1

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1. Lý do chọn đề tài:

Theo WHO ước tính, mỗi năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu

đơn vị máu phục vụ cấp cứu điều trị (≈ 2% dân số) [40]; ngoài máu

và các chế phẩm máu, chế phẩm huyết tương, còn phải kể đến các

chế phẩm huyết thanh như: gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-

T lymphocyte globulin, antivenom [141],[147],[152]... trong đó,

huyết thanh kháng nọc rắn (antivenom) là loại chế phẩm rất quan

trọng, đặc biệt trong điều trị rối loạn đông cầm máu do nhiễm độc

nọc rắn (họ Vipridae).

Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi và đất nông nghiệp,

bờ biển dài hơn 3000 km, Việt Nam có môi trường rất thuận lợi cho

rắn độc phát triển. Phần lớn cư dân sinh sống, làm việc trong môi

trường nông nghiệp, rừng núi, hải đảo...nguy cơ bị rắn độc cắn rất

cao (> 30.000 người /năm [21]); ngoài tổn thất nhân mạng, chi phí

điều trị rất tốn kém: nhiều nạn nhân phải thở máy hàng tháng hoặc

phải truyền hàng chục lít máu và huyết tương để cứu tính mạng; kỷ

lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai đã phải truyền ≈ 46 lít

máu và chế phẩm để cứu một người bệnh [174].

Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu và huyết

tương phải sử dụng trong điều trị rắn độc cắn, Bộ y tế đã quan tâm

chỉ đạo việc nghiên cứu, ứng dụng sản xuất huyết thanh kháng nọc

rắn (HTKNR) [6],[8]. Đến nay, đã có một số nghiên cứu rất thành

công, góp phần cứu sống hàng ngàn bệnh nhân, giảm mạnh lượng

máu và chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23]...

2

Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến nay chúng ta vẫn đang thiếu

trầm trọng nhiều loại HTKNR; hầu như ta chỉ có duy nhất hai loại

HTKNR cho rắn hổ đất và rắn lục tre [8],[165],[166],[171]. Do tính

đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý, mỗi quốc gia phải

tự chế tạo HTKNR cho chính quốc gia mình (khuyến cáo của WHO)

[141],[20],[6]. Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu, điều trị rắn độc cắn,

chúng ta rất cần đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR; đặc biệt là

các HTKNR cho các loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; trong các

loài đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% các loài rắn

độc họ rắn hổ (Elapidae) tại Việt Nam, là loài rắn độc có độc tính

cực mạnh, gây tử vong rất cao (> 80% nếu không được cấp cứu điều

trị kịp thời) [14].

Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn ở Việt Nam từ trước đến nay

cho thấy: nước ta có hai loài rắn cạp nia thường gặp, chủ yếu là rắn

cạp nia nam (Bungrarus candidus) và rắn cạp nia bắc (Bungarus

multicinctus). Đây là hai loài rắn có hình dạng “khúc đen, khúc

trắng” rất giống nhau, thoáng nhìn rất khó phân biệt. Hai loài rắn này

khác nhau cả về độc tính nọc và biểu hiện lâm sàng, chẩn đoán rất dễ

nhầm lẫn, HTKNR đơn đặc hiệu không có tác dụng chéo và cũng

chưa có VDK để chẩn đoán xác định [15]. Nghiên cứu sản xuất

HTKNR đa giá cho cả hai loài rắn độc nguy hiểm này là giải pháp

đem lại thuận lợi cho cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cạp nia cắn

trong cả nước. Để tăng tính an toàn của HTKNR, dạng F(ab’)2 là tối

ưu. Đồng thời, việc hoàn thiện quy trình sản xuất, tiêu chuẩn hóa sản

phẩm là hết sức cần thiết.

3

2. Mục tiêu đề tài:

(1) Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương

ngựa đáp ứng Tiêu chuẩn Việt Nam (Dược điển Việt Nam).

(2) Đánh giá chất lượng của chế phẩm trong phòng thí nghiệm.

3. Ý nghĩa của đề tài và những đóng góp mới:

3.1. Lần đầu tiên tại Việt Nam và trên thế giới đã sản xuất được chế

phẩm HTKN-RCN đa giá chống lại nọc độc hai loài RCN thường

gặp, nguy hiểm nhất Việt Nam, cũng là những loài rắn độc vào hàng

bậc nhất trên thế giới.

3.2. Lần đầu tiên hoàn thiện và chuẩn hóa được toàn bộ các công

đoạn của quy trình sản xuất, cho ra sản phẩm HTKNR đạt 8/8 Tiêu

chuẩn Quốc gia về huyết thanh kháng nọc rắn điều trị cho người. Sản

phẩm đạt 9/10 chỉ tiêu cơ bản của WHO về chất lượng.

3.3. Đã sản xuất và tinh sạch thành công HTKN-RCN đa giá dạng

F(ab’)2 là dạng chế phẩm tiên tiến, hiệu quả nhất hiện nay, loại bỏ

được Fc của phân tử IgG, giải quyết tận gốc vấn đề an toàn miễn

dịch khi điều trị.

3.4. Vấn đề hiệu lực kháng nọc rắn của chế phẩm: đã được giải quyết

thành công với các giải pháp đồng bộ: chọn lựa đúng chủng loại rắn,

lấy nọc có chất lượng, làm mất độc lực nọc nhưng vẫn giữ được tính

KN; đảm bảo lịch trình miễn dịch, liều lượng KN + tá dược; theo dõi

chăm sóc để ngựa sinh KT tốt nhất, huyết tương có hiệu giá KT cao;

theo dõi hình thành KT đặc hiệu; đảm bảo lấy máu vô trùng; tinh chế

mảnh F(ab’)2 vẫn giữ được tính hoạt động sinh học; tinh sạch các

F(ab’)2 có nồng độ cao nhất...

4

4. Bố cục của luận án:

Luận án gồm 128 trang, ngoài phần đặt vấn đề và kết luận, luận án

có 4 chương chính:

- Đặt vấn đề: 2 trang

- Chương 1: Tổng quan (38 trang).

- Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (18 trang).

- Chương 3: Kết quả nghiên cứu (31 trang).

- Chương 4: Bàn luận (37 trang).

- Kết luận & Kiến nghị: 2 trang

Luận án có: 29 bảng, 4 biểu đồ và sơ đồ, 63 ảnh và hình vẽ (48 ảnh

phụ lục), 176 tài liệu tham khảo (40 Tiếng Việt, 114 Tiếng Anh, 22

website), 4 phụ lục.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Một số điểm cần lưu ý về Máu và Huyết tương

1.2. Các loại chế phẩm máu và chế phẩm huyết tương

1.3. Phương pháp tách chiết các thành phần huyết tương

1.3.1. Phương pháp tủa lạnh bằng ethanol.

1.3.2. Phương pháp tủa bằng muối

1.3.3. Phương pháp sắc ký

1.3.4. Phương pháp miễn dịch hấp thụ.

1.3.5. Phương pháp lọc qua màng ma trận với các chất rắn.

1.4. Huyết thanh kháng nọc rắn:

1.4.1. Khái niệm

1.4.2. Lịch sử phát minh

1.4.3. Cơ sở miễn dịch học

5

- Kháng nguyên nọc rắn.

- Kháng thể chống nọc rắn

1.4.4. Các giai đoạn của quy trình sản xuất HTKNR

1.5. Tai nạn do RCN và tình hình NC sản xuất HTKN-RCN

1.5.1. Tình hình tai nạn do RCN tại Việt Nam

1.5.2. Chi rắn cạp nia (Bungarus) tại Việt Nam

1.5.3. Đặc điểm nọc rắn cạp nia và cơ chế bệnh sinh

1.5.4. Tình hình NC, sản xuất HTKN-RCN ở Việt Nam & Thế giới.

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP

2.1. Đối tượng & vật liệu nghiên cứu:

- Đối tượng NC: Nghiên cứu trên các động vật thí nghiệm: rắn cạp

nia bắc và rắn cạp nia nam, ngựa, thỏ, chuột lang, chuột nhắt trắng.

- Vật liệu NC: nọc RCN bắc và nọc RCN nam đông khô: 3,1 gam.

2.2. Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: NC labo + thực nghiệm trên động vật

2.2.2. Tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm cần đạt:

Bảng 2.1: Tiêu chuẩn Quốc gia (Dược điển Việt Nam IV, 2009)

TT Tên các chỉ tiêu Tiêu chuẩn cần đạt

1 An toàn chung Đạt an toàn chung2 Vô khuẩn Không có vi khuẩn, vi nấm3 Chí nhiệt tố Không có chất gây sốt4 Hiệu giá KT/lọ Đạt > 100 LD50/lọ (5ml)5 pH 6 - 76 Merthiolat ≤ 0,01%7 Sodium chlorid 0,85 % - 0,9%8 Nitơ toàn phần ≤ 15 %

6

Bảng 2.2: Tiêu chuẩn cần đạt theo WHO guidelines, 2008.

TT Tên các chỉ tiêu Tiêu chuẩn cần đạt

1 An toàn chung Đạt an toàn chung

2 Vô khuẩn Không có vi khuẩn, vi nấm

3 Chí nhiệt tố Không có chất gây sốt

4 Hiệu giá KT/lọ Đạt tiêu chuẩn đăng ký

5 pH 6 – 7

6 Hàm lượng chấtbảo quản

Phenol < 2,5 g/lCresols < 3,5 g/l

7 Sodium chlorid 0,85 % - 0,9%

8 Nitơ toàn phần ≤ 100 g/l

9 Albumin ≤ 1 %

10 Globulin > 90%

2.2.3. Nội dung nghiên cứu:

2.2.3.1. Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2

- Chế tạo KN nọc rắn cạp nia đa giá giảm độc lực.

- Gây mẫn cảm ngựa, theo dõi hình thành KT đặc hiệu.

- Lấy máu, thu huyết tương, truyền trả khối hồng cầu.

- Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2, xác định mức độ tinh sạch

của sản phẩm.

2.2.3.2. Đánh giá chất lượng HTKN-RCN trong phòng thí nghiệm:

- Kiểm định cơ sở, đánh giá tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm.

- Kiểm định quốc gia, đánh giá an toàn, hiệu lực, đặc điểm lý hóa.

- Sơ bộ tính giá thành sản xuất, đánh giá hiệu quả kinh tế, xã hội.

7

2.2.4. Các phương pháp kỹ thuật nghiên cứu:

- Tuyển chọn RCN, lấy nọc, bảo quản nọc theo phương pháp của

Trần Kiên, David Warell [21],[23],[24].

- Chế tạo KN và đánh giá chất lượng theo phương pháp của Trịnh

Xuân Kiếm, khuyến cáo của WHO, 2008 [151] & Dược điển VN.

- Gây mẫn cảm ngựa, theo dõi hình thành KT đặc hiệu bằng thử

nghiệm Ouchterlony và điện di miễn dịch huyết thanh với nọc RCN.

- Lấy huyết tương theo phương pháp plasmaferesis.

- Tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab')2 theo phương pháp cắt Fc của

- globulin bằng pepsin, tủa phân đoạn với ammonium sulphate,

thẩm tích với nước cất, lọc Seize (WHO, 2008 [151]).

- Kiểm định cơ sở: đánh giá bằng thử nghiệm an toàn chung, chí

nhiệt tố, cấy khuẩn, cấy nấm, xác định LD50 và hiệu giá (ED50).

- Sau khi đạt chất lượng ở kiểm định cơ sở, đóng lọ vô khuẩn 5ml/lọ

và yêu cầu Kiểm định Quốc gia.

- Kiểm định cơ sở gồm: thử nghiệm an toàn chung (Safety test), thử

nghiệm chất gây sốt (Pyrogens test), thử nghiệm vô khuẩn (Sterility

test), thử nghiệm công hiệu (Potency test). Thử công hiệu gồm 2

bước: xác định LD50 của nọc RCN theo công thức Karber, sau đó xác

định ED50 của HTKN-RCN đã sản xuất.

- Kiểm định Quốc gia: theo quy trình của Viện KĐQGVX&SPYT,

gồm: 1. Thử nghiệm an toàn chung. 2. Thử nghiệm vô khuẩn. 3. Thử

nghiệm chí nhiệt tố. 4. Thử nghiệm công hiệu (hiệu giá). 5. Nồng độ

Protein toàn phần. 6. pH. 7. Nồng độ NaCl. 8. Nồng độ chất bảo

quản (Merthiolat).

8

2.3.5. Thời gian, địa điểm nghiên cứu:

- Thời gian nghiên cứu: 6/2008 – 11/2011.

- Địa điểm tiến hành: tại Đơn vị nghiên cứu HTKN, Trung tâm

chống độc Bệnh viện Bạch Mai, Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và

Sinh phẩm y tế, Trung tâm nghiên cứu dã ngoại thực nghiệm HVQY,

Viện HH-TMTW, Bệnh viện 103, Bệnh viện Bạch Mai và một số địa

điểm nghiên cứu tại Thư Phú, Lệ Mật (Hà Nội), Vũng Tàu...

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HTKN - RCN ĐA GIÁ F(ab’)2:

3.1.1. Chế tạo KN, đánh giá chất lượngKN

Bảng 3.1: Kết quả tuyển chọn và lấy nọc RCN

Số rắn lấy nọc (con)

Cạp nia bắc Cạp nia namSL rắn (con)

SL nọc(gam) SLNTB SL rắn

(con)SL nọc(gam) SLNTB

Lần 1(114) 84 0,5 5,9 30 0,3 10Lần 2 (185) 130 0,6 4,6 55 0,5 9,0Lần 3 (122) 62 0,5 8,0 60 0,7 11,6Cộng (421) 276 1,6 5,79 145 1,5 10,3

* Chú thích: SLNTB:số lượng nọc trung bình của một con rắn/lần lấy nọc

Bảng 3.2: Đánh giá sơ bộ về mức độ thường gặp của chi RCN ở VN

Loài rắn

Vùng

Bungarusfasciatus

Bungaruscandidus

Bungarusmulticinctus

Bungarusslowinskii

Bungarus flaviceps

Miền Bắc (++) (-) (+++) (+) (-)Miền Nam (+) (+++) (-) (-) (-)

* Chú thích: Không gặp: (-); Gặp nhưng số lượng rất ít: (+)

Thường gặp, số lượng ít: (++); thường gặp, số lượng nhiều: (+++)

9

Bảng 3.3: Thể tích KN và lượng nọc được khử độc.

Loại lọ

KN

Thể tích KN / lọ (ml)

0,1 0,3 0,5 1 2 3 4 5 6Số lượng lọ KN 12 12 12 22 12 12 12 12 12Số mg nọc/lọ ≈ 1,1 3,3 5,5 11 22 33 44 55 66Thể tích (ml)

(tổng: 272,8 ml) 1,2 3,6 6 22 24 36 48 60 72

Bảng 3.4: Thử nghiệm an toàn với KN.

ChuộtlangTN

Trọnglượng

(g)

KN(ml)

SL nọc (mg)

Thay đổi bất thường Tăng TL(g)Sốt Rụng

lôngTL (g)

1 230 2,30 25,3 0 0 240 102 235 2,35 25,8 0 0 250 153 250 2,50 27.5 0 0 260 10

4 (chứng) 245 0,0 0 0 0 255 10

Bảng 3.5: Thử nghiệm chí nhiệt tố với KN.

ThỏTN

TLthỏ (kg)

KN(ml)

SL nọc(mg)

Nhiệt độ trước/sau tiêm KN(oC) Thay đổi

nhiệt độcao nhấtKhởi

đầuSau

1 giờSau

2 giờSau

3 giờ

1 2,1 2,1 23,1 38,5 38,9 39,0 38,5 0,5oC

2 2, 3 2,3 25,3 39,1 39,8 39,2 39,1 0,7 oC

3 2,2 2,2 24,2 39,3 39,5 39,8 39,3 0,5 oC

Bảng 3.6. Kết quả cấy khuẩn, cấy nấm KN.

Môi trường Sabouraud (37oC) Môi trường Thioglycolate (20-25oC)

Ngày thứ 3

Ngày thứ 7

Ngày thứ 14

Ngày thứ 1

Ngày thứ 2

Ngày thứ 3

Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính

10

3.1.2.Kết quả gây mẫn cảm ngựa & theo dõi đáp ứng miễn dịch:

Bảng 3.7: Liều lượng KN và tá dược gây mẫn cảm ngựa. Lần miễn dịch

Liều lượng1 2 3 4 5 6 7 8 9

KN (ml) 0,1 0,3 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0Tá dược CFA (ml) 0,1 0,3 0,5 0 0 0 0 0 0Tá dược IFA (ml) 0 0 0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0KN + tá dược (ml) 0,2 0,6 1 2 4 6 8 10 12

Số vị trí tiêm 1 3 5 2 4 6 8 10 12Bảng 3.8: Thay đổi sức khỏe ngựa sau gây mẫn cảm.

Lần miễn dịch

Ngựa 1 Ngựa 2Toàn thân

Tại chỗToàn thân Tại

chỗVận động

Hô hấp Tiêu hóa Vận

động Hô hấp Tiêu hóa

1 Yếu BT Bỏ ăn BT Yếu BT Bỏ ăn BT

2 Yếu BT Bỏ ăn Loét Yếu BT Bỏ ăn Loét3 Yếu BT Ăn kém Loét Yếu BT Ăn kém Loét4 BT BT BT BT BT BT BT BT

5 BT BT BT BT BT BT BT BT

6 BT BT BT BT BT BT BT BT

7 BT BT BT BT BT BT BT BT

8 BT BT BT BT BT BT BT BT

9 BT BT BT BT BT BT BT BT

* Chú thích: BT: bình thườngBảng 3.9: Hiệu giá KT kháng nọc RCN sau miễn dịch ngựa.

Ngựa miễn dịch

Hiệu giá KT sau mỗi lần miễn dịch

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Lần 5

Lần 6

Lần 7

Lần8

Lần 9

No 1 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/2048 1/2048

No 2 1/8 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/2048

11

Ảnh 3.4. Vết tủa KN-KT trên thạch agarose 1,5% (ảnh trái)Ảnh 3.5. Xác định KT đặc hiệu bằng điện di miễn dịch.

3.1.3. Lấy máu, tách huyết tương giàu KT, truyền trả khối HC:

Bảng 3.10: Khối lượng máu, huyết tương, khối hồng cầu thu

được.

Số lượng

Ngựa NC

Máu ngựa

(lit)Huyết

tương (lit)Khối hồng

cầu (lit)

Ngựa 1 Lần 1 3,6 2,2 1,4Lần 2 5,1 3,1 2,0

Ngựa 2 Lần 1 2,3 1,4 0,9Lần 2 5,5 3,3 2,2

Cộng cả 2 lần 16,5 10,0 6,5

Bảng 3.11: Lượng máu lấy và phản ứng của ngựa trong khi lấy

máu.

Số lượng máu lấy

(lit)

Biểu hiện của ngựa

Bình thường Choáng nhẹ Shock

Ngựa 1

Lần 1 3,6 X X

Lần 2 5,1 X X

Ngựa Lần 1 2,3 X

12

2 Lần 2 5,5 X X X

3.1.4. Kết quả tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2:

3.1.4.1. Cắt Fc, tủa phần protein không có KT với ammonium sulphate 14%, lọc bỏ tủa, thu dịch lọc chứa nhiều mảnh F(ab’)2:

Bảng 3.12: Thể tích dịch lọc có F(ab’)2 thu được.Chỉ số NC

Lô NCHuyết tươngSản xuất (ml)

Dịch lọc có KT (ml)

Tỷ lệ dịch lọc/huyết tương sx (%)

Lô 1 3600 2900 80,6%Lô 2 6400 5140 80,3%

Cộng : 10.000 8040 80,4%

3.1.4.2. Tủa F(ab’)2 với ammonium sulphate 22%, lọc thu tủa, thẩm tích và lọc vô trùng tạo HTKN-RCN F(ab’)2.

Bảng 3.13 : Lượng tủa có F (ab’)2 thu được. Chỉ số NC

Lô NC Dịch lọc có F(ab’)2

(ml)Tủa có F (ab’)2

(gam)

Lô 1 2900 210Lô 2 5140 395

∑ 2 lần tinh chế 8040 605

Bảng 3.14: Lượng dịch thẩm tích & HTKN-RCN bán thành phẩm

Chỉ số NC

Lô NC

Dịch thẩm tích (ml)

HTKN-RCN bán thành phẩm (ml)

Lượng dịch thẩm tích bị hao hụt (ml)

Lô 1 190 165 25 (13,1%)

Lô 2 510 485 25 (5,2%)

∑ 2 lần 700 650 50 (7,7%)

Bảng 3.15 : Số lượng HTKN-RCN F(ab’)2 đã sản xuất.

Tên sản phẩm Đơn vị Thể tích Số lượng

13

(ml) (lọ)HTKN-RCN bán thành phẩm 500 ml 650 2

HTKN-RCN F(ab’)2 5 ml 650 130

3.1.4.3. Xác định độ tinh sạch của HTKN-RCN bán thành phẩm:

Bảng 3.17: Định lượng protein, albumin, globulin, IgG, IgG, IgM, tỷ lệ A/G huyết thanh ngựa và HTKN-RCN F(ab’)2 .

Xét nghiệm Huyết thanh ngựa

HTKN-RCN F(ab’)2

Số lượng Tỷ lệ

Protein (g/l) 87,1 49,8 100 %Albumin (g/l) 28,7 1,4 2,8 %Globulin (g/l) 58,4 48,4

100% 97,2 %

IgG (mg/dl) 865 203 2,141 g/l

≈ 4,4%IgM (mg/dl) 67,8 8,6IgA (mg/dl) 6,3 2,5Tỷ lệ A/G 0,49 0,03

Hình 3.6. So sánh hình ảnh điện di protein huyết thanh ngựa (trái) và

điện di protein huyết thanh HTKN-RCN F(ab’)2 (phải):

14

(Hình ảnh hai đỉnh rõ rệt của albumin, globulin đã không còn trên điện di

HTKN-RCN, chỉ còn lại hình ảnh thuần nhất một đỉnh tương ứng với dải

phân bố albumin - trong khi định lượng albumin chỉ còn một lượng nhỏ

2,8%. Điều này cho thấy F(ab’)2 chiếm tỷ lệ cao gần như tuyệt đối).

3.2. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM HTKN-RCN ĐA

GIÁ F(ab’)2 TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM:

3.2.1. Kiểm định chất lượng tại cơ sở:

Bảng 3.18: Thử nghiệm an toàn trên chuột lang.

TTTrọng lượng(gam)

HTKN(ml)

Theo dõi chuột thí nghiệm Tăng trọng lượng(gam)

Rụng lông

Trọng lượngTuần

1Tuần

2Tuần

3

1 310 3,1 0 320 325 340 +302 330 3,3 0 343 350 355 +253 350 3,5 0 358 363 370 +20

Bảng 3.19: Tìm chất gây sốt trong HTKN-RCN đa giá F(ab’)2

TTthỏ

Trọng lượng (kg)

Thể tích HTKN

(ml)

Nhiệt độ thỏ trước/sau khi tiêmHTKN RCN (oC) Chênh

lệch(oC)Trước Sau 1 h Sau 2 h Sau 3 h

1 2,8 2,8 39,3 39,6 39,8 39,3 + 0,52 2,8 2,8 39,4 39,7 39,8 39,4 + 0,43 3,0 3,0 39,6 39,8 39,9 39,6 + 0,3

Bảng 3.20: Kiểm tra mức độ vô khuẩn của HTKN-RCN đa giá.

Lô HTKN-

RCN

Môi trường Sabouraud (37oC)

Môi trường thạch máu (20oC – 25oC)

Ngày 3

Ngày 7

Ngày 14

Ngày 3

Ngày 5

Ngày 7

15

Lô I Âm tính

Âm tính

Âm tính

Âm tính

Âm tính

Âm tính

Lô II Âm tính

Âm tính

Âm tính

Âm tính

Âm tính

Âm tính

Bảng 3.21: Xác định liều chết 50% (LD50) của nọc RCN Việt Nam.

TTNồng độ

nọc(µg/ml)

Số nọc/chuột(µg)

Theo dõi chuột thí nghiệm

Tỷ lệchuột chết

(%)Chết Sống Tổng số

1 22,50 4,5 8 0 8 100,00

2 15,00 3,00 7 1 8 87,50

3 10,00 2,00 4 4 8 50,00

4 6,66 1,33 1 7 8 12,50

5 4,44 0,88 0 8 8 0,00

6 0 0 0 8 8 0,00

Bảng 3.22: Xác định Hiệu lực (công hiệu) của HTKN rắn cạp nia.

LôHTKN-RCN(ml)

ĐệmBPS

Nọc RCN 40 LD50

(ml)

Số LD50/ chuột

Tình trạngchuột NC

Chết Sống +

1 0.000 2.000 0.000 0 0 8 8

2 0.000 1.000 1.000 4 8 0 8

3 0.060 0.940 1.000 4 6 2 8

4 0.070 0.930 1.000 4 4 4 8

5 0.080 0.920 1.000 4 0 8 8

3.2.2. Kết quả kiểm định quốc gia về chất lượng HTKN-RCN:

Bảng 3.23: Kết quả Kiểm định Quốc gia về chất lượng HTKN-RCN

16

TT Tên thử nghiệm Kết quả1 An toàn chung Đạt yêu cầu2 chất gây sốt Đạt yêu cầu3 Vô khuẩn Đạt yêu cầu4 Hiệu giá 267,5 LD50/lọ5 NaCl 0,87%6 pH 7.0127 Nồng độ protein 7,43 mg/ml8 Nồng độ merthiolate 0 g%

Chương 4: BÀN LUẬN

4.1. BÀN VỀ SẢN XUẤT HTKN-RCN ĐA GIÁ F(ab’)2 THEO

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM, DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM IV, 2009:

4.1.1. Chế tạo KN:

- Tuyển chọn rắn, lấy nọc: tuyển chọn rắn, lấy nọc là công đoạn đầu

tiên rất quan trọng của quy trình sản xuất. Nọc rắn của hai loài RCN

dự định chế tạo HTKN-RCN đa giá phải có chất lượng tốt, đại diện

cho quần thể cả hai loài RCN ở Việt Nam. Sau 6 lần tiến hành thu

gom đã lấy đủ số lượng nọc cần thiết của cả hai loài RCN bắc và

nam. Nọc của RCN ít, khó lấy và rất nguy hiểm (Bảng 3.1).

- Xác định các loại rắn khoang thường gặp ở Việt Nam: Việt Nam

có nhiều loài rắn khoang “khúc đen, khúc trắng”, dễ nhầm lẫn với

nhau (Bảng 3.2) là B. candidus, B. multicinctus và Rắn khoang sông

Hồng (B. slowinskii), trong đó RCN nam và RCN bắc là hai loài

thường gặp, có số lượng nhiều nhất trong tự nhiên, cần sản xuất

antivenom phục vụ điều trị, các loài khác ít gặp.

- Kết quả chế tạo KN nọc rắn cạp nia đa giá, giảm độc lực:

17

Sử dụng 3 g nọc nguyên chất của cả hai loài RCN, chế tạo được

272,8 ml dung dịch KN nọc RCN giảm độc lực. Đã phân chia số

lượng KN ra các loại thể tích khác nhau căn cứ vào liều KN miễn

dịch trong lịch trình dự kiến và trọng lượng của ngựa nghiên cứu.

Đóng lọ theo từng nhóm có thể tích từ 0,1 ml đến 6 ml, chia ra 9 bậc

cho 9 tháng gây mẫn cảm cho ngựa. Số lượng KN chế tạo đủ dùng

trong nghiên cứu, phòng tình huống ngựa chết, nghiên cứu thất bại

và lưu trữ phục vụ kiểm tra chất lượng HTKNR (Bảng 3.3).

- Kiểm tra chất lượng KN: các Bảng 3.4, 3.5, 3.6 cho thấy: chất

lượng KN đạt yêu cầu về an toàn chung, vô khuẩn, không có chất

gây sốt khi gây mẫn cảm cho động vật thí nghiệm. Với loại độc tố có

độc lực rất mạnh với sinap thần kinh – cơ như nọc RCN, chế tạo KN

để gây mẫn cảm nếu không đảm bảo, sẽ gây chết động vật. Khử độc

tính nọc rắn, chỉ giữ lại tính KN độc tố là mục đích của chế tạo KN.

Quá trình khử độc với glutheraldehyde, các vi khuẩn đã bị tiêu diệt

một phần lớn; những vi khuẩn, vi nấm bị loại bỏ bằng lọc qua màng

lọc Ø 0,2 µm. Trong quá trình chế tạo KN (lấy nọc, khử độc nọc, tiến

hành ly tâm, bỏ cặn, thu dung dịch KN, lọc vô trùng, chiết vào các lọ

nhỏ, đóng nắp lọ,..), yêu cầu vô khuẩn, loại trừ chất gây sốt đã được

tuân thủ nghiêm túc (Bảng 3.5, 3.6).

4.1.2. Quy trình gây mẫn cảm ngựa, theo dõi đáp ứng miễn dịch:

- Lịch trình miễn dịch ngựa, liều lượng KN và tá dược:

Cách 1 tháng/lần là khoảng thời gian bảo đảm an toàn cho ngựa sau

miễn dịch (liền vết loét, mệt, yếu,..) đồng thời là khoảng thời gian

cần thiết cho quá trình đáp ứng miễn dịch xảy ra (theo WHO, cần từ

18

3 - 8 tuần). Liều KN gây mẫn cảm tăng dần, kết hợp với tá dược

Freund gây kích thích đáp ứng miễn dịch thứ phát của hệ miễn dịch

ngựa. Tá dược Freund được sử dụng gồm một trong 2 loại: CFA hoặc

IFA. Đây là một huyền dịch KN được nhũ hóa (emulsify) trong dầu

khoáng, để tăng cường độ đáp ứng miễn dịch (immunopotentiator).

Nhiều tác giả đã sử dụng phương pháp kết hợp KN và CFA để tăng

mạnh hiệu giá KT cho thấy hiệu quả rất rõ rệt. Pratanaphon R. và

cộng sự (1997), đã trộn lẫn KN nọc rắn hổ đất Thái Lan và với các tá

dược khác nhau như: CFA đơn thuần (50% CFA + 50% KN), CFA

với tỷ lệ 25% (75% KN và 25% CFA), KN + vắc xin nội độc tố uốn

ván (tetanus toxoid), KN + vắc xin nội độc tố bạch hầu (diphtheria

toxoid ) với tỷ lệ khác nhau, đã thu được kết quả tốt, hiệu giá KT

tăng cao mạnh mẽ trong thời gian ngắn so với nhóm chứng chỉ dùng

KN và tá dược là bentonite gel.

- Theo dõi sức khỏe ngựa sau mỗi lần miễn dịch: Tiêm KN và tá

dược CFA lần thứ nhất ở cả hai ngựa đều thấy ngựa mệt mỏi, bỏ ăn,

yếu bại, nằm tại chỗ hoặc lười vận động; tại chỗ tiêm bình thường.

Lần tiêm thứ 2 và 3 nhắc lại sau 1 tháng, thấy ngựa bỏ ăn hoặc ăn

kém, tại chỗ tiêm xuất hiện vết loét, đường kính 3 - 7 cm. Những lần

tiêm với tá dược IFA, không xảy ra loét chỗ tiêm; biểu hiện toàn thân

bình thường, ngựa vẫn đi lại, ăn uống tốt, dáng điệu khỏe mạnh.

Hiện tượng loét da xảy ra sau miễn dịch ngựa bằng tá dược CFA lần

thứ 2,3 nhưng không loét ở những lần gây mẫn cảm với tá dược IFA

(Bảng 3.8) (do CFA có BCG chết). Theo WHO, chỉ tiêm một lần

CFA và hạn chế tiêm tại một điểm số lượng lớn KN + tá dược, tuy

19

nhiên nhóm nghiên cứu đã không thực hiện như vậy, ngựa vẫn sống

và đáp ứng miễn dịch xảy ra bình thường, song việc chăm sóc vất vả

hơn; cũng không chứng minh được hiệu quả đáp ứng miễn dịch cao

hơn so với hướng dẫn của WHO.

- Theo dõi hiệu giá KT sau miễn dịch: Sau miễn dịch 9 lần, hiệu giá

KT đặc hiệu với KN nọc RCN tăng lên mức 1/2048 ở cả 2 ngựa và

ổn định sau lần miễn dịch thứ 8 và 9. Như vậy, có thể lấy máu sớm

hơn sau 7 lần miễn dịch bằng KN nọc RCN và tá dược. Kết quả

Bảng 3.9 cũng cho thấy, với hai ngựa khỏe, có cân nặng tương đương

và được nuôi ở hai địa điểm khác nnhau, cùng một liệu trình miễn

dịch với liều lượng như nhau, có thể cho kết quả hiệu giá KT khác

nhau. Điều này gợi ý: chế độ chăm sóc và dinh dưỡng đóng vai trò

quan trọng trong đáp ứng miễn dịch của ngựa.

- Xác định tính đặc hiệu của KT ngựa với KN nọc: Dùng thử

nghiệm Ouchterlony kiểm tra sau gây mẫn cảm, thấy xuất hiện các

vết tủa KN - KT trên thạch, chứng tỏ trong máu ngựa đã hình thành

KT chống KN nọc RCN. Pha huyết thanh với nồng độ khác nhau để

xem xét mức độ hình thành KT. Khi sản xuất được HTKN-RCN đa

giá F(ab’)2, làm điện di miễn dịch với KN nọc RCN, thấy xuất hiện

rất rõ vết tủa KN-KT trên thạch, điều này khẳng định hiệu lực sinh

KT đặc hiệu của KN là rất tốt (Hình 3.4, 3.5)

4.1.3. Lấy máu, tách huyết tương, truyền trả khối hồng cầu:

- Lấy máu vô trùng, máu không bị đông, không vỡ HC, ngựa được

lấy máu đảm bảo an toàn; máu lấy xong tách huyết tương ngay để

truyền trả lại khối HC cho ngựa (Bảng 3.10).

20

- Khi thu huyết tương cần chú ý lượng máu lấy và sức khỏe của

ngựa; máu lấy đủ để sản xuất và ngựa vẫn bình thường. Theo bảng

3.11, khi lấy máu ít hơn 3,5 lít, cả 2 ngựa đều không có biểu hiện gì.

Khi lấy 3,6 --> 5,4 lít máu, tùy theo từng ngựa, khả năng chịu đựng

khác nhau, các mức độ phản ứng với lấy máu khác nhau. Trong

khoảng khối lượng máu lấy ở trên, khi có biểu hiện bất thường, xử lý

dừng lấy máu kịp thời, ngựa đều an toàn, không nguy hiểm. Mức độ

lấy máu nhiều hơn 5,5 lít/ngựa, nếu không chú ý sẽ xảy ra mất an

toàn cho ngựa do shock mất máu.

4.1.4. Để tinh chế HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 đạt chất lượng cao:

- Cắt Fc, tủa phần protein không phải KT kháng nọc RCN, lọc bỏ

tủa, thu dịch lọc chứa nhiều F(ab’)2: Phân tử KT IgG nguyên vẹn

có mảnh Fc, là nguyên nhân của các phản ứng không mong muốn

trên lâm sàng, nhất là shock phản vệ. Fc mang thụ thể gắn các tế bào

mastocyte, bạch cầu ưa kiềm...là kho chứa các chất trung gian hóa

học histamin, serotonin, bradykinin... gây phản vệ, loại phản ứng

nguy hiểm nhất trong kháng huyết thanh trị liệu. Chúng tôi sử dụng

pepsin để cắt bỏ Fc, giữ lại phần F(ab’)2. Tỷ lệ thu lại huyết tương

giàu F(ab’)2 với 2 lần tinh chế là 80,4% (Bảng 3.12). Như vậy, ~

20% lượng tủa của huyết tương chứa các thành phần không có KT và

F(ab’)2 . Đây là sự cần thiết đầu tiên cho tinh sạch sản phẩm. Tủa

ammonium sulfate có lợi điểm: giữ được nguyên tính chất của các

phân tử KT, F(ab’)2, song hiệu xuất thu lại KT kém hơn so với các

kỹ thuật tinh chế khác như sắc ký trao đổi ion (Ion-exchange

chromatography) và sắc ký ái lực (Affinity chromatography).

21

Ammonium sulfate có khả năng hòa tan rất cao tới nồng độ 4M,

trong khi ở nồng độ 3,2 M, hầu hết các loại protein đều đã bị tủa. Chỉ

sau 30-60 phút hòa tan ammonium sulfate theo từng nồng độ chọn

lọc, toàn bộ protein tương ứng đã bị tủa. Khi tái hòa tan hạt protein

kết tủa trong đệm mới, cấu trúc phân tử và hoạt tính sinh học của

protein vẫn được giữ nguyên. Một số muối cùng tủa theo protein,

được loại bỏ bằng thẩm tích. Như vậy, dung dịch protein thành phẩm

(thí dụ: HTKNR) vừa tinh sạch vừa được cô đặc, nhưng vẫn giữ

nguyên được chức năng sinh học của KT. Tất nhiên, ngoài nồng độ

và tính chất của ammonium sulfate ra, tủa protein còn phụ thuộc vào

pH và nhiệt độ của dung môi. Ở pH = 4,2 và nhiệt độ 20oC, với nồng

độ ammonium sulfate = 14%, mọi thành phần protein không phải

KT, kể cả Fc và lipid đều bị tủa, được loại bỏ bằng giấy lọc

Whatman; dịch lọc chứa F(ab')2 được thu lại.

- Tủa F(ab’)2 với ammonium sulfate, lọc thu tủa bằng giấy lọc

Whatman, thẩm tích và lọc vô trùng tạo HTKN-RCN F(ab’)2.

Khi điều chỉnh pH dịch lọc lên 6,8/20oC, rồi thêm ammonium sulfate

tới 36%, trộn đều, sau 60 phút sẽ tủa toàn bộ F(ab')2 cùng với muối

ammonium sulfate (Bảng 3.13). Thẩm tích loại bỏ ammonium sulfate

khỏi tủa giàu F(ab’)2 . Lọc vô trùng bằng màng lọc cellulose acetatae

có kích thước lỗ lọc 0,2 µm, tạo HTKN-RCN F(ab')2 dạng bán thành

phẩm. Bảng 3.14 cho thấy: lọc nhiều huyết tương một lần sẽ tiết

kiệm hơn. Ở đây, một lần lọc sẽ giảm được 25 ml HTKN-RCN dạng

F(ab’)2, tương đương 5 lọ, mỗi lọ có giá sản xuất chừng 70 USD

(Bảng 3.24), đã là giảm một khoản chi phí đáng kể (do dùng máy lọc

22

Seiz, kiểu cũ; nếu lọc với máy mới, ngoài chất lượng tốt hơn, thời

gian lọc nhanh hơn, còn tiết kiệm được nhiều HTKNR hơn). Bảng

3.15 chỉ ra một số hóa chất chính đã sử dụng tinh chế HTKN-RCN.

Kết hợp với Bảng 3.24, thấy số lượng kinh phí cho công đoạn tinh

chế không lớn. Đây là một kỹ thuật dễ thực hiện, đơn giản, quy mô

nhỏ, phục vụ nhu cầu của đối tượng BN không lớn. Bảng 3.16 cho

thấy đã tinh chế được 650 ml HTKN-RCN F(ab’)2 dạng bán thành

phẩm và sau khi kiểm định cơ sở đạt yêu cầu, đóng lọ 5 ml, được

130 lọ HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 thành phẩm.

- Xác định độ tinh sạch của HTKN-RCN đa giá F(ab’)2:

Theo tiêu chuẩn Việt Nam về chất lượng HTKNR, yêu cầu chỉ số

protein toàn phần phải < 150 g/l (tiêu chuẩn của WHO là < 100g/l)

(bảng 2.1, 2.2). Sản phẩm HTKNR sản xuất có lượng protein là

49,8g/l (Bảng 3.17), đạt tiêu chuẩn Việt Nam và cả WHO. Lượng

F(ab’)2 đặc hiệu chống nọc RCN chiếm 95,6% (= 46,26 g/l) trong

tổng số lượng protein 49,8 g/l cho thấy kết quả tinh chế rất hiệu quả,

HTKN-RCN được chế tạo có độ tinh sạch cao; lượng albumin chiếm

1,4 g/l (= 2,8%) (Bảng 3.17) vẫn đạt tiêu chuẩn Việt Nam nhưng

chưa đạt tiêu chuẩn của WHO.

4.2. BÀN VỀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HTKN-RCN ĐA GIÁ

F(ab’)2 TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM:

4.2.1. Kiểm định cơ sở & vấn đề kiểm soát chất lượng:

4.2.1.1. Tính “An toàn” của chế phẩm:

Kết quả thử nghiệm an toàn trên chuột lang Cobay (Bảng 3.18), thử

nghiệm chí nhiệt tố (Bảng 3.19) trên thỏ, và kết quả cấy khuẩn (Bảng

23

3.20) cho thấy HTKN-RCN nghiên cứu sản xuất đã đạt tiêu chuẩn an

toàn, vô khuẩn và không có chất gây sốt.

4.2.1.2. Hiệu lực của chế phẩm nghiên cứu:

- Xác định LD50: theo Bảng 3.21, đã xác định liều chết trung bình

của nọc RCN Việt Nam (gồm cả hai loài RCN bắc và RCN nam) là

2,17 µg/chuột nhắt trắng (18 - 20g). Việc tính toán theo công thức

Karber đã được lựa chọn do dễ sử dụng, dễ tính toán hơn so với các

công thức tính LD50 khác mà vẫn đảm bảo độ chính xác.

- Xác định ED50:. Xác định hiệu lực trung hòa nọc 50% (ED50) của

HTKNR là tiêu chuẩn so sánh HTKNR giữa các lô của một cơ sở sản

xuất cũng như với các cơ sở khác. Chuột nhắt trắng nên dùng nhóm 5

- 6 con, trọng lượng 18 - 20 g/con. Dung dịch nọc cố định trộn đều

với HTKNR (tăng dần). Theo dõi số lượng chuột sống 50% sau khi

tiêm tĩnh mạch hỗn dịch nọc - LD50 và HTKNR/24 giờ để xác định

khả năng bảo vệ (hay hiệu lực) của HTKNR. Bảng 3.22 cho thấy,

liều hiệu lực trung hòa, có khả năng giải độc cứu người của HTKN

cạp nia (ED50) = 57.14 LD50/ml = 124.2 µg/ml. Kết quả này phù hợp

với “Phiếu trả lời kết quả kiểm định số: 00610/SPĐT-NC (Bảng

3.23) của Viện Kiểm định quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ y

tế Việt Nam, ngày 1/12/2010.

4.2.2. Kiểm định chất lượng cấp Quốc gia:

Kết quả ở Bảng 3.23 cho thấy: HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 của đề tài

nghiên cứu đạt toàn bộ các tiêu chuẩn chất lượng Việt Nam, theo

Dược điển Việt Nam IV, 2009 như mục tiêu nghiên cứu đề ra. Tham

khảo và đối chiếu với Tiêu chuẩn chất lượng HTKNR của WHO,

24

2008 (Bảng 2.2), thấy: HTKN-RCN của đề tài đạt 9/10 tiêu chuẩn

quan trọng nhất theo tiêu chuẩn của WHO (Bảng 2.2 và Bảng 3.17).

KẾT LUẬN

1. Đã xác lập quy trình sản xuất và sản xuất thành công lần đầu tiên

tại Việt Nam và trên thế giới HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 của hai loài

RCN Bungarus multicinctus và Bungarus candidus. Sản phẩm đã

được chuẩn hóa theo Tiêu chuẩn quốc gia, Dược điển Việt Nam IV,

2009 về HTKNR dùng cho người và theo Khuyến cáo của WHO,

(Guidelines, 2008). Phương pháp tinh chế có hiệu quả cao trong tập

trung cô đặc và tinh sạch mảnh F(ab’)2, một yếu tố cần thiết để trung

hòa độc tố nọc RCN, với mức độ cô đặc globulin đạt 97,2%; trong

đó F(ab’)2 chiếm 95,6%; lượng albumin được loại bỏ gần như hoàn

toàn (chỉ còn 2,8%).

2. HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ ngựa đã khẳng định tính “An toàn”

và “Hiệu lực” trong phòng thí nghiệm qua Kiểm định chất lượng cấp

cơ sở và Kiểm định quốc gia. Sản phẩm được xác nhận đạt tất cả các

chỉ tiêu (8/8) về tính an toàn (an toàn chung, chí nhiệt tố, vô khuẩn

và các tiêu chuẩn lý hóa: pH, nồng độ merthiolat, nồng độ NaCl, hàm

lượng protein) và có hiệu giá 267,5 LD50/lọ (5ml), trung hòa được

620 µg nọc rắn cạp nia.