Slide Floris - Collana Seminari CRS4 2015

Tossicologia in silico: modelli per la predizione di proprietà chimico-tossicologiche di molecole di

importanza industriale (direttiva REACH).

Matteo FlorisCRS4 - IRGB CNR - UniSS

AbstractTossicologia in silico: Modelli per la predizione di proprietà chimico-tossicologiche di molecole di importanza industriale (direttiva REACH)

La normativa REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals substance – Regolamento (CE) n. 1907/2006) ha posto l’accento sulla necessita di avere a disposizione una caratterizzazione sufficiente sulle proprieta ambientali e tossicologiche delle sostanze chimiche cui siamo esposti nella nostra vita. Le sostanze chimiche fanno parte della nostra quotidianita (ad esempio additivi negli alimenti o coloranti dei tessuti che indossiamo, ma anche coloranti, i pesticidi, e i prodotti a base di grassi naturali, vegetali o animali): non dobbiamo pensare che esse esistano solo negli impianti di produzione, ovvero che l’esposizione si verifichi in occasione di incidenti. Il legislatore europeo ha voluto tenere conto anche di tutti quei prodotti di uso quotidiano, e quindi non solo delle sostanze chimiche pure, ma anche in quanto costituenti o presenti nei beni di uso comune.

Per la normativa europea è possibile valutare la loro sicurezza con metodiche innovative. Durante questo seminario vedremo in dettaglio come si possa migliorare la sicurezza delle sostanze chimiche e al tempo stesso individuare un percorso sostenibile per le industrie ed innovativo dal punto di vista scientifico, adottando serie di soluzioni che prevedeono l’uso di metodi computazionali, e che sono possibili grazie ad una disciplina chiamata chemoinformatica.

QSAR

(Quantitative) Structure-ActivityRelationship

E nel caso delle molecole...L’esperto è in grado di identificare i collegamenti tra la struttura delle molecole e la loro tossicità

A volte è una relazione lineare

Descrittori molecolariConstitutional / information descriptors: molecular weight, number of chemical elements, number of H-bonds or double bonds

Physicochemical descriptors: lipophilicity, polarizability

Topological descriptors: atomic branching and ramification

Electronic, geometrical and quantum-chemical descriptors

Fragmental / structural key

RiassumendoI modelli QSAR sono uno strumento per predire proprietà molecolari, come la tossicità

Le predizioni avvengono attraverso l’uso di descrittori molecolari e l’applicazione di modelli di regressione o classificazione e altre tecniche più avanzate

RiassumendoI modelli QSAR sono uno strumento per predire proprietà molecolari, come la tossicità

Le predizioni avvengono attraverso l’uso di descrittori molecolari e l’applicazione di modelli di regressione o classificazione e altre tecniche più avanzate

Quali sono i campi di applicazione?

Negli USA...US epa - New Chemicals Program - Industrial Chemicals

Section 5 of TSCA (Toxic Substance Control Act) requires a manufacturer and/or importer of a new chemical substance to submit a premanufacture notice (PMN) to US EPA 90 days before commencing manufacture or import of the new chemical

Negli USA...Spesso le decisioni sono prese in assenza di dati sperimentali

Metodi SAR e QSAR sono utilizzati per aiutare gli esperti nella fase di revisione

… e in EuropaLa normativa REACH promuove l’uso di metodiche innovative (art. 1)

Tutte le informazioni a disposizione devono essere usate

I metodi QSAR sono menzionati esplicitamente

La normativa REACHIl regolamento (CE) n.1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio approvato il 18 dicembre 2006, denominato regolamento "REACH" (dall'acronimo "Registration, Evaluation, Authorisation of Chemicals"), prevede la registrazione di tutte le sostanze prodotte o importate nella Comunità in quantità maggiori di una tonnellata per anno. Si tratta, secondo le stime della Commissione Europea, di circa 30.000 sostanze chimiche in commercio.

La registrazione di una sostanza consiste nella presentazione, da parte dei fabbricanti o degli importatori, di alcune informazioni di base sulle sue caratteristiche e, in mancanza di dati disponibili, nell'esecuzione di test sperimentali per caratterizzare le relative proprietà fisico-chimiche, tossicologiche e ambientali.

La normativa REACHIl regolamento REACH, costituito da 141 articoli e 17 allegati tecnici, prevede:

● la valutazione dei test proposti dalle imprese per le sostanze prodotte o importate nella U.E. in quantità superiori a 100 tonnellate per anno

● la predisposizione da parte dell'industria di una "relazione sulla sicurezza chimica" per ciascuna sostanza prodotta o importata in quantità superiori a 10 t/anno


● la valutazione da parte degli Stati membri di alcune sostanze considerate prioritarie

● l'autorizzazione, solo per usi specifici e controllati, delle sostanze "estremamente preoccupanti", come le sostanze cancerogene, mutagene e tossiche per la riproduzione, le sostanze Persistenti, Bioaccumulabili e Tossiche (PBT), le sostanze molto Persistenti e molto Bioaccumulabili (vPvB) e gli "interferenti endocrini"


● l'adozione di restrizioni di portata generale per alcune categorie di sostanze, allo scopo di tutelare la salute umana e proteggere l'ambiente

● l'abrogazione di numerose norme in vigore allo scopo di semplificare il quadro normativo


● l'accesso del pubblico alle informazioni sulle proprietà tossicologiche e ambientali delle sostanze chimiche

● un'attività di informazione e assistenza tecnica alle imprese (help-desk nazionali)

● l'effettuazione di attività di controllo e vigilanza da parte degli Stati membri per garantire il rispetto dei requisiti previsti dal regolamento

Gli endpointsPer la registrazione di sostanze chimiche nell’ambito del REACH, nel dossier tecnico che le accompagnano è necessario fornire informazioni su diversi endpoints

Gli endpointsPer la registrazione di sostanze chimiche nell’ambito del REACH, nel dossier tecnico che le accompagnano è necessario fornire informazioni su diversi endpoints

Informazioni chimico-fisiche

Boiling pointRelative densityVapour pressureWater solubilityPartition coefficient o/wGranulometryViscosityetc...

Informazioni tossicologiche

Skin irritation or skin corrosion Eye irritation Skin sensitisation Mutagenicity Acute toxicity Repeated dose toxicity Reproductive toxicity Toxicokinetics Carcinogenicity

Informazioni eco-tossicologiche

Aquatic toxicityDegradationFate and behaviour in the environment Effects on terrestrial organisms Effects on sediment organismsToxicity to birds

Dubbi sui metodi in silico?Spesso si osserva che i metodi QSAR possano essere una scorciatoria per l’industria per spendere meno in ricerca tossicologica, o che siano un modo per sacrificare meno animali. Oppure che per salvaguardare ambiente e salute, servono metodi più attendibili.

Questo è riduttivo!

Infatti il REACH dispone che tutte le informazioni a disposizione vengano usate: lo scopo non è trovare il miglior metodo QSAR, ma utilizzare i metodi alternativi nel migliore dei modi per proteggere esseri umani e ambiente. Pertanto è importante quali vantaggi derivano dall’usare metodi in silico.

Perchè usare metodi in silicoInnovazione

Iniziative USA hanno prodotto informazioni di tossicità su oltre 100.000 composti chimici.

Tempistica per gli esperimenti

Il tempo necessario per ottenere risultati e misurazioni, soprattutto per endpoints cronici, sarebbe troppo lungo; al contrario, i metodi QSAR sono molto più veloci.

Perchè usare metodi in silico

Necessità di laboratori e risorse


Costi per effettuare solo esperimenti in vivo sarebbero veramente alti, nell’ordine dei miliardi di euro, mentre i metodi QSAR sono spesso liberi e gratuiti.


Animali: sarebbe necessario sacrificarne migliaia!


Prioritizzazione

I regolatori devono identificare le sostanze più rischiose, e verificare tutti i dossiers sottomessi dall’industria. Diverse decine di migliaia di sostanze sono sottomesse all’ECHA, l’Agenzia europea responsabile del processo di registrazione. Solo il 5% di queste vengono valutate: ogni 20 sostanze registrate, l’ECHA riesce a verificare le proprietà tossicologiche di solo 19 di queste. Coi metodi QSAR è possibile velocizzare questo processo!


Pro-active approach for safer chemicals

So far chemical industry addressed the development of new chemicals only on the basis of the target properties for the candidate new products. Critical issues, such as toxicity, have been analysed in a second stage, to comply to regulations. QSAR methods offer tools to incorporate the process of the evaluation of the toxic properties since the beginning of the planning of new compounds, within a pro-active strategy, minimizing the impact of chemicals on the environment and human beings, and reducing the economic resources due to the development of chemicals without the knowledge on their toxicological and environmental properties.


Il nostro team di lavoro

http://www.life-prosil.eu/

Il progetto PROSIL

L’articolo 13 del REACH prescrive quanto segue:

Le informazioni relative alle proprietà intrinseche delle sostanze possono essere acquisite con mezzi diversi dai test [...] In particolare per quanto riguarda la tossicità umana, le informazioni sono acquisite, ove possibile, ricorrendo a mezzi diversi dai test su animali vertebrati, attraverso l'uso di metodi alternativi, ad esempio metodi in vitro o relazioni qualitative o quantitative struttura-attività o dati relativi a sostanze strutturalmente affini (raggruppamento o metodo del nesso esistente - "read-across")

Il read across

Il read-across è una tecnica impiegata per colmare le lacune dei dati, che utilizza le informazioni relative all’endpoint di una sostanza chimica per prevedere lo stesso endpoint per un’altra sostanza chimica considerata simile per certi aspetti fondamentali relativi a detto endpoint, per esempio il modo d’azione, la tossicocinetica, il metabolismo ecc. Il read-across può fornire un risultato qualitativo o quantitativo.

Il read across

Per colmare le lacune dei dati è possibile eseguire il read-across nei seguenti modi:

● relazione uno a uno (una sostanza analoga è utilizzata per realizzare una stima per una singola sostanza chimica);

● relazione uno a molti (una sostanza analoga è utilizzata per realizzare stime per due o più sostanze chimiche);

● relazione molti a uno (due o più sostanze analoghe sono utilizzate per realizzare una stima per una singola sostanza chimica)

● relazione molti a molti (due o più sostanze analoghe sono utilizzate per realizzare stime per due o più sostanze chimiche.

Il read across

La similarità

similar property principle of Johnson and Maggiora: similar compounds have similar properties

La similaritàSimilarity is a subjective and multifaceted concept, regardless of whether compounds or any other objects are considered. Despite its intrinsically subjective nature, attempts to quantify the similarity of compounds have a long history in chemical informatics and drug discovery. Many computational methods employ similarity measures to identify new compounds for pharmaceutical research. However, chemoinformaticians and medicinal chemists typically perceive similarity in different ways. Similarity methods and numerical readouts of similarity calculations are probably among the most misunderstood computational approaches in medicinal chemistry

La similaritàA generalizable definition of chemical similarity for read-acrossMatteo Floris, Alberto Manganaro, Orazio Nicolotti, Ricardo Medda, Giuseppe Felice Mangiatordi and Emilio Benfenati

La similarità

Concetti:1. la rappresentazione molecolare2. le metriche di similarità3. pesi relativi

La rappresentazione molecolare

La rappresentazione molecolareacetylsalicylic acid

C9H8O4

CC(=O)Oc1ccccc1C(O)=O

InChI=1S/C9H8O4/c1-6(10)13-8-5-3-2-4-7(8)9(11)12/h2-5H,1H3,(H,11,12)

La rappresentazione molecolare0101010101010110000000100010000010001010001010011001010001010001010010001010001010011001010000010001010001010011001010001010001010010000010001010001010011001010001010001010000010001010001010011000000011100010100

Fingerprints e chiavi strutturaliThe fingerprinting algorithm examines the molecule and generates the following:

a pattern for each atoma pattern representing each atom and its nearest neighbors (plus the bonds that join them)a pattern representing each group of atoms and bonds connected by paths up to 2 bonds long... atoms and bonds connected by paths up to 3 bonds long... continuing, with paths up to 4, 5, 6, and 7 bonds long.

Fingerprints e chiavi strutturali

Le metriche di similaritàSimT=C/(A+B-C)

C: count of the identical bits set (ones) in both fingerprints

A: count of total bits set (ones) in fingerprint #1

B: count of bits set (ones) in fingerprint #2.

http://www.antares-life.eu/index.php?sec=modellist

“Bioconcentration” è il processo in cui la concentrazione di un composto chimico in un organismo acquatico eccede la concentrazione che si rileva nell’acqua.

La “Bioconcentration” si riferisce ad una situazione in cui il composto è assorbito dall’acqua attraverso le vie respiratorie o attraverso la pelle.

Solitamente si esprime in termini di Bioconcentration factor.

Il “bioconcentration factor (BCF)” è pertanto la concentrazione della sostanza test nel pesce diviso la concentrazione nel medium allo stato di equilibrio.

Le sostanze chimiche definite “carcinogenic” sono quelle che inducono tumori, aumentano incidenza di cancro benigno o maligno o accorciano la vita media di insorgenza dei tumori.

Studi di mutagenicità sono richiesti per tutti i quantitativi (in tonn.) di sostanze chimiche.

A differenza di altri endpoint, una mutagenicità negativa in vitro può essere considerata una evidenza di potenziale non-mutagenicità, ma risultati positivi vanno confermati in vivo.

At 1-10 tonnage level (Annex VII) the in vitro gene mutation study in bacteria (Ames test) is required.

At Annex VIII level (10-100 ton), two additional in vitro studies are required: a cytogenicity study and a gene mutation study in mammalian cells.

At higher tonnage in vivo studies are needed.

Test genetico per l'analisi della genotossicità di una sostanza, molto utilizzato ad esempio in ambito biomedico e farmaceutico-industriale nella fase preclinica di sperimentazione di nuove molecole e per analisi ambientali.

Il principio del test si basa sulla valutazione della capacità di un sospetto mutageno di provocare la reversione di un carattere auxotrofo his- in un ceppo di batteri mutato (Salmonella typhimurium), rendendolo nuovamente capace di sopravvivere in un terreno privo di istidina.

Test di Ames

Test di Ames

Regole di tossicità

Frammenti di tossicità

DATASET CURATI DI MUTAGENICITA’

REGOLE DI FRAMMENTAZIONE

STATISTICA DI PRIORITIZZAZIONEREGOLE

Frammenti di tossicità

DATASET CURATI DI MUTAGENICITA’

REGOLE DI FRAMMENTAZIONE

STATISTICA DI PRIORITIZZAZIONEREGOLE

6065 MOLECOLE CDK

FISHER TEST (R)

DATASET ESTERNO (JP)

Frammenti di tossicità1. Exhaustive fragmentation:

a. RECAP method: Fragment cleaves single bonds to generate molecular fragments. The cleavage rules can correspond to retro- chemical reactions in order to enhance synthetic accessibility.

b. CCQ fragmenta2on is a fast and simple method by fragmenting along functional groups but not destroying them, so no rules, no labelling is needed.

2. Overall “unique” list of Fragments is converted to InChI -> database of mappings.

3. 2D fingerprints calculated for each fragment –> fragment similarity metrix (cutoff=0.85)

Frammenti di tossicità● All the fragment-molecule pairs (81.667) were validated

by using the substructure search implementation of Pybel (Mutagenicity dataset)

● 52.382 pairs validated (64%, corresponding to 30.782 unique fragments), 37.501 rejected (36.738 unique fragments), 14.432 SMARTS exceptions

● Fisher exact test for identification of significant fragments

● 238 fragments with P < 0.01

Metabolismo e tossicità

Una molecola può non essere tossica, un suo metabolita si (o viceversa)

Issues:- spesso gli algoritmi sono fatti con regole che “sottintendono” modifiche

metaboliche- doppia predizione

Contatti

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mailto:[email protected]

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Consigli per la lettura

http://www.antares-life.eu/learning.php

Ringraziamenti

Ricardo MeddaEmilio Benfenati

Fabrizio Murgia, Giuditta Lecca, Andrea Mameli

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