Ruolo della Struttura della Cromatina nella Regolazione Genica

• Struttura della Cromatina nelle sequenze codificanti del gene.

• Struttura della Cromatina nel promotore.

• Ruolo del nucleosoma nel bloccare l’accesso al promotore.

• I nucleosomi possono essere spostati?

Fibre di Cromatina

Fibra cromatinicada 30nm

Fibra cromatinicada 10nm (collana diperle)

+ Istoni core altamenteacetilati (specialmenteH3 ed H4)

N-Termini carichi(legano il DNA dinucleosomi adiacenti)

•Alti livelli di istone H1•Trascrizione OFF

•Ridotti livelli di istone H1•Trascrizione ON

DOMINI CROMATINICI

EUCROMATINA:

•Cromatina decondensata, trascrizionalmente attiva.•Replicazione precoce.•Iperacetilazione degli istoni•Ricca in metH3K4, 36 e 79

Geni eucromatici sottoposti a silenziamento sono ricchi in:meH3K9, 3meH3K27, meH4K20

ETEROCROMATINA:

•Cromatina altamente compattata e silenziata trascrizionalmente.•Replicazione tardiva.•Ipoacetilazione degli istoni•Alti livelli di metilazione.

Costitutiva: adiacente al centromero e contenente grandi blocchi di ripetizioni Alpha Satellite nell’uomo (Major Satellite repeats in topo) Silenziata irreversibilmente Ricca in 3meH3K9 + meH3K27 + 3meH4K20

Facoltativa: E’ silenziata reversibilmente e può tornare ad essere attiva (Esempio: cromosoma X femminile) Ricca in 2meH3K9 + 3meH3K27 + meH4K20

Relazione tra stato della cromatina ed espressione genica

Regola generale:

•L’organizzazione nucleosomale nelle regioni a monte dei geni è correlata negativamente con l’espressione dei geni a valle.

•L’attivazione genica si correla di solito con una riduzione dell’occupanza nucleosomale nei promotori.

Studi di Epigenetica hanno dimostrato anche il contrario.La cromatina può adottare diverse conformazioni con proprietà biochimiche e biofisiche distinte.Regioni genomiche diverse mostrano differenze nella compattezza globale enell’accessibilità ad enzimi modificanti.

Studi fatti sulla frazione di cromatina “aperta” isolata da cellule e analizzatacon microarrays hanno mostrato che:

1) Esiste una correlazione tra cromatina aperta e densità genicaes.: sui cromosomi 17, 19 e 22, più ricchi di geni e di cromatina aperta, si forma un loop decondensato nel nucleo interfasico MA2) Non c’è sempre correlazione tra stato aperto della cromatina e livelli di espressione genica

I GENI POSSONO A VOLTE ESSERE ATTIVI NELLE REGIONI CONDENSATEE INATTIVI NELLE REGIONI DECONDENSATE

•I siti ipersensibili alla DNasi I sono circa 100 volte più sensibili a questo enzimadi un normale sito cromatinico

•Quasi ogni gene attivo contiene un tale sito di ipersensibilità, a volte piùdi uno, nella regione del promotore

•In SV40 si ha un’interruzione nell’organizzazione nucleosomica visibile almicroscopio elettronico di circa 350bp che corrisponde alla regione diipersensibilità

HS = Siti di ipersensibilità alla DNasi I

SITI IPERSENSIBILI ALLA DNasiI

Possono rappresentare:

•Regioni occupate contemporaneamente da istoni e fattori di trascrizione – MMTV

•Regioni dove gli istoni sono stati rimossi dal DNA- geni per la β-globina, SV40

Problema importante: Come avviene l’esclusione dei nucleosomi dalleregioni Ipersensibili?

Ipotesi: Il sito ipersensibile viene riconosciuto da proteine specificheche escludono la formazione del nucleosoma

Come si dimostra che i nucleosomi sono esclusi da una regione?

Mappatura di siti ipersensibili alla DNasi I

DNA nudo

Si usano quantità molto piccole di DNAsi I in modo da avere solo circa un taglio per molecolaQuesto permette di tagliare solo il DNA nudo e non quello nucleosomale. La cromatina viene poi deproteinizzata

Nuclei isolati

RI

RI

Taglio con EcoRI, elettroforesi e blot.Sonda

Domini cromosomici definiti tramite la DNAsi I

Eritrociti di pollo (celluleadulte):

Un gene diventa suscettibileall’enzima nei tessuti in cui è maggiormente espresso.

L’ipersensibilità definisceuno stato di predisposizionealla trascrizione.

Gli esperimenti con la DNasiI hanno permesso di definire e provare

L’esistenza di DOMINI intesi come unità di trascrizione funzionali

(che contengono geni attivi).

Tipicamente siti di ipersensibilità alla DNasi I sono riscontratisu sequenze regolative come gli ENHANCER e i PROMOTORI,ma anche su altri elementi più complessi

LCRISOLATORI

Questi elementi delimitano e definiscono dei domini funzionalie presentano ipersensibilità piuttosto estesa alla DNasi I (a voltesu regioni di parecchie Kb).

LCR: Locus Control Region

• LCR: è un cluster di siti ipersensibili alla DNAsi I scoperto nel locus genico delle β-globine e necessario per la loro espressione.•Scoperto a causa dell’inattivazione di transgeni (globine) che mancano di queste sequenze. •Tutti i siti devono essere presenti per l’attivazione, ma il loro effetto è cooperativo, la delezione di ognuno riduce debolmente la trascrizione del locus.•Ogni gene è poi regolato ulteriormente dai propri controlli specifici, e questo dipende dai fattori di trascrizione gene-specifici di volta in volta attivi.•La sua delezione ripristina la resistenza alla DNAsi I.•Probabilmente funziona rendendo la cromatina di questa regione più aperta.

LOCUS CONTROL REGION (LCR)

•E’ un sito regolatore di legame al DNA lontano dal promotore indipendente dall’enhancer.

•Di solito lega sia fattori ubiquitari che tessuto specifici. Nel locus delle globine ogni sito HS contiene lo stesso tipo di siti di legame per gli stessi fattori di trascrizione.

•Rende un promotore attivo a prescindere dalla sua posizione nella cromatina.

•Funziona aprendo la struttura nucleosomale del promotore, in modo che i fattori possono legarsi.

Parecchi loci presentano elementi LCR a delimitare i loro confini:• -globine umane, di pollo e di topo • Locus Th2 delle citochine umane• Locus GH (growth hormone; comprende GHN, CSA, CSB, CSL e GHV)

LCR funziona attraverso una specifica organizzazione cromatinica che vienestabilita durante la replicazione.

E’ necessario che LCR sia in continuacomunicazione con gli elementi regolativi del cluster, cioè con gli enhancer e promotori dei singoli geni

E’ probabile che questo assetto cromatinico si formi quando ha luogoil differenziamento della linea eritroide.

Il meccanismo prevede l’ancoraggio a proteinedel “nucleoscheletro”. Probabilmente questo avviene tramite fattori che legano LCR e contemporaneamente fattori che legano gli enhancer dei singoli geni (GATA emotivi di legame CACC).

Gli elementi regolativi vengono tutti ancoratie le sequenze interposte formano anse con unmeccanismo diverso da quello che riguardale anse formate sulla matrice nucleare.

RF = Replication Factory

Come funziona l’elemento LCR?

LCR

Acetylase

Pol II

Una delle possibilità è che siano coinvolti sistemi di rimodellamento dellacromatina, associati ai punti di ancoraggio delle anse

In topo:NF-E2 e GATA-1 reclutanoCBP (CREB-binding protein-acetiltrasferasi) sull’LCRSi ha acetilazione sull’LCR ea valle fino al distale 3’HS1

32Kb

In humanPit1- attivatore trascrizionaledel locus presente su LCR e supromotore.Delezione di Pit1 porta a forteriduzione dell’acetilazione edell’espressione di GHN

•Tecniche recenti hanno mostrato la stretta associazione spazialetra i siti HS e i geni trascritti

•Si tratta di un’associazione dinamica dipendente dallo stadiodello sviluppo

Struttura cromatinica“predisposta”

Struttura cromatinica “attiva” ACH

Fattori della linea eritroide contribuiscono alla formazione dellastruttura ACHEKLF (Erythroid kruppel-like factor)GATA-1FOG-1 (friend of GATA)

“predisposta”in tutte le celluledella linea T

“predisposta”solo in cellule T matureed NK

•Nel caso del locus Th2 sono i promotori a realizzare la struttura ad ansa.

I fattori GATA-3 e STAT6 sono responsabili di questa struttura

Gli Isolatori: scs-scs’ – specialized chromatin structures

Sono elementi che posti tra un enhancer e un promotore impediscono all’enhancer di agire sul promotore.Si può dire che delimitano un dominio.L’isolatore di Hsp70 in Drosophila lega un fattore BEAF-32 (di cui esistono due isoforme, A e B, prodotte per splicing alternativo) che viene evidenziato nelle interbande dei cromosomi politenici.Un’altra proteina che lega scs è SBP, sia in vitro che in vivo.Anche il sito HS4 dei geni della -globina di pollo è un isolatore.Hanno azione direzionale (vedi il trasposone gipsy di Drosophila).Posti tra un gene attivo e l’eterocromatina schermano il gene dall’azione silenziatrice dell’eterocromatina.

Proteine che agiscono sull’Isolatore gypsy

su(Hw):mutazioni in questo gene aboliscono lacapacità isolativa.L’isolatore di gipsy contiene 12 siti di legameper su(Hw).

mod(mdg4):mutazioni di questo gene aumentano l’efficienza dell’isolatore, ma esso perdela direzionalità.Interagisce con su(Hw) e impone direzionalità alla capacità di su(Hw) di svolgere la funzioneisolatrice.

Modelli di isolamento

Il modello dei domini lega l’organizzazione fisica del cromosoma con le caratteristiche funzionali dell’isolatore.

L’isolatore delimita un dominio che favorisce l’interazione produttiva di elementi all’interno del dominio ma precludel’interazione con elementi al di fuori di esso.

Trascrizione della cromatina

Un’idea su come possa funzionare:Un’idea su come possa funzionare:

Girando intorno a un DNA-loop

Studitsky, Clark, Felsenfeld Cell 76, 371 (1994)

Il Nucleosoma può bloccare l’accesso all’apparato trascrizionale

Esperimenti di Roeder mostrano che il nucleosoma può bloccare TBP, fattori e polimerasi II. DNA usato è quello di Adenovirus.

Nucleosomi aggiunti prima di TFIID, fattori e pol II

TATA

+

Nessuna trascrizione

II

TATA

Fattori e pol II aggiunti prima, poi gli istoni

TATA

+

Trascrizione

IITATA

Questo può avvenire in seguito alla replicazione

Questo è stato chiamato MODELLO DELL’ACCAPARRAMENTO

In un altro esperimento in vitro:

•DNA 5S + TFIIIA → TRASCRIZIONE

Successiva aggiunta di ottameri istonici NON spiazza ilfattore di trascrizione

•DNA 5S + ISTONI → + TFIIIA NESSUNA TRASCRIZIONE

ESISTE ANCHE UN MODELLO DINAMICO

Anche questo modello è formulato sulla base di esperimenti in vitro.

PROMOTORE DI Hsp70 di Drosophila

DNA + fattore GAGA

Nel promotore inizialmente nucleosomizzato, appare una regionedi ipersensibilità alle nucleasi.

QUESTO AVVIENE ANCHE DOPO LA FORMAZIONE DEINUCLEOSOMI

LA REGIONE DI IPERSENSIBILITA’ (probabilmente più libera dainucleosomi) METTE IN FASE I NUCLEOSOMI ADIACENTI

STABILITA’ DEI SITI IPERSENSIBILI ALLA DNAsiI

FIBROBLASTI DI POLLO

TRASFORMAZIONE CON UN VIRUS ts

CRESCITA A TEMPERATURA PERMISSIVA•espressione delle globine•comparsa dei siti ipersensibili

PASSAGGIO A TEMPERATURA NON PERMISSIVA•disattivazione delle globine•i siti ipersensibili permangono per circa 20 generazioni e poi scompaiono

Esistono meccanismi per l’instaurazione dell’ipersensibilità e per il suo mantenimento?

Analisi sulla struttura nucleosomale su larga scala in lievito ha rivelato

•Numerose ORF e promotori di geni repressi hanno nucleosomi ben posizionati.

•Quasi tutti i geni hanno DHS (siti ipersensibili alla DNasi) nei promotori a prescindere dallo stato trascrizionale dei geni stessi.

LA PRESENZA DI DHS RIFLETTE “COMPETENZA” TRASCRIZIONALEPIU’ CHE “ATTIVITA’” TRASCRIZIONALE