SistemadeBajoCostoyAltoRendimientopara ... · fármacos utilizados en la terapéutica médica....

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Vol. 34, No. 3, Diciembre 2013, pp. 227-242

Sistema de Bajo Costo y Alto Rendimiento paraBioensayos Farmacológicos in vitro de Tejido Vivo

I. Bahena-Casales∗

A. Torres-Cerón∗

A. LavilleV. Plata

A. Hernández-CruzJ. Bargas

J. E. Pérez-Ortega

División de Neurociencias,Instituto de Fisiología Celular,

Universidad NacionalAutónoma de México, México

D.F., 04510, México.∗Estos autores participaron en

igual proporción para larealización de este trabajo.

RESUMENLa potencialidad terapéutica de fármacos se averigua mediante estudiosbioquímicos y celulares que nos hablan de sus acciones sobre víasde señalización y receptores. Sin embargo, en algunas enfermedades−por ejemplo, enfermedades neurológicas conocidas como “desórdenesdel movimiento”−, los bioensayos realizados miden las accionesfarmacológicas mediante valoraciones conductuales en modelos animalesde las mismas. No se han logrado bioensayos que correlacionen laacción terapéutica de fármacos sobre la actividad del tejido vivo.Se puede medir la actividad de decenas de neuronas medianteimagenología de calcio en tejido vivo. Ciertos parámetros de estaactividad neuronal registrada in vitro reflejan su estado patológico,así como la acción terapéutica de fármacos determinados. No hayun sistema integrado orientado a estos bioensayos, por lo que secombinan diferentes equipos comerciales de manera independiente concosto final de alrededor de 100,000 USD. Presentamos un prototipode un sistema integral encaminado a realizar este tipo de bioensayos:microscopía de epifluorescencia con calidad suficiente para adquirir ymedir cuantitativamente la actividad celular del tejido vivo registradain vitro pero de costo 10 veces menor −alrededor de 10,000 USD−.Se pueden realizar satisfactoriamente bioensayos funcionales de usopotencial en la industria farmacéutica, investigación y docencia.

Palabras clave: microscopía digital, led ultrabrillante,instrumentación virtual, bioensayo funcional de alto rendimiento.

228 Revista Mexicana de Ingeniería Biomédica · volumen 34 · número 3 · Diciembre, 2013

Correspondencia:Pérez Ortega, Jesús Esteban.

Instituto de Fisiología Celular,UNAM. Departamento de

Neurociencia Cognitiva. POBox 70-253, México D.F.,

04510. Tel: 56 22 56 15. Fax:56 22 57 47.

Email address:[email protected]

Fecha de recepción:3 de Junio de 2013

Fecha de aceptación:19 de Noviembre de 2013

ABSTRACT

The therapeutic potential of drugs is determined by biochemical andcellular studies that inform us about their actions on signaling pathwaysand receptors. However, in some diseases −for example, neurologicaldiseases such as “movement disorders”−, bioassays measure thepharmacological actions by evaluating behavior in animal models of thediseases. There are no bioassays that correlate drug therapeutic actionson living tissue. The neural activity of several neurons can be measuredby using calcium imaging on living tissue. Certain parameters of therecorded neuronal activity in vitro reflect the pathological state andthe therapeutic actions of specific drugs. There is no integrated systemoriented to these bioassays, so different commercial equipment has tobe integrated independently with costs about 100,000 USD. We presenta prototype of an integral system aimed to perform bioassays in vitro:epifluorescence microscopy with enough quality for the acquisition andquantitative assessment of cell activity recorded in the living tissue withcosts around 10 times less −about 10,000 USD−. It allows successfullyfunctional bioassays of potential use in the pharmaceutical industry,research an education.

Keywords: digital microscopy, power led, virtual instrumentation,high throughput screening, functional bioassay.

INTRODUCCIÓN

En los últimos años se han desarrolladotécnicas que miden la actividad de muchascélulas simultáneamente en el tejido vivomantenido in vitro. Esto permite medirlos efectos farmacológicos de los fármacosmediante bioensayos. Estos ensayos se realizanmediante la integración de diferentes equiposcomerciales adquiridos de manera independiente−microscopios de epifluorescencia, fuentes deiluminación, adquisición digital y procesamientoen línea−. Debido a que cada uno de ellostiene propósitos generales, y no está orientadoespecíficamente a este tipo de bioensayos, surgela necesidad de realizar un sistema dirigidoespecíficamente a este tipo de bioensayosfarmacológicos en tejido vivo mantenido in vitro;el cual es el objetivo principal del presentetrabajo.

Presentamos un sistema integral queincluye microscopía digital con iluminación deepifluorescencia para la realización de bioensayosfuncionales masivos y, por ahora, es un prototipo

de bajo costo para la evaluación cuantitativa defármacos utilizados en la terapéutica médica.Utilizaremos como ejemplo, para dar una guíaal presente artículo, los fármacos utilizadosen enfermedades neurológicas, en particularaquellos diseñados para tratar los llamados“desórdenes del movimiento”. Sin embargo, eluso potencial del presente prototipo se puedeextender a cualquier tipo de tejido biológicomantenido in vitro, y a la evaluación de muchostipos de fármacos.

Se puede realizar la evaluación de variosfármacos de manera simultánea y paralela dadoque el costo de varios de estos sistemas integralesse puede hacer con el mismo presupuesto quese utilizaría para integrar los diferentes equiposcomerciales (ver Tabla 1). El bajo costo de estesistema también es asequible para la capacitacióny la docencia en las escuelas de químicafarmacéutica o de fármaco-biología, en dondeuno solo de los equipos bastaría para entrenar agrupos enteros de estudiantes, mediante la salidadigital de la computadora con un proyector o unapantalla grande.

Bahena-Casales y col. Sistema de Bajo Costo y Alto Rendimiento para Bioensayos Farmacológicos in vitro de Tejido Vivo 229

Mostramos que el prototipo cuenta conla flexibilidad, modularidad, iluminación einstrumentación óptica suficientes para realizarlas siguientes tareas:

• correlaciones entre la actividad neuronaldel tejido y el estadio de la enfermedad;

• curvas dosis-respuesta;

• control de calidad;

• prácticas de laboratorio.

DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA

Los desórdenes del movimiento: unejemplo de enfermedades que necesitandel diseño de bioensayos de altorendimiento

La potencialidad terapéutica de fármacos útilespara el tratamiento de las enfermedadesneurológicas, en particular, las relacionadascon desórdenes del movimiento, como laenfermedad de Parkinson idiopática, se averiguamediante estudios bioquímicos y de fisiologíacelular que obtienen datos precisos sobresus acciones sobre vías de señalización, laocupación de receptores de membrana en losnúcleos sub-corticales denominados “GangliosBasales”, y la relación de estos receptoresy vías de señalización con el control decanales iónicos encargados de la excitabilidadneuronal, y por lo tanto, de la actividadneuronal en los circuitos que controlan losmovimientos [1-2]. Sin embargo, particularmenteen las enfermedades neurológicas que conllevandesórdenes del movimiento, los bioensayos quemiden las acciones terapéuticas de estos fármacosde manera cuantitativa mediante funciones“dosis (concentración) - respuesta”, se realizanmediante la valoración conductual de modelosanimales de estas enfermedades [3-6]. Siempreestá a discusión qué tanto estos modelos animalesreflejan los signos y síntomas de las enfermedadeshumanas [3], por lo que se necesitan bioensayosque correlacionen directamente la acción delos fármacos sobre la actividad neuronal enel tejido vivo (e.g., biopsias) y su eficaciaterapéutica. De acuerdo a nuestro conocimiento,

a la fecha estos ensayos no existen para muchasenfermedades y constituyen el problema aresolver. Como una guía para la presentaciónde este problema, hablaremos de la Enfermedadde Parkinson idiopática (EP). No obstante, elprototipo presentado puede usarse para valorarfármacos de manera cuantitativa dedicados ala terapéutica de muchos otros padecimientos.A su vez, el uso de tejido nervioso para lapresentación de este prototipo no debe de versecomo una limitante, pues el sistema presentadopodría utilizarse para visualizar otros tejidos, nonerviosos, y ensayar múltiples fármacos.

La EP se ha convertido en un problema desalud pública que drena los recursos tanto de lossistemas de salud pública y de retiro, como delas familias de los pacientes, conlleva un elevadocosto económico y anímico familiar debido aque es degenerativa, progresiva, incurable yaltamente incapacitante, llevando en muchoscasos no sólo a la incapacidad motora de lospacientes para atenderse por sí mismos, sinotambién a la demencia [1, 7-9]. Probablemente seha convertido en un problema de salud públicagracias a que la edad promedio de fallecimientose ha elevado a nivel mundial [8-9].

La EP comienza con la degeneración neuronalpor acumulación de α-sinucleína en núcleos deltallo cerebral, que continúa con la degeneraciónde las neuronas dopaminérgicas de la sustancianegra compacta (SNc) y del área ventraltegmental (VTA, por sus siglas en inglés).Sólo hasta que se ha muerto entre el 60y 70 % de las neuronas dopaminérgicas escuando comienzan los signos motores de laenfermedad: rigidez muscular que dificulta lainiciación y ejecución de movimientos, los hacemás lentos (bradicinesia, hipocinesia, acinesia) y,al mismo tiempo, se produce temblor en reposoe inestabilidad postural [7]. Se atribuye a la faltade dopamina (DA) en los circuitos de los gangliosbasales el desarrollo de estos desórdenes enel movimiento [10-11]. De manera consecuente,para aminorar los signos de la EP, se realizala administración de fármacos que permitan lasíntesis de más DA por las neuronas que quedanvivas (e.g., levodopa o L-DOPA), o que utilicenlos receptores neuronales de la DA para ejercersus efectos (agonistas dopaminérgicos). Estos


fármacos retrasan el desarrollo de la enfermedad,mejoran la calidad de vida de los pacientes yresultan en una mayor sobrevida promedio [12].Sin embargo, presentan varios problemas, cuyaexplicación es uno de los temas actuales dela investigación en neurociencias tanto básicascomo aplicadas y clínicas: pierden su eficaciaterapéutica con el paso del tiempo (5 - 10 años)y generan por sí mismos diversos trastornos delmovimiento tan incapacitantes, o incluso más,que la misma EP: discinesias, síndromes “on-off”y “wearing-off” entre otros [13]. Debido a esto, eldesarrollo de nuevos fármacos, que en lo posibleeviten estas complicaciones, se ha convertido enun problema actual.

Para realizar bioensayos farmacológicosmoleculares y celulares existen sistemasintegrales completamente automatizados queson utilizados en la industria farmacológicay en la investigación científica. La principalcaracterística de estos sistemas son los métodosde “análisis de alto contenido” o “exploraciónde alto rendimiento” (conocidas en inglés comoHigh-Content Analysis o High-ThroughputScreening). La gran ventaja de estos sistemases la prueba masiva de fármacos sobre célulaso moléculas y tener resultados en mucho menortiempo. Dado que el costo de estos sistemas esdemasiado elevado -aproximadamente 500,000USD-, sólo las grandes industrias y los grandeslaboratorios científicos pueden acceder a ellos.

Nuestro laboratorio ha demostrado que sepuede medir la actividad neuronal de decenasde neuronas simultáneamente mediante el usode imagenología de calcio con resolución decélula única [14-16], y que la medición de ciertosparámetros de esta actividad neuronal registradain vitro refleja tanto el estado patológico comola acción terapéutica de fármacos determinados[17-18]. Para estos estudios se requiere demicroscopios de epifluorescencia, adquisicióndigital y cierto procesamiento en línea, queintegrados de manera independiente tienencostos alrededor de 100,000 USD. Por lo cual,estos sistemas están limitados al mundo de lainvestigación científica, ya sea en institucionesde educación superior, como universidades, o enel área de investigación y desarrollo de grandescompañías trasnacionales. De todas maneras,

los costos hacen inviables los ensayos masivosde diferentes fármacos sobre la actividad depoblaciones de neuronas y microcircuitos en eltejido nervioso registrado in vitro. Estos costostambién hacen inviable su uso para la docenciaa nivel licenciatura.

Debido a lo anterior, el presente trabajopresenta un prototipo de bioensayo masivo dealto rendimiento y bajo costo −alrededor de10,000 USD, ver Tabla 1−, para la evaluacióncuantitativa de múltiples fármacos en formaparalela, dado que se pueden adquirir variosde estos equipos con el mismo presupuesto deuno de los equipos utilizados actualmente enla investigación científica. Con la adición dela instrumentación virtual, se puede lograr suautomatización total o parcial, dependiendo delproyecto en particular. Su bajo costo tambiénlo haría asequible para la capacitación y ladocencia en las escuelas de química farmacéuticao de fármaco-biología donde uno solo de losequipos bastaría para entrenar a grupos enterosde estudiantes.

Funcionalidad del prototipo

El hardware de este sistema cuenta con un diseñoversátil para su fácil transportación pues susdimensiones son de 15x12x30 cm y su peso es de2 kg sin contar el sistema de cómputo asociado(una laptop o una PC). Para reducir costos ycontrolar la iluminación con el sistema virtual,la iluminación se realiza con un diodo emisorde luz (LED, por sus siglas en inglés) ultrabrillante integrado al microscopio que sustituyea las lámparas de xenón (Xe) o mercurio (Hg),las cuales tienen un mayor consumo de energía,el espacio que ocupan es 10 veces mayor, susciclos de vida son menores y requieren deobturadores mecánicos para controlar el tiempode iluminación al tejido. El LED utilizadoes controlado mediante instrumentación virtualdesde el mismo equipo de cómputo que se usapara la adquisición de datos.

Como demostración de la funcionalidad delprototipo presentamos varios ejemplos de su uso.En el primer ejemplo se utilizó la epifluorescenciapara identificar neuronas en tejido cerebral deanimales transgénicos BAC-GFP-D2 [2], esto es,


que contienen el gen que controla la expresiónde la proteína verde fluorescente (GFP, por sussiglas en inglés) asociado al promotor del gen quecontrola la expresión del receptor a dopamina deltipo D2. De esta manera, las células que expresanestos receptores son las únicas visibles con elsistema de epifluorescencia para GFP (Figura2B).

El segundo ejemplo es un bioensayo funcionaldonde el objetivo es identificar la actividadde muchas neuronas simultáneamente en elcampo visual a lo largo del tiempo. Para ellose aprovechó la relación que existe entre laactividad neuronal (disparo de potenciales deacción por las neuronas) y la entrada de calcioa la células. En resumen, el tejido (biopsias orebanadas de tejido cerebral) es incubado con unfluoróforo (Fluo-8 R© Invitrogen R©) que penetraal interior de las neuronas y que emite luz demanera transitoria al aumentar la concentraciónde calcio [14]. Cuando las neuronas disparanpotenciales de acción se abren canales de calciodependientes de voltaje que permiten la entradade calcio al interior de la célula. Éste es atrapadopor el fluoróforo con la consecuente emisiónde luz (transitorios de calcio) que indica quela neurona está activa. La actividad de lasneuronas, y consecuentemente de microcircuitosenteros con docenas de neuronas, puede sermonitoreada a lo largo del tiempo medianteel registro de imágenes digitales secuenciales[16]. Este proceso se puede realizar tanto enla situación control, como en la situaciónexperimental, por ejemplo, la adición de algúnfármaco que se desee probar. Para el propósitode este trabajo primero registramos simplementeel aumento en la actividad al adicionar 25mM de KCl, pero citamos las publicacionesdel laboratorio donde probamos fármacos anti-parkinsonianos [16-18].

El tercer ejemplo que presentamos es el cursotemporal del registro de la actividad neuronal entejido estriatal vivo obtenido de un animal conel modelo de la EP y el efecto que tiene sobrela actividad neuronal patológica la adición de L-DOPA (1 µM) en el líquido de perfusión, puesal presente prototipo se le puede adaptar, conrelativa facilidad un sistema de perfusión.

DESCRIPCIÓN DEL PROTOTIPO YEJEMPLOS

Hardware

El sistema de microscopia (Figura 1) estáconformado por 5 unidades (A, B, C, D yE), un circuito de control y un programa deadquisición (derechos registrados) desarrolladoen el ambiente de programación LabVIEW R©.La unidad A abarca el sistema de iluminaciónprincipal que incluye al LED y su disipadorde calor. La unidad B está compuesta por unarreglo de óptica infinita, un colimador quehomogeneíza la luz de excitación y un objetivotambién de óptica infinita. La unidad C esuna fuente de iluminación auxiliar para ubicarel campo de observación deseado en campoclaro. El ajuste de la posición en el espaciose realiza mediante la unidad D, donde lamuestra de tejido está fija y el microscopiose manipula en las tres direcciones con unmanipulador macrométrico y uno micrométrico(potencialmente automatizables). La unidad Ees una cámara digital para la adquisición deimágenes (videos). Todo el sistema de controlestá hecho con instrumentación virtual: permitever las imágenes capturadas por la cámara enuna computadora, controla la iluminación, elbrillo, el contraste, etc. Identifica las células conactividad, creando así, un sistema de microscopíavirtual manejado desde la computadora y parauso en preparaciones de tejido vivo mantenidasen condiciones in vitro (perfusión y oxigenaciónconstantes).

Sistema óptico

El sistema óptico (Figura 1, Unidad B) fuediseñado y ensamblado por los autores y consistede un objetivo NIKON R©(plan flour 10x/0.30W, DIC NI, ∞/0 WD 3.5) el cual se acopla aladaptador del objetivo que a su vez se une a laparte inferior del tubo de óptica infinita [19], yéste a la rama inferior de la T de iluminación paraepifluorescencia. Los anteriores componentesson suministrados por INFINITY OPTICS R©.En el tronco de la T se acopla el LED deiluminación mediante una rosca fina hecha adhoc, de esta forma se permite ajustar el LED


Tabla 1. Tabla de los componentes del sistema integral y sus precios.Componentes Modelo Precio en USDCámara CCD Grasshopper PointGrey $ 3,000

Sistema de Iluminación LED Siled R© de 5W $ 7Controlador $ 100

Óptica INFINITY OPTICS $ 3,500Desplazamiento mecánico Edmund Optics $ 550

Thorlabs $ 1,500Objetivo óptico Nikon10x/0.30 W $ 600Ensamblaje Piezas manufacturadas $ 1,000

TOTAL $10,257

Lista de Figuras y Tablas

Componentes Modelo Precio en USD

Cámara CCD Grasshopper dePointGrey $ 3,000

Sistema de Iluminación LED Siled® de 5W $ 7

Controlador $ 100

Óptica INFINITY OPTICS $ 3,500

Desplazamiento mecánico Edmund Optics $ 550

Thorlabs $ 1,500

Objetivo Óptico Nikon10x/0.30 W $ 600

Ensamblaje Piezas manufacturadas $ 1,000

TOTAL $10,257

Tabla 1. Tabla de los componentes del sistema integral y sus precios.

Figura 1. Fotografías del prototipo del sistema para microscopía virtual para bioensayos

funcionales de fármacos. A. Identificación de los componentes: Unidad A: Sistema de iluminación

principal. Unidad B: Sistema óptico. Unidad C: “Sistema de iluminación auxiliar”. Unidad D:

“Sistema mecánico de movimiento en tres dimensiones” y Unidad E: “Sistema de adquisición

digital”. B. Ensamble de las Unidades A, B y E. C. Vista general del prototipo cuyas dimensiones

finales son 30x15x12 cm. A un lado se encuentra un dispositivo electrónico diseñado ad hoc para

el control mediante la instrumentación virtual acoplado a una computadora.

Figura 1. Fotografías del prototipo del sistema para microscopía virtual para bioensayos funcionales defármacos. A. Identificación de los componentes: Unidad A: Sistema de iluminación principal. Unidad B:Sistema óptico. Unidad C: Sistema de iluminación auxiliar. Unidad D: Sistema mecánico de movimientoen tres dimensiones y Unidad E: Sistema de adquisición digital. B. Ensamble de las Unidades A, B y E.C. Vista general del prototipo cuyas dimensiones finales son 30x15x12 cm. A un lado se encuentra undispositivo electrónico diseñado ad hoc para el control mediante la instrumentación virtual acoplado auna computadora.

en el foco del lente colector (colimador óptico)que emite una iluminación homogénea al espejodicroico (Edmund Optics 495-505 nm) ubicadoa 45 grados en la intersección del tronco y lasramas de la T. Este espejo refleja la iluminación através del objetivo sobre el tejido. El tejido emitela fluorescencia de regreso a través del objetivo,el espejo dicroico y el filtro de emisión (EdmundOptics 520-556 nm), este último conectado a larama superior de la T y a la parte superior deltubo de óptica infinita se acopla al sistema deadquisición digital (Unidad E).

Sistema de iluminación paraepifluorescencia

La mayoría de los microscopios comercialescon epifluorescencia utilizan una fuente deiluminación basada en lámparas de alta potenciacon gases generalmente de mercurio o de xenón,con una vida útil de alrededor de 1,000 horas, unrendimiento de 25 Lumen/W y costos que oscilanentre 1,000 y 5,000 USD.

Nuestro sistema de iluminación fue diseñadoa base de un LED de potencia ultrabrillante


fabricado por SILED R© de 5W con disipadoren estrella, tiempo de vida de 50,000 horas,rendimiento de 16 Lumen/W y un costoaproximado de 7 USD[20], el cual adaptamos alsistema mediante un controlador de 100 USD.

Complementariamente, se pueden adquirirvarios LEDs de diferentes bandas de longitudde onda para estimular la fluorescencia en lamuestra, lo cual permite el ahorro del filtrode excitación que normalmente se utiliza en lamayoría de los microscopios con epifluorescencia.En el presente caso, se utilizó un LED azul con unespectro de ancho de banda entre 460 y 490 nm,con suficiente intensidad para la excitación de laproteína verde fluorescente (GFP) que emite enla longitud de onda de 510 nm (verde, Fig. 3.C).

Para asegurar la calidad de la iluminación, seobtuvo el espectro de la luz emitida por el LEDpara verificar su longitud de onda emitida y elancho de banda. El espectro obtenido (datos nomostrados) coincide con las especificaciones delfabricante[20].

El diseño versátil permite intercambiar elLED para tener diferentes longitudes de ondade excitación, así como el intercambio del espejodicroico y el filtro de emisión para diversaslongitudes de onda de emisión.

Sistema de adquisición digital (CámaraCCD)

Muchos microscopios se han “digitalizado”conectando una cámara al sistema óptico, ya seacon sensores de dispositivos de carga acopladao semiconductores complementarios de óxidometálico (CCD y CMOS, por sus siglas en inglés,respectivamente). Las cámaras con sensoresCCD tienen amplia resolución digital, un rangoamplio de tonos (luces brillantes, tonos medios ysombras) y poco ruido digital, lo que proporcionamayor sensibilidad y, por lo tanto, imágenes dealta calidad[21].

Nuestro sistema cuenta con una cámaraCCD, seleccionada después de una investigaciónde mercado que cumple con la sensibilidad,resolución y compatibilidad para ser controladajunto con el microscopio y su iluminación,de forma que los datos obtenidos pudieranser suficientes para bioensayos funcionales, sin

incrementar demasiado el costo del sistema.Utilizamos la cámara Grasshopper[22-23] de

Point Grey Research R© con un costo aproximadode 3,000 USD. Cuenta con un sensor CCDSONY ICX625AL[24], que tiene una sensibilidadmedida de acuerdo a su respuesta relativa(señal/potencia) de 98.5% en la longitud deonda de emisión requerida en el presentetrabajo (510nm), mantiene una sensibilidadmayor al 80% dentro del rango de 444 a 642nm. Tiene resolución de 2448 x 2048 −paratarjetas FireWire de 800Mb/s−, tiene capacidadpara adquirir hasta 15 cuadros (frames) porsegundo, suficiente para este tipo de bioensayos-normalmente se configura a 4 cuadros porsegundo- y un puerto de salida que permitesincronizar la adquisición de la cámara con lailuminación. Esta cámara aún con una tarjetaFireWire de 100 Mb/s puede arrojar una imagende 1048 x 768, que sigue siendo suficiente paraun bioensayo funcional que capture la actividadde decenas de neuronas simultáneamente.

Incluimos el procesamiento inicial, en línea,para el análisis necesario en estos bioensayosfuncionales. Agregamos software, con derechosregistrados, que lo convierte en un instrumentovirtual -manejado desde la computadora- y quecontempla la digitalización de las imágenes, laadquisición de las mismas en tiempo real, sumanipulación, la iluminación de la preparacióny del microscopio. Adicionalmente, se haprogramado en el software un binning digital−promedio de pixeles para crear un solo pixel−que permite eliminar el ruido y aumentar lanitidez de grupos de pixeles, llamada tambiénacutancia, para poder detectar contornos en laimagen, que en nuestro caso son los contornos delas células del tejido.

SISTEMA MECÁNICO DEMOVIMIENTO EN TRES

DIMENSIONES

El microscopio se desplaza en las tresdimensiones con dos manipuladores mecánicos:1) uno macrométrico adquirido de EdmundOpticsMR con un rango de recorrido X-Yde 30 mm más 40 mm en Z con resoluciónde 20 mm por vuelta y 2) un micrométrico


adquirido de ThorlabsMR MAX343 R© con unrecorrido en cada eje de 4 mm y un pasode 60 nm. Es importante hacer notar queeste último manipulador tiene la posibilidadde cambiar los tornillos de avance mecánicospor tornillos acoplados a motores eléctricos,lo cual permitiría la automatización deldesplazamiento micrométrico sin pérdida deresolución (microscopía mecatrónica virtual).

Nótese que en este sistema de movimiento lamuestra biológica de tejido nervioso permanecefija mientras que el que se desplaza es elmicroscopio.

SOFTWARE O INSTRUMENTACIÓNVIRTUAL

Con el objetivo de controlar el sistema completo,así como de poder analizar los bioensayosen línea, creamos el instrumento virtualprogramado en el ambiente LabVIEW R© cuyaversión ejecutable se puede instalar en cualquiercomputadora con mínimas característicasenlistadas a continuación [25-26]:• Procesador mayor a 1.6 GHz de velocidad.

• 1 GB de memoria RAM.

• Preferentemente un monitor HD 1024x720.

• Windows XP o superior.

• Espacio en disco duro de 1 GB.

• Tarjeta Firewire con un mínimo de100Mb/s.

El software cuenta con 4 módulos. Paraevaluar el primer módulo de la interfaz,Figura 2A, se muestran los parámetros quese pueden configurar para las cámaras PointGrey Research R©, de forma que el usuariopuede definir el tiempo de exposición de lamuestra, la ganancia y los cuadros por segundode acuerdo al experimento a realizar. Además,cuenta con indicadores de estado para el correctofuncionamiento del sistema, botones para laadquisición de video e imágenes fijas en rutasdefinibles por el usuario. También permiterealizar un binning digital, para reducir el ruido yobtener una mejora en la nitidez de los contornosde las células en la imagen.

La Figura 2B muestra una imagen defluorescencia obtenida con nuestro sistema entejido cerebral obtenido de ratones transgénicosBAC-GFP-D2, en una rebanada cerebral quecontiene al núcleo cerebral “neoestriado”. Laspequeñas manchas brillantes son las neuronasque expresan al receptor dopaminérgico D2.

Figura 2. Interfaz para el control de la cámara y la adquisición de imágenes digitales. A. La

interfaz muestra los parámetros de adquisición a modificar: cuadros (frames) por segundo, tiempo

de exposición, ganancia y binning. Hay un botón de visualización y dos botones de adquisición:

video e imagen. Los indicadores: temperatura de la cámara, resolución de la imagen adquirida e

indicador de encendido/apagado del sistema de iluminación. B. Imagen de epifluorescencia de

neuronas BAC-GFP-D2 adquirida con el sistema de bioensayo presentado en este trabajo. C.

Imagen de epifluorescencia similar de neuronas BAC-GFP-D2 adquirida en un microscopio

comercial. Nótese la similitud en la calidad de las imágenes B y C.

Figura 3. Interfaz para el control de los sistemas de iluminación: principal y auxiliar. A.

Controles de iluminación: modo de incidencia (Continuos/Strobe), intensidad de iluminación y

activación de los sistemas principal o auxiliar. B. Imagen con poca intensidad de luz. C. Misma

área con aumento en la intensidad de luz. Nótese que la microscopía se maneja digitalmente.

Figura 2. Interfaz para el control de la cámara y la adquisición de imágenes digitales. A. Lainterfaz muestra los parámetros de adquisición a modificar: cuadros (frames) por segundo, tiempode exposición, ganancia y binning. Hay un botón de visualización y dos botones de adquisición: videoe imagen. Los indicadores: temperatura de la cámara, resolución de la imagen adquirida e indicador deencendido/apagado del sistema de iluminación. B. Imagen de epifluorescencia de neuronas BAC-GFP-D2 adquirida con el sistema de bioensayo presentado en este trabajo. C. Imagen de epifluorescenciasimilar de neuronas BAC-GFP-D2 adquirida en un microscopio comercial. Nótese la similitud en lacalidad de las imágenes B y C.


Figura 2. Interfaz para el control de la cámara y la adquisición de imágenes digitales. A. La

interfaz muestra los parámetros de adquisición a modificar: cuadros (frames) por segundo, tiempo

de exposición, ganancia y binning. Hay un botón de visualización y dos botones de adquisición:

video e imagen. Los indicadores: temperatura de la cámara, resolución de la imagen adquirida e

indicador de encendido/apagado del sistema de iluminación. B. Imagen de epifluorescencia de

neuronas BAC-GFP-D2 adquirida con el sistema de bioensayo presentado en este trabajo. C.

Imagen de epifluorescencia similar de neuronas BAC-GFP-D2 adquirida en un microscopio

comercial. Nótese la similitud en la calidad de las imágenes B y C.

Figura 3. Interfaz para el control de los sistemas de iluminación: principal y auxiliar. A.

Controles de iluminación: modo de incidencia (Continuos/Strobe), intensidad de iluminación y

activación de los sistemas principal o auxiliar. B. Imagen con poca intensidad de luz. C. Misma

área con aumento en la intensidad de luz. Nótese que la microscopía se maneja digitalmente.

Figura 3. Interfaz para el control de los sistemas de iluminación: principal y auxiliar. A. Controlesde iluminación: modo de incidencia (Continuos/Strobe), intensidad de iluminación y activación de lossistemas principal o auxiliar. B. Imagen con poca intensidad de luz. C. Misma área con aumento en laintensidad de luz. Nótese que la microscopía se maneja digitalmente.

Figura 4. Iluminación auxiliar de campo claro. Imagen adquirida con el sistema de microscopia

virtual usando el sistema de iluminación auxiliar (Unidad C) con el cual se observa la muestra como

en cualquier microscopio de reflexión en campo claro. Las pequeñas protuberancias son neuronas.

Figura 5. Pre-procesamiento de las imágenes adquiridas. A. Imagen del tejido vivo. Abajo se

observa su histograma de intensidades en pixeles: la mayoría está del lado izquierdo, en los tonos

oscuros. B. Imagen pre-procesada con el rango dinámico del controlador, sin que se afecte la

adquisición de la serie de imágenes para el video. Abajo se observa su histograma de

intensidades, note la distribución a lo largo de diferentes tonos para obtener una imagen más clara.

Figura 4. Iluminación auxiliar de campo claro.Imagen adquirida con el sistema de microscopiavirtual usando el sistema de iluminación auxiliar(Unidad C) con el cual se observa la muestracomo en cualquier microscopio de reflexión encampo claro. Las pequeñas protuberancias sonneuronas.

A modo de comparación se muestra unaimagen del mismo tejido, utilizando la mismapreparación, obtenida con un microscopio deepifluorescencia, mucho más costoso, utilizado ennuestro laboratorio y en la investigación básica(Figura 2C).

El segundo módulo (Figura 3A) muestra lainterfaz para la manipulación del sistema deiluminación, existen 2 tipos de iluminación parael microscopio: principal y auxiliar.

El sistema principal se encarga de iluminar,por arriba, la muestra biológica a través del

objetivo con la longitud de onda necesaria paraexcitar al fluoróforo captado por las neuronasactivas en el tejido, en este caso azul (488nm). Una barra de control le permite al usuarioajustar la intensidad de luz. También cuenta conun botón para cambiar la iluminación entre elmodo estrobo y el continuo. El modo continuopermite encontrar el campo deseado mientrasque el modo estrobo permite capturar lasimágenes del bioensayo funcional y evita el efectode blanqueado del fluoróforo. Las Figuras 3B y3C muestran cómo el usuario puede intensificaro disminuir la iluminación principal, a voluntad.

Sin embargo, para poder observar laactividad neuronal en el tejido se debe ubicarla zona de visualización, recordando que si nohay actividad no hay fluorescencia. Por lo tanto,se utiliza la iluminación auxiliar, construidacon un LED de luz blanca. Esta iluminaciónpermite observar la muestra como en cualquiermicroscopio de reflexión de campo claro (Figura4), permitiendo visibilidad en toda la muestradesplazándola con los manipuladores macro ymicrométricos. La iluminación auxiliar, ademásde regular la intensidad, cuenta con regulacióndel ángulo de incidencia, pues en general, lasmuestras no son planas y se observarían cambiosde fase y otros artefactos ópticos no deseables.El software es capaz de permutar los sistemas deiluminación en tiempo real.

El tercer módulo (Figura 5) permite pre-procesar la imagen adquirida por la cámarade acuerdo a la distribución de grises (rangodinámico) para una mejor visualización y


Figura 4. Iluminación auxiliar de campo claro. Imagen adquirida con el sistema de microscopia

virtual usando el sistema de iluminación auxiliar (Unidad C) con el cual se observa la muestra como

en cualquier microscopio de reflexión en campo claro. Las pequeñas protuberancias son neuronas.

Figura 5. Pre-procesamiento de las imágenes adquiridas. A. Imagen del tejido vivo. Abajo se

observa su histograma de intensidades en pixeles: la mayoría está del lado izquierdo, en los tonos

oscuros. B. Imagen pre-procesada con el rango dinámico del controlador, sin que se afecte la

adquisición de la serie de imágenes para el video. Abajo se observa su histograma de

intensidades, note la distribución a lo largo de diferentes tonos para obtener una imagen más clara.

Figura 5. Pre-procesamiento de las imágenes adquiridas. A. Imagen del tejido vivo. Abajo se observasu histograma de intensidades en pixeles: la mayoría está del lado izquierdo, en los tonos oscuros. B.Imagen pre-procesada con el rango dinámico del controlador, sin que se afecte la adquisición de la seriede imágenes para el video. Abajo se observa su histograma de intensidades, note la distribución a lolargo de diferentes tonos para obtener una imagen más clara.

captura de videos y fotos27. Puede serautomático o manual, con distribucionespredeterminadas, diferentes operadores o algunamáscara de filtrado específica27.

La Figura 5A muestra una imagen muyoscura, el histograma de la intensidad de lospixeles se encuentra en las intensidades másoscuras, del lado izquierdo; se puede aumentarla intensidad de la iluminación del LED, peroafectaría negativamente el ensayo al blanquearel fluoróforo. Al ajustar con el rango dinámicose obtiene como resultado la imagen mostradaen la Figura 5B, la distribución de pixelesestá repartida en todo el histograma. De estamanera el usuario puede ajustar el rangodinámico con una serie de herramientas paratrabajar en tiempo real. Con los equipos actualesusualmente se adquiere el video y se utilizan

herramientas off-line. Nuestro sistema ahorratiempo al incorporar el pre-proceso durante laadquisición on-line.

Después del pre-procesamiento se captura unvideo. Nótese que el pre-procesamiento permitesaber, por ejemplo, si el bioensayo es funcionaldesde las condiciones del tejido control, yde no serlo se desecha, aumentando así lacantidad de experimentos realizables en el mismotiempo, lo que ayuda a convertir el sistemaaquí presentado en un instrumento virtual parabioensayos funcionales de alto rendimiento.

Análisis del video

El cuarto módulo (Figura 6 y 7) está orientadoal análisis en cambios en la fluorescencia(actividad) de las células en situaciones controly experimental, esto es, el bioensayo funcional.


Figura 6. Imagen resumen. Análisis de la actividad celular en situación control y

experimental. A. Imagen resumen obtenida a partir de un video con actividad en condiciones

control. B. Imagen resumen obtenida de un video con actividad posterior a la adición de KCl,

condición experimental.

Figura 7. Conteo automático de células activas en situación control y experimental.

Identificación de patrones y conteo automatizado de celulares activas (mostradas con cuadros

rojos) en condición control (A) y después de la adición de KCl (B).

Figura 6. Imagen resumen. Análisis de la actividad celular en situación control y experimental. A.Imagen resumen obtenida a partir de un video con actividad en condiciones control. B. Imagen resumenobtenida de un video con actividad posterior a la adición de KCl, condición experimental.

Figura 6. Imagen resumen. Análisis de la actividad celular en situación control y

experimental. A. Imagen resumen obtenida a partir de un video con actividad en condiciones

control. B. Imagen resumen obtenida de un video con actividad posterior a la adición de KCl,

condición experimental.

Figura 7. Conteo automático de células activas en situación control y experimental.

Identificación de patrones y conteo automatizado de celulares activas (mostradas con cuadros

rojos) en condición control (A) y después de la adición de KCl (B).

Figura 7. Conteo automático de células activas en situación control y experimental. Identificación depatrones y conteo automatizado de células activas (mostradas con cuadros rojos) en condición control(A) y después de la adición de KCl (B).

Para demostrar la funcionalidad del sistema,mostramos registros de video del núcleoneoestriado del cerebro de un ratón (BAC-GFP-D2 de 11 días) en una rebanada, en situacióncontrol y bajo una condición experimental (25mM de KCl). Con la herramienta “Filtro devideo” se limpia el fondo aumentando la relaciónseñal ruido y con la herramienta “ImagenResumen” se genera una imagen que resaltalas zonas del video en las cuales se presentaroncambios relevantes en la fluorescencia. Esteanálisis se realiza en ambas condiciones paraobservar las diferencias en la actividad neuronal:control (Figura 6A) y experimental (Figura 6B).Sin quitar la preparación, se facilita un análisisrápido y toma de decisiones en tiempo real, estoen caso de que la muestra necesite de una o variascondiciones experimentales extras.

Posteriormente, las imágenes resumen seanalizan con la herramienta “Identificaciónde células” y “Conteo” para encontrarautomáticamente el número de células quepresentaron actividad en ambas situaciones:control y experimental. En la Figura 7A semuestra la imagen resumen de la situacióncontrol con la cantidad de células detectadas(cuadros en rojo). La condición experimental(Figura 7B) muestra una mayor cantidad decélulas detectadas.

Gráficas y cuantificación

La función de conteo del instrumento virtual esuna herramienta de apoyo para el usuario, quepermite en tiempo real obtener resultados delexperimento y, de nuevo, el tomar decisionesoportunas durante el experimento.


Figura 8. Detección automática en comparación con la detección manual de expertos. El

sistema automático identifica el 73.3% que identifica el usuario (Verdaderos Positivos), el otro

26.7% no lo logra identificar (Falsos Negativos). Además, el sistema automático encuentra un

39.4% extra que el experto no identifica como células (Falsos Positivos).

Figura 9. Bioensayo funcional en tejido patológico (Parkinsoniano). A. Gráfica de tipo rastreo

(raster): cada fila representa la actividad de una neurona a lo largo del tiempo, las ordenadas nos

indican que se registró la actividad de 50 neuronas simultáneamente, las abscisas representan el

tiempo en minutos. La actividad se registró con una secuencia de imágenes (video) adquiriendo

una imagen cada 250 ms. Cada vez que una neurona brillaba (tenía un transitorio de calcio debido

al disparo de potenciales de acción), el programa ponía un punto en la fila correspondiente, de esta

manera podemos seguir la actividad de decenas de neuronas simultáneamente: actividad celular

en el tejido vivo mantenido in vitro. Nótese que al momento de administrar L-DOPA (1 M) al

líquido de perfusión (barra horizontal) la actividad patológica decae. B. Histograma que suma la

actividad, columna por columna (imagen por imagen), de todas las neuronas en A. Esto nos da una

idea de la actividad poblacional o multicelular. Nótese que hay momentos donde varias neuronas

Figura 8. Detección automática en comparacióncon la detección manual de expertos. El sistemaautomático identifica el 73.3% que identifica elusuario (Verdaderos Positivos), el otro 26.7% nolo logra identificar (Falsos Negativos). Además,el sistema automático encuentra un 39.4% extraque el experto no identifica como células (FalsosPositivos).

El algoritmo que se realiza para obtener laimagen “resumen” y detectar patrones decélulas reduce considerablemente el tiempode análisis al usuario, se tarda menos de1 minuto para un video de 700 cuadroscon resolución de 1048x768 pixeles −en unacomputadora con las características mínimasindicadas anteriormente−. Mientras que unapersona entrenada en el análisis de estos videoscon métodos manuales se tarda alrededor de 3a 6 horas dedicadas −dependiendo el número decélulas activas−, para seleccionar las células queal final toma en cuenta para el estudio. Paramedir la efectividad de la detección de célulasautomática, se hizo una prueba de comparaciónde la detección automática frente a 3 expertosen el análisis manual de este tipo de videos con 6experimentos. La Figura 8 muestra los siguientesresultados:

1. la detección automática identificó enpromedio el 73.3% de las detectadas porlos expertos, con 26.7% de células noidentificadas;

2. el 35% de células que el sistema automáticodetectó no fueron identificadas por los

expertos, lo que se denomina falsospositivos.

Una vez realizada la identificación y el conteode neuronas que están activas, la dinámica desu actividad puede graficarse a lo largo deltiempo en una matriz de actividad (ordenadas)en función del tiempo (abscisas): A(t), donde lospuntos de cada renglón de la matriz muestranla actividad de una neurona a lo largo deltiempo en minutos (Figura 9). Un video puedeconstar de simplemente 6 minutos de registro,suficiente para observar los efectos de la drogay cuantificar cambios en la actividad neuronal.Sabemos que al privar al tejido nervioso dedopamina (modelo animal de la enfermedadusando la toxina 6-OHDA) el animal adquiere lossignos del Parkinsonismo y que el tejido privadode este transmisor exhibe una actividad neuronalaumentada y patológica [17]. Se trata de observarsi al agregar uno de los fármacos más usados paraaliviar los signos de la enfermedad (L-DOPA, losalivia también en el modelo animal), la actividadneuronal disminuye a condiciones control. Deesta manera, obtendríamos un correlato delmicrocircuito neuronal: la actividad del tejidocon el estado de la enfermedad y la acción delfármaco (Figura 9).

DISCUSIÓN

El sistema de bioensayo de alto rendimientoaquí presentado está constituido por un mínimode hardware (las partes del microscopio yuna tarjeta cuyo circuito es de diseño propio,Figura 1) y un programa, software, quemanipula las características de la imagen,microscopía mediante instrumentación virtual,y realiza cierto procesamiento en línea: conteode neuronas activas antes y después de laprueba experimental (Figuras 2, 3, 5, 6). Seemplean microscopías de epifluorescencia o decampo claro. Cuenta con los elementes mínimospresentes en cualquier microscopio para observarfluorescencia, en particular de tejido vivo (Figura2B). Las imágenes obtenidas son suficientes paraanalizar bioensayos funcionales.


Figura 9. Bioensayo funcional en tejido patológico (Parkinsoniano). A. Gráfica de tipo rastreo (raster):cada fila representa la actividad de una neurona a lo largo del tiempo, las ordenadas nos indican que seregistró la actividad de 50 neuronas simultáneamente, las abscisas representan el tiempo en minutos. Laactividad se registró con una secuencia de imágenes (video) adquiriendo una imagen cada 250 ms. Cadavez que una neurona brillaba (tenía un transitorio de calcio debido al disparo de potenciales de acción),el programa ponía un punto en la fila correspondiente, de esta manera podemos seguir la actividad dedecenas de neuronas simultáneamente: actividad celular en el tejido vivo mantenido in vitro. Nóteseque al momento de administrar L-DOPA (1 µM) al líquido de perfusión (barra horizontal) la actividadpatológica decae. B. Histograma que suma la actividad, columna por columna (imagen por imagen), detodas las neuronas en A. Esto nos da una idea de la actividad poblacional o multicelular. Nótese que haymomentos donde varias neuronas se sincronizan espontáneamente para producir un pico de neuronasco-activas. En este caso se trataría de las oscilaciones Parkinsonianas patológicas. La significanciaestadística de estos pìcos de co-actividad (5% o menos) se obtiene con simulaciones de Montecarlo(revolviendo los mismos puntos de 1000 a 10000 veces). Nótese que después de la administración deL-DOPA ya no hay picos de sincronía que traspasen la línea de significancia, pues la droga reducela actividad patológica. C. Para cuantificar mejor las diferencias entre el tejido Parkinsoniano y elmismo tejido después de la administración de L-DOPA, se grafica la actividad acumulada, esto es, lasumatoria, a lo largo de todo el video, de la actividad graficada en el histograma (B). Se compara laactividad Parkinsoniana contra la actividad después del fármaco (P < 0.0001).

Se disminuyen los costos y se aumentael control en la iluminación, al cambiar lossistemas costosos de iluminación por solucioneseconómicas e igualmente efectivas, como lailuminación con LEDs SiledMR. Como se puedeobservar en la figura 2, el uso de un LEDde potencia permite cumplir satisfactoriamentecon la función de iluminación y excitación deuna muestra de tejido vivo fluorescente. Lafuente de alimentación del LED es sencilla yse controla con instrumentación virtual desde lamisma computadora, lo que agrega un elementoadicional en la digitalización e integración

del microscopio que no se observa en lasadaptaciones a los microscopios y fuentes deiluminación comerciales. En el presente estadodel prototipo, una desventaja es que el cambio deLED, en caso de querer usar diferentes longitudesde onda, no es automático. Pero se asienta aquíque podría llegar a serlo.

La instrumentación virtual que se realizópara adaptar la cámara Grasshopper R©permitió configurar los parámetros necesariospara visualizar con éxito tanto imágenesde epifluorescencia como la funcionalidad dediversos bioensayos.


El instrumento, controlado virtualmente,cuenta con dos posibilidades de ajuste en tiemporeal de la intensidad luminosa (Figura 3) y delcontrol del ángulo e intensidad del sistema deiluminación auxiliar (Figura 4). Al ser estosdos sistemas independientes y controlados por elmismo módulo con una simple permutación, esposible pasar de campo claro a epifluorescenciay viceversa.

Se diseñaron herramientas para elprocesamiento de imágenes que no consumenmuchos recursos y que pueden ser ejecutadasen tiempo real. En los sistemas actuales, esteprocesamiento es off-line. Desafortunadamente,esto hace que se desaprovechen ensayos, pues nose tiene manera de saber cuando el tejido control(incluyendo el patológico) está en condiciones desoportar las pruebas experimentales. Adicionarel procesamiento temprano permite al usuariotomar decisiones sobre la marcha, tales como:el cambio de la muestra; la concentración de losfármacos; experimentar con diversos fármacos;entre otras. Esto hace que el sistema puedaser calificado de alto rendimiento. La actividadde decenas de neuronas (50 a 300) puede seranalizada simultáneamente. Dado el bajo costorelativo, la implementación de sistemas paralelospermitiría evaluar y comparar los efectos devarios fármacos al mismo tiempo.

Algunas desventajas del estado de desarrolloen el cual se encuentra el sistema de bioensayoson las siguientes: el procesamiento on-linetodavía es limitado. Cuenta las células, perose podría graficar el registro en tiempo real(Figura 9) y hacer cuantificaciones que llevena realizar curvas dosis-respuesta en línea.Incluso, a hacer el análisis de los microcircuitosneuronales, ya que en el laboratorio contamoscon estos programas, pero no han sido acopladoscompletamente a este sistema [14]. Otradesventaja tiene que ver con los manipuladores,actualmente se controlan de forma manual.Es fácil ver que pueden automatizarse y asícontrolarse desde la computadora de maneratotal (mecatrónica y virtual). Por estas razonesconsideramos este prototipo como la primeraversión de una serie.

Otra desventaja, digna de considerar, es quepara construir el prototipo en su estado actual,

se eligió una cámara que se acopla al sistemade cómputo mediante el sistema Fire-wire. Elprograma, si se desea su desarrollo comercial,deberá poder controlar muchos tipos de cámaradigital, sobre todo aquellas que se acoplan alsistema de cómputo con el uso de puertosUSB. Se deberá tener un menú de controladores(drivers) para controlar la cámara que se desee.

Este sistema integral, tal y como se presenta,también es útil y asequible −por su costo−para la docencia y capacitación de futurosquímicos farmacéuticos o fármaco-biólogos, loque cerraría el ciclo: se crean herramientaspara la industria con alto valor agregado yse capacita al personal para manejarlas. Losresultados mostrados cuentan con la calidadsimilar a la de los sistemas 10 veces más costosos,cuando menos.

La ventaja de este prototipo es el comienzode sistemas integrales dirigidos específicamenteal bioensayo farmacológico en tejido vivomantenido in vitro, ya que es una tendenciapara las nuevas formas de bioensayos, tanto enla industria para el descubrimiento de nuevosfármacos como en la investigación básica parala descripción de mecanismos de acción. Sise requiere comercializar e iniciar una líneade producción de este sistema integral, seincluiría mucho más software especializado,mayor automatización, mayor compatibilidad ysoporte, y seguramente costará incluso más de100,000 USD. Pero lo más importante es laidea de especializar el producto y orientarloespecíficamente a los bioensayos.

CONCLUSIONES

El mercado internacional cuenta con el mercadode partes y componentes suficientes para diseñarun sistema de microscopía virtual (e inclusomecatrónico) que sea especializado para realizarbioensayos y que complemente a la utilizaciónde equipos comerciales independientes que tienenfunciones generales, que al ser integrados son10 veces más costosos. Los requerimientos dehardware son mínimos. Se acopla a un sistemade cómputo, es de alta portabilidad, de altorendimiento y de bajo costo, lo que hace aeste instrumento idóneo para investigadores,


departamentos de control de calidad, la industriafarmacéutica y la docencia en la educaciónsuperior.

El sistema ha demostrado cumplir conlos requisitos y exigencias para llevar acabo un bioensayo funcional con elementoscomerciales, accesibles y que pueden serfácilmente sustituibles por elementos similares.Por su precio puede ser adquirido en cantidadessuficientes para realizar pruebas en paralelo,y por sus dimensiones no requiere de muchoespacio para su ubicación.

La instrumentación virtual de periféricos,por ejemplo la sustitución del LED por laslámparas de gases, permite un ahorro sustancialen el equipamiento de laboratorios, además de lacapacidad de control y automatización.

El procesamiento de las imágenes es unaparte crucial del sistema integrado, ya queademás de su eficiencia en detectar célulascon actividad, reduce los tiempos de análisisconsiderablemente.

La importancia del desarrollo de este tipode prototipos es mostrar una vía posible dedesarrollo para futuros proyectos de ingenieríabiomédica y biotecnología: el diseño de sistemas(hardware y software) para bioensayos de altorendimiento y bajo costo relativo para laevaluación de fármacos de potencial utilidadterapéutica. Hay tres razones importantes quemotivaron el desarrollo de este prototipo:

1. el apoyo a la industria farmacéuticanacional en su búsqueda de fármacosoriginales;

2. el apoyo a laboratorios de bioequivalenciay control de calidad para el desarrollo defármacos genéricos que cumplan con lasespecificaciones de rigor;

3. el apoyo a las instituciones de enseñanzay capacitación en farmacia, farmacología,química farmacéutica y fármaco-biología.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece a la Dra. E. Galarraga surevisión crítica. El financiamiento de este trabajo

proviene de los subsidios dados por: PICSA 110-16 ICYT DF a A H-C y CONACYT 154131 aJB.

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