Tecniche avanzate per la valutazione del trasporto di farmaci e nanoparticelle nella cute
Candidato Mariana Villante
Matr. 512/3152
Relatori
Ch.ma Prof. Fabiana Quaglia
Ch.mo Dr Pellegrino Musto
ANNO ACCADEMICO 2012/2013
La cute è costituita da tre
strati:
Epidermide
Derma
Ipoderma
La cute
La fase limitante per l’assorbimento dei farmaci attraverso la cute è rappresentata dal superamento dello strato corneo (strato più esterno dell’epidermide)
Le nanoparticelle (NPs) sono vettori colloidali polimerici di forma sferica con dimensioni tra 10- 300 nm
NPs a base di polimeri biodegradabili stanno attirando l’attenzione in ragione della loro:
biocompatibilità
capacità di assemblarsi spontaneamente in nanostrutture ad architettura core-shell ed incapsulare farmaci idrofili e lipofili
H2O>CMC
Porzione idrofila
Porzionelipofila
Farmaco lipofiloFarmaco lipofilo
10-100 nm
H2O>CMC
Porzione idrofila
Porzionelipofila
Farmaco lipofiloFarmaco lipofilo
10-100 nm
Farmaco lipofiloFarmaco lipofiloFarmaco lipofiloFarmaco lipofilo
10-100 nm10-100 nm10-100 nm
Core
Shell
Farmaco lipofilo
H2O>CMC
Porzione idrofila
Porzionelipofila
Farmaco lipofiloFarmaco lipofilo
10-100 nm
H2O>CMC
Porzione idrofila
Porzionelipofila
Farmaco lipofiloFarmaco lipofilo
10-100 nm
Farmaco lipofiloFarmaco lipofiloFarmaco lipofiloFarmaco lipofilo
10-100 nm10-100 nm10-100 nm
Core
Shell
Farmaco lipofilo
Architettura core-shell di un
nanosistema
Nanoparticelle polimeriche
Veicolazione di differenti farmaci attraverso la cute
Valutare il trasporto e la permeazione di nanoparticelle contenenti il farmaco attraverso la cute.
Microscopia a fluorescenza
Spettroscopia Raman Confocale
Microspettroscopia FTIR
Nanoparticelle: copolimero a blocchi a base di poli(ε-caprolattone) (PCL) e di polietilenossido (PEO)
Farmaco: Zinco-ftalocianina (ZnPht)
Zinco-ftalocianina
Tessuto cutaneo: pelle di orecchio di maiale
1. Preparazione NPs Formulazione
ZnPht
(mg)
PEG 400
(ml)
Acqua
(ml)
Sepigel
(g)
NPs
(mg)
ZnPht-NPs/W 7,5 - 800 - 3,75
ZnPht-NPs(crio)/W 7,5 - 100 - 3,75
ZnPht-NPs/PEG 7,5 200 - - 3,75
ZnPht-NPs/gel 7,5 - - 1 3,75
Composizione delle formulazioni di NPs caricate con ZnPht
W = acqua, PEG = polietilenglicole, gel = Sepigel, crio = HPβCD
2. Preparazione dei tessuti
Campione Descrizione
A skin non trattata
B skin + ZnPht-NPs/W
C skin + ZnPht-NPs(crio)/W
D skin + ZnPht-NPs/PEG
E skin + ZnPht-NPs/gel
EtOH/THF 1:1
ZnPht
Copolimero in acqua a 75°C
Sonicazione Raffreddamento Evaporazione
Filtrazione (0.45 mm) HPbCD 10:1 come crioprotettore
Sonda ad ultrasuoni
Melting/Sonication
cella di Franz
Quantità iniziale di ZnPht: 0,2% p/p rispetto al copolimero
Microscopia a fluorescenza di sezioni di
orecchio di maiale trattate con le ZnPht-
NPs dopo 24 ore di permeazione
Campioni microtomati in fettine di circa 20 µm
Il PEG e la ciclodestrina hanno potenziato notevolmente il passaggio percutaneo delle NPs, aumentando l’accumulo del farmaco nello strato corneo
Spettroscopia Raman confocaleL’effetto Raman è un esempio di interazione anelastica tra radiazione e materia
La maggior parte dell’onda elettromagnetica incidente passa indisturbata attraverso il campione. Un fotone su un milione ha un urto anelastico.
Urto elastico effetto Rayleigh
Urto anelastico effetto Raman
1. Stokes 2. anti-Stokes
L’onda emessa può avere una frequenza minore dell’onda incidente di una quantità pari al salto energetico vibrazionale (Stokes) o maggiore della stessa quantità (anti-Stokes)
I fotoni che interagiscono con la materia possono essere diffusi in 3 modi:
E’ una tecnica non invasiva e non distruttiva , non richiede alcuna
preparazione del campione ed è in grado di produrre una mappa spettrale, punto per punto, della distribuzione chimica
del campione.
Np-Ctr
Campione non trattato
Np-ZnPht
ZnPht
Np-ZnPht
Contrasto spettroscopico a 1730 e 1114 cm-1
Efficienza di incapsulazione del farmaco nelle nanoparticelle
ARAMIS (Horiba-Jobin Yvon)
Fettine di circa 200 µm di spessore
Parametri di acquisizione dello spettro: laser 532 nm, Obiettivo 50x/0.75
Band Band position (cm-1) Functional group Mode of vibration
1 870 C–C Stretch
2 973 =C–H Out-of-plane bend cis
3 1068 C–C Aliphatic out-of-phase stretch
4 1082 C–C Aliphatic stretch
5 1123 C–C Aliphatic in-phase stretch
6 1269 =C–H Symmetric rock cis
7 1305 CH2 Twisting (all-in-phase)
8 1440 CH2 Symmetric deformation (scissor)
9 1461 CH3 Antisymmetric deformation
10 1657 C = C Stretch
11 1750 C = O Stretch
Scansione effettuata partendo dall’ epidermide fino a 50 µm all’interno del campione.
I segnali osservati in tutti gli spettri sono quelli caratteristici del tessuto: non si osserva alcun picco attribuibile alle nanoparticelle o al farmaco
campione B (skin + Np-ZnPht/W)
-2 0 2 4 6 8 10 12 14
-2
0
2
4
6
8
10
12
142.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6x 10
5
Immagine Raman elaborata considerando
l’intensità del picco a 1440 cm-1
Area di mappatura 15 x 15 µm
Non si osserva alcun picco attribuibile alle nanoparticelle o al farmaco
Si esclude l’agglomerazione delle nanoparticelle in domini di dimensioni micrometriche
campione B (skin + Np-ZnPht/W)
1440 cm-1
Microspettroscopia FTIR
Metodo di indagine che combina la spettroscopia infrarossa e la microscopia ottica
Permette quindi di ottenere informazioni su porzioni molto piccole di campione
La zona sulla quale ottenere lo spettro viene identificata mediante il microscopio ottico. Lo stesso cammino ottico viene poi percorso dal raggio IR
La presenza di un microscopio permette di vedere il proprio campione e selezionare il punto in cui eseguire lo spettro
Np-Ctr
Np-ZnPht
ZnPht
Campione non trattato
Np-ZnPht
Contrasto spettroscopico nelle regioni 1430 – 1260 cm-1 e 1000 –800 cm-1
Lo spettro della nanoparticella nativa è coincidente con quello della nanoparticella caricata
Campioni microtomati in fettine di circa 20 µm e fissati su speciali vetrini.
Parametri di acquisizione dello spettro:Apertura 50 x 50 µm
Lo spettro varia fortemente in base alla posizione in cui viene raccolto
Lo spettro della regione esterna (traccia rossa) è tipico dei componenti lipidici
Verso gli strati più interni del tessuto emergono:
o le bande proteiche (un doppietto a 1650 e 1555 cm-1, rispettivamente, bande ammide I e ammide II e un
picco a 1243 cm-1, banda ammide III)
o la banda (OH) dell’acqua, centrata a circa 3350 cm-1
campione non trattato
Diagramma bidimensionale frequenza – posizione
campione non trattato campione B (skin + Np-ZnPht/W)
In entrambi i campioni esiste uno strato esterno idrofobico in cui la concentrazione d’acqua è praticamente nulla
C’è un punto di discontinuità in cui la concentrazione d’acqua ha un improvviso incremento. Questo punto che caratterizza la profondità dello strato idrofobico è notevolmente più interno nel caso del campione non trattato
campione non trattato
campione trattato
Area della banda analitica dell’acqua (circa 3350 cm-1)in funzione della posizione
La presenza delle nanoparticelle sembra favorire il processo di idratazione del tessuto
L’idratazione cutanea nel campione trattato con nanoparticelle interessa un livello più superficiale rispetto al riferimento
I risultati ottenuti mediante tecnica a fluorescenza hanno evidenziato la capacità delle NPsdi permeare attraverso la cute, superando la barriera dello strato corneo, distribuendosinegli strati cutanei più profondi dell’epidermide
Tutti gli spettri sia IR che Raman sono quelli caratteristici del tessuto: non si osserva alcunpicco attribuibile alle nanoparticelle o al farmaco. Evidentemente, la concentrazione dinanocarica e/o del farmaco è troppo bassa per poter essere rilevata data la sensibilità di talitecniche
I risultati ottenuti dalle misure di Raman imaging in modalità mappatura x-y ci consentonocomunque di escludere l’agglomerazione delle nanoparticelle in domini di dimensionimicrometriche
È stata sviluppata, mediante microscopia FTIR, una metodica semi-quantitativa moltopromettente per la valutazione dell’ idratazione tissutale in funzione della profondità dicampionamento
Sono stati ottenuti profili di concentrazione d’acqua che mostrano che l’idratazione cutaneanel campione trattato con nanoparticelle interessa un livello più superficiale rispetto alriferimento, proprietà che spiegherebbe il trasporto efficiente del nanosistema fino alderma
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