Stevia rebaudiana - dspace.uclv.edu.cu

, Mayo, 2018

Departamento de Biología

Propagación in vitro de Stevia rebaudiana Bertoni a partir de ápices de

plantas cultivadas ex vitro

Autor: Dionys González Hernández

Tutores: Dra. C. Naivy Lisbet Pérez Alonso

Ms. C. Elizabeth Kairuz Hernández-Díaz

Este documento es Propiedad Patrimonial de la Universidad Central “Marta Abreu” de

Las Villas, y se encuentra depositado en los fondos de la Biblioteca Universitaria

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Universidad Central “Marta Abreu” de las Villas

Facultad de Ciencias Agropecuarias


Tesis de Diploma

Propagación in vitro de Stevia rebaudiana Bertoni a

partir de ápices de plantas cultivadas ex vitro


Tutor: Dra. C. Naivy Lisbet Pérez Alonso

Ms. C. Elizabeth Kairuz Hernández-Díaz

Santa Clara

2018

Universidad Central “Marta Abreu” de las Villas

Facultad de Ciencias Agropecuarias


Tesis de Diploma

Propagación in vitro de Stevia rebaudiana Bertoni a partir de

ápices de plantas cultivadas ex vitro


Tutoras: Dra.C. Naivy Lisbet Pérez Alonso1

Ms. C. Elizabeth Kairuz Hernández-Díaz2

1 Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central Marta Abreu de Las Villas.

Carretera a Camajuaní km 5,5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP 54 830. Dirección de

correo electrónico: [email protected]

2 Departamento de Biología. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Central

Marta Abreu de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5,5. Santa Clara. Villa Clara. Cuba.

CP 54 830. Dirección de correo electrónico: [email protected]

Santa Clara

2018

Pensamiento

Fluctuat nec mergitur…

RESUMEN

Stevia rebaudiana Bertoni es una especie reconocida a nivel mundial por sus propiedades

medicinales. Su cultivo y consumo se han incrementado, por el alto contenido de

edulcorantes naturales no calóricos que presenta. El objetivo de este trabajo fue

desarrollar un protocolo de propagación in vitro de Stevia rebaudiana a partir de explantes

ex vitro. Se procedió a realizar el establecimiento in vitro de ápices, para lo cual se evaluó

el efecto de la concentración de hipoclorito de sodio y el tiempo de desinfección. Los

brotes establecidos fueron transferidos a medio de cultivo de multiplicación, donde se

determinó el efecto de los reguladores de crecimiento y el número de subcultivos sobre el

coeficiente de multiplicación. Se evaluó la supervivencia de las plantas propagadas in vitro

durante la fase de aclimatización ex vitro. Se compararon las plantas propagadas

mediante corte de esquejes y las propagadas in vitro, empleando variables morfométricas

y la técnica de RAPD. Se recomienda el empleo de hipoclorito de sodio al 1% durante 10-

20 minutos para la desinfección de los explantes. La fase de multiplicación debe

realizarse en medio de cultivo sin reguladores de crecimiento, durante cinco subcultivos

cada 15 días. Es posible emplear diversas composiciones de sustrato durante la

aclimatización ex vitro de las plantas propagadas in vitro. Estas desarrollaron mayor

número de hojas y altura, que las propagadas convencionalmente. Ambos grupos

mantienen la variabilidad genética intrínseca de la especie. El protocolo propuesto permite

propagar in vitro plantas de S. rebaudiana en corto tiempo de manera sencilla.

Palabras clave: aclimatización, multiplicación, RAPD, reguladores de crecimiento

ABSTRACT

Stevia rebaudiana Bertoni is worldwide known specie for its medicinal properties. Its

cultivation and consumption have increased, due to the high content of non-caloric natural

sweeteners. The aim of this work was to develop an in vitro propagation protocol of Stevia

rebaudiana Bertoni from ex vitro explants. To in vitro establishment, the effect of sodium

hypochlorite concentration and disinfection time on the survival of the explant was

evaluated. The established shoots were transferred to multiplication culture medium. In

which growth regulators and number of subcultures effects over multiplication coefficient

were determined. The survival of in vitro plants was evaluated using different substrates

on acclimatization stage. Then, the response of the in vitro propagated plants during the

acclimatization phase was evaluated, in comparison with plants propagated by

conventional cuttings using morphologic variables. The variability of both was compared

using the analysis of random amplification patterns of polymorphic DNA segments. The

use of 1% sodium hypochlorite for 10-20 minutes is recommended for the disinfection

process. The multiplication must be carried out in culture medium without growth

regulators, during five subcultures every 15 days at the most. It is possible to employ

various substrate compositions during the acclimatization of micropropagated plants.

These developed a greater number of leaves and height, than those propagated

conventionally. Both groups maintain the intrinsic genetic variability of the specie. The

proposed protocol allows the in vitro propagation of S. rebaudiana plants, easily, in a short

time.

Keywords: acclimatization, growth regulators, multiplication procedure, RAPD

Índice

i

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 1

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................ 4

2.1 Stevia rebaudiana Bertoni. Clasificación taxonómica y características botánicas ...... 4

2.1.1 Importancia económica ........................................................................................ 5

2.2 Métodos de propagación de Stevia rebaudiana .......................................................... 7

2.2.1 Propagación convencional ................................................................................... 7

2.2.2 Propagación in vitro .............................................................................................. 8

2.2.3 Etapas de la propagación in vitro ......................................................................... 9

2.2.4 Empleo de reguladores del crecimiento ............................................................. 10

2.2.5 Cultivo in vitro de Stevia rebaudiana .................................................................. 11

2.2.6 Propagación vía organogénesis ......................................................................... 14

2.3 Variaciones somaclonales ........................................................................................ 14

3. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................... 16

3.1 Determinación de la concentración de hipoclorito de sodio y el tiempo de exposición

para el establecimiento in vitro de ápices de S. rebaudiana ........................................... 17

3.2 Determinación del efecto de los reguladores del crecimiento y del número de

subcultivos en la multiplicación in vitro de Stevia rebaudiana ........................................ 19

3.2.1 Determinación del efecto del 6-BAP y el AIA en la multiplicación de brotes in

vitro .............................................................................................................................. 19

3.2.2 Determinación del efecto del número de subcultivos sobre el coeficiente de

multiplicación ............................................................................................................... 20

3.3 Determinación de la influencia de diferentes sustratos sobre la supervivencia de

plantas propagadas in vitro de S. rebaudiana durante la fase de aclimatización ex vitro

........................................................................................................................................ 20

3.4 Comparación de plantas de Stevia rebaudiana obtenidas por organogénesis y

propagadas mediante corte de esquejes ........................................................................ 22

3.4.1 Evaluación de variables morfométricas de las plantas en aclimatización ex vitro

..................................................................................................................................... 22

3.4.2 Comparación de los patrones de amplificación de ADN de las plantas obtenidas

por organogénesis y propagadas mediante corte de esquejes ................................... 22

4. RESULTADOS ............................................................................................................... 26



Índice

ii




vitro .............................................................................................................................. 29


multiplicación ............................................................................................................... 30



........................................................................................................................................ 31




..................................................................................................................................... 32



5. DISCUSIÓN .................................................................................................................... 40






vitro .............................................................................................................................. 41


multiplicación ............................................................................................................... 43



........................................................................................................................................ 45




..................................................................................................................................... 46



CONCLUSIONES ............................................................................................................... 50

Índice

iii

RECOMENDACIONES ....................................................................................................... 51

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA ......................................................................................... 52

Anexo 1: Protocolos de regeneración in vitro de Stevia rebaudiana vía organogénesis

directa ................................................................................................................................. 59

Introducción

1

1. INTRODUCCIÓN

Stevia rebaudiana Bertoni es una especie de la familia Asteraceae, nativa de la región

tropical de Sudamérica. Por sus propiedades medicinales ha alcanzado gran importancia

a nivel mundial. Su cultivo y consumo se han incrementado, por el alto contenido de

edulcorantes naturales no calóricos (esteviósidos y rebaudiósidos) que presenta como

metabolitos secundarios. Cuyo poder endulzante, es más de 300 veces mayor que el de

la sacarosa (Flores y Cortés, 2011). Estos compuestos, además de presentar propiedades

diuréticas y antimicrobianas, pueden ser ingeridos sin ningún tipo de peligro por pacientes

con enfermedades que provocan trastornos del metabolismo de los carbohidratos como la

diabetes mellitus.

La diabetes es una enfermedad cuya incidencia ha aumentado exponencialmente en las

décadas pasadas, sobre todo en países con ingresos medios o bajos. La Organización

Mundial de la Salud estimó en 2014 que cerca de 422 millones de personas adultas

padecían diabetes en el mundo. Solo en 2012 se registró la muerte de 1,5 millones por

causa directa de esta enfermedad, mientras que otros 2,2 millones murieron por causas

asociadas al alto nivel de glucosa en sangre (WHO, 2016). En Cuba, a pesar del

seguimiento médico y la atención social, este trastorno provoca la muerte de más de 2

200 personas al año (ONEI, 2016).

Las plantas de Stevia contienen una compleja mezcla de glucósidos naturales

diterpénicos dulces (glucósidos de esteviol): esteviósido, esteviolbiosido, rebaudiósido A,

rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E y dulcosido A. El mayor

contenido de esteviósidos se encuentra en las hojas, aunque son producidos por todas las

partes verdes de la planta, lo que sugiere que estas sirven como el tejido principal para la

síntesis y acumulación primaria de glucósidos de esteviol (Karimi et al., 2014).

Aunque crezca preferiblemente en zonas subtropicales en Paraguay, Kenya, China y

Estados Unidos, su progresiva demanda la ha convertido en un importante renglón

comercial en Vietnam, Brasil, India, Argentina y Colombia entre otros (Soto y Del Val,

2002). Por sus propiedades medicinales es necesaria la domesticación, producción,

estudios biotecnológicos y mejoramiento genético de esta planta. Sin embargo, varios

autores enfocan sus estudios en el cultivo in vitro como método de propagación masiva.

Esto se debe al hecho de que el rango de germinación de las semillas es bajo, que su

floración esté condicionada por un descenso grande en la temperatura media y que la

Introducción

2

reproducción asexual (por brotes o esquejes) limite la producción a un bajo número de

individuos (Sivaram y Mukundan, 2003).

Dentro de las técnicas de cultivo in vitro empleadas en Stevia, se encuentran: la

propagación in vitro por cultivo de hojas (Das et al., 2011; Naidu et al., 2011; Karimi et al.,

2014), de segmentos internodales (Laribi et al., 2012; Shende y Manik, 2013; Singh et al.,

2014), de ápices (Miyagawa et al., 1986; Anbazhagan et al., 2010; Giridhar y Sowmya,

2010), de callos y suspensiones celulares (Sivaram y Mukundan, 2003), embriogénesis

somática (Swanson et al., 1992; Kornilova y Kalashnikova, 1996; Salim-Uddin et al., 2006)

y el cultivo de anteras (Flachsland et al., 1996). Siendo los protocolos más eficientes y a la

vez más extendidos aquellos que utilizan explantes vegetativos.

Otras investigaciones en esta especie se centraron en el estudio del metabolismo

secundario y los genes involucrados en la biosíntesis de los mismos. Por otra parte, la

biotecnología, y particularmente las técnicas de cultivo in vitro, tienen una aplicación

potencial en la producción industrial de metabolitos bioactivos (Singh et al., 2014).

En la literatura científica se hace referencia a problemas que son necesarios resolver. Los

mismos se enmarcan en la formación de estructuras callosas en las plantas propagadas

in vitro y períodos de subcultivos superiores a tres semanas con bajos coeficientes de

multiplicación (Pande y Gupta, 2013). Por lo que continuar el desarrollo de protocolos más

eficientes u optimizar los ya existentes, constituye una necesidad de primer orden en este

tema. Además de que el desarrollo de un protocolo adaptado a las condiciones de Cuba,

permitiría establecer una línea de producción y extracción de edulcorantes, que pudiera

ayudar al proceso de sustitución de importaciones.

Otro problema en la propagación in vitro es la aparición de variaciones somaclonales

durante el cultivo de células y tejidos. Entre las que se encuentran las influencias

epigenéticas o cambios en la organización del crecimiento (Karp, 1995). La identificación

de estas variaciones en etapas tempranas, así como la disminución de su frecuencia de

aparición, son elementos primordiales para el control de la calidad durante el desarrollo de

cualquier protocolo de propagación in vitro. La Amplificación Aleatoria de ADN Polimórfico

(RAPD, por sus siglas en inglés), ha sido utilizada con mucho éxito para detectar

polimorfismo genético y describir las variaciones somaclonales en individuos regenerados

de diversas plantas, entre ellas varias especies de Stevia (Moktaduzzaman y Mahbubur-

Rahman, 2009; Modi et al., 2012).

Introducción

3

Teniendo en cuenta la problemática planteada anteriormente se establece como

hipótesis: Es posible obtener plantas in vitro de Stevia rebaudiana Bertoni vía

organogénesis a partir de ápices de plantas ex vitro si se determinan las condiciones de

establecimiento, multiplicación y aclimatización ex vitro.

Objetivo general:

- Obtener plantas in vitro de Stevia rebaudiana Bertoni a partir de ápices de plantas

cultivadas ex vitro.

Objetivos Específicos:

1. Determinar la concentración de hipoclorito de sodio y el tiempo de exposición para

el establecimiento in vitro de ápices de S. rebaudiana.

2. Determinar el efecto de los reguladores de crecimiento y el número de subcultivos

en la multiplicación in vitro de S. rebaudiana.

3. Determinar la influencia de diferentes sustratos sobre la supervivencia de plantas

propagadas in vitro de S. rebaudiana durante la fase de aclimatización ex vitro.

4. Comparar las plantas de S. rebaudiana obtenidas por organogénesis y propagadas

mediante corte de esquejes, empleando variables morfométricas y patrones de

amplificación aleatoria de segmentos polimórficos de ADN.

Revisión Bibliográfica

4

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 Stevia rebaudiana Bertoni. Clasificación taxonómica y características botánicas

El primer investigador en ubicar taxonómicamente a Stevia rebaudiana fue Moisés S.

Bertoni, quien la llamó Eupatorium rebaudianum. Su ubicación taxonómica actual se

acepta de la siguiente forma, según NCBI Taxonomy (NCBI, 2017):

Reino: Plantae

Phylum: Streptophyta

División: Magnoliophyta

Subclase: Asteridae

Orden: Asterales

Familia: Asteraceae

Tribu: Eupatorieae

Género: Stevia

Especie: Stevia rebaudiana.

Es conocida comúnmente en español como Stevia, Estevia, KaaHee, Caaje, hoja dulce de

Paraguay, hoja de caramelo, hierba de miel, dulce hierba y planta de los diabéticos.

Stevia rebaudiana, es nativa de la región tropical de Sudamérica, específicamente de

Paraguay, Brasil y el noreste de Argentina (Soto y Del Val, 2002). Aunque en la actualidad

su rango geográfico abarca desde Estados Unidos a Argentina y el alto Brasil (Gantait et

al., 2017).

Es una planta perenne, herbácea, que alcanza generalmente entre 30 y 85 cm de altura,

con tallos secundarios basales; aunque en estado salvaje suele ser rastrera y menos

ramificada. Las raíces son fibrosas y filiformes, rara vez ramificadas. Presenta hojas

simples, alternas, dentadas, lanceoladas a oblongas, de color verde oscuro brillante y

superficie rugosa; a veces algo vellosas, de hasta 5 cm de largo por 2 cm de ancho

(Gantait et al., 2017).


5

Sus flores son pequeñas, tubulares y blancas, sin fragancia. Es mayormente polinizada

por abejas. Es auto incompatible y requiere de fecundación cruzada. Para la inducción de

la floración requiere de un período constante de bajas temperaturas, tras el cual, florecerá

en la próxima primavera. El fruto es un aquenio que puede ser de coloración parda clara

si es estéril u oscura si es fértil y es dispersado por el viento (Alhady, 2011).

La planta se favorece con la materia orgánica de los suelos y es capaz de adaptarse a un

amplio rango de pH de los mismos. Su cultivo se realiza en una amplia gama de suelos,

aunque de manera natural, crece tanto en suelos de baja fertilidad, ácidos, arenosos

como en orgánicos y con alta humedad. El suelo ideal recomendado para su cultivo es el

areno-arcilloso con regular proporción de humus (Aguirre-Dávila, 2008).

Además, requiere días largos, alta intensidad solar y encuentra su óptimo crecimiento a

temperaturas entre los 20 y 26 °C (Jiménez Quesada, 2011). Generalmente, llega a

rebrotar cada primavera desde debajo de las raíces, durante cuatro ó cinco años.

La planta es afectada por los períodos prolongados de sequía, por las características de

su sistema radical. Su desarrollo se potencia en condiciones donde la estación de

crecimiento es larga y la intensidad de luz es alta, con temperaturas medias sobre los 20-

25 oC, riesgos mínimos de heladas luego de la brotación y sin períodos de larga sequía.

Los fotoperiodos largos aumentan la longitud de los entrenudos, el área foliar, la masa

seca y aceleran la aparición de hojas (Aguirre-Dávila, 2008).

2.1.1 Importancia económica

S. rebaudiana ha sido utilizada ancestralmente por los indios guaraníes para endulzar el

Mate. En la actualidad, su cultivo y consumo se han incrementado extendiéndose a

países como Canadá, Estados Unidos, México, Argentina, Brasil, Paraguay, Uruguay,

Chile, Bolivia, Italia, Alemania, India, China, Malasia, Singapur, Corea del Sur, Taiwán,

Tailandia y Japón, entre otros (Gantait et al., 2014). Su característica más atractiva es el

alto contenido de glucósidos de esteviol que produce (Figura 1). Entre los cuales destacan

edulcorantes naturales no calóricos (esteviósidos y rebaudiósidos), cuyo poder es más de

300 veces mayor que el de la sacarosa (Flores y Cortés, 2011).


6

Figura 1. Estructura química del esteviol y algunos compuestos relacionados. Modificado

de Chatsudthipong y Muanprasat (2009)

Cerca de 230 especies se agrupan dentro del género Stevia, de las cuales solo producen,

glucósidos de esteviol: S. phlebophylla y S. rebaudiana (Ali et al., 2010). La síntesis de

estos compuestos está relegada únicamente a las zonas verdes de la planta (Tabla I),

luego el mayor contenido se produce en las hojas; lo que sugiere que estas constituyen el

principal órgano para la síntesis y acumulación primaria de glucósidos de esteviol. Estos

compuestos, representan alternativas naturales para los alimentos endulzados

sintéticamente y constituyen posibilidades esperanzadoras para pacientes con trastornos

metabólicos relacionados con los carbohidratos.

Tabla I: Glucósidos naturales diterpénicos, presentes en Stevia a diferentes

concentraciones (Karimi et al., 2014)

Glucósidos Concentración

esteviósido (4-13%)

esteviolbiósido (trazas)

rebaudiósido A (2-4%)

rebaudiósido B (trazas)

rebaudiósido C (1-2%)

rebaudiósido D (trazas)

rebaudiósido E (trazas)

dulcósido A (0,4-0,7%)


7

Se estima que S. rebaudiana consta con más de 144 variedades a nivel mundial (Soto y

Del Val, 2002). Además la planta, contiene carbohidratos, proteínas, fibra, hierro, fósforo,

calcio, potasio, zinc y vitaminas A y C. No existen evidencias documentadas de efectos

secundarios de ninguna clase (mutagénicos o negativos) (Aguirre-Dávila, 2008).

Además de su uso como edulcorantes y como sustituto para pacientes diabéticos, los

glucósidos de esteviol se emplean en concentrados como suplemento alimenticio para

animales y plantas, como tratamiento para suelos estériles, y como terapias medicinales

por sus propiedades diuréticas, para regular la hipertensión y la mala circulación (Sivaram

y Mukundan, 2003).

Incluso, otras investigaciones señalan una posible actividad antiácida, antioxidante,

cicatrizante, cosmética, desintoxicante y digestiva (Chatsudthipong y Muanprasat, 2009).

Refieren también su capacidad de actuar como antibiótico contra las bacterias Escherichia

coli y Staphylococcus aureus, y la levadura Candida albicans (Jiménez Quesada, 2011).

2.2 Métodos de propagación de Stevia rebaudiana

2.2.1 Propagación convencional

La reproducción sexual de Stevia rebaudiana es limitada, pues el rango de germinación

de las semillas es generalmente pobre, menos del 10% (Yadav et al., 2011). Este

disminuye significativamente según aumente la salinidad del sustrato (Liopa-Tsakalidi et

al., 2012).

Es auto-incompatible, con presencia de agamospermia en algunos genotipos. La mayoría

de los miembros del género Stevia son diploides, aunque se han informado varios

ejemplos de tri- y tetraploidías. Debido a anormalidades cromosómicas durante el proceso

de gametogénesis, estos muestran un alto grado de esterilidad masculina (Gantait et al.,

2017). La reproducción por brotes presenta buenas tasas de supervivencia, pero está

limitada, a su vez, al bajo número de brotes que produzca cada planta (de cuatro a seis

en cada rebrote).

Por su parte, la reproducción vegetativa por esquejes de ramas secundarias, terciarias y

cuaternarias, presenta elevados índices de eficacia. Se seleccionan preferentemente

esquejes de ramas de más de cinco pares de hojas opuestas y de cerca de 10 cm de

longitud; que serán sembrados durante los meses de inicio de las lluvias, con los dos

primeros pares de hojas por debajo del suelo (Salgado-Cordero, 2013).


8

Sin embargo es el cultivo de tejidos, el método que por excelencia, presenta una

posibilidad de extender la producción a escala industrial, manteniendo una uniformidad

relativa y un incremento en la velocidad de la multiplicación clonal (Das et al., 2011).

2.2.2 Propagación in vitro

El cultivo in vitro es, según George (2008), un conjunto de técnicas que permiten el

desarrollo de células y fragmentos de tejidos hasta tejidos completos o pequeños brotes,

en un ambiente reducido y controlado. Estos se desarrollan en condiciones asépticas, con

tasas de multiplicación, rendimiento y uniformidad elevadas, y sin restricciones

temporales.

La propagación in vitro permite alcanzar ciertas ventajas: Los cultivos iniciales se

establecen a partir de pequeños segmentos de la planta (explantes), que se mantienen en

condiciones de asepsia. Es posible ajustar y controlar la cantidad de nutrientes y

reguladores de crecimiento disponibles para la planta, así como las condiciones de luz y

temperatura. Se obtienen un gran número de plántulas en períodos cortos de tiempo en

comparación con la macropropagación. Se pueden obtener clones de plantas de difícil

propagación vegetativa o que poseen características de interés. El crecimiento es

continuo a lo largo del año sin hacer diferenciación por las estaciones climáticas al crecer

en cámaras de crecimiento con las condiciones controladas (temperatura, humedad). Se

requiere menos espacio y mantenimiento para la propagación que en los métodos

tradicionales. Por último, se puede diagnosticar y mantener la sanidad del cultivo (George

y Debergh, 2008).

Cada tipo de plantas requiere variaciones en los medios de cultivo, tanto en su

composición como en su consistencia. Cada especie tiene requerimientos nutricionales

específicos, así como de factores físicos como luz, temperatura y fotoperiodo. También de

factores químicos como el pH, compuestos orgánicos e inorgánicos, reguladores de

crecimiento e incluso el estado físico del medio de cultivo (semisólidos o líquidos)

(George, 2008; George y de Klerk, 2008).

Las principales reservas contra el cultivo in vitro están dadas por la similitud genética de

las plantas obtenidas, que hace vulnerable a toda una producción contra un patógeno

específico. Además de los recursos necesarios para su implementación, y de las

especificidades de cada especie para una multiplicación óptima (Bespalhok-Filho et al.,

1992).


9

2.2.3 Etapas de la propagación in vitro

Generalmente la propagación in vitro se realiza en cinco fases (Jiménez, 1998; Orellana,

1998; Clemente, 1999):

Fase 0- Selección de las plantas donadoras de explantes

Fase 1- Desinfección y establecimiento del medio de cultivo con los explantes iniciales

bajo condiciones de asepsia

Fase 2- Multiplicación, por yemas axilares o adventicias

Fase 3- Crecimiento de tallos y enraizamiento

Fase 4- Aclimatización a condiciones ex vitro, mediante progresivos cambios de la

temperatura, luz y humedad

Fase de selección o Fase 0

Para la implementación de un sistema de propagación in vitro eficiente y repetible, es

necesario, realizar correctamente esta fase. En esta fase se selecciona la planta

donadora de los explantes y se determinan todas las condiciones para el posterior

establecimiento (Gómez-García, 2013).

Según George y Debergh (2008) el objetivo es garantizar un banco de plantas donantes

de alta calidad genética y disminuir los niveles de contaminación microbiana durante el

establecimiento. Así como aumentar la eficiencia de todo el proceso y la repetibilidad del

mismo.

Fase de establecimiento o Fase I

El objetivo de esta fase es establecer el explante (fisiológicamente vigoroso y libre de

contaminación) para la posterior multiplicación. Los factores que más influyen en la

efectividad del establecimiento son: el tejido vegetal seleccionado, el protocolo de

desinfección a utilizar y el medio de cultivo (Gómez-García, 2013).

Los explantes jóvenes o procedentes de zonas de crecimiento activas presentan mayor

desarrollo. Para desinfectar superficialmente los explantes se utilizan varios compuestos

químicos: con mayor frecuencia el etanol 70% y el hipoclorito de sodio; con menor

frecuencia el hipoclorito de calcio y el bicloruro de mercurio (Jiménez, 1998).


10

Fase de multiplicación o Fase II

La fase de multiplicación por yemas axilares o adventicias es una de las más importantes

desde el punto de vista productivo. En esta fase se incrementa el número de brotes ya

establecidos mediante subcultivos y resiembras periódicas; aumentando el número de

plantas en cada subcultivo (Singh et al., 2014).

La cantidad de plantas obtenidas, la frecuencia de los subcultivos y el número máximo de

estos, así como el coeficiente de multiplicación, dependen de la especie vegetal y en

menor medida, de las condiciones del medio de cultivo (Gómez-García, 2013).

Fase de enraizamiento o Fase III

En esta fase, los brotes deben ser cultivados y manipulados in vitro hasta alcanzar el

desarrollo de un sistema radical funcional, que les permita comenzar la absorción de

nutrientes al ser trasplantados a un sustrato enriquecido. Para ello, se transfieren a un

medio de cultivo sin reguladores del crecimiento, con auxinas o con elevadas

concentraciones de sacarosa (Mroginski et al., 2004).

Fase de aclimatización o Fase IV

Esta fase consiste en el traspaso de las plantas regeneradas de las condiciones aséptica

in vitro, a suelo y posterior adaptación al ambiente. Los factores más importantes en este

paso son precisamente el encuentro con los microorganismos y la presencia de un

sistema radical bien desarrollado (Aguirre-Dávila, 2008).

Esta fase presenta una gran importancia ya que asegura el desempeño que tendrá la

planta en campo, durante el resto de su vida. Una elevada humedad relativa y una baja

intensidad luminosa benefician a las plantas especialmente en los días posteriores al

trasplante (Cifuentes-Hidalgo, 2003).

2.2.4 Empleo de reguladores del crecimiento

Para el cultivo in vitro, se emplean diferentes tipos de sustancias que actúan como

reguladores del crecimiento (auxinas, citoquininas). Aunque los brotes en crecimiento son

capaces de sintetizar pequeñas cantidades de estos compuestos; estos son insuficientes

para soportar el desarrollo y crecimiento en estas condiciones. Por lo que más del 85% de


11

los medios de cultivo empleados en la propagación in vitro incluyen como suplemento

algún tipo de regulador del crecimiento (Quiala et al., 2004).

Las funciones principales de estas sustancias según Nomberto (2001) son: la inducción o

rompimiento de la dominancia apical, aumento del crecimiento de los tallos, promoción de

la división celular en el procambium vascular, diferenciación del xilema secundario,

estimulación de la formación de raíces adventicias. Así como el desarrollo de frutos

(partenocárpicos en ocasiones), la inducción de fototropismo, la promoción de la floración

en algunas especies; y por último, inducir la síntesis de etileno (favoreciendo el cuaje y la

maduración de los frutos) y la inhibición de la abscisión o caída de estos.

Aunque estos compuestos son ampliamente utilizados en el cultivo in vitro, por su

funcionalidad y capacidad de mejorar el crecimiento y desarrollo, también pueden resultar,

en ocasiones, inhibitorios, según su concentración. Algunos pueden provocar

malformaciones en los nuevos tejidos, inducir la aparición de variaciones somaclonales y

otros pueden afectar la translocación de compuestos solubles nitrogenados (Aguirre-

Dávila, 2008).

Según la literatura, el uso de estos compuestos favorece el proceso, a pesar de sus

limitaciones. Aparece reflejado también que sus concentraciones resultan ser el punto

crítico que define su rendimiento óptimo, su papel beneficioso, o su carácter tóxico. Por

eso es necesario evaluar el papel de distintas concentraciones de reguladores de

crecimiento, en solitario, y en acción conjunta.

2.2.5 Cultivo in vitro de Stevia rebaudiana

Por su importancia, los investigadores han implementado diversas técnicas para la

propagación de Stevia a través del cultivo in vitro de diferentes tipos de tejidos. Dentro de

las más utilizadas, destacan: la propagación clonal por cultivo de ápices, la inducción de

brotes múltiples a partir de explantes nodales, el cultivo de establecimiento de callos, el

establecimiento de cultivos de suspensión, la embriogénesis somática y el cultivo de

anteras.

La propagación clonal por cultivo de ápices ha sido abordada utilizando ápices con

algunos primordios foliares en medio de cultivo con agar LS (Linsmaier y Skoog, 1967)

con altas concentraciones de kinetina (10 mg.L-1) (Tamura et al., 1984). También se ha

descrito la alternativa del cultivo de puntas de brotes en medio de cultivo MS (Murashige y


12

Skoog, 1962) compuesto por kinetina (2 mg.L-1) (Das et al., 2011). Se comprobó además

que la inducción de raíces era posible solo con el empleo del medio de cultivo MS sin

reguladores de crecimiento (Pande y Gupta, 2013).

El cultivo de fragmentos internodales ha sido implementado principalmente en medio de

cultivo MS con varias concentraciones de auxinas y citoquininas (AIA (ácido índol-3-

acético), 6-bencilaminopurina (6-BAP), kinetina y N6-(2-Isopentenil)-adenina)). En estos

se obtuvieron los mejores resultados con combinaciones de kinetina (0,5-10 mg.L-1) y de

AIA (2 mg.L-1) o de 6-BAP (1,5-2 mg.L-1) (Yang et al., 1981). Se ha informado que el tipo

de citoquinina resulta ser el factor más importante que afecta la inducción de brotes

múltiples (Alhady, 2011). Para el enraizamiento se ha empleado medio de cultivo MS con

adiciones de ácido naftalenacético (ANA) (1-10 mg.L-1), AIA (0,1 mg.L-1) o AIB (ácido

indol-3-butírico) (1-2 mg.L-1) (Pande y Gupta, 2013). Otros trabajos que destacan en este

tema son los de (Laribi et al. (2012); Shende y Manik (2013); Singh et al. (2014)).

También aparecen otras alternativas como: siembra en medio de cultivo MS líquido a la

mitad de su concentración y kinetina (Delvalle-Báez, 2001); y el empleo de sistemas de

inmersión temporal tipo RITA (Recipiente de Inmersión Temporal Automatizada) durante 5

minutos cada 8 horas (Jiménez Quesada, 2011). Estas investigaciones refieren haber

alcanzado gran número de brotes por explante.

Diversos estudios (Handro et al., 1977; Kornilova y Kalashnikova, 1996; Salim-Uddin et

al., 2006) con diferentes tipos de explantes y disímiles concentraciones de reguladores del

crecimiento, determinaron que la materia prima ideal para la formación de callos son los

explantes de hojas. Así como que el medio de cultivo óptimo debe estar compuesto por

sales MS enriquecido con 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) (1-3 mg.L-1) y ANA (0,75

mg.L-1) (Pande y Gupta, 2013).

Estas especificidades permiten obtener gran número de callos en relativamente poco

tiempo, además el crecimiento de las plantas y el contenido de esteviósidos son más

uniformes que en las plantas obtenidas por semillas (Yadav et al., 2011). A pesar de ello,

la inducción y el crecimiento de callos está influenciado por varios factores externos e

internos, de los cuales, los nutrientes minerales y los reguladores de crecimiento

exógenos son los más importantes.


13

El cultivo de suspensiones celulares en Stevia (Ferreira y Handro, 1988; Sivaram y

Mukundan, 2003), se ha obtenido a partir de callos óptimos en medio de cultivo líquido

con 6-BAP (0,5 mg.L-1) y 2,4-D (1,0 mg.L-1). Pande y Gupta (2013) sugieren que en esta

área se requieren estudios de mayor profundidad, pues los existentes muestran que a

pesar de ser una técnica ideal para la producción a gran escala, exhibe altos índices de

inestabilidad genética.

En la embriogénesis somática, los trabajos se han dividido en dos grupos principales

según el explante inicial utilizado: a partir de explantes vegetativos (principalmente hojas)

(Bespalhok-Filho et al., 1993) y a partir de explantes reproductivos (flores) (Miyagawa et

al., 1984; Bespalhok-Filho y Hattori, 1997). Ambos procedimientos, obtuvieron los mejores

resultados en un medio de cultivo basal, con adiciones de 2,4-D (2,21-5,52 mg.L-1) y 6-

BAP (0,2 mg.L-1) para las hojas y con 2,4-D (4 mg.L-1) y kinetina (0,5 mg.L-1) para las

flores.

El callo con estructuras embriogénicas óptimo fue descrito con coloración verde brillante o

amarillo brillante, de estructura compacta y con varios embriones somáticos globulares en

la superficie (Yadav et al., 2011). Aunque otras investigaciones se han desarrollado en

estas líneas (Swanson et al., 1992; Kornilova y Kalashnikova, 1996; Salim-Uddin et al.,

2006), la literatura especializada reconoce que es necesario continuar profundizando en el

desarrollo de protocolos cada vez más eficientes para la regeneración de Stevia por esta

vía.

El cultivo de anteras, por su parte, es un método mediante el cual se pueden desarrollar

plantas homocigóticas con altos contenidos de glucósidos. Para ello son cultivadas

anteras inmaduras procedentes de una población diferenciada, usualmente al inicio de un

programa de reproducción (Yadav et al., 2011).

Las anteras, según Flachsland et al. (1996), fueron inducidas a formar callos en medio de

cultivo MS con 0,1-1 mg.L-1 de 6-BAP, luego estos regeneraron brotes tras su paso a un

medio de cultivo fresco con iguales condiciones. Finalmente, los brotes formaron raíces al

ser expuestos a un medio con ANA (0,1 mg.L-1). Yadav et al. (2011) y Pande y Gupta

(2013) coinciden en que esta es otra de las áreas que requiere mayor profundidad de

estudios.


14

Los trabajos realizados con Stevia, respecto al cultivo in vitro son numerosos y

funcionales; ofreciendo alternativas plausibles para realizar una propagación in vitro

efectiva de esta planta. Sin embargo, en función del ahorro de recursos y del tiempo, la

propagación vía organogénesis directa, es la variante más práctica y eficiente, para la

propagación in vitro de S. rebaudiana.

2.2.6 Propagación vía organogénesis

La propagación in vitro vía organogénesis, consiste en la multiplicación de brotes axilares,

mediante el cultivo de ápices o meristemos (Gómez-García, 2013). Las ventajas de este

sistema son varias: obtención de altos coeficientes de multiplicación, introducción rápida

de nuevas variedades o clones, permite realizar una producción independiente de las

condiciones ambientales, incremento en los rendimientos de las plantas regeneradas in

vitro debido al rejuvenecimiento y al saneamiento. Además las plantas obtenidas pueden

presentar alta estabilidad genética y gran uniformidad (Jiménez, 1998).

En Stevia, la regeneración vía organogénesis (Anexo 1) se ha obtenido a partir de

diferentes explantes, como hojas (Yang y Chang, 1979; Sivaram y Mukundan, 2003;

Anbazhagan et al., 2010), segmentos de nodos (Laribi et al., 2012; Modi et al., 2012;

Singh et al., 2014), brotes axilares (Bespalhok-Filho et al., 1992; Anbazhagan et al.,

2010), puntas de ápices (Tamura et al., 1984), cultivos de suspensiones (Ferreira y

Handro, 1988), cultivos de anteras (Flachsland et al., 1996) y cultivos de capas celulares

delgadas (Ramírez-Mosqueda y Iglesias-Andreu, 2015).

2.3 Variaciones somaclonales

Las variaciones somaclonales aparecen durante el cultivo de tejidos, en forma de

metilaciones de ADN, rearreglos cromosómicos o mutaciones puntuales (Gantait et al.,

2014). Estas se manifiestan como resultado de influencias epigenéticas o cambios en la

organización del crecimiento (Karp, 1995). La identificación de estas variaciones en

estadíos tempranos, así como la disminución de su frecuencia de aparición son elementos

primordiales para el control de la calidad durante el desarrollo de cualquier protocolo de

multiplicación.

Existen diversas técnicas empleadas para determinar las variaciones somaclonales

(Yadav et al., 2017). Estas incluyen el uso de diversos marcadores moleculares para

determinar polimorfismos genéticos como: los marcadores basados en hibridación de


15

ADN, los basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en

inglés) y los específicos basados en secuenciación de ADN. Los marcadores basados en

hibridación de ADN son los Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción

(RFLPs) y las huellas específicas de oligonucleótidos. Dentro de los marcadores basados

en PCR se encuentran la Amplificación Aleatoria de ADN Polimórfico (RAPD, por sus

siglas en inglés), la Repetición de Secuencia Simple o microsatélites (SSRs) y los

polimorfismos de Longitud de Fragmentos Amplificados (AFLPs). Mientras que el principal

marcador específico basado en secuenciación de ADN es el análisis de polimorfismos de

nucleótidos simples (SNPs).

La Amplificación Aleatoria de ADN Polimórfico, es un procedimiento a base de PCR. Los

marcadores RAPD son generalmente fragmentos dominantes que exhiben polimorfismos

entre los individuos, indicándolo mediante la presencia o ausencia de un fragmento en

particular. El análisis mediante RAPD ha sido utilizado extensivamente para varios

propósitos que incluyen identificación y clasificación de antecesores, identificación de

híbridos y análisis de diversidad genética (Kumari y Thakur, 2014)

La técnica RAPD estándar utiliza como cebadores pequeños oligonucleótidos sintéticos

(10 pb) de secuencias aleatorias, para amplificar cantidades pequeñas del ADN genómico

total bajo las condiciones del PCR. Los productos amplificados, generalmente son

separados en gel de agarosa y teñidos con bromuro de etidio (Kumari y Thakur, 2014).

En Stevia, la técnica RAPD ha sido utilizada con mucho éxito para detectar polimorfismos

genéticos y describir las variaciones somaclonales en individuos regenerados

(Moktaduzzaman y Mahbubur-Rahman, 2009; Modi et al., 2012). Así como para la

construcción de mapas genéticos y análisis de parentesco (Yao et al., 1999). Por sus

resultados favorables ya demostrados con la especie en cuestión y la simplicidad y bajo

costo de su implementación, es una técnica recomendable para determinar si existe

estabilidad genética en las plantas propagadas in vitro.

Materiales y Métodos

16

3. MATERIALES Y MÉTODOS

La presente investigación fue realizada en el Instituto de Biotecnología de las Plantas

(IBP) perteneciente a la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Este estudio se

efectuó en el período comprendido entre septiembre del 2016 y febrero del 2018.

Procedimientos generales

Material vegetal

En esta investigación se utilizó como material vegetal inicial brotes de plantas de S.

rebaudiana, provenientes del Banco de Germoplasma del IBP donadas por el Grupo

Empresarial LABIOFAM y mantenidas en casa de cultivo a 30± 2 ºC, con humedad

relativa del 70%, un flujo de fotones fotosintéticos entre 224 y 457 μmol m-2 s-1 y

frecuencia de riego de 3,0 min de duración dos veces al día. A dichas plantas se les

realizaba manejo cultural basado en limpieza de malezas y aplicación de fungicida.

Para el establecimiento in vitro de S. rebaudiana, se seleccionaron las plantas más

vigorosas teniendo en cuenta sus condiciones fisiológicas, coloración y sanidad. Luego se

extrajeron los ápices caulinares con cortes de 5-7 cm por debajo de la punta de cada tallo,

manteniendo las hojas. Posteriormente fueron llevados al laboratorio, donde se procedió a

la desinfección.

Medios de cultivo

Los medios de cultivo en estado semisólido se dosificaron a razón de 30 mL en frascos de

vidrio con volumen total de 250 mL. El pH de los medios de cultivo fue de 5,7 y se ajustó

antes de la esterilización en autoclave con NaOH 1,0 N y HCl 1,0 N. Los medios y frascos

de cultivo utilizados en este trabajo fueron esterilizados en autoclave vertical a 121 ºC y

1,2 kg cm-2 de presión por tiempos que variaron en dependencia del volumen de medio de

cultivo a esterilizar. Los platos metálicos para el trabajo en la cabina de flujo laminar,

fueron esterilizados en la estufa a 180 ºC durante 2 h.

El instrumental (pinzas y bisturíes), se desinfectó en un esterilizador eléctrico modelo

DENT-EQ (Alemania) que permaneció dentro de la cámara de flujo laminar horizontal,

donde se realizó el manejo del material vegetal en condiciones de esterilidad.


17

Condiciones de cultivo in vitro

Los brotes in vitro se colocaron en cámara de crecimiento con luz solar, temperatura de

27±2 ºC con un período luminoso de aproximadamente 13/11 h de luz/oscuridad con un

rango de densidad flujo de fotones fotosintéticos (DFFF) entre 48,0 y 62,5 µmol m-2 s-1,

medido con un Luxómetro Extech 401025 (Extech Instruments, EUA). Los experimentos

fueron repetidos dos veces.

Análisis estadístico

Para el análisis estadístico y la elaboración de los gráficos se empleó el software

Statistica versión 10.0 (StatSoft, 2011) para Windows. Para contrastar la normalidad del

conjunto de datos obtenidos para cada variable, se utilizaron las pruebas de Kolmogorov-

Smirnov y Shapiro Wilk con la corrección de Lilliefors. Para la comparación entre las

medias se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis y de ser necesario se realizó la comparación

de medias a posteriori, la prueba de Mann Whitney o Tablas de Contingencia 2x2. En

cada experimento se detallan las pruebas estadísticas que se realizaron. En todos los

casos las diferencias fueron establecidas para p≤0,05.

3.1 Determinación de la concentración de hipoclorito de sodio y el tiempo de

exposición para el establecimiento in vitro de ápices de S. rebaudiana

Con el objetivo de determinar las diferentes concentraciones de Hipoclorito de Sodio

(NaClO) y el tiempo de exposición, en la desinfección de los ápices, se realizó el primer

experimento. Para la desinfección del material vegetal en condiciones de laboratorio, se

realizaron los diferentes pasos del procedimiento, según el protocolo propuesto por

Alvarenga (2005) con modificaciones.

Primero, el material vegetal fue lavado con agua corriente durante 30 min. A continuación

los explantes fueron sumergidos en una solución del fungicida Benomil 3 g.L-1 durante 20

min y se enjuagaron con agua corriente. Luego los mismos se colocaron en etanol 70%

durante 5 s. Por último se realizó un lavado con agua desionizada estéril, para seguir con

el experimento de desinfección. Se evaluaron cuatro concentraciones de hipoclorito de

sodio: 0,5; 1,0; 1,5 y 2,0 (v/v); durante tres tiempos de exposición: 10, 15 y 20 min.


18

Posteriormente, y dentro de la cámara de flujo laminar, se realizaron tres enjuagues con

agua desionizada estéril y los ápices fueron reducidos a un tamaño de 2,0-3,0 cm de

altura (Figura 2). Se utilizaron 30 ápices por tratamiento, los cuales se colocaron en tubos

de ensayo (100 x 125 mm) con 15 mL de medio de cultivo semisólido compuesto por las

sales MS (Murashige y Skoog, 1962) al 100% de su concentración, 1 mg.L-1 de tiamina,

100 mg.L-1 de mio-inositol, 30 g.L-1 de sacarosa, 1 mg.L-1 de 6-bencilaminopurina (6-BAP)

y 2,6 g.L-1 de Gelrite .El pH del medio de cultivo fue ajustado a 5,7 previo a la

esterilización por autoclave.

Figura 2. Desinfección de explantes de Stevia rebaudiana Bertoni (A) Tratamiento con

Hipoclorito de Sodio. (B) Disección del material vegetal.

Se cuantificó el número de explantes contaminados por bacterias y hongos a partir de las

72 horas. Además a los 21 días después del establecimiento in vitro, se cuantificó el

número de explantes con necrosis, los explantes viables y se calcularon los porcentajes

correspondientes. El análisis estadístico de las variables se realizó mediante las pruebas

de Spearman, Friedman y análisis de Tablas de contingencia 2x2, previa comparación de

los supuestos de normalidad.

A B


19


subcultivos en la multiplicación in vitro de Stevia rebaudiana


vitro

El objetivo de este experimento fue determinar el efecto de la citoquinina 6-

bencilaminopurina (6-BAP) sola y en combinación con la auxina ácido indol-3-acético

(AIA) sobre el coeficiente de multiplicación. Para ello, se evaluaron cuatro combinaciones

de ambos reguladores del crecimiento (Tabla II) y un control sin reguladores del

crecimiento, para un total de cinco tratamientos.

Tabla II. Combinaciones de concentraciones de reguladores de crecimiento 6

bencilaminopurina (6-BAP) y ácido indolacético (AIA) añadidas al medio de cultivo de

multiplicación de Stevia rebaudiana Bertoni.

No. Tratamiento 6-BAP (mg.L-1) AIA (mg.L-1)

1 0 0

2 2 1

3 4 1

4 2 0

5 4 0

Se utilizaron 25 explantes por tratamiento, que fueron obtenidos según las condiciones

establecidas en el experimento anterior. Estos se distribuyeron a razón de cinco por

frasco de cultivo con tapa de plástico transparente de polipropileno con un volumen total

de 250 mL y 30 mL de medio de cultivo (igual composición que el medio de

establecimiento, excepto las concentraciones de reguladores de crecimiento). A los 15

días se realizó el subcultivo y se cuantificó el número de brotes por explante y se

determinó el coeficiente de multiplicación (CM= No. de segmentos de brotes totales/ No.

brotes iniciales). Los datos fueron comparados utilizando la prueba de Kruskal-Wallis y la

comparación de medias a posteriori, previa comprobación de los supuestos de

normalidad.


20


multiplicación

Con el objetivo de determinar el efecto del número de subcultivos sobre el coeficiente de

multiplicación, se emplearon 32 brotes de S. rebaudiana establecidos según las

condiciones seleccionadas en el acápite 3.1. Se utilizó la composición del medio de cultivo

adecuada para la fase de multiplicación según los resultados del acápite anterior, con

subcultivos cada 15 días. Se determinó en cada uno el número de segmentos viables en

que era posible fragmentar cada planta in vitro, para calcular el coeficiente de

multiplicación (CM= No. de segmentos de brotes totales/ No. brotes iniciales). Los datos

fueron comparados utilizando la prueba de Kruskal-Wallis y la comparación de medias a

posteriori, previa comprobación de los supuestos de normalidad.


plantas propagadas in vitro de S. rebaudiana durante la fase de aclimatización ex

vitro

El objetivo de este experimento fue evaluar el efecto del tipo de sustrato en la

supervivencia de las plantas in vitro de S. rebaudiana en condiciones de aclimatización ex

vitro. Se utilizaron 20 plantas por tratamiento que provenían del quinto subcultivo en la

fase de multiplicación con una altura entre 15 y 20 cm, con entre cinco y 10 pares de

hojas y raíces que podían ser de una hasta cinco.

Previo a la plantación en sustrato las plantas in vitro fueron separadas del medio de

cultivo, lavadas con agua corriente e individualizadas. Posteriormente se plantaron según

su tratamiento en bandejas de polipropileno negras de 28 alvéolos con una capacidad de

200 cm3 cada uno. Se estudiaron distintas combinaciones de sustratos con diferentes

porcentajes de zeolita y compost de cachaza (25-75, 50-50, 75-25, 100-0, 0-100,

respectivamente).

Estas fueron llevadas a casa de cultivo (temperatura promedio durante el día de 30±2 ºC,

humedad relativa del 70%, DFFF entre 224 y 457 μmol m-2 s-1, frecuencia de riego de 3,0

min de duración dos veces al día) para su aclimatización ex vitro. Luego, según su

crecimiento y presencia de un sistema radical bien desarrollado fueron pasadas a bolsas

de cultivo y mantenidas en las condiciones anteriormente descritas.


21

La zeolita utilizada fue producida por la Empresa GEOMINERA de Villa Clara y el compost

de cachaza fue obtenido del Complejo Agroindustrial Azucarero “Ifraín Alfonso” del

Municipio Ranchuelo, Villa Clara. Las características físico-químicas de ambos sustratos

se muestran en las Tablas III y IV.

Tabla III. Características físico-química de la zeolita. Tomado de Gómez-García (2013)

Composición química %

Silicio (SiO2) 70,10

Aluminio (Al2O3) 11,20

Hierro (Fe2O3) 2,20

Hierro (FeO) 0,30

Magnesio (MgO) 0,60

Calcio (CaO) 4,50

Sodio (Na2O) 1,50

Potasio (K2O) 1,30

Fósforo (P2O5) 0,07

Agua (H2O) 4,70

Composición mineral %

Clinoptilolita 40,00

Modernita 40,00

Otros (Calcita, cuarzo, feldespato) 20,00

Propiedades físicas Valor

Tamaño de la partícula 0,01-1,0 mm

Densidad (δ) 0,37 g.cm-3

Densidad de la fase sólida (γ) 1,77 g.cm-3

Porosidad total (PT) 80,59 % vol.

Tabla IV. Composición química de la cachaza. Tomado de Gómez-García (2013)

Composición química Valor

Calcio (CaO) 231,23 mg.L-1

Potasio (K2O) 125,2 mg.L-1

Fósforo (P2O5) 1008,80 mg.L-1

Materia orgánica 41,3 %

C. E 1,14 mol.cm-3

pH 7,6


22

A los 15 días se contó el número de plantas que sobrevivieron y se determinó el

porcentaje de supervivencia. La comparación entre tratamientos se realizó utilizando la

prueba de Kruskal-Wallis, previa comprobación de los supuestos de normalidad.


propagadas mediante corte de esquejes

3.4.1 Evaluación de variables morfométricas de las plantas en aclimatización ex

vitro

Con el objetivo de validar el protocolo propuesto, se realizaron comparaciones entre las

plantas propagadas in vitro y las plantas multiplicadas mediante corte de esquejes.

Primero se comparó la respuesta de las plantas in vitro en casa de cultivo con las plantas

multiplicadas por esquejes empleando variables morfométricas.

Del banco de germoplasma establecido en fase cultivo, se seleccionaron plantas y se

realizó el corte de esquejes a una altura de 15-20 cm, según las técnicas tradicionales.

Paralelamente se transfirieron las plantas in vitro a bolsas con el sustrato seleccionado en

el acápite anterior. En ambos casos se eligieron plantas con alturas similares y se

mantuvieron en las condiciones de cultivo previamente descritas.

Luego de transcurridos 60 días se evaluaron las variables: altura, número de hojas y

número de tallos por planta. Para ello se utilizó una regla graduada de 1,0 m. Los datos

obtenidos fueron comparados mediante la prueba de Kruskal-Wallis/ U de Mann-Whitney

y comparación de medias a posteriori.

3.4.2 Comparación de los patrones de amplificación de ADN de las plantas

obtenidas por organogénesis y propagadas mediante corte de esquejes

Con el objetivo de determinar el nivel de variabilidad genética asociada al proceso de

clonación mediante ápices de plantas cultivadas ex vitro y corte de esquejes, se efectuó

una comparación de patrones moleculares de las mismas. Esta se realizó mediante el uso

de marcadores moleculares tipo RAPD. Para ello se seleccionaron hojas jóvenes

procedentes de cinco plantas in vitro y de cinco plantas propagadas por esquejes.

Las muestras fueron lavadas con agua corriente, limpiadas con etanol y agua destilada.

Seguidamente se trituraron con nitrógeno líquido en morteros de porcelana con ayuda del

pistilo, luego fueron almacenadas en tubos Eppendorf (2,0 mL). Para la extracción del


23

ADN, se evaluaron dos protocolos de aislamiento de ADN: uno presentado por Khayat et

al. (2004) y otro propuesto por Doyle y Doyle (1990). El primer protocolo empleado se

basó en el propuesto por Khayat et al. (2004) con algunas modificaciones descritas a

continuación.

Se tomaron 100 mg de tejido vegetal de plantas cultivadas in vitro y se maceraron con

nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino, que se distribuyó en tubos Eppendorf. Se

adicionó 1 mL de buffer de extracción [4% (m/v) CTAB (bromuro de cetil-trimetil-amonio);

10 mM Tris–HCl/pH 8,0; 1,4 M NaCl; 20 mM EDTA (ácido etilén-diamino-tetracético); 2%

(m/v) PVP 10 000; 10 mM mercaptoetanol] y se homogenizó empleando el agitador tipo

MISTRAL® (LAB-LINE INTRUMENTS, 1190-1CE) durante unos segundos.

Las muestras fueron incubadas a 55 °C durante 30 min y posteriormente centrifugadas

(Eppendorf, Alemania, Lot: 5415D) a 2 800 g y 4 °C, durante 5 min. Se colectó el

sobrenadante y se le adicionó RNAsa (200 μg/mL de concentración final) por 15 min a 37

°C. El extracto fue mezclado con igual volumen de cloroformo y luego centrifugado en

iguales condiciones. Se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio y se adicionaron 700

μL de 2-isopropanol helado.

Las muestras se mantuvieron toda la noche a -20 °C y posteriormente se centrifugaron a

13 500 g y 4 °C, durante 15 min. El precipitado resultante se lavó con 500 µL de etanol

70% (v/v), se centrifugó según las condiciones anteriormente mencionadas y fue secado

en campana por 15 min. El precipitado se resuspendió en 30 µL de agua desionizada.

El otro protocolo empleado fue propuesto por Doyle y Doyle (1990) también, con ligeras

modificaciones como se describe a continuación. A 200 mg del material se adicionó 1 mL

de buffer de extracción [2% (m/v) CTAB (bromuro de cetil-trimetil-amonio), 10 mM Tris–

HCl/pH 8.0, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA (ácido etilén-diamino-tetracético), 0,2% 2-

mercaptoetanol] previamente calentado a 65 oC.

Las muestras fueron incubadas a 65 °C durante 30 min y mezcladas frecuentemente

utilizando un vórtex. Luego se adicionó RNAsa (10 µg/mL de concentración final) y se

incubaron por 15 min a 37 °C. Posteriormente se añadió 700 µL de cloroformo, se mezcló

y se procedió a centrifugar las muestras a 5 480 g durante 10 min a temperatura ambiente

en una centrífuga Centrifuge 5415D Eppendorf. Se transfirió la fase acuosa a tubos


24

limpios de igual volumen y se repitió el paso anterior. Luego se le adicionó 700 µL de

isopropanol helado, y tras mezclarlo se mantuvo a -20 °C por 1h.

A continuación, se centrifugó a 11 180 g a temperatura ambiente, durante 15 min. El

precipitado resultante se lavó con 1 mL de buffer de lavado [etanol 76%, 10 mM acetato

de amonio] durante 20 min con agitación frecuente. Luego se centrifugó según las

condiciones anteriormente mencionadas y se dejó secar al vacío por 20 min. El

precipitado final, se resuspendió en 50 µL de agua estéril.

En ambos casos, se comprobó la integridad del ADN genómico mediante electroforesis en

gel de agarosa al 0,8% (p/v) con tampón TBE para la separación de los productos de

amplificación, a 100 V durante 40 min, luego se observaron en un transiluminador

MacroVue mediante la incidencia de luz ultravioleta (UV). Como criterio de pureza se

determinaron las razones de Absorbancia a 260/230 nm y a 260/280 nm y la

concentración de ADN doble cadena, empleando un espectrofotómetro (Biophotometer,

Eppendorf, Alemania).

Para realizar la técnica de RAPD se utilizó un equipo PCR Termocycler epgradient

(Alemania). Las reacciones se prepararon empleando micropipetas 2P, 20P y 200P, con

puntas desechables estériles.

Todos los cebadores empleados tenían amplitud de 10 pb. Estos fueron seleccionados del

repositorio de cebadores del Laboratorio de Biología molecular del IBP. Las secuencias

de los seis cebadores utilizados fueron:

R1: 5´-CGACCGCAGT-3´

R2: 5´-CCCTCTGCGG-3´

R4: 5´-AGCCATTGTC-3´

R5: 5´-GCTCAGGACG-3´

R6: 5´-GCCGTCGGGC-3´

R14: 5´-CTAAGCCATG-3´

La reacción en cadena de la polimerasa se realizó con cada cebador, 100 ng de ADN

genómico en un volumen final de 20 μL. Se empleó un Kit de PCR Core con Taq

polimerasa (Sigma), de acuerdo a las recomendaciones del productor. El programa

empleado fue el siguiente: 4 min a 94 °C; 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos

a 36 °C, y 90 segundos a 72 °C; seguido de 10 min a 72 °C.


25

Una vez terminado se procedió a realizar una electroforesis en gel de Agarosa al 1,5%

(p/v), con tampón TBE para la separación de los productos de amplificación. Los

productos de PCR y el marcador de masa molecular GeneRuler 100 pb DNA Ladder Plus,

ready-to-use se mezclaron con el colorante EZVision (Biotechnology) y se aplicaron en los

pocillos. Las corridas se realizaron a 60 V durante 120 min, luego se observaron en un

transiluminador MacroVue mediante la incidencia de luz ultravioleta (UV).

Las bandas resultantes del RAPD fueron interpretadas según la presencia/ausencia de

polimorfismos como valores binarios (1/0 respectivamente), con ellos se confeccionó una

matriz de datos. La similitud y la distancia genética entre las diferentes muestras se

calculó de acuerdo a la metodología de Nei (1972), utilizando el servidor web

DendroUPGMA (Garcia-Vallvé y Puigbò, 2002).

Resultados

26

4. RESULTADOS



De los 360 explantes totales, 62 mostraron contaminación microbiana y 93 resultaron

severamente dañados por el proceso de desinfección. Estos últimos se necrosaron y en

ocasiones causaron fenolización del medio de cultivo. Los 205 ápices restantes (56,9%

del total) fueron positivamente establecidos y se desarrollaron hasta una longitud entre

10-15 cm y formaron brotes (Figura 3).

Figura 3. Ápice y brote de Stevia rebaudiana Bertoni en medio de cultivo para el

establecimiento. (A) luego del proceso de desinfección y (B) a los de 21 días de cultivo.

Al comparar el efecto del tiempo de desinfección sobre el número de explantes

necrosados y contaminados, no se encontraron diferencias significativas (Figura 4). No

existieron correlaciones entre el número de explantes necrosados o contaminados y el

tiempo de desinfección. Por lo que es posible realizar la desinfección con hipoclorito de

sodio entre 10 y 20 minutos, sin afectar la viabilidad de los explantes.

A B

Resultados

27

Figura 4. Efecto del tiempo de desinfección con hipoclorito de sodio sobre el número de

explantes necrosados (A) y contaminados (B). Los valores medios por tratamiento no

fueron significativamente diferentes, de acuerdo a la prueba de Kruskal Wallis p>0,05.

En contraste, la concentración de hipoclorito de sodio provocó diferencias significativas

sobre el número de explantes necrosados y contaminados, de acuerdo a la prueba de

Friedman (Figura 5). Existe una correlación positiva entre el número de explantes

necrosados y la concentración de hipoclorito de sodio (R de Spearman 0,927, p<0.01).

Por lo que al aumentar la concentración del desinfectante, se aumenta el daño producido

al tejido.

6,25

7,50

9,50

5,75

5,00

4,75

A

B

Resultados

28

Figura 5. Efecto de la concentración de hipoclorito de sodio sobre el número de explantes

necrosados (A) y contaminados (B). Medias con letras desiguales difieren según Tablas

de contingencia 2x2, p<0,05.

La concentración de hipoclorito de sodio al 1% es la mayor donde se produce una menor

mortalidad de los explantes. Este efecto se invierte al analizar el número de explantes

contaminados, donde al incrementar las concentraciones de hipoclorito de sodio, se

minimiza significativamente la contaminación (R de Spearman -0,9659, p<0.01).

El tratamiento desinfectado con hipoclorito de sodio al 0,5% mostró porcentajes de

supervivencia entre 93,33 y 96,67% y de desinfección entre 55,17 y 67,86%. Mientras que

11,00a

5,66b

2,66bc 1,33c

1,33c 1,66c

6,33b

21,66a A

B

Resultados

29

cuando se empleó al 1% la supervivencia fue entre 90 y 96,67% y un rango de

desinfección entre 74,07 y 79,31%. Para el 1,5%, los porcentajes oscilaron entre 76,67 y

80% para la supervivencia y entre 87,50 y 91,30% para la desinfección. Por último con la

concentración de NaClO 2% la supervivencia fue menor (13,33 y 43,33%), mas en cambio

la desinfección estuvo entre 75 y 92,31%. De acuerdo a los porcentajes de supervivencia

y desinfección anteriormente analizados, se recomienda emplear el hipoclorito de sodio al

1% como agente desinfectante.




vitro

En la Figura 6, se muestran los coeficientes de multiplicación determinados, para las

diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento añadidas al medio de cultivo de

multiplicación. En los tratamientos donde no se empleó reguladores de crecimiento (1) o

se adicionó solo uno de ellos (4 y 5), fue posible obtener de uno a tres segmentos viables

por brote, con una media de dos. Mientras que cuando se adicionó al medio de cultivo 2

mg.L-1 de 6-BAP y 1 mg.L-1 de AIA, los coeficientes adoptaron valores entre 1 y 4, con una

media de 2,40.

En el tratamiento donde se emplearon 4 mg.L-1 de 6-BAP y 1 mg.L-1 de AIA, la media fue

numéricamente superior (2,60), con valores entre dos y cuatro. Al analizar

estadísticamente estos datos, no se encontraron diferencias significativas entre los

coeficientes de multiplicación por tratamiento. Por lo que el empleo de las combinaciones

de reguladores de crecimiento evaluadas, no modificó el coeficiente de multiplicación de

esta especie.

Durante el segundo subcultivo de los explantes evaluados, los segmentos en medio de

multiplicación con reguladores de crecimiento (Tratamientos del 2-5), se tornaron

delgados, hiperhídricos y en algunos casos despigmentados. Mientras que en el medio de

cultivo donde no se añadieron los mismos (Tratamiento 1), no se produjo afectación en el

desarrollo de los brotes. Por lo que se recomienda no emplear reguladores de crecimiento

en la composición del medio de cultivo para la multiplicación de S. rebaudiana.

Resultados

30

Figura 6. Efecto de la concentración de los reguladores de crecimiento 6-

bencilaminopurina (6-BAP) y ácido indolacético (AIA) sobre el coeficiente de multiplicación

de brotes de Stevia rebaudiana, luego de 15 días en medio de multiplicación. Los valores

medios no fueron significativamente diferentes, según prueba de Kruskal Wallis, p>0,05.


multiplicación

En la Figura 7 se relacionan los coeficientes de multiplicación calculados en cada

subcultivo. El número de segmentos viables obtenidos de cada brote no fue

significativamente diferente durante los subcultivos 1, 2, 4 y 5. Mientras que en el tercer

subcultivo se produjo un incremento considerable de este coeficiente.

No fue posible prolongar más de 15 días el periodo entre cada subcultivo, pues se

producían afectaciones en los explantes, debido al agotamiento del medio de cultivo. Si se

prolongaba este tiempo, los brotes mostraban signos de delgadez general y marchitez en

las hojas y en los brotes nuevos.

Las plantas obtenidas, luego del quinto subcultivo, presentaron características óptimas

para ser trasladadas a la fase de aclimatización ex vitro, sin ser transferidas a la fase de

enraizamiento. Pues durante la fase de multiplicación fueron capaces de regenerar un

sistema radical funcional.

1,80

2,40 2,60

2,10 2,30

Resultados

31

No fue posible mantener las plantas de S. rebaudiana más de cinco subcultivos en el

medio de cultivo de multiplicación. Pues luego de este tiempo se incrementa

notablemente la pérdida del material vegetal, que evidencia síntomas de marchitez,

comienza a perder hojas y muestra una disminución general del crecimiento.

Figura 7. Efecto del número de subcultivos sobre el coeficiente de multiplicación de

Stevia rebaudiana Bertoni. Medias con letras desiguales difieren según las pruebas de

Kruskal-Wallis y comparación de medias a posteriori, p<0,05.



vitro

El éxito del proceso de aclimatización ex vitro de las plantas propagadas in vitro, se debe

en parte a la correcta selección de la composición del sustrato. Las condiciones de cultivo,

garantizaron una alta supervivencia de las plantas propagadas in vitro, entre un 80-90%,

sin diferencias significativas entre los tratamientos, según prueba de Kruskal Wallis,

p>0,05. (Tabla V). Luego, es posible emplear todas las combinaciones valoradas en este

trabajo, durante la fase de aclimatización ex vitro.

1,84b

2,18b

2,81a

2,04b 1,99b

Resultados

32

De acuerdo a la disponibilidad, se seleccionó el sustrato conformado por compost de

cachaza (100%), para alojar las plantas propagadas in vitro en casa de cultivo. Este

mismo sustrato se seleccionó para realizar también el cultivo de las plantas propagadas

por cortes de esquejes.

Tabla V. Porcentajes de supervivencia según la composición del sustrato de las plantas

de S. rebaudiana a los 15 días de plantadas. Los valores medios no fueron

significativamente diferentes, según prueba de Kruskal Wallis, p>0,05.

Tratamiento Zeolita Cachaza % Supervivencia

1 25 75 80

2 75 25 85

3 50 50 80

4 0 100 90

5 100 0 90




vitro

Una vez en casa de cultivo se evaluó la existencia de diferencias morfométricas entre las

plantas propagadas in vitro y las que se propagaron mediante corte de esquejes. Ambos

grupos se mantuvieron en iguales condiciones ambientales durante la fase de

aclimatización en casa de cultivo. Para su comparación, se evaluaron las variables altura

(Figura 8), número de hojas (Figura 9) y número de tallos (Figura 10).

Resultados

33

Figura 8. Altura en cm de las plantas propagadas in vitro (1) y propagadas por cortes de

esquejes (2) a los 60 días en casa de cultivo. Medias con letras desiguales difieren según

prueba de Mann Whitney, p<0,05.

Figura 9. Número de hojas de plantas propagadas in vitro (1) y propagadas por cortes de

esquejes (2) a los 60 días en casa de cultivo. Medias con letras desiguales difieren según

prueba de Mann Whitney, p<0,05

46,94a

33,68b

317,3a

259,9b

Resultados

34

Figura 10. Número de tallos de plantas in vitro (1) y por cortes de esquejes (2) a los 60

días en casa de cultivo. Los valores no fueron significativamente diferentes, según prueba

de Kruskal Wallis, p>0,05.

La altura y el número de hojas de las plantas propagadas in vitro, fueron

significativamente superiores a los determinados en las plantas propagadas por esquejes

(Figura 11). No se encontraron diferencias significativas entre ambos para el número de

tallos. Las plantas propagadas in vitro mantuvieron un crecimiento homogéneo y fueron

morfológicamente similares a las plantas propagadas por esquejes.

Figura 11. Plantas de Stevia rebaudiana Bertoni, a los 60 días en casa de cultivo.

Propagadas in vitro (A y B).Propagadas por cortes de esquejes (C y D)

5,30

4,54

A B C D

Resultados

35



El empleo del protocolo propuesto por Khayat et al. (2004) no fue efectivo en S.

rebaudiana. Mientras que si fue posible aislar ADN genómico de esta planta, empleando

el protocolo de CTAB con modificaciones. En la Tabla VI, se relacionan los valores

referentes a algunas de las muestras aisladas.

Tabla VI. Concentración de ADN y densidad óptica (DO) de Stevia rebaudiana Bertoni.

Aislados de hojas de (a) Plantas in vitro. (b) Plantas por corte de esquejes

Muestras [ADN]ng/µL DO 260/280 DO 260/230

1ª 251,1 1,70 0,67

2ª 738,7 1,67 1,06

3ª 524,5 1,63 1,09

4ª 231,9 1,76 1,03

5ª 504,8 1,84 1,83

1b 413,4 1,82 0,68

2b 501,8 1,64 1,05

3b 417,1 2,04 1,21

4b 438,5 1,64 0,87

5b 873,6 1,79 1,12

Las muestras de ADN genómico purificadas, fueron empleadas para el análisis de la

estabilidad genética de las líneas propagadas in vitro, mediante RAPD. De los seis

cebadores empleados en las reacciones de amplificación, solo en uno fue posible

observar la presencia de bandas (Figura 12). Los cebadores R2, R4, R5, R6 y R14 no

produjeron ninguna amplificación.

En el patrón de amplificación RAPD obtenido utilizando el cebador R1: 5´-

CGACCGCAGT-3´, se produjeron 63 bandas totales para las 10 muestras analizadas.

Estas se encontraron distribuidas en 12 líneas de bandas, de las cuales solo dos fueron

comunes para todas las muestras (monomórficas). El resto de las bandas resultaron

polimórficas variando en número entre una y siete para cada muestra. Esto resultó en un

polimorfismo del 83,3%.

Resultados

36

Figura 12. Electroforesis en gel de agarosa 1,5% del patrón de amplificación RAPD

obtenido utilizando el cebador R1. Carriles 1: Marcador de peso molecular GeneRuler 100

pb DNA Ladder Plus, ready-to-use; 2-6: muestras de plantas propagadas in vitro; 7-11:

muestras de plantas propagadas por cortes de esquejes; 12: control negativo.

La similitud y la distancia genética entre las muestras, se calculó utilizando el método

UPGMA con el coeficiente de Dice. Los valores de similitud se encontraron entre 0,33 y

1,00; mientras que los de diferencia oscilaron entre 0 y 0,66 (Tabla VII). Con esos datos

se confeccionó un dendograma que muestra la relación entre las muestras analizadas

según la distancia genética (Figura 13).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Resultados

37

Tabla VII. Matriz de similitud genética entre las muestras analizadas (a) plantas

propagadas in vitro y (b) plantas propagadas por cortes de esquejes de S. rebaudiana.

Muestras 1a 2a 3ª 4ª 5a 1b 2b 3b 4b 5b

1a 1 0.500 0.444 0.571 0.364 0.364 0.333 0.333 0.800 1.000

2a 1 0.769 0.909 0.667 0.800 0.750 0.750 0.667 0.500

3a 1 0.833 0.750 0.750 0.824 0.706 0.400 0.444

4a 1 0.714 0.714 0.667 0.667 0.500 0.571

5a 1 0.889 0.737 0.947 0.333 0.364

1b 1 0.737 0.947 0.500 0.364

2b 1 0.800 0.462 0.333

3b 1 0.462 0.333

4b 1 0.800

5b 1

Figura 13. Dendograma UPGMA de distancia genética calculado de acuerdo al perfil

electroforético obtenido con el cebador R1, en (a) plantas propagadas in vitro y (b) plantas

propagadas por cortes de esquejes.

Resultados

38

Con todos los resultados obtenidos se confeccionó un protocolo de propagación in vitro

para Stevia rebaudiana (Figura 14), que permite propagar 45 plantas a partir de cada

ápice establecido en tres meses. Luego, con su aplicación se pueden obtener 4 500

plantas adultas en casa de cultivo a partir de 100 ápices establecidos en un período de

cinco meses aproximadamente. El protocolo se explica a continuación:

1. Extraer ápices caulinares de plantas adultas de Stevia rebaudiana Bertoni con

cortes de 5-7 cm por debajo de la punta de cada tallo y llevar al laboratorio. Lavar

tres veces con agua corriente alternando con la acción de detergentes. Aplicar

fungicida (Benomil) a 3 g.L-1 durante 20 minutos.

2. Desinfectar con etanol al 70% durante 5 segundos. Tratar con NaClO al 1%

durante un 10, 15 o 20 minutos. Efectuar tres enjuagues con agua destilada estéril.

3. Fragmentar en cabina de flujo laminar hasta obtener ápices caulinares de

alrededor de 3 cm de longitud.

4. Establecer en medio de cultivo compuesto por sales MS al 100%, 0,10 g.L-1 de

tiamina, 100 mg.L-1 de mio-inositol, 30 g.L-1 de sacarosa, 1 mg.L-1 de 6-

Bencilaminopurina (6-BAP), pH 5,7 y 2,6 g.L-1 de Gelrite. Colocar en cámara de

crecimiento por 21 días, a temperatura de 27±2ºC con fotoperiodo de 13/11h de

luz/oscuridad con intensidad luminosa entre 48,0 y 62,5 µmol m-2 s-1.

5. Multiplicar los explantes, fragmentándolos en segmentos viables, y colocarlos en

medio de cultivo sin reguladores de crecimiento compuesto por: 4,3 g.L-1 de sales

MS, 0,10 g.L-1 de tiamina, 100 mg.L-1 de mio-inositol, 30 g.L-1 de sacarosa, pH 5,7

y 2,6 g.L-1 de Gelrite. Colocar en cámara de luz natural, a temperatura de 27±2ºC

con fotoperiodo de 13/11h de luz/oscuridad con intensidad luminosa entre 48,0 y

62,5 µmol m-2 s-1. Realizar subcultivos cada dos semanas, con un máximo de cinco

subcultivos.

6. Llevar a aclimatización en casa de cultivo, plantas con presencia de un sistema

radical desarrollado y al menos cinco pares de hojas. Colocar en bolsas de cultivo

que contengan como sustrato zeolita, compost de cachaza, o combinaciones de

ambos y aplicar riego por micro-aspersión dos veces al día por 3,0 min.

Temperatura promedio durante el día de 30± 2 ºC, humedad relativa del 70% e

intensidad luminosa entre 224 y 457 μmol m-2 s-1. Mantenerlas en estas

condiciones por al menos 60 días.

Resultados

39

Figura 14. Propuesta de esquema de trabajo para la propagación in vitro de Stevia

rebaudiana Bertoni a partir de ápices de plantas cultivadas ex vitro.

Discusión

40

5. DISCUSIÓN



El establecimiento es una etapa determinante dentro del cultivo in vitro, pues de ella

depende el posterior estado de las características sanitarias, fisiológicas y genéticas del

explante. La contaminación microbiana es uno de los principales problemas de esta fase,

y su fuente primaria generalmente es la propia planta donadora (Gómez-García, 2013).

Para disminuir dicha contaminación se han utilizado diferentes estrategias que incluyen

tanto los tratamientos a las plantas madres, como a los explantes.

El tiempo de exposición, contrario a lo esperado, a la evidencia empírica y a lo referido en

la literatura, no mostró tener influencias significativas sobre las variables analizadas;

tampoco la interacción entre ambos factores. La concentración de NaClO, que resultó el

factor determinante, mostró correlaciones con el número de explantes muertos y con el

porcentaje de contaminación, como se esperaba.

Se observó que mientras aumentaba la concentración del agente desinfectante, también

se incrementó el daño a los explantes (resultaron dañados solo cuatro de los 90

sometidos a la mínima concentración y 65 de los sometidos a la máxima). De manera

contraria, bajas concentraciones produjeron mayor número de explantes contaminados

(33 con la menor concentración y solo cuatro con la mayor). Se seleccionó la

concentración donde que permitiera obtener el máximo porcentaje de supervivencia con el

mínimo de contaminación. Según los resultados la concentración de NaClO al 1% fue el

tratamiento donde se produjo menor afectación del explante y mayor desinfección.

En la literatura científica, se ha descrito el uso de NaClO al 1% como agente de

desinfección y diferentes tiempos de exposición en varios trabajos (Shatnawi et al., 2011;

Namdari et al., 2015; Martínez-Rivillas et al., 2016), en contraposición al uso de bicloruro

de mercurio (HgCl2) (Modi et al., 2012; Singh et al., 2014). Estos últimos han referido

haber alcanzado muy bajos índices de contaminación, pero es necesario destacar que el

HgCl2 es un producto altamente tóxico y difícil de eliminar de los explantes (Gómez-

García, 2013).

Específicamente Martínez-Rivillas et al. (2016), obtuvieron con igual concentración de

NaClO, pero menos tiempo (5 min), una supervivencia de 83,33% y una desinfección del

Discusión

41

66,67%, utilizando como explantes brotes jóvenes. Los resultados del presente trabajo en

este aspecto son superiores (supervivencia: 90-96,67% y desinfección: 74,07-79,31%). Lo

cual implica que el proceso de desinfección propuesto es más ventajoso.

El uso de ápices de tallos adultos como explantes para la multiplicación in vitro ha sido

poco difundido, destacando investigaciones como las de Tamura et al. (1984) y Das et al.

(2011). Ambas utilizaron medios de cultivo basales compuestos con bajas

concentraciones de algún regulador de crecimiento (como kinetina), para el

establecimiento. Condiciones estas, similares a las empleadas en el presente estudio.

Por eso se recomienda durante el proceso de desinfección tratar los explantes, luego de

someterlos a la acción de detergentes, de fungicidas y de etanol al 70%, con NaClO al 1%

durante un tiempo de exposición no menor a 10 minutos y no mayor a 20 minutos. Luego,

fragmentar los explantes y establecerlos en medio de cultivo basal y llevarlos a cámara de

luz natural.




vitro

Un balance apropiado entre los reguladores de crecimiento (auxinas y citoquininas) en el

medio de cultivo es necesario para la multiplicación de plantas a partir de meristemos,

ápices o yemas (Jiménez, 1998). Según Nomberto (2001), el efecto de los reguladores de

crecimiento depende, en gran medida de los valores endógenos que presente el explante,

por lo que se evaluaron diferentes concentraciones de los mismos.

En este trabajo, los coeficientes de multiplicación obtenidos de los tratamientos que

contenían medios de cultivo con reguladores de crecimiento no fueron significativamente

diferentes entre ellos, o respecto al control sin reguladores. Los resultados obtenidos por

la literatura científica conforman dos grupos: uno donde los reguladores de crecimiento

inciden definitivamente en el crecimiento, desarrollo, y producción de brotes de los

explantes; y otro donde no muestran acción alguna en el proceso (Gantait et al., 2014).

Canchignia-Martínez et al. (2008) en la propagación vegetativa de dos variedades de

banano y una de plátano utilizaron diferentes tratamientos con reguladores de

crecimiento, para evaluar el número, la longitud y el diámetro de los brotes. En esta

Discusión

42

investigación, no se encontraron diferencias entre las concentraciones de 6-BAP y AIA

utilizadas. Mientras que Pratibha et al. (2010) evaluaron varias concentraciones de

diferentes reguladores del crecimiento: kinetina, 6-BAP y la combinación de 6-BAP y ANA

sobre la inducción de brotes a partir de explantes nodales. Alcanzando los mejores

resultados en los aspectos evaluados con la concentración de 4 mg.L-1 de kinetina. Este

regulador del crecimiento ha sido ampliamente usado en los trabajos referentes a Stevia,

aunque la literatura informa resultados tanto positivos como negativos de su uso. Para

futuras investigaciones podría evaluarse el efecto de este regulador de crecimiento dentro

del protocolo propuesto.

La investigación de Condori-Laurente (2013) mostró que la adición de reguladores de

crecimiento no influyó significativamente en la supervivencia, ritmo de crecimiento ni en el

número de hojas por planta. Asimismo, en el estudio efectuado por Modi et al. (2012), se

empleó positivamente para la multiplicación, un medio de cultivo MS modificado

compuesto con sacarosa, agar y sin ningún regulador del crecimiento. En ese estudio, el

medio de cultivo sin reguladores de crecimiento, como en la presente investigación, fue

capaz de inducir la formación de raíces.

El propio trabajo de Modi et al. (2012), al que se hace referencia, expone que la utilización

de diversos medios de cultivo con la adición de los reguladores del crecimiento 6-BAP y

kinetina, indujo la aparición de hiperhidricidad y otras deformaciones en los explantes

después de algunos subcultivos. Mientras que Martínez-Rivillas et al. (2016) informaron

una disminución del área foliar y un acortamiento de los tallos de los explantes tras el

tercer subcultivo en medio de cultivo con reguladores de crecimiento. Características que

desaparecían tras subcultivar los explantes en medio de cultivo sin reguladores del

crecimiento. Quiala et al. (2004) advirtieron que la presencia de algunas concentraciones

de 6-BAP en el medio de cultivo pueden inducir hiperhidricidad en los explantes, lo cual se

corresponde con este estudio.

Los síntomas que caracterizan el fenómeno de hiperhidricidad difieren entre los tipos de

plantas. Los síntomas visuales aparecen solo después de cierto período de tiempo bajo

condiciones específicas de cultivo y de acuerdo a la naturaleza de los explantes. Varios

factores se han informado como causantes de hiperhidricidad, sin embargo estos solo

inducen o evocan este fenómeno cuando otras condiciones del sistema de cultivo (el

medio de cultivo, el recipiente, el ambiente o el explante) no son los óptimos (Debergh et

al., 1992). Ese trabajo, también pone como ejemplo que la adición de 6-BAP provoca

Discusión

43

hiperhidricidad cuando los cultivos se encuentran además bajo otros factores de estrés,

como la alta capacidad de retención de agua en la parte superior del recipiente.

La utilización del medio de cultivo de multiplicación libre de reguladores de crecimiento,

puede llegar a representar una situación ventajosa. Pues, además de hacer más barato el

proceso de propagación in vitro, permite obtener coeficientes de multiplicación

relativamente cercanos a los alcanzados mediante la utilización de medios de cultivo con

reguladores, pero sin el peligro de inducir deformaciones morfológicas, o incluso

genéticas.


multiplicación

Durante el cultivo in vitro de S. rebaudiana, se realizaron un total de cinco subcultivos en

medio de cultivo libre de reguladores de crecimiento. De ellos, el tercer subcultivo mostró

el mayor coeficiente de multiplicación. No fue posible continuar con el proceso de

propagación luego del quinto subcultivo, debido al estado del material vegetal. Por lo que

bajo las condiciones propuestas, no se puede extender el proceso de multiplicación por

más de tres meses.

En la literatura, algunos trabajos han evaluado el efecto del número de subcultivos sobre

la propagación in vitro, al determinar esta relación como negativa. Gómez et al. (2007)

estudiaron el efecto de subcultivos sucesivos sobre la producción de microtallos de líneas

organogénicas de Eucalyptus globulus Labill. Los resultados indicaron una disminución en

la cantidad de microtallos desde el 3ro al 6to subcultivo, que fue acompañada por una

compactación general de los macizos de proliferación.

Los resultados de Villafranca et al. (1998) mostraron que el número de subcultivos tuvo un

efecto adverso en el vigor de las plántulas. La masa seca de las plántulas y la tasa de

crecimiento, decrecieron continuamente al incrementarse los subcultivos. También se

perdió progresivamente el estímulo tuberizante presentado por la planta madre. Ríos et al.

(2005) determinaron el número de subcultivos y el diámetro basal en el cual se obtiene la

mayor tasa de enraizamiento ex vitro para microtallos de castaño. Sus resultados

mostraron una disminución de la capacidad de enraizamiento a medida que aumentó el

número de subcultivos.

Discusión

44

En Stevia poco se ha estudiado el efecto de un número máximo de subcultivos. Sin

embargo, Lyakhovkin et al. (1993) coinciden con el presente trabajo, en un número

promedio recomendado de cinco subcultivos. Aun así, más importante parece ser, el

período en que se realizan los mismos: 30 días (Preethi et al., 2011), 30-45 (Jiménez

Quesada, 2011), 28 días (Modi et al., 2012) etc. Cabe destacar que todos estos utilizan

medios de cultivo con reguladores de crecimiento (6-BAP-kinetina/6-BAP + ANA, AIA,

AIB).

Laribi et al. (2012) y Martínez-Rivillas et al. (2016) coinciden con el presente estudio en la

implementación de períodos de subcultivos de 2 semanas, sin embargo refieren que esto

solo es posible gracias a la adición de reguladores de crecimiento. En ese sentido, los

resultados alcanzados son evidentemente diferentes, pues se obtuvieron intervalos

similares de multiplicación sin el empleo de dichos reguladores de crecimiento.

La imposibilidad de mantener períodos de subcultivos superiores a dos semanas y de

prolongar el proceso de multiplicación por más de cinco subcultivos, podría estar

relacionada con las condiciones de cultivo in vitro, la cantidad del medio de cultivo y el tipo

de recipiente utilizado. Es probable que variando estas condiciones se puedan determinar

los valores óptimos que permitan extender los períodos alcanzados.

Los coeficientes de multiplicación que se obtuvieron en el presente trabajo resultaron

inferiores respecto a otros reflejados en la literatura. Debido a que generalmente los

protocolos de propagación in vitro se auxilian de los reguladores del crecimiento para

inducir la formación de brotes múltiples. Tamura et al. (1984) consiguieron la formación de

40 brotes múltiples por explante al adicionar al medio de cultivo 10 mg.L-1 de kinetina. Por

su parte, Das et al. (2011) lograron la formación de 11 brotes a partir de cada explante al

emplear 2 mg.L-1 de este mismo regulador. Sin embargo, el empleo de concentraciones

elevadas del regulador de crecimiento kinetina, según Pratibha et al. (2010) puede

provocar una alta incidencia de variaciones morfológicas y genéticas.

Laribi et al. (2012) obtuvieron 4,25 brotes por explante al utilizar 1 mg.L-1 de 6-BAP y 0,25

mg.L-1 de AIA. Mientras que Martínez-Rivillas et al. (2016) alcanzaron para el tratamiento

control (medio de cultivo libre de reguladores de crecimiento) 1,01 brotes por ápice inicial

y para el tratamiento con mejor desempeño (0,5 mg.L-1 de 6-BAP + 0.5 mg.L-1 de AIB)

obtuvieron tres brotes por explante. Los resultados de la presente investigación se

acercan a estos últimos (coeficiente de multiplicación mínimo de 1,84 y máximo de 2,81)

Discusión

45

para el mismo tipo de explante, pero sin el empleo de reguladores del crecimiento. Esto

implica que se minimizan los efectos negativos de la adición de los reguladores de

crecimiento y la continuidad del proceso de multiplicación, sobre la planta. Pero provoca

una disminución del número de plantas propagadas in vitro. Como ventaja, es posible

ejecutar la multiplicación en corto tiempo.



vitro

La composición del sustrato es uno de los elementos imprescindibles a tener en cuenta

durante la fase de aclimatización ex vitro, debido a que de este depende la adecuada

retención de humedad y los componentes químicos necesarios. Además influye

significativamente en la arquitectura del sistema radical, influenciando el estado nutricional

y el transporte de agua en la planta (Gómez-García, 2013).

Según Aguirre-Dávila (2008), Stevia ha sido cultivada en una amplia gama de suelos, con

diferentes características fisicoquímicas (tanto arenosos como orgánicos). En el presente

trabajo se arribó a la misma conclusión, pues no hubo diferencias estadísticamente

significativas entre las plantas cultivadas en medio orgánico (compost de cachaza) y las

cultivadas en zeolita.

De forma similar, la literatura científica refiere una amplísima gama de sustratos utilizados:

Cifuentes-Hidalgo (2003) alcanzó un promedio de 13% de supervivencia con un sustrato

de 25% Promix y 75% Arena. Aguirre-Dávila (2008) utilizó un sustrato compuesto por

humus de lombriz, pomina y fibra de coco con una relación de 2:1:1, mostrando una

supervivencia del 96% y un 25% de contaminación. Khan et al. (2014) evaluaron varias

combinaciones de tierra, Soilrite y vermiculita, siendo la mejor proporción 2:1:1 que

alcanzó una supervivencia de 75%. Las condiciones de manejo y las combinaciones de

sustrato evaluadas en este trabajo, permitieron alcanzar entre 80 y 85% de supervivencia

en los sustratos compuestos, y 90% en los sustratos puros.

Es una gran ventaja que la especie en cuestión cuente con tanta plasticidad de sustrato y

mantenga, según los resultados alcanzados, altas tasas de supervivencia en medios tan

diferentes. Esto permite transferir a las plantas hacia la fase de aclimatización

exitosamente, con independencia del sustrato. Es posible utilizar el sustrato más

Discusión

46

económico, o de mayor disponibilidad, indistintamente sin afectar la productividad y de

acuerdo con las condiciones del lugar donde se ejecute.




vitro

El cultivo in vitro presenta entre sus ventajas la producción de plantas más vigorosas,

uniformes y sanas (George y Debergh, 2008). Por lo que es de esperar que al comparar

morfométricamente plantas reproducidas in vitro, con otras propagadas mediante técnicas

convencionales, las primeras alcancen mejores indicadores. Los resultados del presente

estudio avalaron esta hipótesis. Aunque el número de tallos no mostró diferencias

estadísticamente significativas entre los dos grupos, sí fueron estadísticamente diferentes

el número de hojas y la altura.

En la literatura no existen muchas referencias a este tipo de comparación para la especie

(entre plantas reproducidas in y ex vitro). Pues el desarrollo de protocolos de propagación

in vitro solo comprende, generalmente, hasta la evaluación de la supervivencia en la

transferencia a fase de aclimatización. Las evaluaciones de desempeño una vez en esta

fase solo son reflejadas por algunos trabajos de reproducción vegetativa por esquejes o

de producción y extracción de los metabolitos secundarios.

Sin embargo algunos trabajos analizan el desempeño de plantas provenientes de

explantes apicales como superior respecto a otras fuentes. Araujo et al. (2016)

determinaron la longitud promedio, tamaño de raíces y peso seco de plantas en sustrato

estéril con potasio, calcio, fósforo, magnesio y materia orgánica. En ese trabajo las

plantas fueron propagadas a partir de yemas apicales y laterales, en varios tipos de

envases y con diferentes dosis del enraizador comercial Razormín. Donde los pesos

secos y la longitud de las raíces fueron mayores en los esquejes con yemas apicales a los

provenientes de segmentos internodales. Debido posiblemente a las características

meristemáticas del tipo de tejido que presentan estos explantes.

Aguirre-Dávila (2008) también evaluó las variables altura, supervivencia y enraizamiento

de diferentes fuentes (apicales y uninodales) en varios sustratos: fibra de coco y sustrato

compuesto por humus de lombriz, pomina y fibra de coco (2:1:1). Este estudio determinó

Discusión

47

que las plantas propagadas a partir de ápices se adaptan mejor a la fibra de coco y

pueden desarrollar más hojas, pero que no había influencia alguna del tipo de explante o

el sustrato sobre la altura de la planta.

En este aspecto el presente estudio ofrece una información novedosa para esta especie,

pues no se han realizado con anterioridad este tipo de comparaciones que ofrecen

evidencia de la superioridad cualitativa y cuantitativa de las plantas reproducidas in vitro

sobre las reproducidas por esquejes.



Para la extracción de ADN genómico de Stevia rebaudiana, se refieren en la literatura

diversos protocolos empleados, casi todos a base de CTAB. Por ello se decidió evaluar

dos protocolos diferentes que incluyen este producto, propuestos por Doyle y Doyle

(1990) y Khayat et al. (2004), ambos con las modificaciones explicadas en el acápite 3.4.2

El protocolo de Khayat et al. (2004), no funcionó en las condiciones establecidas. No fue

posible aislar y observar el ADN genómico de esta especie mediante electroforesis,

aunque el protocolo se repitió en tres ocasiones. Mientras que el protocolo propuesto por

Doyle y Doyle (1990) funcionó a la perfección permitiendo obtener aislados de ADN

genómico de todas las muestras analizadas.

La relación entre los valores de densidad óptica 260/280 permite inferir si existe

contaminación de la muestra con proteínas y aminoácidos aromáticos y su valor ideal es

dos. Mientras que la relación de absorbancia 260/230 está asociada a la contaminación

por fenoles y debe ser superior a uno. Al analizar las muestras de ADN purificadas por el

protocolo de CTAB, mediante espectrofotometría, se obtuvieron altas concentraciones de

ADN genómico y valores de densidad óptica cercanos a los recomendables.

Los marcadores moleculares RAPD proveen una manera rápida y eficiente de observar y

registrar secuencias polimórficas de ADN en un gran número de loci. La mayor ventaja de

esta técnica radica en que no requiere una pre-secuenciación del ADN. El gran rango de

cebadores potenciales que pueden ser utilizados, le dan a la técnica un gran poder de

diagnóstico (Kumari y Thakur, 2014).

Discusión

48

En Stevia, la técnica RAPD se ha utilizado para analizar variaciones somaclonales con

anterioridad (Moktaduzzaman y Mahbubur-Rahman, 2009; Modi et al., 2012). En estos

trabajos se perseguía principalmente obtener similitudes (monomorfismos) entre una

planta madre y varias plantas propagadas in vitro a partir de esta. El presente estudio, se

enfoca en realizar una comparación de perfiles polimórficos, para comprobar que se

mantiene la variabilidad introducida y la estabilidad genética de la especie.

De los seis cebadores empleados en las reacciones de amplificación, solo uno (R1: 5´-

CGACCGCAGT- 3´) fue capaz de amplificar. Este produjo 63 bandas totales para las 10

muestras analizadas. En la literatura se refiere con frecuencia que solo una parte de los

cebadores totales utilizados llega a aportar productos de amplificación. Tal es el caso del

trabajo de Modi et al. (2012), donde del total de 80 cebadores probados, solo seis

mostraron bandas. Mientras que Moktaduzzaman y Mahbubur-Rahman (2009) probaron

dos cebadores y solo uno amplificó.

Los datos de la amplificación de un solo cebador no son suficientes para establecer un

perfil genético. Pues la presencia de bandas iguales puede ser producto del peso

molecular de los fragmentos y no de su secuencia. Mientras que la ausencia de bandas

no puede ser atribuida exclusivamente a la falta de la secuencia esperada, pues puede

deberse simplemente a la no amplificación por otros motivos como degradación o poca

cantidad de ADN (Kumari y Thakur, 2014). Sin embargo la literatura científica asegura que

el producto de amplificación de un solo cebador con muchas bandas permite inferir un

perfil genético preliminar, y es suficiente para tener una idea general sobre el grado de

similitud y distancia genética (Moktaduzzaman y Mahbubur-Rahman, 2009). Aún así, se

recomienda la utilización de un mayor número de cebadores para asegurar varias

amplificaciones y poder contar con datos suficientes para realizar un análisis más

completo, sobre la incidencia de variaciones somaclonales como consecuencia del cultivo

in vitro.

El dendograma UPGMA de distancia genética confeccionado con los datos obtenidos

mostró que la variabilidad genética entre ambos grupos de plantas es similar. La distancia

genética se mantuvo entre 0 y 0,66 (similitud entre 0,33 y 1), valores correspondientes a

la variabilidad genética individual dentro de una misma especie. Por lo que es posible

afirmar que el protocolo permite conservar la variabilidad intrínseca de la especie,

evitando plantaciones monoclonales que pudieran ser susceptibles a un mismo patógeno

o a una condición física específica (Murillo-Gamboa et al., 2016).

Discusión

49

De acuerdo a las comparaciones realizadas, se evidencia que las plantas propagadas in

vitro muestran un mejor desarrollo morfológico en condiciones de casa de cultivo, en

comparación con las propagadas mediante técnicas tradicionales de corte de esquejes.

Además, muestran la gran ventaja de mantener relativamente estable el nivel de

variabilidad genética introducida. Estos elementos apoyan la validación del protocolo.

De manera general el protocolo propuesto en esta investigación es simple y de fácil

implementación. Esto se debe primeramente al tipo de explante utilizado (ápices), que

permite mantener la variabilidad genética de la especie, además de ser un tipo de

explante con grandes capacidades de regeneración y crecimiento. Luego, al proceso de

desinfección que garantiza el máximo de supervivencia/desinfección de los mismos,

evitando pérdidas excesivas.

La multiplicación sin reguladores de crecimiento implica una disminución del costo

asociado a la compra de este compuesto, a la vez que elimina posibles efectos adversos

como malformaciones y minimiza las variaciones somaclonales. Mientras que el corto

período de tiempo entre los subcultivos agiliza considerablemente el proceso, sin contar

que no es necesario el paso de los explantes a la fase de enraizamiento. El uso de

cualquier tipo de sustrato (mineral u orgánico) brinda una versatilidad de disposición y

abarata la implementación de la fase de aclimatización.

Con el protocolo propuesto sería posible mantener una línea de producción que posibilite

la extracción de los metabolitos secundarios (esteviósidos y rebaudiósidos) de manera

continua. De esa manera se podría disponer de grandes cantidades de ese edulcorante

natural para ser comercializado entre la población y dirigido además específicamente al

tratamiento de los pacientes diabéticos y prediabéticos. Así como para ser utilizado en la

industria nacional sustituyendo edulcorantes artificiales de obligada importación comercial.

Conclusiones

50

CONCLUSIONES

1. Se establecieron explantes de S. rebaudiana en condiciones in vitro, determinando

que la concentración de NaClO más efectiva para el proceso de desinfección fue

de 1% y puede ser aplicado durante el rango de tiempo evaluado.

2. La multiplicación in vitro de brotes de S. rebaudiana debe ser realizada sin

reguladores de crecimiento durante cinco subcultivos cada 15 días de cultivo.

3. Se comprobó que el sustrato de zeolita, el compost de cachaza o sus

combinaciones, pueden ser empleados durante la aclimatización de S. rebaudiana.

4. Las plantas propagadas in vitro fueron genéticamente similares y desarrollaron

mayor altura y número de hojas, en comparación a las propagadas mediante corte

de esquejes.

5. Se obtuvieron plantas propagadas in vitro de Stevia rebaudiana Bertoni a partir de

ápices de plantas cultivadas ex vitro, mediante el desarrollo y la implementación

de un protocolo de propagación in vitro.

Recomendaciones

51

RECOMENDACIONES

1. Analizar si existen variaciones somaclonales como consecuencia del proceso de

propagación in vitro, empleando la técnica RAPD con otros cebadores específicos.

2. Perfeccionar las condiciones de cultivo in vitro del protocolo propuesto, para

aumentar el número de subcutivos y el coeficiente de multipicación de los brotes

de S. rebaudiana.

3. Comparar los perfiles metabólicos de las plantas propagadas in vitro y las

propagadas por corte de esquejes, con el objetivo de establecer una línea de

producción y extracción de edulcorantes naturales.

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Anexos

Anexo 1: Protocolos de regeneración in vitro de Stevia rebaudiana vía organogénesis directa

Referencia Tipo de explante Multiplicación Enraiz

(mg.L-1)

Superv

ex vitro

RC (mg.L-1) brotes Sbc. Características Deficiencias

Yang et al.

(1981) Brotes axilares

2 6-BAP

10 Kin

10 2iP

15 mx 50 d Medio

semisólido

Formación de

callos 0,1 ANA ---

Tamura et al.

(1984) Ápices 10 Kin 40 mx 30-50 d

Frascos de

vidrio, medio

semisólido

Altos niveles de

Kin 0,1 ANA 83%

Sivaram y

Mukundan

(2003)

Ápices,

segmentos

nodales y hojas

8,87 6-BAP +

5,71 IAA --- --- --- --- 4,90 AIB ---

Debnath

(2008)

Segmentos

nodales y yemas

axilares

2 6-BAP +

1,13 AIA 39 mx 30 d

Frascos de

vidrio, medio

semisólido

Formación de

callos 2 AIB ---

Anbazhagan

et al. (2010)

Ápices,

segmentos

nodales y hojas

1 6-BAP + 0,5

AIA --- --- --- --- 1 AIA ---

Preethi et al.

(2011) Hojas

2 6-BAP + 0,5

Kin + 0,1 AIA 28.7 30 d

Frascos de

vidrio, medio

semisólido

Malformaciones

en brotes 2 AIB 100%

Anexos

Das et al.

(2011)

Ápices,

segmentos

nodales y yemas

axilares

2 Kin 11 ---

Frascos de

vidrio, medio

semisólido

--- No RC 93,09%

Laribi et al.

(2012)

Segmentos

nodales

1 6-BAP +

0,25 AIA 4,25 --- Tubos de ensayo --- 0,5 AIA 67%

Modi et al.

(2012)

Segmentos

nodales No RC 9,56 28 d

Contenedores

plásticos, medio

líquido

--- No RC 80%

Martínez-

Rivillas et al.

(2016)

Ápices y

segmentos

nodales

0,5 6-BAP +

0,2 AIB 3 15 d

Contenedores

plásticos, medio

semisólido

Hiperhidricidad 0,5 AIB ---

Kin: Kinetina; 6-BAP: 6-bencilaminopurina; 2iP: N6-(2-isopentil)-adenina; ANA: ácido naftalenacético; AIA: ácido indol-3-acético; AIB:

ácido indol-3-butírico

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