Stevia rebaudiana -

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Departamento de Biología
Propagación in vitro de Stevia rebaudiana Bertoni a partir de ápices de
plantas cultivadas ex vitro
Autor: Dionys González Hernández
Ms. C. Elizabeth Kairuz Hernández-Díaz
Este documento es Propiedad Patrimonial de la Universidad Central “Marta Abreu” de
Las Villas, y se encuentra depositado en los fondos de la Biblioteca Universitaria
“Chiqui Gómez Lubian” subordinada a la Dirección de Información Científico Técnica
de la mencionada casa de altos estudios.
Se autoriza su utilización bajo la licencia siguiente:
Atribución- No Comercial- Compartir Igual
Para cualquier información contacte con:
Dirección de Información Científico Técnica. Universidad Central “Marta Abreu” de
Las Villas. Carretera a Camajuaní. Km 5½. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP. 54 830
Teléfonos.: +53 01 42281503-1419
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Autor: Dionys González Hernández
Ms. C. Elizabeth Kairuz Hernández-Díaz
Santa Clara
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Propagación in vitro de Stevia rebaudiana Bertoni a partir de
ápices de plantas cultivadas ex vitro
Autor: Dionys González Hernández
Ms. C. Elizabeth Kairuz Hernández-Díaz2
1 Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas.
Carretera a Camajuaní km 5,5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830. Dirección de
correo electrónico: [email protected]
2 Departamento de Biología. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Central
Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5,5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba.
CP 54 830. Dirección de correo electrónico: [email protected]
Santa Clara
RESUMEN
Stevia rebaudiana Bertoni es una especie reconocida a nivel mundial por sus propiedades
medicinales. Su cultivo y consumo se han incrementado, por el alto contenido de
edulcorantes naturales no calóricos que presenta. El objetivo de este trabajo fue
desarrollar un protocolo de propagación in vitro de Stevia rebaudiana a partir de explantes
ex vitro. Se procedió a realizar el establecimiento in vitro de ápices, para lo cual se evaluó
el efecto de la concentración de hipoclorito de sodio y el tiempo de desinfección. Los
brotes establecidos fueron transferidos a medio de cultivo de multiplicación, donde se
determinó el efecto de los reguladores de crecimiento y el número de subcultivos sobre el
coeficiente de multiplicación. Se evaluó la supervivencia de las plantas propagadas in vitro
durante la fase de aclimatización ex vitro. Se compararon las plantas propagadas
mediante corte de esquejes y las propagadas in vitro, empleando variables morfométricas
y la técnica de RAPD. Se recomienda el empleo de hipoclorito de sodio al 1% durante 10-
20 minutos para la desinfección de los explantes. La fase de multiplicación debe
realizarse en medio de cultivo sin reguladores de crecimiento, durante cinco subcultivos
cada 15 días. Es posible emplear diversas composiciones de sustrato durante la
aclimatización ex vitro de las plantas propagadas in vitro. Estas desarrollaron mayor
número de hojas y altura, que las propagadas convencionalmente. Ambos grupos
mantienen la variabilidad genética intrínseca de la especie. El protocolo propuesto permite
propagar in vitro plantas de S. rebaudiana en corto tiempo de manera sencilla.
Palabras clave: aclimatización, multiplicación, RAPD, reguladores de crecimiento
ABSTRACT
Stevia rebaudiana Bertoni is worldwide known specie for its medicinal properties. Its
cultivation and consumption have increased, due to the high content of non-caloric natural
sweeteners. The aim of this work was to develop an in vitro propagation protocol of Stevia
rebaudiana Bertoni from ex vitro explants. To in vitro establishment, the effect of sodium
hypochlorite concentration and disinfection time on the survival of the explant was
evaluated. The established shoots were transferred to multiplication culture medium. In
which growth regulators and number of subcultures effects over multiplication coefficient
were determined. The survival of in vitro plants was evaluated using different substrates
on acclimatization stage. Then, the response of the in vitro propagated plants during the
acclimatization phase was evaluated, in comparison with plants propagated by
conventional cuttings using morphologic variables. The variability of both was compared
using the analysis of random amplification patterns of polymorphic DNA segments. The
use of 1% sodium hypochlorite for 10-20 minutes is recommended for the disinfection
process. The multiplication must be carried out in culture medium without growth
regulators, during five subcultures every 15 days at the most. It is possible to employ
various substrate compositions during the acclimatization of micropropagated plants.
These developed a greater number of leaves and height, than those propagated
conventionally. Both groups maintain the intrinsic genetic variability of the specie. The
proposed protocol allows the in vitro propagation of S. rebaudiana plants, easily, in a short
time.
Índice
i
ÍNDICE
2.1.1 Importancia económica ........................................................................................ 5
2.2.1 Propagación convencional ................................................................................... 7
2.2.3 Etapas de la propagación in vitro ......................................................................... 9
2.2.4 Empleo de reguladores del crecimiento ............................................................. 10
2.2.5 Cultivo in vitro de Stevia rebaudiana .................................................................. 11
2.2.6 Propagación vía organogénesis ......................................................................... 14
2.3 Variaciones somaclonales ........................................................................................ 14
3. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................... 16
3.1 Determinación de la concentración de hipoclorito de sodio y el tiempo de exposición
para el establecimiento in vitro de ápices de S. rebaudiana ........................................... 17
3.2 Determinación del efecto de los reguladores del crecimiento y del número de
subcultivos en la multiplicación in vitro de Stevia rebaudiana ........................................ 19
3.2.1 Determinación del efecto del 6-BAP y el AIA en la multiplicación de brotes in
vitro .............................................................................................................................. 19
3.2.2 Determinación del efecto del número de subcultivos sobre el coeficiente de
multiplicación ............................................................................................................... 20
3.3 Determinación de la influencia de diferentes sustratos sobre la supervivencia de
plantas propagadas in vitro de S. rebaudiana durante la fase de aclimatización ex vitro
........................................................................................................................................ 20
3.4 Comparación de plantas de Stevia rebaudiana obtenidas por organogénesis y
propagadas mediante corte de esquejes ........................................................................ 22
3.4.1 Evaluación de variables morfométricas de las plantas en aclimatización ex vitro
..................................................................................................................................... 22
3.4.2 Comparación de los patrones de amplificación de ADN de las plantas obtenidas
por organogénesis y propagadas mediante corte de esquejes ................................... 22
4. RESULTADOS ............................................................................................................... 26
4.1 Determinación de la concentración de hipoclorito de sodio y el tiempo de exposición
para el establecimiento in vitro de ápices de S. rebaudiana ........................................... 26
Índice
ii
4.2 Determinación del efecto de los reguladores del crecimiento y del número de
subcultivos en la multiplicación in vitro de Stevia rebaudiana ........................................ 29
4.2.1 Determinación del efecto del 6-BAP y el AIA en la multiplicación de brotes in
vitro .............................................................................................................................. 29
4.2.2 Determinación del efecto del número de subcultivos sobre el coeficiente de
multiplicación ............................................................................................................... 30
4.3 Determinación de la influencia de diferentes sustratos sobre la supervivencia de
plantas propagadas in vitro de S. rebaudiana durante la fase de aclimatización ex vitro
........................................................................................................................................ 31
4.4 Comparación de plantas de Stevia rebaudiana obtenidas por organogénesis y
propagadas mediante corte de esquejes ........................................................................ 32
4.4.1 Evaluación de variables morfométricas de las plantas en aclimatización ex vitro
..................................................................................................................................... 32
4.4.2 Comparación de los patrones de amplificación de ADN de las plantas obtenidas
por organogénesis y propagadas mediante corte de esquejes ................................... 35
5. DISCUSIÓN .................................................................................................................... 40
5.1 Determinación de la concentración de hipoclorito de sodio y el tiempo de exposición
para el establecimiento in vitro de ápices de S. rebaudiana ........................................... 40
5.2 Determinación del efecto de los reguladores del crecimiento y del número de
subcultivos en la multiplicación in vitro de Stevia rebaudiana ........................................ 41
5.2.1 Determinación del efecto del 6-BAP y el AIA en la multiplicación de brotes in
vitro .............................................................................................................................. 41
5.2.2 Determinación del efecto del número de subcultivos sobre el coeficiente de
multiplicación ............................................................................................................... 43
5.3 Determinación de la influencia de diferentes sustratos sobre la supervivencia de
plantas propagadas in vitro de S. rebaudiana durante la fase de aclimatización ex vitro
........................................................................................................................................ 45
5.4 Comparación de plantas de Stevia rebaudiana obtenidas por organogénesis y
propagadas mediante corte de esquejes ........................................................................ 46
5.4.1 Evaluación de variables morfométricas de las plantas en aclimatización ex vitro
..................................................................................................................................... 46
5.4.2 Comparación de los patrones de amplificación de ADN de las plantas obtenidas
por organogénesis y propagadas mediante corte de esquejes ................................... 47
CONCLUSIONES ............................................................................................................... 50
BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA ......................................................................................... 52
Anexo 1: Protocolos de regeneración in vitro de Stevia rebaudiana vía organogénesis
directa ................................................................................................................................. 59
1. INTRODUCCIÓN
Stevia rebaudiana Bertoni es una especie de la familia Asteraceae, nativa de la región
tropical de Sudamérica. Por sus propiedades medicinales ha alcanzado gran importancia
a nivel mundial. Su cultivo y consumo se han incrementado, por el alto contenido de
edulcorantes naturales no calóricos (esteviósidos y rebaudiósidos) que presenta como
metabolitos secundarios. Cuyo poder endulzante, es más de 300 veces mayor que el de
la sacarosa (Flores y Cortés, 2011). Estos compuestos, además de presentar propiedades
diuréticas y antimicrobianas, pueden ser ingeridos sin ningún tipo de peligro por pacientes
con enfermedades que provocan trastornos del metabolismo de los carbohidratos como la
diabetes mellitus.
La diabetes es una enfermedad cuya incidencia ha aumentado exponencialmente en las
décadas pasadas, sobre todo en países con ingresos medios o bajos. La Organización
Mundial de la Salud estimó en 2014 que cerca de 422 millones de personas adultas
padecían diabetes en el mundo. Solo en 2012 se registró la muerte de 1,5 millones por
causa directa de esta enfermedad, mientras que otros 2,2 millones murieron por causas
asociadas al alto nivel de glucosa en sangre (WHO, 2016). En Cuba, a pesar del
seguimiento médico y la atención social, este trastorno provoca la muerte de más de 2
200 personas al año (ONEI, 2016).
Las plantas de Stevia contienen una compleja mezcla de glucósidos naturales
diterpénicos dulces (glucósidos de esteviol): esteviósido, esteviolbiosido, rebaudiósido A,
rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E y dulcosido A. El mayor
contenido de esteviósidos se encuentra en las hojas, aunque son producidos por todas las
partes verdes de la planta, lo que sugiere que estas sirven como el tejido principal para la
síntesis y acumulación primaria de glucósidos de esteviol (Karimi et al., 2014).
Aunque crezca preferiblemente en zonas subtropicales en Paraguay, Kenya, China y
Estados Unidos, su progresiva demanda la ha convertido en un importante renglón
comercial en Vietnam, Brasil, India, Argentina y Colombia entre otros (Soto y Del Val,
2002). Por sus propiedades medicinales es necesaria la domesticación, producción,
estudios biotecnológicos y mejoramiento genético de esta planta. Sin embargo, varios
autores enfocan sus estudios en el cultivo in vitro como método de propagación masiva.
Esto se debe al hecho de que el rango de germinación de las semillas es bajo, que su
floración esté condicionada por un descenso grande en la temperatura media y que la
Introducción
2
reproducción asexual (por brotes o esquejes) limite la producción a un bajo número de
individuos (Sivaram y Mukundan, 2003).
Dentro de las técnicas de cultivo in vitro empleadas en Stevia, se encuentran: la
propagación in vitro por cultivo de hojas (Das et al., 2011; Naidu et al., 2011; Karimi et al.,
2014), de segmentos internodales (Laribi et al., 2012; Shende y Manik, 2013; Singh et al.,
2014), de ápices (Miyagawa et al., 1986; Anbazhagan et al., 2010; Giridhar y Sowmya,
2010), de callos y suspensiones celulares (Sivaram y Mukundan, 2003), embriogénesis
somática (Swanson et al., 1992; Kornilova y Kalashnikova, 1996; Salim-Uddin et al., 2006)
y el cultivo de anteras (Flachsland et al., 1996). Siendo los protocolos más eficientes y a la
vez más extendidos aquellos que utilizan explantes vegetativos.
Otras investigaciones en esta especie se centraron en el estudio del metabolismo
secundario y los genes involucrados en la biosíntesis de los mismos. Por otra parte, la
biotecnología, y particularmente las técnicas de cultivo in vitro, tienen una aplicación
potencial en la producción industrial de metabolitos bioactivos (Singh et al., 2014).
En la literatura científica se hace referencia a problemas que son necesarios resolver. Los
mismos se enmarcan en la formación de estructuras callosas en las plantas propagadas
in vitro y períodos de subcultivos superiores a tres semanas con bajos coeficientes de
multiplicación (Pande y Gupta, 2013). Por lo que continuar el desarrollo de protocolos más
eficientes u optimizar los ya existentes, constituye una necesidad de primer orden en este
tema. Además de que el desarrollo de un protocolo adaptado a las condiciones de Cuba,
permitiría establecer una línea de producción y extracción de edulcorantes, que pudiera
ayudar al proceso de sustitución de importaciones.
Otro problema en la propagación in vitro es la aparición de variaciones somaclonales
durante el cultivo de células y tejidos. Entre las que se encuentran las influencias
epigenéticas o cambios en la organización del crecimiento (Karp, 1995). La identificación
de estas variaciones en etapas tempranas, así como la disminución de su frecuencia de
aparición, son elementos primordiales para el control de la calidad durante el desarrollo de
cualquier protocolo de propagación in vitro. La Amplificación Aleatoria de ADN Polimórfico
(RAPD, por sus siglas en inglés), ha sido utilizada con mucho éxito para detectar
polimorfismo genético y describir las variaciones somaclonales en individuos regenerados
de diversas plantas, entre ellas varias especies de Stevia (Moktaduzzaman y Mahbubur-
Rahman, 2009; Modi et al., 2012).
Introducción
3
Teniendo en cuenta la problemática planteada anteriormente se establece como
hipótesis: Es posible obtener plantas in vitro de Stevia rebaudiana Bertoni vía
organogénesis a partir de ápices de plantas ex vitro si se determinan las condiciones de
establecimiento, multiplicación y aclimatización ex vitro.
Objetivo general:
- Obtener plantas in vitro de Stevia rebaudiana Bertoni a partir de ápices de plantas
cultivadas ex vitro.
Objetivos Específicos:
1. Determinar la concentración de hipoclorito de sodio y el tiempo de exposición para
el establecimiento in vitro de ápices de S. rebaudiana.
2. Determinar el efecto de los reguladores de crecimiento y el número de subcultivos
en la multiplicación in vitro de S. rebaudiana.
3. Determinar la influencia de diferentes sustratos sobre la supervivencia de plantas
propagadas in vitro de S. rebaudiana durante la fase de aclimatización ex vitro.
4. Comparar las plantas de S. rebaudiana obtenidas por organogénesis y propagadas
mediante corte de esquejes, empleando variables morfométricas y patrones de
amplificación aleatoria de segmentos polimórficos de ADN.
Revisión Bibliográfica
2.1 Stevia rebaudiana Bertoni. Clasificación taxonómica y características botánicas
El primer investigador en ubicar taxonómicamente a Stevia rebaudiana fue Moisés S.
Bertoni, quien la llamó Eupatorium rebaudianum. Su ubicación taxonómica actual se
acepta de la siguiente forma, según NCBI Taxonomy (NCBI, 2017):
Reino: Plantae
Phylum: Streptophyta
División: Magnoliophyta
Subclase: Asteridae
Orden: Asterales
Familia: Asteraceae
Tribu: Eupatorieae
Género: Stevia
Especie: Stevia rebaudiana.
Es conocida comúnmente en español como Stevia, Estevia, KaaHee, Caaje, hoja dulce de
Paraguay, hoja de caramelo, hierba de miel, dulce hierba y planta de los diabéticos.
Stevia rebaudiana, es nativa de la región tropical de Sudamérica, específicamente de
Paraguay, Brasil y el noreste de Argentina (Soto y Del Val, 2002). Aunque en la actualidad
su rango geográfico abarca desde Estados Unidos a Argentina y el alto Brasil (Gantait et
al., 2017).
Es una planta perenne, herbácea, que alcanza generalmente entre 30 y 85 cm de altura,
con tallos secundarios basales; aunque en estado salvaje suele ser rastrera y menos
ramificada. Las raíces son fibrosas y filiformes, rara vez ramificadas. Presenta hojas
simples, alternas, dentadas, lanceoladas a oblongas, de color verde oscuro brillante y
superficie rugosa; a veces algo vellosas, de hasta 5 cm de largo por 2 cm de ancho
(Gantait et al., 2017).
5
Sus flores son pequeñas, tubulares y blancas, sin fragancia. Es mayormente polinizada
por abejas. Es auto incompatible y requiere de fecundación cruzada. Para la inducción de
la floración requiere de un período constante de bajas temperaturas, tras el cual, florecerá
en la próxima primavera. El fruto es un aquenio que puede ser de coloración parda clara
si es estéril u oscura si es fértil y es dispersado por el viento (Alhady, 2011).
La planta se favorece con la materia orgánica de los suelos y es capaz de adaptarse a un
amplio rango de pH de los mismos. Su cultivo se realiza en una amplia gama de suelos,
aunque de manera natural, crece tanto en suelos de baja fertilidad, ácidos, arenosos
como en orgánicos y con alta humedad. El suelo ideal recomendado para su cultivo es el
areno-arcilloso con regular proporción de humus (Aguirre-Dávila, 2008).
Además, requiere días largos, alta intensidad solar y encuentra su óptimo crecimiento a
temperaturas entre los 20 y 26 °C (Jiménez Quesada, 2011). Generalmente, llega a
rebrotar cada primavera desde debajo de las raíces, durante cuatro ó cinco años.
La planta es afectada por los períodos prolongados de sequía, por las características de
su sistema radical. Su desarrollo se potencia en condiciones donde la estación de
crecimiento es larga y la intensidad de luz es alta, con temperaturas medias sobre los 20-
25 oC, riesgos mínimos de heladas luego de la brotación y sin períodos de larga sequía.
Los fotoperiodos largos aumentan la longitud de los entrenudos, el área foliar, la masa
seca y aceleran la aparición de hojas (Aguirre-Dávila, 2008).
2.1.1 Importancia económica
S. rebaudiana ha sido utilizada ancestralmente por los indios guaraníes para endulzar el
Mate. En la actualidad, su cultivo y consumo se han incrementado extendiéndose a
países como Canadá, Estados Unidos, México, Argentina, Brasil, Paraguay, Uruguay,
Chile, Bolivia, Italia, Alemania, India, China, Malasia, Singapur, Corea del Sur, Taiwán,
Tailandia y Japón, entre otros (Gantait et al., 2014). Su característica más atractiva es el
alto contenido de glucósidos de esteviol que produce (Figura 1). Entre los cuales destacan
edulcorantes naturales no calóricos (esteviósidos y rebaudiósidos), cuyo poder es más de
300 veces mayor que el de la sacarosa (Flores y Cortés, 2011).
Revisión Bibliográfica
Figura 1. Estructura química del esteviol y algunos compuestos relacionados. Modificado
de Chatsudthipong y Muanprasat (2009)
Cerca de 230 especies se agrupan dentro del género Stevia, de las cuales solo producen,
glucósidos de esteviol: S. phlebophylla y S. rebaudiana (Ali et al., 2010). La síntesis de
estos compuestos está relegada únicamente a las zonas verdes de la planta (Tabla I),
luego el mayor contenido se produce en las hojas; lo que sugiere que estas constituyen el
principal órgano para la síntesis y acumulación primaria de glucósidos de esteviol. Estos
compuestos, representan alternativas naturales para los alimentos endulzados
sintéticamente y constituyen posibilidades esperanzadoras para pacientes con trastornos
metabólicos relacionados con los carbohidratos.
Tabla I: Glucósidos naturales diterpénicos, presentes en Stevia a diferentes
concentraciones (Karimi et al., 2014)
Glucósidos Concentración
esteviósido (4-13%)
esteviolbiósido (trazas)
7
Se estima que S. rebaudiana consta con más de 144 variedades a nivel mundial (Soto y
Del Val, 2002). Además la planta, contiene carbohidratos, proteínas, fibra, hierro, fósforo,
calcio, potasio, zinc y vitaminas A y C. No existen evidencias documentadas de efectos
secundarios de ninguna clase (mutagénicos o negativos) (Aguirre-Dávila, 2008).
Además de su uso como edulcorantes y como sustituto para pacientes diabéticos, los
glucósidos de esteviol se emplean en concentrados como suplemento alimenticio para
animales y plantas, como tratamiento para suelos estériles, y como terapias medicinales
por sus propiedades diuréticas, para regular la hipertensión y la mala circulación (Sivaram
y Mukundan, 2003).
cicatrizante, cosmética, desintoxicante y digestiva (Chatsudthipong y Muanprasat, 2009).
Refieren también su capacidad de actuar como antibiótico contra las bacterias Escherichia
coli y Staphylococcus aureus, y la levadura Candida albicans (Jiménez Quesada, 2011).
2.2 Métodos de propagación de Stevia rebaudiana
2.2.1 Propagación convencional
La reproducción sexual de Stevia rebaudiana es limitada, pues el rango de germinación
de las semillas es generalmente pobre, menos del 10% (Yadav et al., 2011). Este
disminuye significativamente según aumente la salinidad del sustrato (Liopa-Tsakalidi et
al., 2012).
Es auto-incompatible, con presencia de agamospermia en algunos genotipos. La mayoría
de los miembros del género Stevia son diploides, aunque se han informado varios
ejemplos de tri- y tetraploidías. Debido a anormalidades cromosómicas durante el proceso
de gametogénesis, estos muestran un alto grado de esterilidad masculina (Gantait et al.,
2017). La reproducción por brotes presenta buenas tasas de supervivencia, pero está
limitada, a su vez, al bajo número de brotes que produzca cada planta (de cuatro a seis
en cada rebrote).
Por su parte, la reproducción vegetativa por esquejes de ramas secundarias, terciarias y
cuaternarias, presenta elevados índices de eficacia. Se seleccionan preferentemente…