10 C2 2,01 1.566.539,00

11 C12 2,18 1.639.969,00

12 C13 2,36 1.794.044,00

13 C15 2,84 2.138.592,00

14 C1 3,01 2.291.589,00

Từ bảng số liệu trên, vẽ được đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ glucose – diện tích peak.


60

y = 786637x - 54489R2 = 0.9961

0

500,000

1,000,000

1,500,000

2,000,000

2,500,000

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5C

S

Hình 3-10 Đường chuẩn glucose

Từ đồ thị trên có thể nội suy ra phương trình sau

S = 786637×C – 54489 (1)

Phương trình (1) cho phép tính nồng độ glucose khi biết diện tích peak, phương trình này áp dụng cho khoảng nồng độ 0,2 – 3,01 g/l.

c) Chuẩn ethanol

Các dung dịch ethanol được pha theo nồng độ định trước và được đo bằng máy HPLC. Kết quả được trình bày trong bảng sau

Bảng 3-4 Kết quả cho chuẩn ethanol

STT Ký hiệu Nồng độ (g/l) Diện tích

1 R1 9,56 2.890.448,00

2 R11 4,78 1.387.166,00

3 R12 4,30 1.245.487,00

4 R13 3,83 1.092.224,00

5 R14 3,33 927.311,00

6 R15 2,99 823.560,00


61

7 R16 2,48 656.040,00

8 R17 1,99 498.059,00

9 R18 1,46 326.814,00

10 R19 0,99 186.844,00

Từ bảng số liệu trên, vẽ được đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ ethanol – diện tích peak.

y = 316430x - 126371R2 = 0.9999

0

500,000

1,000,000

1,500,000

2,000,000

2,500,000

3,000,000

3,500,000

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

C

S

Hình 3-11 Đường chuẩn ethanol

Từ đồ thị trên có thể nội suy ra phương trình sau

S = 316430×C – 126371 (2)

Phương trình (2) cho phép tính nồng độ ethanol khi biết diện tích peak, phương trình này áp dụng cho khoảng nồng độ 0,99 – 9,56 g/l.

d) Chuẩn cellobiose

Các dung dịch cellobiose được pha theo nồng độ định trước và được đo bằng máy HPLC. Kết quả được trình bày trong bảng sau


62

Bảng 3-5 Kết quả chuẩn cellobiose

STT Nồng độ (g/l) Diện Tích

1 0,00 0,00

2 0,10 65.429,00

3 0,20 134.060,00

4 0,45 333.194,00

5 0,63 459.923,00

6 0,85 643.102,00

7 1,02 768.183,00

y = 761446x ‐ 9859.4

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Nồng độ (g/l)

Diệ

n tíc

h

Hình 3-12 Đường chuẩn cellobiose

Từ bảng số liệu và đồ thị trên, nội suy được phương trình đường chuẩn, xác định mối quan hệ của nồng độ cellobiose và diện tích peak là

4,9859761446 −×= cellobioseCS (3)

Phương trình (3) cho phép tính nồng độ cellobiose khi biết diện tích peak, phương trình này áp dụng cho khoảng nồng độ cellobiose từ 0 g/l đến 1,02g/l.


63

3.3.2.4 Đo dung dịch mẫu

Mẫu được lọc qua phễu lọc có kích thước 20μm. Pha loãng từ 10 – 30 lần. Sau đó đo bằng máy HPLC

3.3.2.5 Tính kết quả

a) Xác định các chất có trong dung dịch mẫu

Căn cứ vào thời gian lưu của từng chất và so sánh với chất chuẩn, có thể kết luận về thành phần các chất có trong dung dịch mẫu. Nếu cần có thể xác định bằng cách thêm chuẩn vào mẫu.

b) Kết quả glucose

Từ diện tích peak thu được trên sắc ký đồ, tính được nồng độ glucose theo phương trình (1) như sau:

S = 786637×C – 54489 (1)

)/(786637

54489cos lgSC eglu

+=⇒

c) Kết quả ethanol


S = 316430×C – 126371 (2)

)/(316430

126371 lgSCethanol+

=⇒

d) Kết quả cellobiose


4,9859761446 −×= cellobioseCS (3)

)/(761446

4,9859 lgSCcellobiose+

=⇒

3.3.3 Phương pháp xác định độ ẩm của nguyên liệu

Cân chính xác mẫu rơm: m1 (g)


64

Cho mẫu rơm vừa cân vào cốc, cân lại khối lượng cốc: m2 (g)

Làm khô rơm và cốc băng tủ sấy, nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi. Cân lại khối lượng cốc m3 (g)

Tính hàm ẩm: % ẩm %1001

23×

−=

mmm

3.3.4 Phương pháp nuôi cấy và đếm nấm men

3.3.4.1 Hóa chất sử dụng

a) Môi trường Hansen

Thành phần môi trường Hansen gồm có

Bảng 3-6 Thành phần môi trường Hansen dùng cho việc nuôi cấy, bảo quản gống nấm men.

Tên hóa chất Khối lượng Nơi sản xuất

Glucose 50g Trung Quốc

K2HPO4 3g Trung Quốc

Peptone 10g Difco

MgSO4.7H2O 2,5g Trung Quốc

Agar 20g Việt Nam

Nước cất 1000ml Việt Nam

b) Nguồn Nitơ bổ sung

Để bổ sung nguồn nitơ vào dịch lên men, chúng tôi sử dụng dịch chiết nấm men của Difco với hàm lượng 1%.

3.3.4.2 Phương pháp cấy và bảo quản gống nấm men

Chuẩn bị môi trường Hansen có chứa agar. Tiệt trùng, rót dung dịch vào ống nghiệm và để nghiêng đến khi agar đông lại.

Tiến hành gieo cấy giống nấm men từ ống giống gốc của phòng thí nghiệm sang ống môi trường thạch nghiêng đã được chuẩn bị sẵn từ trước (môi trường Hansen có bổ sung thạch với hàm lượng 2%). Công việc này được tiến hành trong tủ cấy vô khuẩn để tránh


65

bị nhiễm các vi sinh vật khác có ảnh hưởng xấu đến men giống và quá trình lên men sau này.

Phương pháp gieo cấy như sau:

- Dùng que cấy vòng và vô khuẩn trên đèn cồn.

- Tháo nút bông ở ống canh trường giống và ống môi trường.

- Đốt nóng miệng 2 ống nghiệm trên đèn cồn.

- Đưa que cấy vào ống canh trường và lấy một ít canh trường nấm men.

- Đưa đầu que cấy vào đáy ống môi trường, hòa giọt canh trường vào giọt nước ngưng ở đáy.

- Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy lên trên mặt thạch, từ đáy lên theo hình sin.

- Lấy que cấy ra, vô khuẩn trên đèn cồn.

- Hơ nóng nút bông và miệng 2 ống nghiệm (canh trường và môi trường). Đậy nút bông vào ống nghiệm.

Giống nấm men sau khi được gieo cấy sang môi trường thạch nghiêng được đặt vào tủ ấm và giữ ở nhiệt độ 300C, sau 48 giờ giống đã phát triển tốt, chúng tôi đặt các ống nghiệm vào tủ lạnh (nhiệt độ 4-60C) để bảo quản giống, phục vụ cho quá trình nghiên cứu. Nếu muốn tiếp tục bảo quản thì thời gian sau này cần cấy chuyền sang môi trường mới.

3.3.4.3 Phương pháp nhân giống

Giống nấm men trước khi đưa vào lên men cần được nhân giống nhằm tăng sinh khối, tăng hoạt lực giống. Ở quy mô phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành nhân giống qua hai giai đoạn:

• Giai đoạn 1: sau khi nấm men đã phát triển trên môi trường thạch nghiêng, chúng tôi cấy vào erlen chứa 20ml dịch môi trường Hansen đã được hấp tiệt trùng, tiếp đó nuôi ở nhiệt độ thường (28-300C) trong 24 giờ.

• Giai đoạn 2: lấy 100 ml dịch môi trường Hansen cho vào erlen 250ml, hấp tiệt trùng, để nguội, cho toàn bộ nấm men trong erlen đã nuôi giống (giai đoạn 1) vào erlen và nuôi ở điều kiện 300C, 24 giờ.


66

3.3.4.4 Phương pháp đếm mấm men

Để đánh giá chất lượng canh trường nấm men, cần đếm số tế bào trong 1ml. Trong 1ml canh trường nấm men phát triển bình thường phải có ít nhất 12-14 triệu tế bào. Chúng tôi đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu.

a) Tiến hành

- Đặt lá kính lên khu vực buồng đếm.

- Lắc đều dịch tế bào nấm men và dùng pipet pasteur để lấy một giọt cho vào khe ở mép buồng đếm, tránh tạo bọt khí. Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn.

- Đặt buồng đếm vào bàn kính hiển vi và để yên vài phút.

- Chỉnh kính hiển vi với vật kính x40, tìm mạng ô đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn (4 x 4 = 16 ô nhỏ).

- Đếm số tế bào trong 5 ô vuông lớn đại diện cho 25 ô vuông lớn trong ô trung tâm.

b) Cách tính

Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu được tính bằng công thức:

N = [(a/b) x 400/0,1] x 103 x 10n

Trong đó:

N : số lượng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu

a : số tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ)

b : số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn

400 : tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm

0,1 : thể tích dịch tế bào chứa trong ô trung tâm

103 : số chuyển mm3 thành ml

10n : độ pha loãng mẫu

3.4 TRÌNH TỰ NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu này tập trung vào hai quá trình chính là quá trình thủy phân và quá trình thủy phân và lên men đồng thời.


67

3.4.1 Sơ đồ quy trình

THUYẾT MINH SƠ ĐỒ QUY TRÌNH

Rơm rạ được lấy từ xã Thái Mỹ, huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh. Một lượng nhỏ rơm rạ được đem đi phân tích thành phần xơ sợi theo phương pháp phân tích được trình bày ở mục 3.3.1. Sau đó rơm được cắt nhỏ thành kích thước từ 2-3 cm, được đem đi nổ hơi. Quy trình gồm những bước chính được trình bày dưới đây

3.4.2 Quá trình nổ hơi – tiền xử lý rơm rạ

Rơm và nước được cho vào bộ phận nạp liệu của thiết bị nổ hơi. Tỉ lệ nạp liệu là 200g rơm/4l nước. Trước khi cho nguyên liệu vào phải chú ý đóng van xả áp của bộ phận nạp liệu. Đóng nắp bộ phận nạp liệu.

Rơm rạ

Tiền xử lý – nổ hơi

Thủy phân Thủy phân và lên men đồng thời

Chưng cất

Ethanol

Nấm men Enzyme

Enzyme

H2O

Rửa bã sau nổ hơi H2O


68

Cài đặt điều kiện vận hành cho thiết bị là nhiệt độ 210oC, bật công tắc gia nhiệt.

Sau khi nhiệt độ của toàn khối nguyên liệu đạt 210oC, áp suất vào khoảng 26atm. Tắt gia nhiệt, kiểm tra các valve và các cửa ở bộ phận xả, đảm bảo tất cả cả valve và cửa đã được đóng. Gạt nhanh valve xả áp, toàn bộ khối nguyên liệu ở áp suất cao bị giảm áp độ ngột, nước thấm trong nguyên liệu sẽ hóa hơi, tăng thể tích độ ngột. Chính điều này tạo lực xé vỡ xơ sợi, làm cho cấu trúc xơ sợi trở nên dễ dàng hơn cho enzyme tấn công.

Tiến hành lọc lấy bã và rửa bã bằng 4l nước ấm để làm sạch các chất có khả năng ức chế hoạt động của enzyme và nấm men như fufural. Các chất này tạo thành do nhiệt độ cao và áp suất cao trong thiết bị nổ hơi.

Bã sau nổ hơi được đem đi phân tích thành phần xơ sợi theo phương pháp trình bày ở mục 3.3.1, phân tích thành phần ẩm theo phương pháp trình bày ở mục 3.3.3. Dịch nổ hơi được lọc và đem đo xác định thành phần bằng máy sắc ký lỏng HPLC.

3.4.3 Quá trình thủy phân

Nghiên cứu này tập trung vào khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố gồm % bã rắn (khô), % enzyme, nhiệt độ, pH, thời gian lên quá trình thủy phân. Trong nghiên cứu trước của Cao Đình Khánh Thảo [1], điểm tốt nhất cho quá trình thủy phân là % bã rắn 10%, % enzyme 5%, pH 4,8; nhiệt độ 50oC. Điểm này được chọn làm điểm bắt đầu cho nghiên cứu này, các yếu tố được khảo sát theo phương pháp luân phiên từng biến.

• Ảnh hưởng của % bã rắn: khảo sát theo tỉ lệ khối lượng bã rắn/ thể tích dung dịch. Các % khảo sát gồm 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%. Nồng độ glucose được đo tại các thời điểm 24 giờ; 26,5 giờ; 48 giờ và 72 giờ. Nồng độ glucose tạo thành và hiệu suất lớn nhất của mỗi % bã rắn là thông số đặc trưng để vẽ đồ thị ảnh hưởng của % bã rắn lên quá trình thủy phân.

• Ảnh hưởng của % enzyme: khảo sát theo tỉ lệ thể tích enzyme / thể tích dung dịch. Các giá trị khảo sát gồm 1%, 3%, 5%, 7%, 9%. Nồng độ glucose được đo tại các thời điểm 0 giờ; 0.5 giờ; 1 giờ; 2 giờ; 24 giờ; 26,5 giờ và 72 giờ. Nồng độ glucose tạo thành, hiệu suất đạt được lớn nhất, tốc độ phản ứng ban đầu là những yếu tố phản ánh ảnh hưởng của % enzyme lên quá trình thủy phân.

• Ảnh hưởng pH: khảo sát theo pH của dung dịch, pH dung dịch được giữ nhờ hệ đệm acid acetic và natri acetate. Các giá trị pH khảo sát gồm 3; 4; 4,2; 4,4; 4,6; 4,8; 5; 6. glucose tạo thành được đo tại các thời điểm 0 giờ; 0,5 giờ; 1 giờ; 2 giờ;


69

24 giờ; 26,5 giờ và 72 giờ. Trình bày kết quả theo ảnh hưởng của pH lên nồng độ glucose và hiệu suất lớn nhất.

• Ảnh hưởng của nhiệt độ: khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên phản ứng thủy phân enzyme. Các nhiệt độ khảo sát gồm nhiệt độ phòng, 37oC, 40 oC, 50 oC, 55 oC, 60oC. nồng độ glucose được đo tại 0 giờ; 1 giờ; 3 giờ và 24 giờ. Kết quả được trình bày ảnh hưởng của nhiệt độ lên nồng độ glucose, cellobiose, tốc độ ban đầu và hiệu suất đạt được tại 48 giờ.

• Khảo quá trình thủy phân theo thời gian, mẫu được lấy tại các thời điểm 0 giờ; 1 giờ; 15,75 giờ; 19 giờ; 23 giờ; 24 giờ; 26,5 giờ; 48 giờ và 72 giờ. Kết quả được trình bày theo nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất thời gian.

3.4.4 Quá trình thủy phân và lên men đồng thời

Bã sau nổ hơi, xác định hàm ẩm được đưa đi thủy phân và lên men đồng thời. Tiến hành thí nghiệm với thể tích dung dịch tổng cộng 100ml. Dung dịch được bổ sung môi trường dinh dưỡng cho nấm men phát triển.

Bảng 3-7 Thành phần chất dinh dưỡng bổ sung cho dung dịch thủy phân và lên men đồng thời.

Thành phần Dịch chiết nấm men K2HPO4 MgSO4

Nồng độ 1% 3 g/l 2,5 g/l

• Trước khi tiến hành, nấm men được nuôi cấy trong môi trường Hansen theo quy trình được trình bày ở mục 3.3.4.3, sau đó tiến hành đếm nấm men bằng buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ nấm men trong bình nuôi cấy. Sau khi quyết định mật độ nấm men (triệu tế bào/ml) cần có trong dung dịch, tác giả sẽ tính thể tích nấm men cần cho vào (ml) 100 ml dung dịch.

• Enzyme cellulase được tiệt trùng bằng đèn UV trong vòng 1 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm.

• Rơm rạ, các dung dịch được cho vào erlen 250ml. Tất cả được tiệt trùng bằng nồi hấp tiệt trùng. Sau đó, bộ dụng cụ được lắp như hình sau. Bộ dụng cụ này chỉ cho phép CO2 thoát ra khỏi dung dịch chứ không cho khí từ môi trường ngoài lọt vào. Sau đó, erlene được đặt vào bể lắc điều nhiệt.


70

Hình 3-13 Bộ dụng cụ thủy phân và lên men đồng thời

Nghiên cứu này tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố sau lên quá trình thủy phân và lên men đồng thời: mật độ nấm men trong dung dịch, % enzyme, quá trình theo thời gian. Các yếu tố khác được giữ cố định, nhiệt độ: 37oC, pH: 4,8, % bã rắn 11%.

Nghiên cứu của Cao Đình Khánh Thảo [1] cho thấy rằng đối với quá trình lên men, mật độ nấm men 23,6 triệu tế bào/ml cho hiệu quả quá trình lên men tốt nhất. Nghiên cứu này lấy mật độ này (23,6) và lấy % enzyme 5% làm gốc, nghiên cứu ảnh hưởng hai yếu tố này theo phương pháp luân phiên từng biến.

• % enzyme: khảo sát các tỷ lệ enzyme 3%, 5%, 7%, 9%. Mẫu được lấy tại 24 giờ và 48 giờ, được đo bằng máy HPLC để xác định lượng glucose còn và lượng ethanol tạo thành.

• Mật độ nấm men trong dung dịch: tiến hành khảo sát theo các giá trị :11,8 triệu tế bào/ml; 23,6 triệu tế bào/ml; 35,4 triệu tế bào/ml; 47,2 triệu tế bào/ml. Mẫu được lấy tại 24 giờ và 48 giờ, được đo bằng máy HPLC để xác định lượng glucose còn và lượng ethanol tạo thành.

• Khảo sát quá trình thủy phân và lên men đồng thời theo thời gian. Mẫu được lấy tại 2 giờ; 21 giờ; 24 giờ; 26 giờ; 51 giờ; 71 giờ. Mẫu được đo bằng máy HPLC để xác định lượng glucose, cellobiose còn và lượng ethanol tạo thành theo thời gian.

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

71

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

4.1 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN RƠM RẠ

4.1.1 Thành phần rơm rạ trước nổ hơi

Rơm được đem đi phân tích theo phương pháp trình bày ở mục 3.3.1, độ ẩm của rơm thô là 14,17%. Kết quả phân tích thành phần được trình bày ở bảng và đồ thị sau.

Bảng 4-1 Thành phần rơm rạ khô trước nổ hơi

Cellulose Hemicellulose Lignin Chất trích ly Tro

43,96 % 22,39 % 4,65 % 15,84% 13,16%

44%

22%

5%

16%

13%

cellulose

hemicellulose

lignin

chaát trích ly

tro

Hình 4-1 Thành phần rơm rạ trước nổ hơi

Bảng 4-2 Thành phần rơm rạ theo Hồ Sĩ Tráng [3]

Cellulose hemicellulose Lignin Tro

34 – 38% 32 – 40% 12% 14 – 18%

Rơm rạ thô chứa 44% cellulose, 22% hemicellulose, cả hai polysaccharide này đều là nguồn nguyên liệu trực tiếp tổng hợp ethanol. Kết quả này cho thấy rơm là một nguồn nguyên liệu thích hợp cho quá trình sản xuất ethanol.

Nhìn chung kết quả phân tích được đối với hàm lượng cellulose, hemicellulose và tro là gần với kết quả tham khảo. Tuy nhiên thành phần lignin trong rơm rạ ít hơn rất


72

nhiều so với kết quả tham khảo được ( 4,65% so với 12%). Lý do là những phương pháp phân tích khác nhau sẽ đem đến kết quả khác nhau, tuy nhiên cũng không thể loại trừ lý do sai số trong phương pháp phân tích. Ngoài ra, các nguồn nguyên liệu khác nhau cũng cho % các thành phần khác nhau tuỳ thuộc vào giống cây, khí hậu, đất đai…

4.1.2 Thành phần rơm rạ sau nổ hơi

Bảng 4-3 Thành phần rơm rạ khô sau nổ hơi

Cellulose Hemicellulose Lignin Chất trích ly Tro

56,2 % 4,01% 13,54 % 19,5 % 6,75

19.50

56.20

4.01

13.546.75 chaát trích ly

cellulosehemicelluloselignintro

Hình 4-2 Thành phần rơm rạ sau nổ hơi.

4.1.3 So sánh rơm rạ trước và sau nổ hơi

a) Thành phần

Tiến hành thí nghiệm với chế độ nổ hơi ở 210oC, sử dụng tỉ lệ rơm và nước là 200g rơm/4l nước. Kết quả các thành phần thay đổi như sau

Bảng 4-4 So sánh thành phần rơm rạ trước và sau nổ hơi

% còn Sau nổ hơi (g) Trước nổ hơi (g) Thành phần

52,5% 81,54 171,66 Khối lượng khô*

61% 45,83 75,12 Cellulose


73

8,5% 3,27 38,44 Hemicellulose

146,67% 11 7,99 Lignin

0

20

40

60

80

100

120

140

1 2

Khố

i lượn

g (g

)

ligninhemicellulosecellulose

Hình 4-3 So sánh kết quả các thành phần rơm rạ trước và sau nổ hơi.

Ghi chú *: khối lượng rơm khô trước và sau nổ hơi, được tính dựa theo hàm ẩm đo được.

NHẬN XÉT

Phần trăm cellulose tăng lên khi tiến hành tiền xử lý rơm rạ bằng phương pháp nổ hơi. Tuy nhiên, lượng cellulose giảm sau quá trình nổ hơi. Lý do là cellulose cũng bị phân hủy một phần trong quá trình nổ hơi. Đây là mặt hạn chế của quá trình nổ hơi, quá trình nổ hơi chỉ giữ lại được 61% lượng cellulose, cần phải nghiên cứu để nâng cao hơn tỉ lệ này giúp cho việc sử dụng nguyên liệu hiệu quả hơn.

Hemicellulose giảm đáng kể sau quá trình nổ hơi (chỉ còn 8,1%), việc hemicellulose bị thủy phân sẽ tạo cho rơm có cấu trúc xốp hơn, cellulose sẽ dễ bị tấn công hơn bởi enzyme.

Tuy nhiên lượng lignin xác định được lại tăng lên sau quá trình nổ hơi, điều này là do sai số trong phương pháp phân tích.

b) Cấu trúc


74

Hình 4-4 Rơm trước nổ hơi

Hình 4-5 Rơm sau nổ hơi

NHẬN XÉT

Hình trên cho thấy cấu trúc rơm rạ bị thay đổi mạnh sau khi tiền xử lý nổ hơi. Sau nổ hơi, toàn bộ cấu trúc đã bị phá vỡ, có thể quan sát thấy các sợi nhỏ trong rơm rạ. Quá trình nổ hơi sử dụng tác động hoá hơi độ ngột của nước phá vỡ cấu trúc xơ sợi. Như vậy, sau quá trình nổ hơi, xơ sợi và cellulose bị xé nhỏ và sẽ dễ bị tấn công bởi enzyme. Chính điều này giúp cho quá trình thủy phân rơm rạ bằng enzyme diễn ra dễ dàng hơn.

4.1.4 Thành phần dịch nổ hơi.

Dịch nổ hơi được lọc bằng giấy lọc, sau đó dịch lọc được lọc tiếp bằng phễu lọc có kích thước lỗ 20μm và đo bằng máy HPLC, kết quả thành phần được trình bày trong bảng sau

Bảng 4-5 Thành phần dịch nổ hơi

STT Thời gian lưu (phút) Chất Thời gian lưu chất chuẩn

1 5,321

2 5,729

3 6,041 acid oxalic 5,958

4 6,649 cellobiose 6,506

5 7,232

6 7,859 xylose 7,993

7 8,536 arabinose 8,525

8 9,532 acid citric 9,689


75

9 10,238

10 11,015 acid acetic 11,108

11 12,221

12 13,344

13 14,286

14 18,033

15 20,422 Hydroxymethyl fufural

16 21,733

17 30,412 Fufural

NHẬN XÉT

Dịch nổ hơi có 17 chất, trong đó có 8 chất là có thể giải đoán được. Xylose được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu.

Dịch nổ hơi có màu vàng, đó là do xylan. Xylan là các olygomer của xylose, tạo thành từ quá trình thủy phân hemicellulose.

Trong dịch nổ hơi có chứa các acid: acid oxalic, acid acetic, acid citric. Cụ thể là pH của dịch nổ hơi cho thấy môi trường acid yếu, pH=4,9. Trong thiết bị nổ hơi, nhiệt độ và áp suất cao, nước sẽ thủy phân các nhóm acetyl trong hemicellulose để tạo các acid gây ra môi trường acid trong toàn khối nguyên liệu. Môi trường acid lại thúc đẩy việc thủy phân của hemicellulose vì polysaccharide này không bền trong môi trường acid ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao. Ngoài ra dịch nổ hơi còn có các đường: cellobiose, mannose, arabinose, xylose. Các đường này tạo thành là do hemicellulose và cellulose bị thủy phân trong quá trình nổ hơi. Sự giảm khối lượng của cellulose, hemicellulose và sự tạo thành của các đường 5, đường 6 trong dịch nổ hơi chứng minh cho những điều trình bày trên.

Ngoài ra, quá trình nổ hơi còn tạo thành fufural và hydoxymethyl fufural tương ứng từ xylose và glucose. Đây là một nhược điểm của quá trình nổ hơi vì fufural và hydroxymethyl fufural gây ức chế hoạt động của nấm men. Khi nhiệt độ và áp suất tăng, khả năng tạo thành fufural và hydroxylmethyl fufural cũng tăng. Các peak hydroxymethyl fufura và fufural lần lượt xuất hiện tại 20,422 và 30,412 (Theo giáo sư Mochidzuki – Đại học Tokyo).

TÓM LẠI: trong quá trình tiền xử lý nổ hơi

- Hemicellulose bị phân hủy mạnh, tạo cấu trúc xốp cho xơ sợi. Đồng thời tạo các acid, đường, fufural và các dẫn xuất của fufural.


76

- Cellulose cũng bị phân hủy nhưng với một lượng ít, cấu trúc cellulose trở nên xốp hơn và dễ bị tấn công bởi enzyme hơn.

- Lignin bị phá vỡ cấu trúc, cắt nhỏ mạch, đồng thời một phần bị kết tụ lại, làm giảm bớt tác dụng bao bọc cellulose, thuận lợi hơn co sự tấn công của enzyme.

4.2 QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN

Rơm sau nổ hơi được xác định hàm ẩm và tiến hành thủy phân.

Đối với quá trình thủy phân, 3 yếu tố xác định hiệu quả của quá trình là: nồng độ glucose, hiệu suất tạo thành glucose và tốc độ phản ứng ban đầu. Nồng độ glucose tạo thành và hiệu suất lớn nhất là 2 yếu tố chính để so sánh hiệu quả thủy phân của các điều kiện khác nhau, tốc độ phản ứng ban đầu là yếu tố phụ.

4.2.1 Thành phần dịch thủy phân

Dịch thủy phân được lọc qua phễu lọc và đem đi phân tích HPLC. Kết quả được trình bày ở bảng sau

Bảng 4-6 Thành phần dịch thủy phân

STT Thời gian lưu (phút) Chất Thời gian lưu chất chuẩn (phút)

1 5,394

2 5,919 acid oxalic 5,984

3 6,316 Cellobiose 6,506

4 7,526 Glucose 7,558

5 8,043 Xylose 7,993

6 8,678 Arabinose 8,525

7

8 10,964 Acid acetic 11,108

9

NHẬN XÉT

Kết quả HPLC cho thấy, dịch thủy phân gồm 9 thành phần (với nồng độ đủ lớn để có thể nhận ra nhờ máy HPLC). Trong đó có 6 chất là có thể giải đoán được. Quá trình thủy phân cellulose sẽ tạo ra cellobiose và glucose. Phản ứng thủy phân hemicellulose sẽ tạo ra xylose và arabinose. Vì acid acetic được sử dụng làm chất đệm cho dịch thủy phân


77

nên trong kết quả phân tích có xuất hiện acid acetic. Điều này cho thấy enzyme cellulase thủy phân được cả cellulose và hemicellulose.

4.2.2 Ảnh hưởng của phần trăm bã rắn

Thực hiện khảo sát ảnh hưởng của lượng bã rắn cho vào lên quá trình thủy phân. Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện : nhiệt độ 50oC; pH: 4,8; % enzyme: 5%. Lượng bã rắn cho vào và thời gian lấy mẫu được trình bày trong mục 3.4.3. Kết quả trình bày trong bảng sau

Bảng 4-7 Kết quả ảnh hưởng của phần trăm bã rắn

STT % bã rắn Nồng độ đường(g/l)

Nồng độ cellobiose (g/l)

Hiệu suất (%)

1 5 30,38 1,26 97,05

2 6 33,40 2,38 88,50

3 7 36,09 1,72 82,46

4 8 39,49 - 79,02

5 9 42,84 - 75,64

6 10 46,62 2,14 74,78

7 11 52,28 5,42 75,89

8 12 48,81 - 71,41

9 13 48,81 - 60,15

10 15 50,47 5,4 53,89


78

30.3833.40

46.62

52.28

48.81 48.8150.47

5.40

36.09

42.84

39.49

5.426.362.141.722.381.26

88.50

75.8971.41

60.1553.89

74.7875.64

97.05

82.46

79.02

0

10

20

30

40

50

60

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16% baõ raén

Noàn

g ño

ä (g/l)

0

20

40

60

80

100

120

Hie

äu su

aát (%

)

Noàng ñoä glucoseCellobioseHieäu suaát

Hình 4-6 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất thu được theo % bã rắn cho vào

NHẬN XÉT

Đối với cellobiose, khi % bã rắn thấp (từ 5% đến 10%), lượng cellobiose tích tụ trong dung dịch sau 72 giờ nhỏ (<2,14 g/l). Khi % bã rắn tăng cao (từ 11% đến 15%) lượng cellobiose tích tụ trong dung dịch nhiều và với giá trị hầu như không đổi theo % bã rắn. Khi nồng độ chất rắn tăng, lượng cơ chất tăng nên cellobiose được tạo thành nhiều hơn. Tuy nhiên, cellobiose là sản phẩm trung gian, bị tiêu thụ bởi enzyme β-glucosidase, sự tích tụ cellobiose trong dung dịch sau thời gian dài cho thấy hoạt tính enzyme này bị giảm đối với các % bã rắn cao. Vì glucose tạo thành nhiều ở các % bã rắn cao, gây tác dụng ức chế đối với enzyme β-glucosidase.

Trong khoảng 5 -11% bã rắn, nồng độ glucose thu được trong dung dịch tăng từ 30g/l đến 52,28g/l. Sau đó khi % bã rắn tăng từ 12% đến 15%, nồng độ glucose thu được giảm và giá trị thay đổi không đáng kể. Nồng độ glucose lớn nhất thu được tại 11% bã rắn. Thật vậy, khi nồng độ bã rắn tăng cao, lượng cellulose cũng tăng. Như vậy, lượng cellulose có thể bị tấn công bởi enzyme sẽ tăng lên và kết quả là lượng glucose, cellobiose trong dung dịch cũng tăng theo. Tuy nhiên, khi nồng độ chất rắn tăng quá cao, enzyme sẽ bị bão hòa cơ chất, khả năng tác động của enzyme sẽ giảm và ảnh hưởng tới lượng glucose tạo thành. Ngoài ra, cellobiose có tác dụng ức chế enzyme đặc biệt là


79

cellobiohydrolase, khi nồng độ cơ chất tăng cao đến một ngưỡng nhất định, lượng cellobiose sinh ra sẽ có tác dụng ức chế enzyme cellulase, vì vậy hoạt tính enzyme này bị giảm và lượng glucose sinh ra cũng bị giảm. Mặt khác, khi nồng độ chất rắn cao, dung dịch đậm đặc, quá trình khuếch tán của enzyme trong toàn khối nguyên liệu sẽ rất khó khăn dẫn đến phản ứng thủy phân diễn ra khó khăn, nồng độ glucose thu đuợc nhỏ.

Đối với hiệu suất, tương ứng % bã rắn tăng dần, hiệu suất giảm dần. Với cùng một lượng enzyme, khi nồng độ chất rắn càng nhỏ, enzyme sẽ càng dễ tấn công do dung dịch loãng, khả năng khuếch tán enzyme cao; cơ chất ít, enzyme có thể tác động triệt để hơn. Ngoài ra, khi nồng độ bã rắn tăng, sản phẩm trung gian như cellobiose và sản phẩm cuối cùng như glucose tạo thành nhiều, sẽ gây ra tác dụng ức chế lên enzyme cellulase (cellobiosehydrolase) và β-glucosidase. Chính những lý do trên làm cho hiệu suất của quá trình thủy phân giảm dần khi nồng độ cơ chất tăng.

Như vậy, đối với yếu tố này, hiệu suất và nồng độ glucose thu được là hai hàm nghịch nhau, hiệu suất cao sẽ càng thu được ít glucose. Để đưa ra được kết luận về điểm tốt nhất đối với yếu tố này cầng phải xem xét hai vấn đề. Thứ nhất, hiệu suất liên quan đến việc sử dụng nguyên liệu hiệu quả. Thứ hai, nồng độ glucose liên quan đến quá trình sau, nồng độ glucose càng lớn, quá trình lên men càng thu được nhiều ethanol và như vậy quá trình chưng cất thu ethanol sẽ tiết kiệm hơn về mặt chi phí. Nguyên liệu – rơm rạ là một phế phẩm nông nghiệp, giá thành thấp, trong lúc đó vấn đề năng lượng tiêu tốn cho quá trình chưng cất lại đóng một vai trò quan trọng trong giá thành của bioethanol. Chính vì vậy, vấn đề thứ hai cần được xem xét kĩ. Dựa trên sự thay đổi của nồng độ glucose theo nồng độ chất rắn ban đầu, chọn 11% là nồng độ bã rắn thích hợp cho quá trình thủy phân.

4.2.3 Ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào

Thực hiện khảo sát ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào lên quá trình thủy phân. Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện : nhiệt độ 50oC; pH: 4,8; % bã rắn: 11%. Lượng enzyme cho vào và thời gian lấy mẫu được trình bày trong mục 3.4.3. Kết quả trình bày trong các đồ thị và bảng sau.

Bảng 4-8 Nồng độ glucose theo thời gian ứng với các % enzyme khác nhau

Nồng độ glucose (g/l) Thời gian

1% enzyme 3% enzyme 5% enzyme 7% enzyme 9% enzyme

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,5 3,56 5,47 7,62 9,29 13,35

1 6,01 7,97 7,23 12,90 14,65


80

2 5,06 9,01 15,07 16,36 21,28

24 14,03 34,38 45,83 47,84 50,03

26,5 14,41 34,15 44,88 48,57 55,71

48 - - - 48,67 58,14

72 22,79 47,43 55,80 54,01 60,95

(*) Mẫu được lấy tại 26 giờ

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50 60 70Thôøi gian (giôø)

Noàn

g ño

ä (g/l)

1%3%5%7%9%

Hình 4-7 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian tương ứng với các % enzyme

khác nhau

Bảng 4-9 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian ứng với % enzyme khác nhau

Nồng độ cellobiose (g/l) Thời gian (giờ) 1% enzyme 3% enzyme 5% enzyme 7% enzyme 9% enzyme

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,5 0,37 8,64 8,91 8,89 7,01

1 9,91 11,73 9,25 10,75 8,94

2 8,33 10,67 13,95 11,64 9,79


81

24 9,45 10,92 9,36 6,33 7,21

26,5 9,43 10,24 9,22 5,87 7,61

48 - - - 4,03 4,77

72 8,33 6,25 5,63 3,69 4,22

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Thời gian (giờ)

Nồn

g độ

cel

lobi

ose

(g/l)

1%3%5%7%9%

Hình 4-8 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian ứng với các % enzyme

Bảng 4-10 Hiệu suất quá trình thủy phân theo thời gian ứng với các % enzyme khác nhau

Hiệu suất Thời gian

1% enzyme 3% enzyme 5% enzyme 7% enzyme 9% enzyme

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,5 5,18 7,96 11,09 13,52 19,42

1 8,74 11,59 10,52 18,77 21,30

2 7,36 13,10 21,93 23,81 30,95

24 20,42 50,01 66,69 69,62 72,66


82

26,5 20,97 49,67 65,30 70,67* 80,90

48 - - - 70,82 84,42

72 33,17 69,00 81,23 78,59 88,51

Từ các đồ thị và bảng trên, rút ra được các bảng số liệu và đồ thị sau:

Bảng 4-11 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất và tốc độ ban đầu theo lượng enzyme cho vào

STT % enzyme Nồng độ

glucose (g/l) Nồng độ

cellobiose(g/l) Hiệu suất

(%) Tốc độ ban đầu (g/l.h)

1 1 23 8,33 33 2,33

2 3 47 6,25 69 4,15

3 5 56 5,63 81 6,86

4 7 54 3,69 79 7,56

5 9 61 4,22 89 9,49

23

47

5654

61

8.336.25 5.63

3.69 4.22

33

69

8179

89

0

10

20

30

40

50

60

0 2 4 6 8 10

% enzyme

Noàn

g ño

ä(g/l)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Hiệ

u suấ t

(%)

Glucose

Cellobiose

Hiệu suất

Hình 4-9 Nồng độ glucose, cellobiose thu được và hiệu suất theo % enzyme

Đồng thời vẽ đồ thị của tốc độ phản ứng ban đầu theo % enzyme cho vào.


83

2.33

4.15

6.867.56

9.49

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

% enzyme

Tốc độ

phả

n ứn

g đầ

u (g

/l.giờ

Hình 4-10 Tốc độ phản ứng ban đầu theo % enzyme cho vào

NHẬN XÉT

Khi lượng enzyme cho vào tăng, tốc độ phản ứng ban đầu tăng (hình 4-10). Khi % enzyme tăng từ 1% đến 5% thì tốc độ phản ứng ban đầu tăng nhanh. Khi % enzyme tăng từ 5% đến 9% thì tốc độ phản ứng ban đầu tăng chậm. Thật vậy, khi lượng enzyme cho vào tăng lên, tốc độ phản ứng tăng[4], tuy nhiên khi lượng enzyme tăng đến một giới hạn nhất định, nồng độ cơ chất sẽ là yếu tố hạn chế tốc độ phản ứng, ở giá trị đó, tốc độ phản ứng sẽ không tăng nữa. Trong giới hạn enzyme khảo sát ở nghiên cứu này, chưa thể hiện được giá trị enzyme mà tại đó, tốc độ phản ứng không tăng nữa. Tuy nhiên cũng thể hiện được đoạn tăng chậm trên đồ thị % enzyme – tốc độ phản ứng.

Đối với cellobiose, khi % enzyme tăng, lượng cellobiose tích tụ trong dung dịch tại thời điểm cuối giảm (hình 4-9). Khi lượng enzyme cellulase tăng, lượng β-glucosidase cũng tăng, tương ứng, cellobiose được tiêu thụ mạnh và nồng độ cellobiose còn trong dung dịch ít.

Đối với nồng độ glucose và hiệu suất (hình 4-9), ảnh hưởng của enzyme tương tự như đối với tốc độ ban đầu. Khi lượng enzyme cho vào tăng lên, nồng độ glucose thu được tại 72 giờ tăng, % enzyme tăng 1% - 5%, nồng độ glucose tăng nhanh 23g/l – 56g/l. Nhưng sau đó, từ 5% đến 9% enzyme, nồng độ glucose tăng rất chậm từ 56g/l đến 61g/l, Điều này có thể được giải thích: khi lượng enzyme tăng, sẽ có nhiều enzyme tấn công vào cơ chất hơn nên lượng glucose tạo thành tăng. Tuy nhiên, với một lượng cơ chất nhất định (% bã rắn được giữ không đổi), lượng cellulose cũng nhất định và không phải tất cả


84

cellulose đều có thể bị tấn công bởi enzyme. Khi enzyme tấn công, những phần cellulose dễ bị tấn công như cấu trúc cellulose xốp, vô định hình… sẽ bị thủy phân trước. Khi những phần cellulose này bị mất đi thì tốc độ phản ứng cũng giảm dần [10], khả năng tấn công của enzyme sẽ trở nên rất khó khăn. Vì vậy, ở giai đoạn này, nếu lượng enzyme có được tăng lên thì cũng không cải thiện tốc độ phản ứng cũng như không thể tạo thành nhiều glucose hơn. Việc này cho thấy ứng với mỗi nồng độ bã rắn nhất định, chỉ cần một lượng enzyme nhất định, nhiều hơn cũng không tăng được hiệu suất đáng kể. Enzyme cellulase lại rất mắc, chi phí cho enzyme là chi phí lớn nhất cho quá trình thủy phân, vì vậy cần chọn một giá trị enzyme thích hợp. Đối với yếu tố này, 5% enzyme là giá trị thích hợp, cho hiệu suất cao, nồng độ glucose cao và tiêu tốn một lượng enzyme thích hợp.

4.2.4 Ảnh hưởng của pH

Thực hiện khảo sát ảnh hưởng của pH lên quá trình thủy phân. Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện : nhiệt độ 50oC; % bã rắn: 11%; % enzyme: 5%, pH ban đầu của môi trường và thời gian lấy mẫu được trình bày trong mục 3.4.3.

Bảng 4-12 Nồng độ glucose theo thời gian ứng với các giá trị pH ban đầu khác nhau.

Nồng độ glucose (g/l) Thời gian (giờ) pH=3 pH=4 pH=4,2 pH=4,4 pH=4,6 pH=4,8 pH=5 pH=6

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,5 7,87 6,49 5,79 6,63 5,57 7,62 8,20 6,03

1 9,53 12,84 9,65 9,61 9,31 7,23 10,48 6,94

2 12,33 13,05 12,62 12,62 12,58 15,07 15,90 9,34

3 14,49 16,70 14,86 16,99 17,58 - 17,76 10,19

24 30,30 40,34 40,16 43,66 43,62 45,83 43,30 25,80

26,5 30,69 - - - - 44,88 46,01 26,90

72 22,83 45,55 47,97 48,70 52,78 55,80 53,95 34,34

(-) mẫu không được chạy.


85

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50 60 70Thôøi gian (giôø)

Noàn

g ño

ä glu

cose

(g/l)

pH 4pH 4,2pH 4,4pH 4,6pH 4,8pH 3pH 5pH 6

Hình 4-11 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị pH khác

nhau

Bảng 4-13 Hiệu suất thủy phân theo thời gian ứng với các giá trị pH ban đầu khác nhau

Hiệu suất (%) Thời gian (giờ) pH=3 pH=4 pH=4,2 pH=4,4 pH=4,6 pH=4,8 pH=5 pH=6

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,5 11,40 9,44 8,37 9,63 8,09 11,09 11,90 8,75

1 13,82 18,69 13,96 13,95 13,53 10,52 15,20 10,07

2 17,87 18,99 18,25 18,32 18,28 21,93 23,08 13,54

3 21,01 24,30 21,48 24,66 25,54 - 25,77 14,77

24 43,93 58,70 58,08 63,38 63,38 66,69 63,02 37,40

26,5 44,49 - - - - 65,30 66,97 39,00

72 33,09 66,27 69,37 70,70 76,69 81,23 78,52 49,78

Với các giá trị đo được tại 72 giờ, ta rút ra bảng sau


86

Bảng 4-14 Hiệu suất và nồng độ glucose, cellobiose theo pH dung dịch

STT pH Hiệu suất (%) Nồng độ glucose

(g/l) Nồng độ

cellobiose (g/l)

1 3 44 30,69 5,79

2 4 66 45,55 4,78

3 4,2 69 47,97 7,09

4 4,4 71 48,70 6,66

5 4,6 77 52,78 3,99

6 4,8 81 55,80 5,63

7 5 79 53,95 5,65

8 6 50 34,34 7,89

30.69

53.95

34.34

5.797.89

48.70

55.8052.78

47.97

45.55

5.655.63

3.99

6.667.09

4.78

44

6669 71

7781 79

50

0

10

20

30

40

50

2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5pH

Noàn

g ño

ä (g/

l)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Hie

äu su

aát (%

)

Glucose

Cellobiose

Hiệu suất

Hình 4-12 Hiệu suất, nồng độ glucose và nồng độ cellobiose theo pH dung dịch

NHẬN XÉT

Khi pH tăng từ 3 đến 4,8 thì nồng độ glucose thu đựơc (30,6 g/l đến 55,8 g/l) và hiệu suất tăng (từ 44% đến 81%) (hình 4-12), nhưng khi pH tăng từ 4,8 đến 5 thì nồng độ glucose thu được giảm ( từ 55,80 còn 34,34g/l) và hiệu suất cũng giảm (từ 81% còn 50%). Như đã trình bày ở mục 2.2.3.3 c, ảnh hưởng của pH lên quá trình thủy phân, mỗi enzyme


87

sẽ hoạt động tốt nhất ở một khoảng giá trị pH nhất định. Đối với enzyme cellulase, khoảng pH này là từ 4 đến 5. Điều này được phản ánh ở đồ thị 4-12, nồng độ glucose và hiệu suất đạt được tốt nhất trong khoảng pH từ 4 đến 5, trong đó pH 4,8 cho giá trị cao nhất. Khoảng pH hoạt động của enzyme rất có ý nghĩa với sản xuất công nghiệp vì trong quy mô công nghiệp, việc giữ pH ở một giá trị không đổi là rất khó khăn, vì vậy, việc đưa ra kết luận về một khoảng pH hoạt động sẽ giúp quá trình vận hành đơn giản hơn mà vẫn đạt được hiệu quả quá trình cao.

Đồ thị cho thấy rằng, pH không cho ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và tiêu thụ của cellobiose, nồng độ cellobiose trong dung dịch tại thời điểm kết thúc theo pH không có một quan hệ rõ rệt (hình 4-12).

Đối với yếu tố này, pH 4,8 là giá trị pH cho hiệu quả quá trình thủy phân tốt nhất.

4.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Thực hiện khảo sát ảnh hưởng của pH lên quá trình thủy phân, Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện : pH 4,8; % bã rắn: 11%; % enzyme: 5%, Các nhiệt độ khảo sát và thời gian lấy mẫu được trình bày trong mục 3.4.3. Kết quả trình bày trong các đồ thị và bảng sau.

Bảng 4-15 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị nhiệt độ khác nhau.

Nồng độ glucose (g/l) Thời gian

(giờ) Nhiệt độ thường (28oC)

37 oC 40 oC 50 oC 55 oC 60 oC

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,5 - - - 7,62 - -

1 3,29 8,42 3,71 7,23 9,00 11,70

2 6,28 8,60 7,10 15,07 13,49 14,08

3 6,87 9,05 10,00 - 17,11 17,17

24 26,55 29,85 43,56 49,69 44,99 36,92

26,5 26,77 - - - - -

48 28,38 33,75 46,28 54,35 - 40,30


88

0

10

20

30

40

50

0 10 20 30 40 50Thôøi gian (giôø)

Noàn

g ño

ä glu

cose

(g/l)

Nhieät ñoä phoøng

40

50

37

55

60

Hình 4-13 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị nhiệt độ:

nhiệt độ phòng khác nhau.

Bảng 4-16 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian tương ứng các chế độ nhiệt độ khác nhau.

Nồng độ cellobiose(g/l) Thời gian


37 oC 40 oC 50 oC 55 oC 60 oC

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,5 - - - 8,91 - -

1 5,34 8,52 5,80 9,25 10,13 9,18

2 9,57 11,01 11,83 13,95 11,89 9,58

3 8,80 11,95 14,56 - 13,50 9,87

24 13,36 14,74 15,24 9,36 7,62 3,63

26,5 13,97 - - - - -

48 9,41 12,21 11,04 7,51 5,29 2,34


89

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

0 10 20 30 40 50

Thời gian (giờ)

Nồn

g độ

cel

lobi

ose

(g/l)

Nhiệt độthường37

40

50

55

60

Hình 4-14 Nồng độ cellobiose theo thời gian ứng với các điều kiện nhiệt độ khác

nhau.

Bảng 4-17 Hiệu suất quá trình thủy phân theo thời gian tương ứng các nhiệt độ khác nhau

Hiệu suất (%) Thời gian


37 oC 40 oC 50 oC 55 oC 60 oC

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

0,5 - 11,09 - -

1 4,79 8,79 5,39 10,52 13,01 16,87

2 9,14 11,90 10,31 21,93 19,49 20,29

3 10,01 15,73 14,52 - 24,73 24,75

24 38,66 47,26 63,24 72,30 65,02 53,22

26,5 38,98 - - - - -

48 41,32 49,05 67,19 79,13 71,64 58,10

Từ đồ thị trên, ghi nhận được bảng số liệu sau.


90

Bảng 4-18 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất và tốc độ ban đầu đạt được theo nhiệt độ

STT Nhiệt độ (oC) Nồng độ

glucose (g/l)

Nồng độ cellobiose

(g/l) Hiệu suất (%)

Tốc độ phản ứng ban đầu(g/l,h)

1 Nhiệt độ thường

28,38 9,41 41,32 2,36

2 37oC 32,52 12,21 47,26 3,46

3 40 oC 43,56 9,50 63,24 3,34

4 50 oC 49,69 7,51 49,69 6,86

5 55 oC 44,99 7,62 44,99 5,58

6 60 oC 36,92 3,63 36,92 5,39

28.38

43.56

49.69

44.99

36.92

12.21

7.51 7.62

3.63

32.52

9.41

9.50

72.30

65.02

53.2263.24

41.32

47.26

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

25 30 35 40 45 50 55 60 65

Nhieät ñoä (ñoä C)

Noàn

g ño

ä (g/

l)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

GlucoseCellobioseHiệu suất

Hình 4-15 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất tại 24 giờ theo nhiệt độ


91

2.36

3.46

6.86

5.58 5.39

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

25 30 35 40 45 50 55 60 65

Nhiệt độ (độ C)

Tốc độ

đầu

(g/l.

giờ)

Hình 4-16 Tốc độ phản ứng ban đầu theo nhiệt độ.

NHẬN XÉT

Khi nhiệt độ tăng, tốc độ phản ứng ban đầu tăng (hình 4-16), quan hệ này rõ rệt trong khoảng nhiệt độ từ nhiệt độ thường (28oC) đến 50oC. Thủy phân ở 50oC sẽ cho tốc độ phản ứng ban đầu lớn nhất. Khi nhiệt độ tiếp tục tăng (từ 50oC đến 60oC), tốc độ phản ứng ban đầu giảm. Như đã trình bày trong mục 2.2.3.3 b, ảnh hưởng của nhiệt độ lên tốc độ phản ứng thuỷ phân, tốc độ phản ứng thuỷ phân bằng enzyme tăng theo nhiệt độ, tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất định tốc độ phản ứng sẽ giảm dần đến mức triệt tiêu. Vì enzyme là protein, đến một nhiệt độ nhất định, enzyme sẽ bị bất hoạt và không còn tác dụng nữa. Đối với hệ enzyme cellulase, nhiệt độ này là 50oC.

Đối với glucose và hiệu suất phản ứng (hình 4-15), khi nhiệt độ tăng từ 28oC đến 50oC, lượng glucose tạo thành tăng và do đó hiệu suất cũng tăng. Theo [4] nhiệt độ tăng sẽ làm tăng hoạt tính enzyme, từ đó tốc độ phản ứng enzyme cũng tăng theo và sản phẩm tạo thành nhiều hơn. Tuy nhiên, sau nhiệt độ bất hoạt enzyme, hoạt tính enzyme giảm dần, vì thế sau 50oC, nồng độ glucose và hiệu suất cũng giảm dần.

Đối với cellobiose (hình 4-14 và 4-15), trong giai đoạn đầu của phản ứng (hình 4-14, 3 giờ đầu) lượng cellobiose tạo thành tăng theo nhiệt độ tương ứng đến 50oC, và giảm khi nhiệt độ tăng quá 50oC. Điều này phù hợp với những giải thích nêu trên. Trong giai đoạn


92

phản ứng kết thúc (hình 4-14) nhiệt độ tăng, nồng độ cellobiose tạo thành giảm. Giải thích như sau: đối với khoảng 28 - 50oC, hoạt tính enzyme tăng dần, cellobiose được tiêu thụ mạnh nên lượng tích tụ trong dung dịch tại thời điểm cuối là giảm dần. Tuy nhiên đối với khoảng 50-60oC hoạt tính enzyme bị giảm theo nhiệt độ nên lượng cellobiose tạo thành ít và tương ứng lượng tích tụ ít.

Hình 4-15 cho thấy, khoảng nhiệt độ 40oC - 50oC cho nồng độ glucose chênh lệch không nhiều. Vì vậy nếu quá trình thủy phân được tiến hành trên quy mô lớn thì có thể giữ nhiệt độ cho quá trình ở khoảng nhiệt độ này mà không ảnh hưởng nhiều tới lượng glucose sinh ra. Trong khoảng nhiệt độ này, 50oC là nhiệt độ cho hoạt tính enzyme tốt nhất.

4.2.6 Hiệu suất thủy phân , nồng độ đường tạo thành theo thời gian

Sau các thí nghiệm với các yếu tố trên, tìm được giá trị thích hợp cho các yếu tố lần lượt là: % bã rắn: 11%; % enzyme: 5%; pH 4,8; nhiệt độ 50oC. Tiến hành khảo sát nồng độ đường tạo thành, giúp có một cái nhìn tổng quát về toàn bộ quá trình thủy phân. Thí nghiệm được thực hiện với các giá trị kể trên của các yếu tố và lấy mẫu theo thời gian.

Bảng 4-19 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất theo thời gian

STT Thời gian (h) Nồng độ glucose (g/l)

Nồng độ cellobiose (g/l)

Hiệu suất (%)

1 0 0,00 0,00 0,00

2 1 8,18 10,52 11,92

3 15,75 38,31 11,62 55,77

4 19 41,79 11,09 60,84

5 23 43,86 10,19 63,85

6 24 43,65 9,92 63,55

7 26,5 47,26 9,72 68,80

8 48 54,35 7,51 79,13

9 72 55,80 3,79 81,23


93

0

10

20

30

40

50

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Thôøi gian (giôø)

Noàn

g ño

ä glu

cose

(g/l)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Hie

äu su

aát (%

)

GlucoseCellobioseHiệu suất

Hình 4-17 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất theo thời gian.

NHẬN XÉT

Trong 1 đến 3 giờ đầu tiên (hình 4-17 và 4-14), lượng cellobiose tạo thành nhiều, glucose tạo thành ít. Nồng độ cellobiose trong dung dịch phụ thuộc vào tốc độ sinh ra cellobiose bởi enzyme endo, exo và tốc độ tiêu thụ bởi enzyme β-glucosidase. Ở giai đoạn này, cơ chất mới, tác động của enzyme endo và exo vào cơ chất là tác động chủ yếu. Tốc độ tiêu thụ celllobiose của enzyme β-glucosidase nhỏ hơn tốc độ tạo thành celllobiose, vì vậy lượng celllobiose là chủ yếu trong dung dịch.

Trong 24 giờ tiếp theo, cellobiose giảm và glucose tăng nhanh (43,65 g/l) tương ứng hiệu suất đạt được khá cao (63,85%). Do trong giai đoạn này cellulose và enzyme vẫn còn mới, các cấu trúc dễ bị tấn công của cellulose còn nhiều và không có chất ức chế hoạt tính của enzyme. Enzyme β-glucosidase bắt đầu tiêu thụ cellobiose mạnh, glucose tạo thành nhiều. Đây là giai đoạn glucose được sinh ra nhanh và nhiều nhất trong suốt quá trình phản ứng.

Từ 24 đến 48 giờ, tốc độ phản ứng giảm dần, nồng độ glucose và hiệu suất tăng chậm. Trong giai đoạn này, cellobiose và glucose tích tụ trong dung dịch gây ức chế enzyme, những phần cellulose dễ thủy phân đã hết. Mặt khác, hoạt tính enzyme đã bị


94

giảm nhiều sau một thời gian tác động, một số enzyme bị nhốt trong cấu trúc xốp của cellulose.

Từ 48 giờ đến 72 giờ, nồng độ glucose tăng rất chậm từ 54,35 g/l đến 55,80 g/l, Kết thúc phản ứng ở 72 giờ, nồng độ glucose đạt được là 55,80 g/l tương ứng hiệu suất đạt được là 81,23%. Không thể đạt hiệu suất 100% hay nói cách khác không thể thủy phân tất cả cellulose có trong rơm rạ. Phản ứng thủy phân cellulose là một phản ứng dị thể, vấn đền tiếp xúc pha đóng một vai trò quan trọng [10]. Ngoài ra, cấu trúc cellulose có những phần rất khó bị tấn công bởi enzyme, enzyme không thể tấn công vào để thủy phân phần cơ chất này.

4.3 QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI

Quá trình thủy phân và lên men đồng thời có nhiều ưu điểm so với quá trình thông thường như đỡ hao tốn thiết bị, thời gian, năng lượng, hiệu suất toàn quá trình cao hơn. Làm ra bioethanol từ quá trình thủy phân và lên men đồng thời là một hướng nghiên cứu mới, chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ ở Việt Nam. Trên thế giới đã tiến hành rất nhiều nghiên cứu và đã triển khai sản xuất thử mô hình này.

Nghiên cứu này sẽ tiến hành khảo sát các chất có trong dịch thủy phân và lên men đồng thời, ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào và ảnh hưởng của mật độ nấm men lên hiệu suất quá trình.

4.3.1 Thành phần dịch thủy phân và lên men đồng thời

Dịch thủy phân và lên men đồng thời được lọc qua phễu lọc và đo bằng máy HPLC, Kết quả được trình bày trong bảng sau.

Bảng 4-20 Thành phần dịch thủy phân và lên men đồng thời

STT Thời gian lưu (phút) Chất Thời gian lưu chất

chuẩn (phút)

1 5,507

2 5,163

3 5,974 Acid oxalic 5,985

4 6,332 Cellobiose 6,506

5 7,079

6 7,425 Glucose 7,558

7 8,203 Xylose 7,993


95

8 8,403 Arabinose 8,525

9 8,639

10 9,518 Acid lactic 9,579

11 9,867

12 10,979 Acid acetic 11,108

13 12,354

14 12,735

15 13,213

16 13,888

17 15,502 Ethanol 15,565

Thành phần dịch thủy phân và lên men đồng thời gồm có 17 chất. Trong đó, có thể giải đoán được 8 chất, riêng xylose được giải đoán bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu. Có thể lý giải như sau: cellobiose và glucose là do enzyme tạo thành và nấm men chưa chuyển hóa hết thành ethanol. Xylose và arabinose là những đường pentose có từ quá trình thủy phân của hemicellulose, chủng nấm men sử dụng là saccharomyces cerevisiae chỉ có khả năng lên men đường hexose, vì vậy, các đường này vẫn còn lại trong dịch. Ngoài ra, quá trình lên men còn tạo thành các acid hữu cơ và các aldehyde, một số acid hữu cơ có thể giải đoán được như acid acetic và acid lactic. Các acid khác và các aldehyde do không chạy được chuẩn nên không thể giải đoán được. Ethanol là sản phẩm được tạo thành trong quá trình.

4.3.2 Ảnh hưởng của lượng emzyme cho vào

Thực hiện khảo sát ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào lên quá trình thủy phân và lên men đồng thời. Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện : nhiệt độ 37oC; % bã rắn: 11%; pH: 4,8; mật độ nấm men 23,6 triệu tế bào/ml. Lượng enzyme cho vào và thời gian lấy mẫu được trình bày trong mục 3.4.4. Kết quả trình bày trong các đồ thị và bảng sau.


96

Bảng 4-21 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất toàn quá trình theo % enzyme cho vào tại 24 giờ và 48 giờ.

STT % enzyme Thời gian (giờ)

Nồng độ ethanol (g/l)

Nồng độ glucose còn(g/l)


(g/l)

Hiệu suất (%)

1 24 15,70 1,87 9,08 47,12

2

3%

48 17,09 3,32 4,75 53,17

3 24 18,31 0 11,03 51,76

4

5%

48 27,61 0 2,47 78,05

5 24 24,77 2,24 4,73 73,26

6

7%

48 24,49 3,65 1,76 74,52

7 24 24,31 1,84 1,98 71,26

8

9%

48 21,34 1,81 0,55 62,83

Đồ thị thu được tại 24 giờ

24.3124.77

18.3115.70

0.001.842.241.87

71.2673.26

51.7647.12

0

5

10

15

20

25

30

2 3 4 5 6 7 8 9 10% enzyme

Noàn

g ño

ä (g/

l)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Hiệ

u suấ t

(%)

EthanolGlucoseHiệu suất

Hình 4-18 Nồng độ ethanol, glucose và hiệu suất theo % enzyme, tại 24 giờ


97

Vẽ đồ thị, nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất tại 48 giờ theo lượng enzyme cho vào để thấy được ảnh hưởng của lượng enzyme lên quá trình thủy phân và lên men đồng thời.

17.09

27.61

24.49

21.34

3.32

0.00

1.81

4.75

0.55

3.65

1.76

2.47

53.17

78.0574.52

62.83

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10% enzyme

Noàn

g ño

ä (g/

l)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Hi ệ

u suất

(%)

EthanolGlucoseCellobioseHiệu suất

Hình 4-19 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo % enzyme cho vào

tại 48 giờ

NHẬN XÉT

Khi lượng enzyme tăng từ 3% đến 5% cả nồng độ ethanol và hiệu suất tổng cộng của quá trình đều tăng. Tuy nhiên khi lượng enzyme cho vào tăng từ 5% đến 9%, lượng ethanol và hiệu suất toàn quá trình giảm (chênh lệch nồng độ là 6,27g/l; chênh lệch hiệu suất là 15%).(Hình 4-19)

Thủy phân và lên men đồng thời bao gồm hai quá trình diễn ra song song, thủy phân cellulose thành glucose và lên men glucose thành ethanol. Phản ứng thủy phân là phản ứng dị thể rắn/lỏng, trong khi đó phản ứng lên men là phản ứng đồng thể. Quá trình lên men diễn ra dễ dàng hơn quá trình thủy phân do quá trình khuếch tán glucose từ dung dịch đến tế bào nấm men dễ dàng hơn quá trình hấp phụ và khuếch tán enzyme đến sợi cellulose, chính vì vậy mà enzyme có ảnh hưởng mạnh lên quá trình. Tương tự như đối với quá trình thủy phân, với một lượng cơ chất nhất định, chỉ cần một lượng xác định enzyme là có thể thủy phân hiệu quả. Vì vấn đề hạn chế chính là lượng cellulose có thể bị thủy phân đã hết. Việc dùng lượng enzyme nhiều hơn sẽ không cho hiệu quả đáng kể.

Ngoài ra, trong khảo sát này, khi lượng enzyme tăng cao (7% và 9%) lượng ethanol tạo thành và hiệu suất chuyển hóa lại giảm đi. Đồ thị biểu diễn theo 24 giờ cho thấy trong


98

24 giờ đầu, lượng ethanol và glucose tương ứng với 7% và 9% đều lớn hơn 5%. Sau đó ethanol lại bị giảm đi tại 48 giờ. Có thể giải thích rằng, do sự tích tụ lớn của các sản phẩm này sau 24 giờ đã ức chế hoạt động của nấm men (ethanol) và enzyme (glucose) chính vì thế mà trong khoảng thời gian tiếp theo, hoạt động của enzyme và nấm men trong hai thí nghiệm này không tốt bằng 5%, tạo ra sự giảm quan sát thấy trên đồ thị. Ngoài ra, ethanol có thể bị chuyển hoá thành các acid do sự hiện diện của các vi sinh vật khác trong dung dịch, làm cho nồng độ ethanol bị giảm sau 24 giờ đối với 7% và 9% enzyme.

Đồng thời tại các % enzyme 3%, 7% và 9%, vẫn còn tồn tại một lượng glucose đáng kể tại 48 giờ, điều này cho thấy hoạt tính của nấm men sử dụng không cao. Đây cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến toàn quá trình. Vì nấm men tiêu thụ glucose làm chuyển dịch cân bằng tạo glucose của enzyme cellulase, hoạt tính nấm men không cao ảnh hưởng tới việc tạo ra ethanol đồng thời lượng glucose tích tụ trong dung dịch sẽ ảnh hưởng đến tác dụng làm chuyển dịch cân bằng enzyme.

Từ loạt thí nghiệm này, có thể kết luận % enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân và lên men đồng thời rơm rạ tạo ethanol là 5%.

4.3.3 Ảnh hưởng của mật độ nấm men ban đầu

Thực hiện khảo sát ảnh hưởng của mật độ nấm men cho vào lên quá trình thủy phân và lên men đồng thời. Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện: nhiệt độ 37oC; % bã rắn: 11%; pH: 4,8; % enzyme 5%. Mật độ nấm men cho vào và thời gian lấy mẫu được trình bày trong mục 3.4.4. Để tiện việc trình bày kết quả cũng như theo dõi kết quả, mật độ nấm men 23,6 triệu tế bào/ml được chọn làm gốc, các mật độ khác được biểu diễn dưới dạng tỉ lệ với mật độ này.

Tỉ lệ mật độ nấm men = mật độ nấm men sử dụng (triệu tế bào /ml)/ 23,6


99

Bảng 4-22 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo mật độ nấm men cho vào

STT

Mật độ nấm men (triệu tế bào/ml)

Tỉ lệ mật độ

nấm men

Thời gian (giờ)

Nồng độ ethanol

(g/l)

Nồng độ glucose còn(g/l)


(g/l)

Hiệu suất (%)

1 24 19,11 1,79 5,97 57,94

2 11,8 0,5

48 25,60 0 1,96 72,60

3 24 18,31 0 11,03 51,76

4 23,6 1

48 27,61 0 2,47 78,05

5 24 18,42 1,79 8,51 54,91

6 35,4 1,5

48 26,06 0 2,27 74,01

7 24 23,04 1,72 4,62 67,72

8 47,2 2

48 28,80 0 0,27 81,52

Vẽ đồ thị các mối quan hệ tại 24 giờ

23.04

1.72

18.4218.3119.11

1.79

0.002.59

67.72

51.7654.91

57.94

0

5

10

15

20

25

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Tỉ lệ mật độ nấm men

Noàn

g ño

ä (g/

l)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Hiệ

u suất

(%)

Ethanol GlucoseHiệu suất

Hình 4-20 Nồng độ ethanol, glucose và hiệu suất theo tỉ lệ mật độ nấm men cho vào

tại 24 giờ


100

25.60

27.6126.06

28.80

0.27

2.272.471.96

72.6078.05

74.01

81.52

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

0 0.5 1 1.5 2 2.5Tæ leä maät ñoä naám men

Noàn

g ño

ä (g/

l)

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

80.00

90.00

100.00

Hiệ

u suất

(%)

Ethanol

Glucose

Cellobiose

Hiệu suất

Hình 4-21 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo tỉ lệ mật độ nấm

men cho vào tại 48 giờ

NHẬN XÉT

Nhìn chung, khi mật độ nấm men cho vào tăng lên, lượng ethanol tạo thành tăng và do đó hiệu suất của toàn quá trình cũng tăng. Tuy nhiên, mức độ chênh lệch không nhiều, chỉ trong khoảng 3,2 g/l đối với nồng độ ethanol và 8,92% đối với hiệu suất (hình 4-21). Lượng cellobiose tích tụ tại thời điểm cuối có giá trị gần như nhau đối với các tỉ lệ nấm men 0,5; 1; 1,5 và không có cellobiose tích tụ đối với tỉ lệ nấm men 2 (hình 4-21).

Như vậy, khi mật độ nấm men tăng lên, hiệu suất tạo ethanol cũng tăng, Tuy nhiên điều này chỉ đúng với một khoảng nhất định, khi vượt quá một ngưỡng giá trị, tăng mật độ nấm men không làm tăng hiệu suất chuyển hóa ethanol. Lý do là với mật độ nấm men lớn, nấm men sẽ sử dụng đường tạo thành trong quá trình thủy phân để tăng sinh khối, và như thế lượng ethanol sinh ra sẽ giảm theo [1].

Nấm men sử dụng nhiều sẽ tạo chuyển dịch cân bằng, làm cho cellobiose và glucose bị tiêu thụ mạnh và tương ứng lượng tích tụ của hai chất này ít khi dùng tỉ lệ nấm men cao. Như quan sát trên hình 4-21, tỉ lệ nấm men 2 không còn cellobiose.

Thí nghiệm này cũng cho thấy, quá trình lên men không đóng vai trò lớn trong thủy phân và lên men đồng thời như quá trình thủy phân. Khi mật độ nấm men thay đổi, hiệu suất chuyển hóa của quá trình không thay đổi mạnh như khi % enzyme thay đổi.


101

Đối với thí nghiệm này, chọn mật độ nấm men thích hợp là 23,6 triệu tế bào/ml. Mật độ gấp 2 lần (47,2 triệu tế bào/ml) cho hiệu suất ethanol lớn hơn không nhiều mặt khác sử dụng một lượng nấm men gấp đôi nên hiệu qủa không cao.

4.3.4 Hiệu suất toàn quá trình theo thời gian

Sau các thí nghiệm khảo sát các yếu tố trên, tìm ra được các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân và lên men đồng thời là: mật độ nấm men 23,6 triệu tế bào/ml; % enzyme 5%; pH 4,8; nhiệt độ 37oC; % bã rắn 11%. Tiến hành thí nghiệm khảo sát nồng độ ethanol tạo thành, nồng độ glucose và cellobiose trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời tại các giá trị kể trên.

Bảng 4-23 Nồng độ cellobiose, glucose và ethanol tạo thành theo thời gian trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời

STT Thời gian (giờ)

Nồng độ cellobiose(g/l)

Nồng độ glucose (g/l)

Nồng độ ethanol (g/l)

Hiệu suất (%)

1 0 0,00 0,00 0,00 0,00

2 2 9,96 6,73 1,73 14,58

3 21 4,59 1,87 22,10 65,10

4 24 4,21 1,79 24,73 72,40

5 26 3,13 1,89 25,49 74,68

6 51 0,72 0 29,23 82,53

7 74 0,88 0 30,68 86,61


102

Từ số liệu trên vẽ được đồ thị sau

0.001.73

22.10

30.6829.23

24.7325.49

0

5

10

15

20

25

30

35

0 10 20 30 40 50 60 70 80Thời gian (giờ)

Nồn

g độ

(g/l)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Hiệ

u suất

(%)

EthanolGlucoseCellobioseHiệu suất

Hình 4-22 Nồng độ cellobiose, glucose và ethanol tạo thành theo thời gian trong

quá trình thủy phân và lên men đồng thời.

NHẬN XÉT

Trong thời gian đầu (2 giờ), glucose và cellobiose được tạo thành nhanh, ethanol tạo thành không nhiều (hình 4-22). Nồng độ clellobiose trong dung dịch được quyết định bởi tốc độ thuỷ phân của enzyme endo, exo và tốc độ tiêu thụ cellobiose của enzyme β-glucosidase . Nồng độ glucose được quyết định bởi tốc độ tạo phản ứng thuỷ phân bằng enzyme cellulase và tốc độ lên men của nấm men. Tuỳ thuộc vào mối quan hệ của các tốc độ này, cellobiose và glucose trong dung dịch sẽ có các giá trị nồng độ khác nhau. Như được đề cập trong [9] giai đoạn đầu, nấm men không lên men kịp tốc độ tạo thành glucose từ phản ứng thủy phân cellulose của enzyme. Ngoài ra, cơ chất trong giai đoạn này là mới, các bề mặt dễ tấn công còn nhiều, enzyme chưa bị ức chế. Vì vậy tồn tại glucose và cellobiose tích tụ trong dung dịch ở giai đoạn này. Hoạt động của nấm men trong giai đoạn này còn yếu, glucose không bị tiêu thụ mạnh, lượng glucose tích tụ trong thời điểm này sẽ làm hạn chế tốc độ thủy phân của enzyme β-glucosidase.

Sau đó, trong 24 giờ tiếp theo, khi nấm men đã thích nghi được với môi trường và tăng sinh khối đáng kể. phản ứng lên men tạo ethanol diễn ra nhanh và quá trình thủy phân tạo glucose trở thành giai đoạn quyết định tốc độ phản ứng. Lúc này, lượng glucose


103

không còn đủ để ức chế enzyme β-glucosidase nữa, phản ứng thủy phân diễn ra nhanh hơn, tác dụng chuyển dịch cân bằng của quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời được thể hiện trong giai đoạn này. Từ 24 đến 51 giờ, nồng độ ethanol vẫn tiếp tục tăng nhưng chậm, nồng độ cellobiose và glucose dần giảm tới 0.

Từ 51 đến 74 giờ, ethanol vẫn được tạo thành nhưng với tốc độ chậm, lượng glucose và cellobiose không còn đáng kể. Tuy nhiên, như đã trình bày ở mục 2.2.5.2, hiệu suất quá trình chỉ đạt được đến 86,61%. Lý do là vẫn có những phần cellulose không thể bị tấn công bởi enzyme.

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

104

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 KẾT LUẬN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN

Từ các thí nghiệm khảo sát các yếu tố, rút ra được điểm tốt nhất cho quá trình thủy phân rơm rạ bằng enzyme

% bã rắn 11%

% enzyme 5%

Nhiệt độ 50oC

pH 4,8

Nồng độ glucose đạt được 55,08 g/l

Hiệu suất 81,23%

Như vậy, khi tiến hành thủy phân ở điều kiện này, 1 kg rơm thô sẽ thu được 204,16g glucose.

5.2 KẾT LUẬN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI

Từ các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng các yếu tố, kết luận được điểm tốt nhất cho quá trình thủy phân và lên men đồng thời

Mật độ nấm men 23,2 triệu tế bào/ml

% enzyme 5%

% bã rắn 11%

Nhiệt độ 37oC

pH 4,8

Nồng độ ethanol đạt được 30,68 g/l

Nồng độ glucose tích tụ 0 g/l

Hiệu suất 86,61%

Nếu tiến hành quá trình thủy phân và lên men đồng thời ở điều kiện này, 1 kg rơm thô sẽ thu được 113,72 g ethanol tương đương 144 ml ethanol. Trong thí nghiệm tiến hành với rơm đã qua tiền xử lý bằng acid yếu, Keikhosro Karimi và cộng sự [13], 1 kg rơm sẽ cho 172g ethanol tương ứng 218ml ethanol đối với quy trình sử dụng nấm men S.cerevisiae.

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

105

5.3 SO SÁNH HIỆU SUẤT TOÀN QUÁ TRÌNH CỦA THỦY PHÂN VỚI THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI

Như đã trình bày ở trên, hiệu suất quá trình thủy phân thường là yếu tố quyết định lên hiệu suất toàn quá trình. Vì quá trình lên men thường đạt hiệu suất rất cao (99%) do phản ứng lên men là đồng thể nên dễ xảy ra. Trong khi đó enzyme thường không thủy phân hết được lượng cellulose có trong rơm rạ. Hiệu suất toàn quá trình thường bằng hoặc nhỏ hơn hiệu suất quá trình thủy phân.

Hiệu suất quá trình thủy phân và lên men đồng thời đạt được 86,62% ( tại 74 giờ), lớn hơn so với hiệu suất quá trình thủy phân 81%. Như vậy, có thể chỉ ra rằng quá trình thủy phân và lên men đồng thời cho hiệu suất cao hơn quá trình thủy phân thông thường, hay nói cách khác cao hơn quá trình thủy phân và lên men tách biệt. Bên cạnh đó, quá trình tiến hành trong thời gian ngắn hơn (48 – 72 giờ, so với 6 ngày (144 giờ) như các quá trình thông thường). Các thiết bị cũng được giảm từ hai còn một thiết bị nếu sử dụng thủy phân và lên men đồng thời.

5.4 ĐỀ NGHỊ

Để quá trình sản xuất bioethanol từ rơm rạ và từ nguồn nguyên liệu lignocellulose có hiệu quả hơn, tác giả đưa ra một số đề nghị như sau:

Quá trình thủy phân và lên men đồng thời rất có ý nghĩa đối với công nghiệp sản xuất bioethanol từ nguồn nguyên liệu lignocellulose chung và từ rơm rạ nói riêng. Những kết quả từ nghiên cứu này cũng đã phần nào chứng minh tính khả thi của quá trình này. Tuy nhiên, nghiên cứu này vẫn còn nhiều hạn chế. Việc nghiên cứu kỹ hơn quá trình thủy phân và lên men đồng thời là rất có ý nghĩa đối với việc sản xuất bioethanol.

Hiệu suất quá trình thủy phân cũng như thủy phân và lên men đồng thời chỉ đạt đến ngưỡng 80%. Cellulose cũng đóng một vai trò rất lớn vào sự hạn chế này. Có những phần cellulose không thể bị tấn công bởi enzyme, làm ảnh hưởng tới hiệu suất toàn quá trình. Nghiên cứu để nâng cao hiệu quả của quá trình tiền xử lý là cần thiết.

Kết quả phân tích dịch thủy phân cũng như thủy phân và lên men đồng thời chỉ ra rằng, trong dịch có tồn tại các đường pentose gồm xylose và arabinose, nấm men saccharomyces cerevisiae không thể lên men các đường này. Một quy trình được đề ra là dịch sau lên men đường hexose được loại ethanol (chưng cất…) sau đó sẽ tiếp tục lên men đường 5. Quá trình lên men lần hai này có thể tiến hành bằng chủng nấm men Pichia Stipitis. Như vậy sẽ tận dụng hết lượng cơ chất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

106

TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Cao Đình Khánh Thảo, Nghiên cứu thử nghiệm khả năng xử lý rơm rạ để

lên men ethanol, Luận văn Đại học, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Khoa Công Nghệ Hóa Học, 01/2007

[2] TS. Nguyễn Thị Ngọc Bích, Kỹ thuật cellulose và giấy, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2003.

[3] Hồ Sĩ Tráng, Cơ sở hoá học gỗ và cellulose, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, trang 30-81.

[4] TS. Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2001.

[5] TS. Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ sinh học, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2001.

[6] Th.S Trịnh Hoài Thanh, Nghiên cứu quá trình xử lý rơm rạ để chế biến cồn nhiên liệu, Luận văn Thạc sĩ, Bộ môn Máy Thiết bị - Khoa Công nghệ Hóa học.

[7] Nguyễn Ngọc Quế, Trần Đình Thao, Báo cáo tổng quan ngành hàng lúa gạo Việt Nam, Viện Chính sách và Chiến lược Phát triển Nông Nghiệp Nông Thôn, 2005.

[8] TS. Nguyễn Thế Bảo, TS.Bùi Tuyên, Điều tra quy hoạch các dạng năng lượng mới trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh, Sở Khoa học và Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, 2001.

[9] Charles E.Wyman, Handbook on Bioethanol: Product and Utilization, Taylor&Francis, 1996. p 119-285

[10] Hetti Palonen, Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose, VTT Biotechnology, 2004, p 11-39.

[11] M.Roehr, The Biotechnology of ethanol classical and future application, Weinheim, WILEY-VCH Verlag GmbH, 2001.

[12] Ilona Sárvári Horváth, Carl Johan Franzén, Mohammad J. Taherzadeh, Claes Niklasson, Gunna Lidén, Effect of Fufural on the Respiratory Metabolism of Saccharomyces Cerevisiae in Glucose-Limited Chemostats, American Scociety for Microbiology vol.69, 07/2004, p.4076-4086.

[13] Keikhosro Karimi, Giti Emtiazi, Mohammad J. Taharzadeh, Ethanol production from dilute-acid pretreated rice straw by simultaneous saccharification

TÀI LIỆU THAM KHẢO

107

and fermentation with Mucor indicus, Rhizopus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, Science Direct, Enzyme and microbial Technology 40, 2006, p 138-144.

[14] Lonnie O. Ingram, Joy B.Doran, Conversion of cellulosic materials to ethanol, FEMS Microbiology Reviews, 1995.

[15] Carlo N Hamelinck, Greertje van Hooijdonk, André PC Faaij, Ethanol from lignocellulosic biomass: techno-economic performance in short-, middle- and long-term, Science Direct, Biomass and bioenergy 28, 2005, p.384-410 .

[16] M. Clark Dale và Mark Moelhman, Enzymatic Simultaneous saccharification and fermentation of biomass to ethanol in a pilot 130 liter multistage continuous reaction separator.

[17] Haagensen F., Ahring B.K., Enzymatic hydrolysis and glucose fermentation of wet oxidized sugarcane bagasse and rice straw for bioethanol production, Environment Microbiology & Biotechnology Research Group, Technical University of Denmark.

[18] Seungdo Kim, Bruce E. Dale, Global potential bioethanol production from wasted crops, Science Direct, Biomass and Bioenergy 26, 2004, p.361-375.

[19] Jeibing li, Gunnar Henriksson, Goran Gellerstedt, Lignin depolymerization/ repolymerization and its critical role for deligninfication of aspen wood by steam exposion, Science Direct, Bioresource Technology 98, 2007, p. 3061-3068 .

[20] Muhammad Ibrahim Rajoka, The enzymatic hydrolysis and fermentation of pretreated wheat straw and bagasse to ethanol, ATDF Journal Volume 2, Issue 2, p.29-35

[21] Ghasem Najafpour, Habibollah Younesi, Ku Syahidah Ku Ismail, Ethanol fermentation in an immobilized cell reactor, Science Direct, Bioresource Technology 92, 2004, p.251-260.

[22] Luiz Pereira Ramous, The chemistry involved in the steam treatment of lignocellulosic materials, Quin. Nova, 2003.

[23] Karin Ohgren, Oskar Bengtsson, Marie F.Gorwa-Grauslund, Simultaneous saccharification and co-fermentation of glucose and xylose in steam-pretreated corn stover at high fiber content with Saccharomyces cerevisiae TMB3400, Science Direct.

[24] Jesper Norgard, Ethanol production from biomass – optimization of simultaneous saccharification and fermentation with respect to stirring and heating, Department of Chemical engineering, Lund Institute of Technology.

PHỤ LỤC

108

PHỤ LỤC TÍNH HIỆU SUẤT

Một số kí hiệu sử dụng:

Khối lượng bã sử dụng mrom (g)

Hàm ẩm a %

Phần trăm cellulose trong bã b %

Khối lượng cellulose có trong bã mcellulose-1 (g)

Thể tích dung dịch V (ml)

Nồng độ glucose trong dung dịch Cglucose (g/l)

Khối lượng mol cellulose 162×n (g)

Khối lượng mol glucose 180 (g)

Khối lượng cellulose phản ứng mcellulose-2 (g)

Nồng độ ethanol trong dung dịch Cethanol (g/l)

Khối lượng cellulose bị lên men mcellulose-3 (g)

HIỆU SUẤT QUÁ TRÌNH THUỶ PHÂN

Khối lượng cellulose có trong bã ban đầu

000.10)100(

1bam

m romcellulose

×−×=− (g) (4)

Khối lượng cellulose thủy phân

180162

10001000cos

cos

cos2 ×

×=

××

×=−

VCMn

MVCm eglu

eglu

celluloseeglucellulose (g) (5)

Hiệu suất phản ứng thuỷ phân

%1001

2 ×=−

−

cellulose

cellulose

mm

H (6)

HIỆU SUẤT QUÁ TRÌNH THUỶ PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI

Tính khối lượng cellulose có trong bã ban đầu theo (4)

Tính khối lượng cellulose bị thuỷ phân ứng với nồng độ glucose còn trong dung dịch

PHỤ LỤC

109

Khối lượng cellulose tham gia phản ứng lên men

462162

1000210003 ××

×=

×××

×=−

VCMn

MVCm ethanol

ethanol

celluloseethanolcellulose (g) (7)

Hiệu suất quá trình thủy phân và lên men đồng thời

%1001

32 ×+

=−

−−

cellulose

cellulosecellulose

mmm

H (8)

TÍNH TỐC ĐỘ PHẢN ỨNG BAN ĐẦU

Từ các giá trị nồng độ glucose đo được ứng với các thời điểm ban đầu: 0; 0,5; 1; 2; 3 giờ. Tiến hành vẽ đồ thị nồng độ glucose – thời gian. Từ đồ thị, dùng phương pháp bình phương cực tiểu nội suy ra dạng đường thẳng đi qua các điểm. Giá trị hệ số góc của đường thẳng nội suy được chính là tốc độ phản ứng ban đầu.

Thủy phân rơm rạ - Lên men cồn

Documents

Transcript of Thủy phân rơm rạ - Lên men cồn