Tecniche avanzate per la valutazione del trasporto di farmaci e nanoparticelle nella cute

Candidato Mariana Villante

Matr. 512/3152

Relatori

Ch.ma Prof. Fabiana Quaglia

Ch.mo Dr Pellegrino Musto

ANNO ACCADEMICO 2012/2013

La cute è costituita da tre

strati:

Epidermide

Derma

Ipoderma

La cute

La fase limitante per l’assorbimento dei farmaci attraverso la cute è rappresentata dal superamento dello strato corneo (strato più esterno dell’epidermide)

Le nanoparticelle (NPs) sono vettori colloidali polimerici di forma sferica con dimensioni tra 10- 300 nm

NPs a base di polimeri biodegradabili stanno attirando l’attenzione in ragione della loro:

biocompatibilità

capacità di assemblarsi spontaneamente in nanostrutture ad architettura core-shell ed incapsulare farmaci idrofili e lipofili

H2O>CMC

Porzione idrofila

Porzionelipofila

Farmaco lipofiloFarmaco lipofilo

10-100 nm

H2O>CMC

Porzione idrofila

Porzionelipofila

Farmaco lipofiloFarmaco lipofilo

10-100 nm

Farmaco lipofiloFarmaco lipofiloFarmaco lipofiloFarmaco lipofilo

10-100 nm10-100 nm10-100 nm

Core

Shell

Farmaco lipofilo

H2O>CMC

Porzione idrofila

Porzionelipofila

Farmaco lipofiloFarmaco lipofilo

10-100 nm

H2O>CMC

Porzione idrofila

Porzionelipofila

Farmaco lipofiloFarmaco lipofilo

10-100 nm

Farmaco lipofiloFarmaco lipofiloFarmaco lipofiloFarmaco lipofilo

10-100 nm10-100 nm10-100 nm

Core

Shell

Farmaco lipofilo

Architettura core-shell di un

nanosistema

Nanoparticelle polimeriche

Veicolazione di differenti farmaci attraverso la cute

Valutare il trasporto e la permeazione di nanoparticelle contenenti il farmaco attraverso la cute.

Microscopia a fluorescenza

Spettroscopia Raman Confocale

Microspettroscopia FTIR

Nanoparticelle: copolimero a blocchi a base di poli(ε-caprolattone) (PCL) e di polietilenossido (PEO)

Farmaco: Zinco-ftalocianina (ZnPht)

Zinco-ftalocianina

Tessuto cutaneo: pelle di orecchio di maiale

1. Preparazione NPs Formulazione

ZnPht

(mg)

PEG 400

(ml)

Acqua

(ml)

Sepigel

(g)

NPs

(mg)

ZnPht-NPs/W 7,5 - 800 - 3,75

ZnPht-NPs(crio)/W 7,5 - 100 - 3,75

ZnPht-NPs/PEG 7,5 200 - - 3,75

ZnPht-NPs/gel 7,5 - - 1 3,75

Composizione delle formulazioni di NPs caricate con ZnPht

W = acqua, PEG = polietilenglicole, gel = Sepigel, crio = HPβCD

2. Preparazione dei tessuti

Campione Descrizione

A skin non trattata

B skin + ZnPht-NPs/W

C skin + ZnPht-NPs(crio)/W

D skin + ZnPht-NPs/PEG

E skin + ZnPht-NPs/gel

EtOH/THF 1:1

ZnPht

Copolimero in acqua a 75°C

Sonicazione Raffreddamento Evaporazione

Filtrazione (0.45 mm) HPbCD 10:1 come crioprotettore

Sonda ad ultrasuoni

Melting/Sonication

cella di Franz

Quantità iniziale di ZnPht: 0,2% p/p rispetto al copolimero

Microscopia a fluorescenza di sezioni di

orecchio di maiale trattate con le ZnPht-

NPs dopo 24 ore di permeazione

Campioni microtomati in fettine di circa 20 µm

Il PEG e la ciclodestrina hanno potenziato notevolmente il passaggio percutaneo delle NPs, aumentando l’accumulo del farmaco nello strato corneo

Spettroscopia Raman confocaleL’effetto Raman è un esempio di interazione anelastica tra radiazione e materia

La maggior parte dell’onda elettromagnetica incidente passa indisturbata attraverso il campione. Un fotone su un milione ha un urto anelastico.

Urto elastico effetto Rayleigh

Urto anelastico effetto Raman

1. Stokes 2. anti-Stokes

L’onda emessa può avere una frequenza minore dell’onda incidente di una quantità pari al salto energetico vibrazionale (Stokes) o maggiore della stessa quantità (anti-Stokes)

I fotoni che interagiscono con la materia possono essere diffusi in 3 modi:

E’ una tecnica non invasiva e non distruttiva , non richiede alcuna

preparazione del campione ed è in grado di produrre una mappa spettrale, punto per punto, della distribuzione chimica

del campione.

Np-Ctr

Campione non trattato

Np-ZnPht

ZnPht

Np-ZnPht

Contrasto spettroscopico a 1730 e 1114 cm-1

Efficienza di incapsulazione del farmaco nelle nanoparticelle

ARAMIS (Horiba-Jobin Yvon)

Fettine di circa 200 µm di spessore

Parametri di acquisizione dello spettro: laser 532 nm, Obiettivo 50x/0.75

Band Band position (cm-1) Functional group Mode of vibration

1 870 C–C Stretch

2 973 =C–H Out-of-plane bend cis

3 1068 C–C Aliphatic out-of-phase stretch

4 1082 C–C Aliphatic stretch

5 1123 C–C Aliphatic in-phase stretch

6 1269 =C–H Symmetric rock cis

7 1305 CH2 Twisting (all-in-phase)

8 1440 CH2 Symmetric deformation (scissor)

9 1461 CH3 Antisymmetric deformation

10 1657 C = C Stretch

11 1750 C = O Stretch

Scansione effettuata partendo dall’ epidermide fino a 50 µm all’interno del campione.

I segnali osservati in tutti gli spettri sono quelli caratteristici del tessuto: non si osserva alcun picco attribuibile alle nanoparticelle o al farmaco

campione B (skin + Np-ZnPht/W)

-2 0 2 4 6 8 10 12 14

-2

0

2

4

6

8

10

12

142.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6x 10

5

Immagine Raman elaborata considerando

l’intensità del picco a 1440 cm-1

Area di mappatura 15 x 15 µm

Non si osserva alcun picco attribuibile alle nanoparticelle o al farmaco

Si esclude l’agglomerazione delle nanoparticelle in domini di dimensioni micrometriche

campione B (skin + Np-ZnPht/W)

1440 cm-1

Microspettroscopia FTIR

Metodo di indagine che combina la spettroscopia infrarossa e la microscopia ottica

Permette quindi di ottenere informazioni su porzioni molto piccole di campione

La zona sulla quale ottenere lo spettro viene identificata mediante il microscopio ottico. Lo stesso cammino ottico viene poi percorso dal raggio IR

La presenza di un microscopio permette di vedere il proprio campione e selezionare il punto in cui eseguire lo spettro

Np-Ctr

Np-ZnPht

ZnPht

Campione non trattato

Np-ZnPht

Contrasto spettroscopico nelle regioni 1430 – 1260 cm-1 e 1000 –800 cm-1

Lo spettro della nanoparticella nativa è coincidente con quello della nanoparticella caricata

Campioni microtomati in fettine di circa 20 µm e fissati su speciali vetrini.

Parametri di acquisizione dello spettro:Apertura 50 x 50 µm

Lo spettro varia fortemente in base alla posizione in cui viene raccolto

Lo spettro della regione esterna (traccia rossa) è tipico dei componenti lipidici

Verso gli strati più interni del tessuto emergono:

o le bande proteiche (un doppietto a 1650 e 1555 cm-1, rispettivamente, bande ammide I e ammide II e un

picco a 1243 cm-1, banda ammide III)

o la banda (OH) dell’acqua, centrata a circa 3350 cm-1

campione non trattato

Diagramma bidimensionale frequenza – posizione

campione non trattato campione B (skin + Np-ZnPht/W)

In entrambi i campioni esiste uno strato esterno idrofobico in cui la concentrazione d’acqua è praticamente nulla

C’è un punto di discontinuità in cui la concentrazione d’acqua ha un improvviso incremento. Questo punto che caratterizza la profondità dello strato idrofobico è notevolmente più interno nel caso del campione non trattato

campione non trattato

campione trattato

Area della banda analitica dell’acqua (circa 3350 cm-1)in funzione della posizione

La presenza delle nanoparticelle sembra favorire il processo di idratazione del tessuto

L’idratazione cutanea nel campione trattato con nanoparticelle interessa un livello più superficiale rispetto al riferimento

I risultati ottenuti mediante tecnica a fluorescenza hanno evidenziato la capacità delle NPsdi permeare attraverso la cute, superando la barriera dello strato corneo, distribuendosinegli strati cutanei più profondi dell’epidermide

Tutti gli spettri sia IR che Raman sono quelli caratteristici del tessuto: non si osserva alcunpicco attribuibile alle nanoparticelle o al farmaco. Evidentemente, la concentrazione dinanocarica e/o del farmaco è troppo bassa per poter essere rilevata data la sensibilità di talitecniche

I risultati ottenuti dalle misure di Raman imaging in modalità mappatura x-y ci consentonocomunque di escludere l’agglomerazione delle nanoparticelle in domini di dimensionimicrometriche

È stata sviluppata, mediante microscopia FTIR, una metodica semi-quantitativa moltopromettente per la valutazione dell’ idratazione tissutale in funzione della profondità dicampionamento

Sono stati ottenuti profili di concentrazione d’acqua che mostrano che l’idratazione cutaneanel campione trattato con nanoparticelle interessa un livello più superficiale rispetto alriferimento, proprietà che spiegherebbe il trasporto efficiente del nanosistema fino alderma