Terapia Genica

• E’ un approccio moderno per trattare, curare o in ultima analisi prevenire una malattia cambiando l’espressione di uno o più geni. Può essere applicata a cellule somatiche o a cellule germinali.

• La terapia genica allo stato attuale è largamente sperimentale. La terapia genica germinale non è ad animali di grossa taglia e all’uomo.

Gene therapy in medicina interna

• Definizione: modificazione di un fenotipo mediante trasferimento di (un) gene.

• Notevolmente sviluppata dal punto di vista sperimentale in modelli cellulari ed animali.

• Relativamente avanzata dal punto di vista clinico.

Cosa è realmente la terapia genica?

• Per inserire un gene in un sistema complesso bisogna innanzitutto avere un gene.

• La terapia genica fornisce quindi uno strumento per conoscere meglio le funzioni dei geni e delle proteine da essi codificati.

A cosa serve la terapia genica?

• Cancro: cellule tumorali, progenitori ematopoietici,T-cells, fibroblasti, cellule muscolari.

• Disordini ereditari monogenici: cellule epiteliali polmonari, macrofagi, progenitori ematopoietici, epatociti, cellule muscolari.

• Malattie infettive: cellule T, progenitori ematopoietici, cellule muscolari.

• Malattie cardiovascolari: cellule endoteliali, cellule muscolari.

• Artrite Reumatoide: cellule epiteliali sinoviali.• Sindrome del tunnel Carpale: cellule nervose.

Sistemi di gene transfer

• DNA nudo

• Lipidi cationici

• Particelle di DNA condensato

• Gene guns

• Virus

Dna nudo

• Funziona meglio in vivo che in vitro.• Uso: vaccini.• Pro: economico e facilmente

maneggiabile.• Contro: poco efficiente, breve

espressione, non si presta a selettività tissutale, crea infiammazione (CpG non metilate).

Lipidi Cationici

• Legano il DNA mediante interazioni elettrostatiche (non covalenti)

• Transitorio• Uso: Fibrosi Cistica (entra bene

nell’epitelio polmonare)• Pro: come il DNA nudo.• Contro: bassa efficienza, breve

espressione.

DNA condensato

• I polimeri usati sono: polilisine, oligopeptidi,imine polietileniche.

• Pro: si presta a future manipolazioni può prababilmente favorire la selettività se usato insieme ad altre tecnologie.

• Contro: come si fa a far andare il dna nel nucleo (dove deve replicarsi).

Gene Guns

• Cannoncini che sparano il DNA nudo o nelle cellule (difficile in vivo) o nell’interstizio. E’ un alternativa all’iniezione.

• Pro: bassa immunogenicità. Sostituirà l’ago nell’iniezione di DNA nudo.

• Contro: Si può sparare sulla pelle, ma quali altri organi?

Elettroporazione

• Mediante delle differenze di potenziale

(scariche elettriche) si fanno dei buchi sulla membrana citoplasmatica e il DNA entra nelle cellule.

• Poco applicabile in vivo, in vitro “uccide” molte cellule.

Vettori virali

• Adenovirus.

• Retrovirus.

• Virus Adeno associati (AAV): Parvo virus.

Adenovirus

• I più efficaci sistemi di gene transfer a disposizione.• Oltre 50 sierotipi di AV umani.• In G.T: si usano quasi esclusivamente il sierotipo 2 e 5, in

più comuni.• 36 Kb DS-DNA.• >50 polipeptidi divisi in:-E1 fattori di trascrizione.-E2 replicatori genoma virale-E3 Fattori prottetivi immunogeni-E4 replicatore genoma viraleFirst generation: E3 def. Circa 7.5 KBNewer generations: E1,E2/E4.

• Promotore CMV.

• Fegato sito di maggiore uptake.

• Pro: molto efficaci, elevata e rapida espressione, relativa specificità.

• Contro: tossici, rapida eliminazione, molti umani sono già sensibilizzati, spesso contaminati.

Retrovirus

• SS-RNA avviluppato in lipidi, 7-11 KB, si inseriscono nel genoma dopo essere stato retrotrascritto.

• Si divide in: Onco Retrovirus, Lenti virus, Spuma virus.

• Infezioni croniche. Ben tollerati dall’ ospite in cui si slatentizzano di tanto in tanto.

• GAG: proteine strutturali; POL: polimerasi; ENV: proteine di superficie.

• 83 KB di Dna eterologo che si può inserire nel genoma.

• Prolonged transgene expression.

• Ridotti livelli di espressione.

• Le proteine di superficie hanno recettori specifici sulle membrane cellulari, per cui entrano più facilmente in alcuni tessuti che in altri.

• Vengono rapidamente eliminati dal circolo.

• Molto usati ex vivo, poco usati in vivo.

Virus Adeno Associati (AAV)

• Parvovirus.• Necessitano di un helper.• 6 sierotipi, si usa il 2.• Non ci sono malattie associati agli AAV.• Nel genoma ci sono 2 geni che producono

multipli polipeptidi:- REP produce prodotti per la

replicazione.- CAP produce proteine strutturali.

• REP permette l’ integrazione nel cromosoma 19.

• Espressione lenta ma duratura

• 5.0 KB di spazio.

• Pro: espressione stabile e duratura.

• Contro: poco spazio, difficile da produrre su larga scala.

Studi clinici

• Malattia: Ischemia (Miocardio,Claudicatio intermittens).• Gene: VEGF.• Transfer: in vivo.• Vettore: Dna nudo.• Risultati: VEGF è un fattore solubile. L’iniezione di DNA

nudo IM conduce all’aumento dei livelli circolanti del fattore induzione della neoangiogenesi. Rivascolarizzazione eterotropa del vaso.

• Obiezioni: Studio in fase 1, mancano i controlli. Per il miocardio, mancano evidenze angiografiche di rivascolarizzazione, solo evidenze “morfologiche e funzionali” ottenute alla scintigrafia.

Studi di fase I/II per valutare la tossicità

• 1° studio: Malattia SCID.• Gene: ADA.• Transfer: ex vivo in T Cell.• Vettore: LASN (Retrovirus).• Risultato: miglioramento del quadro clinico• Obiezioni: scarso numero di pazienti (n=2)

assenza di controlli. La terapia tradizionale non fu discontinuata.

• NIH trial.• Telethon study.

Caso Gelsinger

• Malattia: Iperammonemia.• Gete: OTC (Ornithyne

Transcarbamylase).• Transfer: in vivo, target: il Fegato.• Vettore : Adenovirus, replicatio

deficient.• Risultato: morte per ARDS nell’ ambito

di SIDS.

Gene therapy in Hypertension

• L’ ipertensione è una sindrome (malattia) a trasmissione familiare, ma multifattoriale. Probabilmente più di un gene vi è coinvolto e alcuni geni in certi tipi di ipertensione sono più colpevoli di altri.

• Si definisce iperteso:

Sistolica >140 mmHg.

Diastolica > 90 mmHg

Condizioni cliniche che derivano dall’ipertensione

• Stroke

• Cardiopatia ipertrofica e poi dilatativa.

• Cardiopatia ischemica.

• Arterosclerosi.

• Insufficienza renale.