REHIDRATACIÓN DE LEVADURAS VÍNICAS CON ACTIVADORES ...

REHIDRATACIÓN DE LEVADURAS VÍNICAS CON

ACTIVADORES METABÓLICOS:

INFLUENCIA EN LA CINÉTICA FERMENTATIVA

Y FISIOLOGÍA CELULAR

Universidad de Castilla- La Mancha

Facultad de Ciencias y Tecnologías Químicas Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos

Patricia Díaz- Hellín Patiño

Tesis Doctoral

Ciudad Real, 2013

Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos Facultad de Ciencias Químicas

REHIDRATACIÓN DE LEVADURAS VÍNICAS CON ACTIVADORES METABÓLICOS:

INFLUENCIA EN LA CINÉTICA FERMENTATIVA Y FISIOLOGÍA CELULAR

Por

Patricia Díaz- Hellín Patiño

Visado en Ciudad Real,

Fdo.: Dr. Juan F. Úbeda Iranzo

Profesor Titular del Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos. Universidad

de Castilla-La Mancha.

Fdo.: Dra. Ana I. Briones Pérez

Catedrático del Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos. Universidad de

Castilla-La Mancha.

Trabajo presentado para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Castilla- La Mancha

Fdo.: Patricia Díaz- Hellín Patiño

Licenciada en Ciencia y Tecnología de Alimentos

Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos Facultad de Ciencias Químicas

Dª Juana Rodríguez Flores, Catedrática y Secretaria del Departamento de Química Analítica

y Tecnología de Alimentos de la Universidad de Castilla-La Mancha

CERTIFICA:

Que el presente trabajo de investigación titulado "Rehidratación de levaduras vínicas con

activadores metabólicos: influencia en la cinética fermentativa y fisiología celular" constituye la

Tesis Doctoral que presenta Dª PATRICIA DÍAZ- HELLÍN PATIÑO para aspirar al Doctorado

en Ciencia y Tecnología de Alimentos, y ha sido realizado en los laboratorios de este

Departamento bajo la dirección del Dr. D. Juan F. Úbeda Iranzo y de la Dra. Dª Ana I. Briones

Pérez.

Y para que así conste, expido y firmo el presente certificado en Ciudad Real a

Vº Bº

Fdo. Ana I. Briones Pérez Fdo. Juana Rodríguez Flores

Directora del Departamento Secretaria del Departamento

Prólogo

Prólogo

Patricia Díaz- Hellín Patiño, 2013

i

PRÓLOGO

En esta Memoria de Tesis Doctoral se recogen cuatro artículos científicos en los que se

estudia la influencia de la adición de activadores metabólicos de la fermentación al agua de

rehidratación de las levaduras seco- activas. Uno de ellos ha sido publicado en una revista

internacional del área de Ciencia y Tecnología de Alimentos indexadas en el ISI (Institute for

Scientific Information), mientras que los otros tres se encuentran en proceso de revisión.

Todos los trabajos fueron propuestos y desarrollados en el Área de Tecnología de Alimentos de

la Facultad de Ciencias y Tecnologías Químicas de la Universidad de Castilla-La Mancha. Parte

de los resultados expuestos en el cuarto artículo se obtuvieron durante una estancia en la

Universitat Rovira i Virgili, bajo la supervisión del Dr. Ricardo R. Cordero Otero.

La Justificación de este trabajo se presenta en el primer apartado de esta Memoria.

En la Introducción se revisan los factores que más influyen en la actividad fermentativa

durante el proceso de vinificación, aquellos que determinan la composición lipídica de la

membrana celular y finalmente se hace referencia a la expresión de los genes implicados en

transporte de azúcares en levaduras. Posteriormente se describen los objetivos de esta

investigación así como el plan de trabajo que se siguió.

En los cuatro capítulos siguientes se recogen los artículos científicos que constituyen esta

Tesis, precedidos por un resumen en castellano. El noveno apartado corresponde a las

conclusiones generales y por último, en el décimo se recogen las publicaciones y

comunicaciones a congresos fruto de este trabajo de investigación.

Índice


ii

Índice

0. Resumen .................................................................................. 1

1. Justificación ............................................................................... 3

2. Lista de abreviaturas .................................................................. 7

3. Introducción ............................................................................ 11

3.1. Cultivos iniciadores: Levaduras seco- activas ....................... 11

3.1.1. Producción de levaduras seco- activas ............................. 12

3.1.2. Reconstitución celular: rehidratación................................ 14

3.2. Parámetros que definen el estado de las levaduras durante

el proceso fermentativo ..................................................... 15

3.2.1. Vitalidad, viabilidad y cinética fermentativa ...................... 16

3.3. Factores de crecimiento y supervivencia: activadores

metabólicos de la fermentación ........................................... 19

3.3.1. Factores de crecimiento ................................................. 19

3.3.2. Factores de supervivencia .............................................. 21

3.3.3. Activadores comerciales ................................................. 22

3.4. Composición lipídica de membrana en levaduras................... 24

3.4.1. Lípidos apolares o neutros .............................................. 25

3.4.2. Lípidos polares .............................................................. 27

3.5. Discrepancia entre el consumo de glucosa y fructosa

en levaduras ..................................................................... 28

3.5.1. Transporte y fosforilación .............................................. 29

3.5.2. Expresión génica .......................................................... 30

3.5.2.1. Cuantificación de la expresión génica ....................... 31

3.6. Condiciones de estrés en la fermentación:

Ralentización y parada fermentativa ................................... 33

3.6.1. Influencia de la composición del medio ........................... 33

3.6.2. Influencia de la viabilidad celular .................................... 34

3.7. Bibliografía ...................................................................... 36

4. Objetivos y plan de trabajo ......................................................... 47

5. Capítulo I ................................................................................. 53

6. Capítulo II ................................................................................ 65

7. Capítulo III ................................................................................ 85

8. Capítulo IV ............................................................................... 103

9. Conclusiones generales .............................................................. 125

10. Publicaciones y comunicaciones en congresos ................................ 128

Resumen

Resumen


1

RESUMEN

El uso de "activadores metabólicos de la fermentación" constituye en la actualidad una

práctica enológica comúnmente aceptada. Su adición directa al mosto en fermentación está

bastante extendida; sin embargo, su incorporación al agua de rehidratación de las levaduras

seco- activas está menos estudiada, si bien existen una serie de activadores comerciales

complejos, no se ha estudiado el efecto que puede tener la adición de determinadas moléculas

que, individualmente, podrían aportar beneficios a la levadura durante el proceso

fermentativo.

Analizar el efecto y las mejoras que proporcionan los activadores añadidos en la etapa de

rehidratación de las levaduras es uno de los retos que por estar insuficientemente abordado en

la actualidad, se planteó en esta Tesis Doctoral, para lo cual se llevaron a cabo los siguientes

trabajos:

1. Determinación de la vitalidad, viabilidad, actividad metabólica, cinética fermentativa y

metabolitos mayoritarios de cuatro levaduras seco-activas comerciales rehidratadas

en presencia de nueve activadores metabólicos.

Cada levadura presentó un comportamiento diferente, lo que indica un elevado nivel

de cepa- dependencia. No se encontró un activador "universal", aunque los mejores

resultados respecto a las variables analizadas se observaron en la rehidratación con

ácido ascórbico, ergosterol y ácido oleico.

2. Evaluación del comportamiento de dos cepas rehidratadas en presencia de cinco

activadores metabólicos, a distintas dosis, en condiciones de parada fermentativa:

estudio de la discrepancia de consumo fructosa/ glucosa, vitalidad, producción de

metabolitos mayoritarios y nitrógeno. No se encontró una relación dosis- respuesta.

Por otra parte el ergosterol a determinadas dosis mostró en general un efecto

favorable.

3. Estudio del nivel de expresión del gen Hxt3, implicado en el transporte de azúcares,

tanto en condiciones óptimas como en situaciones de parada fermentativa, en una

levadura caracterizada por su buen consumo de azúcares, y poca vitalidad al final del

proceso fermentativo, rehidratada en presencia de ergosterol, ácido tetrahidrofólico y

ácido ascórbico.

Los tres activadores aumentaron la expresión del gen Hxt3, destacando

especialmente el comportamiento con ácido tetrahidrofólico.

Resumen


2

4. Análisis de la fracción lipídica (fosfolípidos, lípidos neutros y ácidos grasos) de la

membrana plasmática de dos levaduras seco-activas comerciales rehidratadas en

presencia de ergosterol, ácido tetrahidrofólico y manganeso a tres dosis diferentes.

De los activadores testados el más eficaz fue el ergosterol, aunque el efecto dependió

de la dosis utilizada.

Justificación

Justificación


3

1. JUSTIFICACIÓN

Castilla-La Mancha es la región con mayor extensión de cultivo de vid y cuenta con una

producción estable anual de aproximadamente unos 20 millones de hectólitros de vino.

Durante las últimas décadas, el sector vitivinícola ha modernizado el proceso de producción

y elaboración de sus vinos, imponiendo la calidad a la cantidad. Ante este panorama, hoy se

puede afirmar que la vitivinicultura de la zona es ejemplar y que sus vinos luchan con otros

buscando un hueco en el panorama nacional e internacional.

Se caracteriza por noches calurosas durante la época estival así como periodos de vendimia

cada vez más amplios, factores que, añadidos a determinados cambios en la climatología,

como veranos cada vez más cálidos, da lugar a mostos con un elevado contenido en azúcares,

lo cual supone un problema, ya que las levaduras están sometidas no solo a un estrés

osmótico-térmico sino además a elevados niveles de etanol, lo que propicia la lentitud del

proceso así como la aparición de enlentecimientos y paradas fermentativas.

El mosto de uva es un medio nutritivo bastante completo, pero teniendo en cuenta su bajo

pH, su alto contenido en azúcar y uno relativamente bajo en nitrógeno asimilable, se impone

una fuerte selección de la microbiota y sólo unas pocas especies de levaduras y bacterias

pueden proliferar.

Para asegurar una correcta fermentación se emplean desde hace décadas los cultivos

iniciadores y para apoyar su buena finalización, se usan "activadores metabólicos", los cuales

pueden adicionarse de forma directa al mosto, bien al inicio, 1/3 o al final del proceso

fermentativo, constituyendo una práctica habitual en enología. Otra forma de adición menos

estudiada consiste en añadir estos compuestos al agua de rehidratación de la levadura seco-

activa, si bien ya existen preparados comerciales complejos disponibles, como Super start

(Lafort®), Go Ferm o Go Ferm Protect (Fermentis®) se desconoce el efecto que puede tener la

adición de determinadas moléculas o compuestos simples que, por sus características

fisiológicas o por su intervención en rutas metabólicas clave, podrían suponer ventajas durante

la fermentación ya que influyen en la fisiología celular, siendo además susceptibles de mejorar

finales de fermentación difíciles.

Analizar el efecto que tiene la adición de activadores novedosos, al agua de rehidratación

de las levaduras, optimizando su dosis y diseñando las formulaciones más adecuadas son retos

insuficientemente abordados en la actualidad y que pueden conducir a resultados relevantes y

con una aplicación práctica en enología.

Lista de Abreviaturas

Lista de abreviaturas


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2. LISTA DE ABREVIATURAS

ADN: ácido desoxiribonucleico.

ARN: ácido ribonucleico.

ARNm: ARN mensajero.

DO: densidad óptica.

DT: tiempo de detección (Detection Time).

FA: ácido graso (Fatty Acid).

FAN: nitrógeno amínico libre (Free Amino Nitrogen).

GC: cromatografía de gases (Gas Chromatography).

GLK: glucoquinasa (GLucoKinase).

hL: hectólitro.

HPLC: cromatografía líquida de alta resolución (High Performance Liquid Chromatography).

HPTLC: cromatografía en capa fina de alta resolución (High Performance Thin Layer

Chromatography).

HXK: hexo- quinasa (HeXoKinase).

HXT: genes transportadores de hexosas (HeXose Transporter genes).

Km: constante de Michaelis- Menten.

LSA: Levaduras Secas Activas.

LSI: Levaduras Secas Inactivas.

NAD: nicotín- amida dinucleótido.

NCBI: centro nacional de información biotecnológica (National Center for Biotechnology

Information).

NFA: nitrógeno fácilmente asimilable.

NL: lípidos neutros (Neutral Lipids).

PA: ácido fosfatídico (Phosphatidic Acid).

Pb: pares de bases.

PC: fosfatidilcolina (PhosphatidylCholine).

PCA: Análisis de componentes principales (Principal Component Analysis).

PCR: reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction).

PE: fosfatidiletanolamina (PhosphatidylEthanolamine).

Lista de abreviaturas


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PI + PS: fosfatidilinositol + fosfatidilserina (PhosphatidylInositol + PhosphatidylSerine).

PL: fosfolípidos (PhosphoLipids).

qRT-PCR: Retro Transcriptasa- PCR cuantitativa (quantitative Retro Transcriptase PCR).

ROS: especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxygen Species).

r.p.m.: revoluciones por minuto.

SOD: superóxido- dismutasa.

TAG: triacilglicerol.

ufc: unidades formadoras de colonias.

YM: extracto de levadura, extracto de malta (Yeast Malt).

YPD: extracto de levadura, peptona y dextrosa (Yeast extract, Peptone, Dextrose).

Introducción

Introducción


11

3. Introducción

La Microbiología enológica tiene su origen en los estudios de Louis Pasteur, quien en 1858

demostró que las levaduras eran las responsables de la fermentación alcohólica del mosto y

que ciertas especies de bacterias eran causantes del deterioro de los vinos. Desde entonces la

Microbiología de la vinificación ha sido ampliamente estudiada y se ha revelado la complejidad

de las dinámicas poblaciones de especies de levaduras y de bacterias lácticas, sobre todo a

raíz de la utilización de las herramientas que ha proporcionado la biología molecular.

Saccharomyces cerevisiae es la especie de levadura que ha sido empleada empíricamente

desde tiempos muy antiguos en la obtención de bebidas alcohólicas en cultivo sumergido.

En las últimas décadas, algunas bodegas han usado cultivos puros o mezclas de levaduras

aisladas de sus propios mostos en fermentación, con la convicción de que una mejor

adaptación de las cepas al entorno ecológico puede beneficiar la calidad del vino y que éste

mantenga las peculiaridades sensoriales típicas bajo el denominado concepto de terroir.

La obtención de un producto de calidad, que sea predecible y reproducible campaña tras

campaña es un objetivo primordial de cualquier bodega. Para ello, además de la calidad de la

uva, hay que considerar los problemas intrínsecos y extrínsecos que pueden surgir a lo largo

del proceso fermentativo.

3.1. Cultivos iniciadores: Levaduras seco- activas

Para la obtención de vinos de calidad son deseables unos criterios comunes que permitan

ofrecer un producto característico y sometido a las menores desviaciones cualitativas posibles.

La necesidad de asegurar un buen proceso fermentativo así como la calidad del producto, ante

el hecho de que hay un gran número de variables que intervienen en una fermentación

espontánea, ha generalizado el uso de las levaduras seco- activas (LSA), desde hace ya varios

lustros. Se prefiere normalizar la microbiota inicial mediante el empleo de un cultivo iniciador,

de manera que una única cepa de levadura, conocida y controlada sea la responsable de la

etapa fermentativa en vinificación. Además de evitar desviaciones de calidad y normalizar el

proceso fermentativo, su empleo redunda en la consecución de características específicas,

tanto tecnológicas como sensoriales, genuinas. En los últimos años se ha ido un poco más allá

y en la actualidad se comercializan cultivos iniciadores no- Saccharomyces que, inoculados de

forma secuencial, mejoran la complejidad del vino.

Por otra parte, algunos viticultores y enólogos defienden que la práctica de fermentaciones

espontáneas permite obtener un vino con un estilo y calidad distintivos, y que la mezcla de

diferentes poblaciones de levadura permite no sólo la transformación del azúcar en alcohol sino

la obtención de otros metabolitos finales que aportan al vino mayor complejidad. Sin embargo,

en ocasiones esta biodiversidad da lugar a fermentaciones lentas e incluso paradas de la

fermentación, mientras que la presencia de un número pequeño de cepas dominantes se

caracteriza por una fermentación rápida y completa (Ribéreau-Gayon y col., 2001).

Introducción


12

Aunque los cultivos líquidos de levadura vínica se emplean desde 1930 (Instituto Laclaire,

Francia), las cepas deshidratadas no se produjeron hasta mediados de los años cincuenta,

cuando de forma independiente varios laboratorios europeos, canadienses y estadounidenses

llevaron a cabo una selección de cepas vínicas para su uso como inóculo en fermentaciones

dirigidas (Fleet and Heard, 1993). En 1965, Red Star Yeast (Universal Foods Corporation)

comercializó la primera levadura seco- activa vínica, en Estados Unidos (Fugelsang, 1996).

Actualmente se comercializan más de doscientas cepas diferentes distribuidas principalmente

por seis casas comerciales. La mayoría son cepas de S. cerevisiae y S. bayanus, y se

presentan en preparados comerciales que contienen en torno a 2∙1010 ufc/g; a esta

concentración, 20-40 gramos de LSA serían suficientes para inocular 1 hL de mosto.

Una de las ventajas de las LSA conservadas a temperatura ambiente es su estabilidad

genética, lo cual supone una ventaja económica para la industria en cuanto a costes de

transporte y almacenamiento, al ser su producción puntual, puesto que las necesidades en

levaduras panarias harían poco rentable una elaboración desestacionalizada.

Uno de sus inconvenientes respecto a las levaduras "frescas" extrusionadas o líquidas es

que presentan menor actividad, por lo cual se necesitan cantidades superiores (Rodríguez

Porrata y col., 2008).

El grado de eficacia en la implantación de las LSA dependerá de factores muy variados que

van desde la calidad industrial del preparado utilizado, donde influye la caducidad y

conservación, pasando por la cantidad de células vivas y su estado fisiológico después de la

rehidratación, hasta la competitividad propia de cada cepa de levadura frente a la población

autóctona presente en el mosto a fermentar. Otros factores clave son el transporte,

distribución, almacenamiento y el manejo por los operarios de la bodega por lo que respecta a

las condiciones de rehidratación.

Hoy en día el uso de cultivos iniciadores no solo se restringe a la elección de cepas con una

buena capacidad fermentativa sino las específicas para determinados procesos de vinificación

buscando unas características organolépticas determinadas propias de una variedad de mosto

y ajustadas al gusto del consumidor.

3.1.1. Producción de levaduras seco- activas

La adecuada producción industrial de los cultivos puros es crucial para asegurar la

pureza y la estabilidad de las características por las que se seleccionaron.

Una de las materias primas utilizadas en la obtención de levaduras secas son las melazas,

normalmente mezclas de caña de azúcar y de remolacha, ya que además de ser un medio rico

en fuente de carbono (50-65% de sacarosa), es relativamente económico, factor relevante en

los procesos industriales. En cambio, las melazas son pobres en nutrientes básicos para la

célula como el nitrógeno, fósforo y magnesio, deficiencia que se corrige adicionando sales de

amonio, urea, ácido fosfórico y sulfato de magnesio. También se hace necesario

suplementarlas con vitaminas, principalmente con biotina (Ough, 1992), ya que las levaduras

son incapaces de sintetizarla, tiamina y ácido pantoténico.

Introducción


13

Figura 1. Esquema del proceso industrial de obtención de LSA. (HR: Humedad Relativa). Garre, 2008.

La metodología de preparación y propagación del cultivo iniciador es una etapa crucial

para la estabilidad de las levaduras (Fugelsang, 1997). Ambos procesos se realizan en

condiciones aeróbicas para obtener una mayor cantidad de biomasa, ya que la ausencia de

oxígeno da lugar a la fermentación de los azúcares, produciendo etanol y dióxido de carbono.

Un cultivo puro de la levadura se escala en primer lugar en el laboratorio entre 2 y 4 días

(Figura 1). Posteriormente se siguen una serie de etapas consecutivas on batch realizadas en

condiciones estériles, en fermentadores en escala creciente y con alta aireación. El número de

etapas dependerá de la cantidad de levadura a producir. Finalmente, la denominada "fase

comercial" se lleva a cabo para aumentar la estabilidad en el almacenamiento y maximizar así

el rendimiento, lo que se logra manipulando parámetros como el pH, aireación y velocidad de

alimentación del medio.

El aspecto más crítico de la fermentación on batch es la tasa de alimentación con el

sustrato, puesto que constituye el punto de control del crecimiento de las levaduras. Cuando

hay un exceso de azúcar residual en el medio se produce el efecto conocido como Crabtree,

que es el resultado de una represión del catabolismo por glucosa. Así, Saccharomyces sp.

metabolizará la glucosa oxidativamente hasta un cierto porcentaje, a partir del cual comenzará

a formar etanol (Ribéreau-Gayon, 2000). Por ello, la tasa de crecimiento específico debe estar

por debajo del punto de producción de etanol, para que el rendimiento biomásico de la

levadura no decrezca (Cannizzaro y col., 2004).

Finalmente tiene lugar una "maduración" de la levadura, mediante el control del aporte de

medio de cultivo y mantenimiento de una aireación muy suave, durante un breve periodo de

tiempo. Esta etapa proporciona una población de células pobre en nitrógeno y fósforo, y

provoca una serie de mecanismos de respuesta que incrementa el contenido intracelular de

Introducción


14

trehalosa y glucógeno, así como de proteínas de protección frente al estrés (chaperonas),

requisitos indispensables para resistir bien el proceso de secado (Suárez, 1997).

Las células recuperadas y concentradas se mezclan con emulsionantes, que impiden la

absorción de agua y facilitan el extrudido, sometiéndose a continuación a un proceso de

secado durante un periodo comprendido entre 0,5 y 4 horas en un desecador de lecho fluido.

Este proceso tiene un gran impacto sobre la composición genética y la tolerancia al etanol,

influyendo por tanto en la etapa fermentativa.

Las levaduras secas se pueden envasar en diversos formatos, aunque el más empleado es

a vacío o en atmósfera de nitrógeno, lo que les proporciona una vida útil comprendida entre 1

y 2 años a temperatura ambiente. Durante el almacenamiento, es importante evitar el

contacto con el oxígeno y preservarlas de la luz, así como mantener una humedad del 7 - 8%

para que conserven su vitalidad y viabilidad durante un tiempo prolongado (Mejías y col.,

1998) y evitar estrés oxidativo así como daños a nivel de membrana por oxidación lipídica.

3.1.2. Reconstitución celular: rehidratación

En bodega sólo se puede actuar en la rehidratación de las LSA, por ello un protocolo

adecuado de revitalización-rehidratación es esencial ya que influirá en el proceso de

vinificación, pudiendo evitar paradas o enlentecimientos fermentativos, la aparición de aromas

anómalos y/o cualquier parámetro directa o indirectamente relacionado con la población de

levaduras.

En la rehidratación las LSA recuperan el agua que perdieron durante la desecación

industrial. Esta etapa es fundamental para que las células vuelvan a ser funcionales y

fermenten los azúcares del mosto de manera eficaz. Permite a las células recuperar su

actividad metabólica así como la funcionalidad de sus membranas, facilitando un rápido inicio

de la fermentación alcohólica. Una adecuada rehidratación, minimizando los daños a nivel de

membrana plasmática así como la pérdida de componentes intracelulares repercutirá en la

viabilidad y la vitalidad de las células (Poirier y col., 1999).

Existen distintos protocolos de reconstitución celular, supeditados al criterio de los

enólogos. Monk (1986) demostró que la rehidratación a 37-40ºC suponía una viabilidad que

rondaba el 100% comparada con el 40-50% que se alcanzaba a 15ºC, diferencia que se

atribuyó al tiempo que necesitaba la membrana celular en recuperar su funcionalidad. A una

temperatura óptima, el tiempo idóneo es de 20 minutos; no debe exceder de 30 (Fugelsang,

1997), ya que las células reactivadas comienzan a consumir los nutrientes acumulados, con el

riesgo de que éstos se agoten y la consiguiente pérdida de actividad celular.

Algunos protocolos recomiendan el uso de mezclas de agua y azúcar o de agua y mosto

(1:1), aunque este último no es muy recomendable debido a la posible presencia de

inhibidores.

Recuperada la fluidez de la membrana y antes de su inoculación, es necesario ajustar la

temperatura de la suspensión mediante la adición de pequeñas cantidades de mosto, de modo

que el salto térmico no sea superior a 5-10 ºC entre la levadura rehidratada y el mosto a

Introducción


15

fermentar. Es recomendable que la temperatura del mosto no sea inferior a 18 ºC para evitar

fases de latencia prolongadas (Suárez, 1997). Una fermentación efectiva requiere disponer de

una población mínima inicial de 1- 3 x 106 células viables/mL, debiéndose emplear para ello

dosis de inóculo de unos 20- 40 g/hL. Una densidad poblacional inferior aumentaría el periodo

de latencia, favoreciendo el crecimiento de la microbiota competitiva (Fugelsang, 1997).

El proceso de deshidratación-rehidratación es traumático para la célula ya que pierde

materia vital esencial, como nucleótidos, iones y algunos componentes celulares solubles

(Rapoport y col., 1995); sin embargo, si las condiciones de crecimiento son óptimas la mayoría

de las células rehidratadas conservan su capacidad de reproducirse (Rodríguez Porrata y col.,

2008).

La trehalosa y el glicerol actúan como agentes protectores ante distintos niveles de

estrés; así Li y col. (2009) estudiaron los niveles de ambos y los perfiles de expresión génica

implicados en su metabolismo en una cepa de S. cerevisiae (XQ1) sometida a estrés térmico,

osmótico (sorbitol) y a etanol. Los resultados mostraron que los genes implicados en la síntesis

y degradación de trehalosa y glicerol se inducían ante situaciones de estrés, y que se

sintetizaban de forma simultánea durante las etapas iniciales de los diversos tratamientos:

temperaturas de 30 o 42ºC, presencia o ausencia de sorbitol 1M y 6% v/v etanol. El glicerol se

acumuló mayoritariamente bajo estrés osmótico, además este compuesto aumentó la

estabilidad de las enzimas termolábiles.

Por último, un factor a considerar es el momento de la adición de LSA ya que ello permite

minimizar los riesgos de un levadurado ineficaz habiendo enólogos que prefieren su adición al

principio, mientras que otros optan por dejar un tiempo para el desarrollo de la microbiota

espontánea.

3.2. Parámetros que definen el estado de las levaduras durante el proceso

fermentativo.

Para que una población seleccionada de levaduras seco-activas se implante hay que

conseguir un número suficiente de células vivas y en buen estado fisiológico, lo cual

repercutirá en la fermentación alcohólica.

Ninguno de los beneficios de los cultivos iniciadores podría darse si éste no se encuentra en

buenas condiciones fisiológicas para que comience rápidamente su crecimiento.

La viabilidad y vitalidad celular proporcionan una idea precisa de la fisiología celular;

asimismo, los estudios de cinética también permiten evaluar el comportamiento de las

levaduras durante la fermentación alcohólica: la determinación de parámetros como la

producción de CO2, consumo de azúcares reductores, medida del área bajo la curva a un

tiempo y temperatura prefijados, velocidad específica de crecimiento, tasa de producción de

CO2 (vitalidad), o la asíntota o valor máximo de la ordenada ayudan a definir la bondad de las

levaduras.

Introducción


16

3.2.1. Vitalidad, viabilidad y cinética fermentativa.

La vitalidad celular se define como la capacidad para desprender CO2 por unidad de

tiempo en un momento determinado (Rodríguez Porrata y col., 2008).

El metabolismo microbiano utiliza nutrientes que son moléculas pequeñas como

monosacáridos y aminoácidos como fuentes de Carbono y Nitrógeno, dando lugar a

compuestos ionizados de menor peso molecular. Éstos, o sus productos de disociación pueden

alterar la conductividad de un líquido, lo cual provoca una variación en su resistencia eléctrica,

o la inversa, denominada impedancia. Si se aplica una corriente eléctrica, la suma de la carga,

capacitancia y la inducción magnética o inductancia entre electrodos en contacto con la matriz

o impedancia directa, o bien en contacto con una disolución que varía su impedancia fruto de

la actividad de la otra matriz o impedancia indirecta. En este último caso, el CO2 producido por

las células es absorbido por una disolución de hidróxido potásico, produciéndose carbonato

potásico que aumenta la impedancia de la solución. Este parámetro permite determinar la

microbiota de la muestra así como su nivel de actividad de la microbiota presente en ella.

Normalmente esta metodología se utiliza para determinar la contaminación presente en un

alimento, aunque en este trabajo de investigación se empleó para estudiar la vitalidad de las

distintas muestras, fijando la población, con el objetivo de caracterizar la influencia de las

condiciones ensayadas, en la vitalidad celular.

La viabilidad del inóculo, definida como la capacidad de reproducción, depende de la cepa

utilizada, envasado, tiempo y condiciones de almacenamiento, dosis de levadura seca

(especialmente del proceso de rehidratación seguido) y está relacionada con parámetros como

la presión osmótica (Scott, 1957; Esener y col. 1981), la temperatura (Walton y Pringle 1980;

Hottiger y col. 1987; Suutari y col. 1990) y otros como la tasa de crecimiento (Beney y col.,

2001; Gervais y col. 1992).

El tiempo necesario para iniciar la fermentación, o fase de latencia, dependerá de la

viabilidad y actividad de las levaduras inoculadas. Ésta a su vez, de factores como las

condiciones de producción, almacenamiento, rehidratación, o las características del mosto a

fermentar (Henschke, 1991).

La composición del mosto juega también un importante papel, ya que la relación de

azúcares (Leslie y col., 1995) y aminoácidos (Kets y de Bont, 1994) determinan la resistencia

al estrés fermentativo. La cantidad de nitrógeno en el mosto para asegurar una correcta

fermentación es de al menos 1mg por cada g de azúcar. Asimismo, la viabilidad de las

levaduras es especialmente sensible a las bajadas bruscas de temperatura (Strange, 1976;

Calcot y Rose 1982).

Introducción


17

Durante el crecimiento de una levadura en un proceso discontinuo se pueden distinguir

varias fases (Figura 2) (Walker, 1998):

A. Fase de latencia o período de adaptación de la levadura a un nuevo entorno

(nutrientes, temperatura, pH, etc.): durante esta fase, el número de células

permanece constante, o incluso disminuye. Su duración depende del tamaño del

inóculo y del estado fisiológico de las levaduras.

B. Fase de aceleración: se produce cuando comienza la división activa de las células,

estas entran en una fase de aceleración antes comenzar la etapa exponencial.

C. Fase exponencial: representa un periodo de crecimiento logarítmico y constante.

Se intensifica la actividad metabólica así como el número de divisiones celulares

(mitosis), aumentando en progresión geométrica. Su duración depende de la

especie de levadura y de las condiciones ambientales.

D. Fase de deceleración: los nutrientes comienzan a ser escasos, alcanzándose un

equilibrio entre células no viables y células viables que aún se siguen dividiendo, de

manera que la biomasa permanece relativamente constante. La velocidad de

crecimiento va disminuyendo progresivamente, hasta anularse por completo.

E. Fase estacionaria: Se detiene el crecimiento celular por completo. Al agotarse los

nutrientes, las levaduras comienzan a sintetizar metabolitos secundarios, algunos de

los cuales pueden ser perjudiciales para la propia levadura. Al finalizar esta fase se

produce la muerte y lisis celular y el número de individuos no viables supera a los

viables. Se produce una disminución constante del número de células vivas hasta su

total desaparición.

Figura 2. Curva de crecimiento típica de levaduras. La figura muestra las fases de crecimiento de una levadura

en un cultivo en discontinuo. µmax es la tasa máxima de crecimiento y tD es el tiempo de duplicación Hough (1985).

Introducción


18

En los estudios de cinética fermentativa, se hace necesario aplicar un modelo con un

buen ajuste. Zwietering y col. (1990) compararon algunas funciones sigmoidales (ajuste

Losgístico, Gompertz, Richards, Schute o Stannard) con el objetivo de describir una curva de

crecimiento microbiano con un buen ajuste estadístico (Tabla 1).

Tabla 1. Algunos modelos de crecimiento usados en la literatura Zwietering y col. (1990).

La ecuación modificada de Gompertz sirvió para describir el crecimiento de

Lactobacillus plantarum; fue la que mejor se ajustó al crecimiento de distintos

microorganismos, adaptándose al 70% de aquellos diferentes de Lactobacillus plantarum.

Las distintas fases del crecimiento microbiano pueden ser definidas por tres parámetros: la

duración de la fase de latencia λ (dependiente del estado fisiológico de las células,

composición del mosto y concentración inicial de levaduras), el valor de asíntota A o máximo

alcanzado y la tasa máxima de crecimiento, µmax, dependiente únicamente de las

condiciones del medio de cultivo y que se estima ajustando los datos experimentales a una

curva exponencial cuya pendiente nos dará el valor buscado (Figura 3).

Figura 3. Curva de crecimiento microbiano Zwietering y col. (1990)

Zwietering y col. (1990) diseñaron un modelo de ajuste modificando la ecuación de

Gompertz (1825) [1]:

[1] y = A. exp {-exp [(µmax∙e/A)∙(λ-t) +1]}

y = pérdida de peso (g) a tiempo t (h).

µmax = tasa máxima de crecimiento (h-1); tangente al punto de inflexión de la curva.

λ = fase de latencia (h), intersección de la tangente con el eje x.

A= pérdida de peso máxima o valor asintótico (t ∞).

Introducción


19

Dicho modelo se ajusta adecuadamente al crecimiento de S. cerevisiae por lo que fue elegido

para los estudios cinéticos de esta Tesis Doctoral.

3.3. Factores de crecimiento y supervivencia: activadores metabólicos de la

fermentación

Pese a las buenas características de las levaduras seco-activas comerciales, su inoculación

no garantiza su implantación durante la fermentación alcohólica, lo cual puede atribuirse a

distintos factores como el choque térmico, estrés osmótico, rehidratación prolongada o la

competencia que ejercen las cepas autóctonas, entre otros (Barrajón y col., 2009). Las

mismas compañías productoras de LSA en previsión de estos problemas, comercializan algunos

de los llamados activadores metabólicos de la fermentación: factores de crecimiento

que afectan a la multiplicación celular y, factores de supervivencia que la levadura no es

capaz de biosintetizar en condiciones de anaerobiosis (Rodríguez- Porrata y col., 2010).

3.3.1. Factores de crecimiento

Los factores de crecimiento afectan a la actividad y multiplicación celular, aún en

concentraciones pequeñas, siendo indispensables para las levaduras, y su deficiencia afecta

negativamente al metabolismo celular. Las levaduras presentan distintos requerimientos en

relación a dichos factores. Algunas los pueden sintetizar completa o parcialmente; sin

embargo, otras presentan auxotrofías a estos compuestos.

Ejemplos de factores de crecimiento son las vitaminas, el nitrógeno fácilmente asimilable

(NFA) (que comprende el nitrógeno amoniacal y ciertos aminoácidos) las sales minerales y las

levaduras inactivas o cortezas de levadura. Estos últimos además son antioxidantes y

detoxificantes de ácidos grasos de cadena intermedia.

Las vitaminas son componentes esenciales de coenzimas involucrados en reacciones

metabólicas. Guerzoni y col. (1989) destacaron su influencia en la eficiencia de la

fermentación, siendo incluso más importante que las fuentes de nitrógeno. Esto se debe a que,

a pesar de que el mosto presenta un contenido adecuado en vitaminas, el proceso

fermentativo lo altera de forma significativa. Las levaduras sintetizan parcial o totalmente sus

vitaminas, con alguna excepción como la biotina (Ough, 1992), o la tiamina, que disminuyen

drásticamente su concentración al ser consumida por la célula (Ribéreau-Gayon y col., 2000).

La vitamina C o ácido L- ascórbico actúa como un secuestrador de especies reactivas de

oxígeno (ROS), potenciando la protección celular frente al daño oxidativo. Mientras que la

mayoría de eucariotas sintetizan este compuesto, las levaduras producen ácido eritro-

ascórbico en su lugar. Branduardi y col. (2007) modificaron genéticamente varias cepas de S.

cerevisiae con el objetivo de inducir la síntesis endógena de ácido ascórbico, consiguiendo

aumentar la resistencia al estrés oxidativo, a bajos pH y a los ácidos orgánicos débiles.

Además comprobaron que a mayor cantidad de ácido ascórbico, mayor tolerancia al estrés

fermentativo y oxidativo, mayor viabilidad y mejores tasas de crecimiento.

Introducción


20

El ácido tetrahidrofólico (FH4) es un derivado del ácido fólico (vitamina B9), coenzima en

un gran número de reacciones enzimáticas, es intermediario en el metabolismo de

aminoácidos y ácidos nucleicos. Actúa como donante de grupos químicos con un átomo de

carbono (metilo, formilo, metileno y formimino), obtenidos mediante el secuestro del

formaldehído producido en otros procesos (Mathews y col., 2002).

En cuanto al nitrógeno, se acepta que su presencia en el mosto afecta al crecimiento y

metabolismo de las levaduras, ya que es el segundo nutriente más importante para las mismas

(Jiranek y col., 1989) y su déficit uno de los causantes de las paradas de fermentación

(Bisson, 1999). Saccharomyces sp. es capaz de sintetizar aminoácidos, pero la adición de

nitrógeno amínico estimula más su crecimiento que el nitrógeno amoniacal. Una mezcla de

aminoácidos e iones amonio es más efectiva, pero han de ser transportados al interior de la

célula mediante permeasas. La eficacia de este mecanismo de transporte depende de la

concentración de esteroles y ácidos grasos insaturados de la membrana (David y Kirsop,

1972), que está influida a su vez por el contacto con el oxígeno y los tratamientos de

clarificación. Por tanto, la concentración intracelular de nitrógeno no sólo depende del

contenido en el mosto, sino también de la eficiencia de los sistemas de transporte de la célula,

así como de la regulación de los sistemas metabólicos (Castor, 1953; Ribéreau-Gayon y

Peynaud, 1966).

Por último, el nitrógeno aumenta la producción de biomasa y estimula la tasa de utilización

del azúcar. La adición de este compuesto durante la fase exponencial de crecimiento da lugar a

una población celular máxima, en cambio, las adiciones durante la fase estacionaria no tienen

efecto en la misma, pero aumenta la tasa de fermentación, reduciendo por tanto la duración

del proceso (Bely y col., 1990).

El glutatión es un tripéptido de defensa de naturaleza no- enzimática. Interviene en la

actividad de varias enzimas como la glucosa 6- fosfato deshidrogenasa y glutatión- reductasa.

Por otra parte, su deficiencia favorece la oxidación y peroxidación lipídica. (Penninckx y col.,

2002). De Souza y col. (2003) analizaron su papel en la supervivencia de las levaduras

durante la deshidratación, concluyendo que este compuesto juega un importante papel como

protector de membrana además de participar en el mantenimiento del equilibrio redox ante la

falta de agua, favoreciendo la tolerancia al estado de desecación.

La influencia del calcio y el magnesio en la resistencia a la deshidratación en S. cerevisiae

ha sido estudiada por Trofimova y col., 2010, quienes concluyeron que ambos iones podrían

incrementar la tolerancia al estrés de la deshidratación y contribuían a estabilizar de las

membranas celulares en la rehidratación.

Finalmente, el ácido pirúvico o piruvato es un alfa- ceto- ácido que interviene en

numerosas de reacciones metabólicas. Su descarboxilación y posterior deshidrogenación,

mediadas por piruvato descarboxilasa y alcohol deshidrogenasa, respectivamente, da lugar a la

formación de etanol (Mathews y col., 2002). Yu y col. (2012) estudiaron la mejora en la

producción de etanol mediante la sobre-expresión de genes implicados en la conversión de

piruvato a etanol en S. cerevisiae usando glicerol como sustrato. En la actualidad no ha sido

Introducción


21

utilizado para aumentar la tolerancia al estrés y podría resultar positivo para las levaduras en

el proceso fermentativo, por lo que se propone como posible activador metabólico de la

fermentación.

3.3.2. Factores de supervivencia

La noción de factores de supervivencia complementa a la de factores de crecimiento. Se

trata de esteroles, ácidos grasos y lípidos cuya adición no afecta al crecimiento celular en las

primeras fases de la fermentación, pero sí mejora significativamente su supervivencia en las

últimas etapas, y además están relacionadas con la tolerancia al etanol (Reed y

Nagodawithana, 1988). Son especialmente importantes en las fermentaciones difíciles, con

mostos que contienen una gran concentración de azúcar y/o pobres en nitrógeno asimilable.

Generalmente, la presencia de este tipo de moléculas en el mosto está asegurada debido a su

abundancia en la cera de la piel de la uva, donde se localizan el ergosterol, el lanosterol, el

colesterol y el ácido oleanoleico (Radler, 1968). Este último así como la oxitocina aumentan la

viabilidad de las células y prolongan su actividad fermentativa (Lafon-Lafourcade y col., 1979).

En anaerobiosis, los esteroles son indispensables para las levaduras porque en estas

condiciones no pueden sintetizarlos. Aunque al inicio del proceso, las levaduras posean

suficientes esteroles; en mostos con elevadas concentraciones de azúcar, se alarga el periodo

de fermentación y sus reservas se agotan; su adición alivia esta deficiencia durante la fase

estacionaria y de declive y mejora el intercambio entre las células y el medio, manteniendo su

actividad fermentativa durante un periodo de tiempo más largo (Larue, 1980).

El ergosterol es uno de los componentes principales de las membranas celulares

eucariotas, constituye entre el 90 y el 98% (Zinser y col., 1993), y es responsable en gran

medida de sus características físicas. Se sintetiza a nivel de retículo endoplásmico desde donde

será transportado a la membrana plasmática. Se le atribuyen bondades como un aumento de

la actividad fermentativa, mejora en la viabilidad celular, favorece una correcta finalización de

fermentación alcohólica además de aumentar la permeabilidad y fluidez de membrana

(Landolfo y col., 2010). Saccharomyces sp. es auxótrofo a este compuesto en ausencia de

oxígeno, por lo que en condiciones de anoxia lo toma del ambiente y lo transporta hasta el

retículo endoplásmico, donde se esterifica y se almacena en gotas lipídicas (Zinser y col.,

1993). Alteraciones en el ergosterol de membrana afectan a la permeabilidad de aminoácidos,

cationes, azúcares y nucleótidos en las levaduras (Prasad, 1985).

Los ácidos grasos de membrana juegan un importante papel respecto a la tolerancia ante

el estrés. You y col. (2003) mostraron los efectos beneficiosos de los monoenos de la fracción

fosfolipídica sobre la viabilidad celular: un aumento en el contenido de ácido oleico mejoró de

forma notable la tolerancia de la membrana frente al etanol. Landolfo y col. (2010)

encontraron que la adición de ergosterol y ácido oleico aumentaba la viabilidad celular y la

actividad superóxido dismutasa (SOD), lo cual confirmó la hipótesis de que la suplementación

de lípidos mitiga el estrés y el daño oxidativo en cepas vínicas de S. cerevisiae en condiciones

desfavorables.

Introducción


22

El manganeso II es un metal de transición esencial que entre otras funciones protege de

procesos de estrés oxidativo (McNaughton y col., 2010), actúa como cofactor de enzimas

(SOD, RNA sintetasa, piruvato cocarboxilasa y arginasa) y también está relacionado con la

glutamina sintetasa y piruvato carboxilasa. A concentraciones suficientes, activa la síntesis de

proteínas y de tiamina, y aumenta la biomasa celular (McNaughton y col., 2010).

El glicerol es el tercer constituyente del vino después del agua y el etanol; sus

concentraciones varían entre 5 y 10 g/L. Está implicado en la osmoregulación (Ansell y col.,

1997; Nevoigt y Stahl, 1997) así como en la tolerancia a bajas temperaturas (Izawa y col.,

2004) y le confiere al vino el "cuerpo" que se traducirá en una sensación untuosa en boca.

3.3.3. Activadores comerciales

En la actualidad hay algunos activadores comerciales que generalmente se adicionan

directamente al mosto. Un ejemplo de estos activadores sería Goldcell® LIS XP (Biorigin), a

base de levadura inactiva, rico en aminoácidos, vitaminas y minerales.

Los activadores añadidos al agua de rehidratación están menos estudiados, aunque algunas

multinacionales ya comercializan algunos productos, los cuales se pueden añadir al inicio, 1/3

y al final de la fermentación, en función del preparado y objetivo deseado. Uno de ellos es el

denominado Super start (Lafort®), el cual asocia factores de crecimiento y de supervivencia,

siendo rico en esteroles, vitaminas, cortezas y ácidos grasos. Fermentis® con Go Ferm®,

producido a partir de biomasa de levadura, o Go Ferm Protect®, un protector rico en

microprotectores y micronutrientes biodisponibles.

Está ganando interés el uso de preparaciones comerciales que incluyan en su composición

productos procedentes de las levaduras. Este tipo de preparados se obtienen a partir de S.

cerevisiae tras su inactivación térmica o enzimática, una vez que se ha crecido en medios

concentrados y ricos en azúcares (Pozo-Bayón y col., 2009).

Dependiendo del método de obtención, las preparaciones pueden clasificarse en cuatro

tipos principales:

a) Levaduras inactivas, obtenidas por inactivación térmica y posterior secado.

b) Autolisados de levaduras, en los que además de la inactivación térmica hay un paso de

incubación en el que se permite a los enzimas de la levadura ser liberados de las vacuolas y

degradar parte del contenido intracelular.

c) Paredes o cortezas de levaduras, insolubles y formadas por las paredes de levadura sin

contenido citoplasmático.

d) Extractos de levadura o extracto soluble que se obtiene tras la degradación total del

contenido citoplasmático.

De ellos los más usados son las cortezas de levadura, ya que aportan un efecto positivo en

la tasa de fermentación así como en la duración del proceso (Soubeyrand y col., 2005; Pozo-

Bayón y col., 2009).

Otro tipo de preparados a base levaduras inactivas que se comercializan actualmente son

preparaciones de composición muy variable, que suelen incorporar levaduras inactivas y

Introducción


23

metabolitos procedentes de la autolisis (proteína, péptidos aminoácidos nucleótidos, ácidos

grasos) cuya concentración puede variar en función de las condiciones de cultivo; además

suelen contener paredes de levaduras, vitaminas y minerales. Todos estos productos son

actualmente suministrados por numerosas compañías biotecnológicas y/o enológicas, bajo

diferentes marcas comerciales, para un amplio espectro de aplicaciones enológicas con el

objetivo de mejorar la calidad de los vinos (Tabla 2).

Tabla 2. Ejemplos de algunos productos comerciales formulados a base de levaduras secas inactivas empleadas

en vinificación (Pozo- Bayón y col., 2009).

De entre todas estas preparaciones, las manoproteínas, que son el principal constituyente

de la pared de S. cerevisiae (25-50% de peso seco) han sido extensivamente estudiadas para

mejorar los procesos tecnológicos y las características sensoriales de los vinos. La pared

celular representa entre el 15 y el 25% de la materia seca total de la célula. Los principales

constituyentes de su estructura son polisacáridos, que suponen el 80-90% de la pared,

principalmente glucanos y mananos, y en menor proporción la quitina (Walker, 1998). Las

manoproteínas proporcionan un efecto protector durante la rehidratación de las LSA (indirecto)

y de estimulación de la fermentación alcohólica y maloláctica (directo). La pared celular no es

un elemento inerte, permite la entrada de nutrientes y la salida de productos de desecho.

Aunque la encargada de controlar este tránsito de compuestos es la membrana celular, es a

nivel de pared donde se discrimina que productos salen al exterior y cuales se mantienen en la

región periplásmica (Spencer y Spencer, 1997).

Una alternativa al empleo de estos preparados sería el uso de compuestos simples o

moléculas, que añadidos en cierta cantidad a pequeños volúmenes de agua podrían resultar

más efectivos, ya que la rehidratación es osmóticamente muy favorable para su ingreso en la

célula. Durante el proceso de hidratación de las levaduras secas activas, las células pueden

experimentar modificaciones bioquímicas y cambios estructurales (Beker y col., 1984) que

pueden dañar la membrana celular. Se ha demostrado que la rehidratación de las levaduras

secas activas en presencia de una cantidad relativamente grande de levaduras secas inactivas

(LSI) (100-200 g/L) aumenta la velocidad de fermentación y disminuye su duración (Dulau y

col., 2002). La liberación de fragmentos insolubles de las paredes de la levadura puede formar

agrupaciones de esteroles en forma de micelas que se podrían incorporar en las membranas de

Introducción


24

las levaduras secas activas reparando posibles daños. En medios de fermentación sintéticos, se

ha comprobado que la adición de 150 g/L de LSI añadidos durante la rehidratación sería

equivalente a la adición de 40 µL/L de ergosterol en el medio de fermentación.5 Por otro lado,

se ha sugerido que los ácidos grasos poliinsaturados (AGP) procedentes de las LSI podrían

actuar como agentes protectores reduciendo el choque osmótico de las LSA debido al elevado

contenido de azúcares en el medio y favoreciendo la adaptación metabólica de las células a las

nuevas condiciones (Caridi y col., 1999; Caridi, 2002).

3.4. Composición lipídica de membrana en levaduras

La membrana plasmática de S. cerevisiae posee en torno a 7,5 nm de grosor con

invaginaciones citoplasmáticas en algunas regiones. Es una bicapa lipídica con proteínas

globulares intercaladas formando un mosaico fluido (Figura 4). Se trata de una barrera

selectiva que controla los intercambios entre la levadura y el medio exterior. Su permeabilidad

es muy limitada, por eso la mayoría de los nutrientes entran en la célula a través de sistemas

específicos de transporte.

Contiene aproximadamente un 40% de lípidos cuya composición le confiere fluidez,

desempeñando un importante papel en la adaptación a distintos tipos y/o grados de estrés.

También cabe destacar su importancia en transporte y tolerancia a algunos compuestos

tóxicos como el etanol, el ácido acético, el acetaldehído y los ácidos grasos de cadena media

(Bisson, 1999).

Figura 4. Diagrama de la estructura de la membrana citoplasmática (Madigan y col., 2009).

La importancia de la composición lipídica de la membrana celular en respuesta adaptativa

es también relevante (Sajbidor, 1997), pequeñas alteraciones pueden modificar ciertas

funciones esenciales, como son el transporte o la permeabilidad a iones (Keenan y col., 1982;

Hazel y Williams, 1990).

Introducción


25

La composición lipídica en levaduras es extremadamente sensible a sus condiciones de

crecimiento. En un cultivo discontinuo las condiciones del medio van cambiando con cada

generación de células; el contenido total en lípidos de S. cerevisiae disminuye durante las

primeras etapas de crecimiento, ya que un porcentaje se utiliza como fuente de energía; sin

embargo al final de la fase exponencial se produce un aumento en la concentración de estos

compuestos (Prasad, 1985). También influyen otros factores como la temperatura o el tipo de

nutrientes durante su crecimiento: las levaduras muestran un mayor contenido en lípidos y un

mayor grado de insaturación cuando crecen a temperaturas por debajo del valor óptimo; se

requieren nutrientes inorgánicos como nitrógeno, fósforo, calcio o magnesio aunque el factor

que más influye en la acumulación de lípidos es el ratio Carbono: Nitrógeno. Por último, una

carencia en los ya mencionados factores de crecimiento se asocia a una alteración en la

composición lipídica (Prasad, 1985).

Existen diversas formas de clasificar los lípidos, una de ellas es en base a su polaridad:

apolares o neutros (ácidos grasos, acilglicéridos, esteroles) y polares (fosfolípidos,

glucolípidos).

3.4.1. Lípidos apolares o neutros

Los ácidos grasos mayoritarios que conforman la membrana lipídica son los insaturados

oleico (18:1) y palmitoleico (16:1) y los saturados, palmítico (16:0) y esteárico (18:0) (Daum

y col., 1998). Su empaquetamiento determina en gran medida la fluidez, de modo que a

menor grado de insaturación y mayor longitud de la cadena, mejora su empaquetado lo que

lleva a una estructura más ordenada y menos fluida; en cambio aquellas membranas cuyos

ácidos presentan un índice de insaturación elevado son más fluidas y se adaptan mejor a

condiciones adversas tolerando la presencia de etanol o las bajas temperaturas de

fermentación (Avery y col., 1996). El grado de insaturación de los ácidos grasos cobra gran

importancia en la fisiología de S. cerevisiae, ya que existe una relación directa entre la

estructura de estos compuestos, y el crecimiento celular, influyendo en gran medida tanto la

longitud de cadena, la posición, número y configuración de los dobles enlaces (Prasad, 1985).

Durante la fermentación alcohólica hay factores que alteran a la bicapa lipídica y/o a su

composición en ácidos grasos insaturados, como las bajas temperaturas de fermentación, la

disponibilidad de oxígeno, tasa de crecimiento, y la adición o no de esteroles. Estas

circunstancias modifican propiedades funcionales esenciales, especialmente en relación al

transporte selectivo de azúcares y aminoácidos (Henschke y Rose, 1991). S. cerevisiae

sintetiza ácidos grasos saturados y monoinsaturados de 16 y 18 átomos de carbono, pero no

poli-insaturados (PUFAs) (Yazawa y col., 2009). Durante la vinificación, la ausencia de oxígeno

suprime la desaturación de los ácidos grasos y la biosíntesis de esteroles, limitando la

capacidad celular para encarar los cambios ambientales drásticos que van a suceder

(Rodríguez-Vargas y col., 2006).

La membrana plasmática cobra especial importancia al considerar la fisiología de las cepas

industriales producidas en cultivo sumergido y agitado; se ha comprobado que aquellas

Introducción


26

membranas celulares enriquecidas en ácido linoleico (C18:2) y ergosterol presentan una

mayor tolerancia al etanol (Rose, 1993).

Los ácidos grasos se almacenan mayoritariamente en forma de triacilgliceroles (TAG),

esto es, triésteres de ácidos grasos y glicerol. Estos lípidos, de naturaleza apolar, constituyen

un reservorio energético para la síntesis de lípidos de membrana como la fosfatidiletanolamina

(Grillitsch y col., 2011). La síntesis de TAG en S. cerevisiae requiere la formación de sus

precursores ácido fosfatídico y diacilglicerol (DAG). Existen dos rutas biosintéticas principales

(Figura 5) que producen ácido fosfatídico a partir de los precursores glicerol 3- fosfato (G-3-P)

o dihidroxiacetona fosfato (DHAP) (Athenstaedt y Daum, 1999).

Figura 5. Formación de triacilgliceroles en S. cerevisiae (Müllner y Daum, 2004).

Las cadenas hidrocarbonadas de los ácidos grasos resultan eficaces para almacenar

energía, ya que contienen carbono en una forma totalmente reducida por lo que proporcionan

una cantidad máxima de energía con la oxidación (Mathews y col., 2002). Estos compuestos

junto con los ésteres de esteroles se almacenan en unos depósitos denominados partículas

lipídicas o gotas (LP- lipid particles); Grillitsch y col. (2011) estudiaron la relación entre

lipidoma de S. cerevisiae y su capacidad homeostática: los autores estudiaron la influencia de

la composición lipídica y proteica en estas partículas. El crecimiento de las células en presencia

de ácido oleico causó cambios en la levadura como la acumulación de TG a expensas de los

ésteres de esteroles, con un aumento en la cantidad de glicerofosfolípidos así como un mayor

nivel de insaturación, datos que confirman la hipótesis que se postulaba años atrás sobre la

capacidad que posee el lipidoma de la membrana celular para adaptarse a cambios

ambientales.

Los esteroles son esteroides con 27 a 29 átomos de carbono. Su estructura química deriva

del ciclopentanoperhidrofenantreno o esterano, una molécula de 17 carbonos formada por tres

anillos hexagonales y uno pentagonal. Pueden ser esterificados por dos tipos de enzimas:

Introducción


27

lecitincolesteroltransferasa (LCAT) y acil- CoA- colesterolaciltransferasa (ACAT) (Müllner y

Daum, 2004). ARE1P y ARE2P son proteínas pertenecientes a la familia ACAT cuya función es

catalizar la esterificación de los esteroles (Figura 6) (Müllner y Daum, 2004).

Los esteroles pueden usarse como sustratos además de como precursores del ergosterol

(Müllner y Daum, 2004). Su principal función es construir y mantener las membranas

eucariotas: regulando su permeabilidad y fluidez, la resistencia al etanol y la actividad de la

H+- ATPasa plasmática (Deytieux y col., 2005). Hay variables que afectan a la fluidez, como la

cantidad y estructura de los esteroles, o la naturaleza de los grupos polares de los fosfolípidos

(Hosono, 1992). Soubeyrand y col., (2005) observaron que los esteroles añadidos in situ

durante la rehidratación estimulaban la capacidad fermentativa de las células. Otro factor a

tener en cuenta es la presencia de oxígeno, imprescindible para la síntesis de esteroles y

ácidos grasos insaturados. En condiciones de anaerobiosis, S.cerevisiae acumula escualeno, ya

que en ausencia de oxígeno es incapaz de transformarlo en ergosterol (Prasad, 1985).

Figura 6. Formación de ésteres en S. cerevisiae, (Müllner y Daum, 2004).

3.4.2. Lípidos polares

Los fosfolípidos son compuestos de 1,2- diacilglicerol y un enlace fosfodiéster que une el

esqueleto del glicerol a algunas bases, como colina, inositol, serina y etanolamina. Los ácidos

grasos situados en la posición 1 son mayoritariamente saturados, mientras que los de la 2 son

insaturados. Poseen una parte polar o hidrófila de alcohol fosforilado, y otra no polar o

hidrófoba formada por dos cadenas paralelas de ácidos grasos, que se estructuran en la

membrana en forma de doble capa.

Estos compuestos confieren fluidez a las membranas (Walker, 1998), siendo los principales

la fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina y fosfatidilinositol, que representan entre un 70 y un

85% del total, existiendo además otros como fosfatidilserina o cardiolipina (Tabla 3). El

fosfatidilinositol podría estar relacionado con el estado de las levaduras durante el crecimiento

celular, ya que en ausencia de este compuesto, la división disminuye y se pierde viabilidad

Introducción


28

celular. Algunos fosfolípidos, que constituyen en torno al 10% del total, son liso- derivados de

los fosfolípidos principales, como el ácido fosfatídico, la fosfatidilmonometiletanolamina y la

fosfatidilmetiletanolamina (Prasad, 1985).

La mayoría de los fosfolípidos en levaduras están caracterizados por un elevado grado de

insaturación, sin embargo, la distribución posicional de los ácidos grasos varía dentro de la

misma o distintas especies de levaduras (Prasad, 1985).

Fosfolípido Porcentaje

Fosfatidilcolina 41,2

Fosfatidiletanolamina 18,5

Fosfatidilserina + Fosfatidilinositol 25,4

Cardiolipina 2,9

No caracterizados 12,0

Tabla 3. Composición fosfolipídica porcentual de membrana en S. cerevisiae (Prasad, 1985).

Cobran gran importancia en la estructura de las membranas lipídicas. Un único fosfolípido

como la fosfatidilcolina, podría formar estructuras de bicapa. También influyen en la

conformación de las proteínas de membrana, ya que los fosfolípidos juegan un importante

papel en el mantenimiento de la conformación nativa de las proteínas (Prasad, 1985).

3.5. Discrepancia entre el consumo de glucosa y fructosa en levaduras

El mosto de uva suele poseer cantidades equimolares de glucosa y fructosa (Flanzy y col.,

2003), aunque este factor es dependiente de parámetros como el momento de la vendimia o la

climatología. En el envero, la concentración de glucosa en la uva es normalmente superior que

la de fructosa (Boulton y col., 1996). Durante la maduración, los niveles de fructosa van

aumentando, con una disminución en el ratio glucosa- fructosa, alcanzando mayores

concentraciones de fructosa que de glucosa (Amerine y Thoukis, 1958; Kliewer, 1965; Kliewer,

1966; Snyman, 2006). Jolly (2007) determinó que las fermentaciones que se iniciaban con un

menor ratio glucosa- fructosa (menor de 0,8) tenían mayor probabilidad de sufrir una parada

fermentativa. Si bien las levaduras vínicas muestran una preferencia por la glucosa, lo cual

contribuye al acúmulo de fructosa, especialmente en las últimas etapas del proceso

fermentativo (Fleet, 1998). Si el ratio glucosa- fructosa es inferior a 0,1 la fermentación se

puede parar (Gafner y col., 2000). Se desconoce la base molecular de esa diauxia parcial, pero

se sabe que la discrepancia fructosa/glucosa es cepa-dependiente (Berthels y col. 2004).

Todas las cepas conocidas de S.cerevisiae comparten una mayor apetencia por glucosa

comparada con fructosa, relacionada con la preferencia por esta hexosa de las

correspondientes proteínas transportadoras (Berthels y col., 2004).

Introducción


29

Figura 7: Transferencia de glucosa y fructosa a la ruta glucolítica en S.cerevisiae.

La fermentación alcohólica implica la degradación de las hexosas por la vía glucolítica hasta

piruvato y, posteriormente, la actuación de la piruvato descarboxilasa y alcohol

deshidrogenasa, producen etanol como producto final de la fermentación, regenerando el

poder reductor, en forma de NAD+. En la glucólisis, glucosa y fructosa comparten dicha ruta

catabólica a partir de la fructosa 6- fosfato (Figura 7).

3.5.1. Transporte y fosforilación

Existen diferentes mecanismos de transporte a través de la membrana celular. En S.

cerevisiae se han identificado más de 20 genes implicados en transporte de azúcares, los

denominados transportadores de hexosas (HXT) (Özcan y Johnston, 1999), que codifican para

permeasas en difusión facilitada. HXT1-7 son las proteínas implicadas en el transporte de

hexosas, presentando diferente afinidad y actividad durante las distintas etapas del proceso

fermentativo (Luyten y col., 2002). La caracterización cinética de esos sistemas de transporte

indica que su Km (constante de Michaelis- Menten), variable en función del transportador que

se estudie, es siempre superior para la fructosa que para la glucosa (Reifenberger y col.,

1997), lo que se traduce en una menor afinidad para el primer azúcar y un mayor tiempo para

alcanzar la velocidad máxima de transporte. Los autores estudiaron diversos transportadores

de hexosas, y en todos ellos encontraron valores de Km superiores para fructosa que para

glucosa. Ese dato se traduce en que tanto los transportadores de alta como los de baja

afinidad poseen distinta preferencia/apetencia por glucosa que por fructosa. El valor de Km

para el transportador de baja afinidad HXT3 es aproximadamente 65mM vs. 125mM para la

Introducción


30

fructosa. La baja afinidad por la fructosa podría estar relacionada al hecho de que la glucosa se

transporte en forma de piranosa, mientras que la fructosa lo hace como furanosa (Heredia y

col., 1968).

La fosforilación de las hexosas a hexosas fosfato en el C6 es el primer paso en su

metabolismo y está presente en prácticamente todos los organismos, siendo clave en la

regulación del metabolismo fermentativo en levaduras.

Las hexoquinasas HXK1, HXK2 y la glucoquinasa GLK1, que catalizan la fosforilación de las

ceto- y aldo- hexosas, glucosa, fructosa y manosa a hexosa- 6- fosfato usan MgATP como

donador para la fosforilación. Con la excepción de la GLK1, las quinasas son inhibidas por sus

productos (Entian y Barnett, 1992). En general todas las enzimas de fosforilación de hexosas

de S. cerevisiae presentan cierta preferencia por la glucosa como sustrato; la GLK1

concretamente posee una afinidad 50 veces superior por la glucosa.

Las distintas cepas vínicas de S. cerevisiae presentan diferentes tasas de consumo de

glucosa y fructosa, lo cual se describe como discrepancia de consumo glucosa/ fructosa.

Los valores de Km para la fosforilación de las hexosas se correlacionan con los mencionados

valores de discrepancia (Berthels y col., 2008). Al inicio de la fermentación, el mosto suele

contener cantidades equimolares de glucosa y fructosa, lo cual se traduce en un ratio de

glucosa- fructosa aproximado de 1. A medida que avanza la fermentación, y ante un elevado

consumo de glucosa, crecientes concentraciones de etanol y falta de nutrientes, la fructosa se

convierte en el azúcar predominante (Schütz y Gafner, 1995).

La discrepancia entre el consumo de ambos azúcares aumenta rápidamente al inicio del

proceso, y va disminuyendo en las últimas etapas, siempre y cuando éste transcurra con

normalidad.

3.5.2. Expresión génica

Como ya se ha mencionado, el consumo de hexosas en Saccharomyces sp. está mediado

por transportadores específicos (HXT). HXT1 es un transportador de baja afinidad, con

elevada capacidad de transporte y se expresa ante elevadas concentraciones de glucosa o

fructosa, mientras que HXT2, de alta afinidad, con baja capacidad de transporte, se hace

necesario cuando los azúcares son escasos.

El resto de transportadores de hexosas han evolucionado para soportar distintas

concentraciones de azúcares bajo diferentes condiciones. La mayoría de los genes HXT se

expresan únicamente en condiciones muy específicas, mientras que HXT3, transportador con

un nivel de afinidad intermedia, se expresa tanto a niveles bajos como elevados de azúcares

(Johnston y Kim, 2005).

La glucosa puede modular la expresión de genes que regulan algunos aspectos del

metabolismo y crecimiento de la célula, actuando como una hormona de crecimiento, lo cual

incluye regulación a distintos niveles: transcripcional, post- transcripcional, traduccional y

post- traduccional (Johnston y Kim, 2005). La inducción de la expresión de los genes HXT es

una de las primeras respuestas de las células ante la presencia de glucosa (Kim y col., 2006).

Introducción


31

Los componentes centrales de la inducción de esta ruta son los sensores SFN3 y RGT2, que

detectan la presencia de glucosa extracelular mediante su unión a la glucosa, generando una

señal para la inducción de la expresión de los genes HXT (Özcan y col., 1998).

3.5.2.1. Cuantificación de la expresión génica

La reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction- PCR) es una técnica

muy utilizada en biología molecular debido a las aplicaciones que ofrece así como a su elevada

sensibilidad. Surgió a mediados de los años 80 gracias al premio Nobel Kary Mullis (Mullis,

1987) y en la actualidad existen muchas variantes.

Figura 8. Esquema de la Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa

(RT- PCR).

Se denomina RT-PCR (del inglés Reverse Transcription PCR) cuando se parte de ADN

obtenido a partir de ARN mensajero (ARNm) a través de retrotranscripción (Figura 8); por

ello, la RT-PCR es una técnica muy útil para la cuantificación de pequeñas cantidades de ARN y

medida puntual de la expresión génica. Empleando una transcriptasa inversa es posible

estimar la cantidad de trascrito de la muestra problema (Nolan y col., 2006).

En 1993, Higuchi y col. describieron una variante de la PCR convencional, basada en la

detección y cuantificación simultánea de la fluorescencia emitida por los productos de PCR que

se acumulan durante el proceso de amplificación. Esta variante se conoce como PCR

cuantitativa (quantitative- PCR, qPCR) o PCR a tiempo real (Real- Time PCR, RT-PCR). La

ventaja que presenta es la posibilidad de amplificar y cuantificar simultáneamente el producto

de la amplificación de ADN. Permite, por tanto prescindir de la electroforesis para la

visualización de los resultados. La qPCR se realiza en un termociclador con capacidad para

hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y

detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado.

Introducción


32

La señal de fluorescencia, proporcional a la cantidad de producto de PCR amplificado, se

genera con colorantes fluorescentes (Costa, 2004).

Existen distintos tipos de qPCR en función de la técnica en la que estén basadas:

fluorocromos o sondas.

En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN se une al fluorocromo (generalmente

SYBR Green®) produciendo una señal de fluorescencia que es medida por el

termociclador (Figura 9).

Figura 9. Colorante SYBR Green® insertado en la doble hélice.

Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos

fluorocromos que hibridan en la zona intermedia entre el primer directo (forward) y el

inverso (reverse); cuando la sonda está intacta, presenta una transferencia energética

de fluorescencia por resonancia (FRET). Su producto comercial más extendido son las

sondas TaqMan® (Figura 10).

Figura 10. Representación esquemática del funcionamiento de una sonda TaqMan®.

Introducción


33

Una técnica común utilizada en cuantificación relativa es la selección de un gen conservado

para normalizar las variaciones que puedan tener lugar fruto de la experimentación, del gen a

cuantificar. La expresión del gen seleccionado debe permanecer constante y su ARN no debe

sufrir alteraciones durante los tratamientos experimentales (Argyropoulos y col., 2006).

Cuando se compara la expresión génica de dos muestras, es esencial que la cantidad de

material génico de partida sea similar en ambas, ya que pequeñas variaciones podrían indicar

expresiones erróneas (Radonic y col., 2004).

3.6. Condiciones de estrés en la fermentación:

Ralentización y parada fermentativa

Las últimas décadas han estado marcadas por una mejora de la vinificación (calidad del

mosto, adición de cultivos iniciadores y tecnología control de procesos) pero aún no se han

resuelto todos los problemas de acabado de fermentación, constituyendo un problema en la

actualidad.

Los elevados niveles de azúcar en los mostos pueden retardar el arranque de la

fermentación alcohólica por la elevada presión osmótica en el medio que limita la población

celular, además de generar mayores concentraciones de etanol que provocan unos finales de

fermentación más difíciles.

3.6.1. Influencia de la composición del medio

Debido al fenotipo glucofílico de S. cerevisiae, el principal azúcar residual en

fermentaciones incompletas es la fructosa. Las ralentizaciones y paradas fermentativas se

producen con relativa frecuencia en la vinificación. Hay muchas causas incluyendo la elección

de una levadura inadecuada, procedimientos de rehidratación incorrectos, mal control de la

temperatura de fermentación, insuficiente nutrición de la levadura y el aumento en la

concentración de etanol en la última parte de la fermentación. Cuando se produce una parada

fermentativa, la relación glucosa/ fructosa suele ser inferior a 0,1, (Gafner y col., 2000), sin

embargo, cuando la fermentación alcohólica finaliza y los vinos resultan secos, ambos azúcares

desaparecen del medio. El índice fructofílico de una levadura, o poder de metabolizar más

fácilmente la fructosa, es una ventaja frente a las paradas de fermentación. Además, otros

factores también pueden influir en el metabolismo de la fructosa, así una falta de nitrógeno

fácilmente asimilable (NFA), por debajo de los 150 mg/L, hace que las levaduras metabolicen

peor la fructosa, y del mismo modo ocurre con las temperaturas de fermentación por debajo

de los 18ºC.

El etanol representa el producto principal de la fermentación alcohólica, y puede alcanzar

concentraciones extracelulares de hasta 12 a 14% vol. (Flanzy y col., 2003). La biosíntesis de

un grado alcohólico (1% vol.) representa un consumo comprendido entre 16,5 y 17 gramos

por litro de azúcares reductores (glucosa o fructosa) (Flanzy y col., 2003). También disminuye

el aroma del vino y la percepción del flavor, ya que aumenta la solubilidad de los compuestos

aromáticos en el vino (Ferreira, 2007). La síntesis de este compuesto por parte de S.

Introducción


34

cerevisiae está limitada por el efecto tóxico que posee (Casey y Ingledew, 1986). Su efecto

inhibidor es bien conocido; como se ha mencionado anteriormente, existe una relación entre la

cinética al final de la fermentación y la concentración inicial de azúcar de los mostos (Insa y

col., 1995); es importante destacar que una misma cepa de levadura puede resistir

concentraciones más o menos elevadas de alcohol según su estado fisiológico.

Los ácidos grasos de cadena larga parecen tener un efecto positivo en la viabilidad de las

levaduras (Guilloux-Benatier y col., 1998), de manera que la tolerancia al etanol podría estar

asociada con un alto contenido en estos ácidos. En cambio, los de cadena media como el

hexanoico, octanoico, decanoico y dodecanoico, y sus ésteres, pueden inhibir el crecimiento

celular. Su mecanismo de toxicidad no está muy claro, pero se cree que se adsorben en la

pared celular y ocasionan problemas en el intercambio de sustancias (Lafon-Lafourcade,

1984). Las levaduras inactivas adsorben estos ácidos tóxicos eliminándolos del medio.

La temperatura de fermentación afecta la tasa de crecimiento y, consecuentemente, a la

duración del proceso además de influir en las reacciones bioquímicas que determinan la

composición química y sensorial del producto final. La tasa de crecimiento aumenta con la

temperatura, con máximos entre 20 y 25ºC (Amerine y col. 1980; Benda, 1982).

Las fermentaciones a baja temperatura se caracterizan por el crecimiento de especies No-

Saccharomyces, más sensibles a concentraciones de etanol elevadas.

3.6.2. Influencia de la viabilidad celular

Los finales de fermentación son precisamente más lentos cuando la población de levaduras

viables disminuye. La fuerte mortalidad puede ser producida por distintos factores: las

carencias nutricionales y/o desequilibrios y la presencia de productos inhibidores.

El mosto de uva puede tener carencias en diferentes nutrientes susceptibles de causar

problemas fermentativos. Entre ellos, tres son los más comunes: el nitrógeno asimilable, la

tiamina y el oxígeno:

La concentración en nitrógeno fácilmente asimilable (NFA) del mosto influye sobre la

cinética durante la fase exponencial del crecimiento. Cuando la concentración es baja, el

proceso se alarga, aunque no por ello tiene que ir acompañado de una parada fermentativa

(Flanzy y col., 2003). Como ya se ha comentado, el equilibrio NFA/ azúcar es un binomio

fundamental a controlar a lo largo del proceso fermentativo.

La tiamina puede también ser limitante y provocar fermentaciones muy lentas. Se hace

necesaria la presencia de 250 µg/L de tiamina para que no se vea afectada la velocidad de

fermentación (Bataillon y col., 1996), ya que aunque S. cerevisiae es capaz de sintetizarla por

sí misma, lo hace a una velocidad baja.

Para desarrollarse convenientemente y conservar una buena viabilidad, las levaduras

tienen también necesidad del aporte de algunos mg/L de oxígeno. Las necesidades máximas

pueden ser estimadas entre 5 y 10 mg/L (Sablayrolles y Barre, 1986) y su ausencia puede ser

compensada, al menos en parte, por la presencia de lípidos en el medio (Brechot y col., 1966).

Introducción


35

La aireación del mosto- vino se consigue por operaciones tecnológicas como el bazuqueo en la

vinificación en tinto o la clarificación por flotación en mostos blancos.

También se ha descrito la influencia de otros factores como la presencia de determinados

ácidos grasos producidos durante la fermentación (principalmente los ácidos octanoicos y

decanoicos) (Geneix, 1984; Lafon- Lafourcade y col., 1984; Viegas y col., 1985; Winter,

1988), la aparición de cepas "killer" (Bevan y Makover, 1963) así como determinados

fungicidas utilizados durante el tratamiento de las viñas (Schopfer, 1978; Sapis- Domerq,

1980).

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Objetivos y Plan de Trabajo



47

4. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue estudiar la influencia en la fermentación

alcohólica de ciertos activadores metabólicos adicionados en la etapa de rehidratación de las

levaduras seco- activas comerciales.

Para ello se propusieron los siguientes objetivos parciales:

Caracterizar las levaduras secas- activas rehidratadas con activadores en cuanto a su

vitalidad, viabilidad y cinética fermentativa para determinar una posible relación de

estos parámetros con la optimización del proceso fermentativo.

Determinar la capacidad de consumo de azúcares de estas levaduras en distintas

condiciones fermentativas, estableciendo la discrepancia fructosa- glucosa y su relación

con la expresión del gen Hxt3, implicado en la regulación del transporte de hexosas.

Buscar una posible relación dosis- respuesta en el uso de determinados activadores

metabólicos añadidos en la etapa de rehidratación de diferentes levaduras seco- activas

comerciales.

Definir la composición lipídica de membrana de las levaduras tras rehidratarlas en

presencia de determinados activadores metabólicos.



48

PLAN DE TRABAJO

En este trabajo de Tesis Doctoral se estudiaron nueve activadores metabólicos de la

fermentación añadidos en la etapa de rehidratación de cuatro levaduras seco- activas

comerciales (L1, L2, L3 y L4).

Se evaluó su influencia en diferentes parámetros que definen la bondad de una

fermentación: vitalidad y viabilidad celular, cinética fermentativa y producción de etanol.

La planificación de la parte experimental de este trabajo se fue modificando en función de

los resultados obtenidos marcando nuevos objetivos:

Capítulos

Capítulo I

Capítulo I


53

5. Capítulo I:

"Mejora de la fermentación alcohólica mediante la activación de

Saccharomyces sp. durante la etapa de rehidratación"

El objetivo de este estudio fue conocer el efecto de nueve "activadores" añadidos al agua de

rehidratación de cuatro levaduras vínicas comerciales a través de la medida de algunos

parámetros bioquímicos y fisiológicos. A los 2, 8 y 15 días de fermentación, se analizó la

vitalidad, la viabilidad, la actividad metabólica así como los azúcares residuales, el glicerol y el

etanol.

Se estudiaron cuatro cepas de S. cerevisiae comerciales (L1, L2, L3 y L4) rehidratadas en

solución fisiológica estéril a 35 ºC durante 30 minutos. A dicha solución de rehidratación se le

adicionaron de forma individual los nueve compuestos a estudiar: glicerol (126,1 g/L);

tween80 (0,3 g/L) + ergosterol (4,5∙10-2 g/L); ácido ascórbico (1,8∙10-2 g/L); glutatión

(2,0∙10-3 g/L); ácido nicotínico (5,0∙10-3 g/L); tween80 (0,3 g/L) + ácido oleico (2,9∙10-2 g/L);

manganeso (MnII) (1,5 g/L); ácido tetrahidrofólico (FH4) (0,56 g/L) y piruvato (9,0∙10-2 g/L)

(Sigma®). Como control se emplearon las cepas rehidratadas únicamente con solución

fisiológica.

Los activadores se eligieron por su intervención en diferentes ciclos metabólicos:

componentes de la membrana celular (glicerol, ergosterol, ácido oleico) a la que confieren

plasticidad, condicionando favorablemente el transporte de nutrientes; vitaminas (ácido

nicotínico, FH4), que participan en las reacciones de oxidación que generan energía;

antioxidantes (ácido ascórbico, glutatión) y finalmente un ion (MnII) que forma parte de

algunos coenzimas e interviene en distintas reacciones de la glucólisis.

Las células rehidratadas se inocularon en una concentración final de 106 células/mL en 200

mL de mosto sintético estéril (pH 3,7), que contenía un exceso de nitrógeno asimilable (360

ppm) y amínico (43,0 ppm).

La determinación de la vitalidad celular se efectuó a los 2, 8 y 15 días de fermentación

estudiando la variación de la impedancia de una solución de KOH al 0,2% que captura el CO2

desprendido. Debido a que los valores absolutos de los tiempos de detección (TD) ofrecían

sesgos excesivos, las comparaciones se llevaron a cabo con medidas relativas; esto es, cada

levadura se rehidrató en solución fisiológica en las condiciones descritas y paralelamente con la

molécula elegida, se midieron los TDs de ambas a M= -15 y se aplicó la fórmula: dM= (MH2O-

Mm)/MH2O. Siendo MH2O el TD con solución fisiológica y Mm, el TD con la molécula ensayada.

El comportamiento de una fermentación se puede evaluar a través del estudio de su

cinética, parámetros como la pérdida de CO2 (midiendo el área bajo la curva a un tiempo y

temperatura prefijados) velocidad específica de crecimiento, fase de latencia, la asíntota o

valor máximo de la ordenada son aptos para conocer el desarrollo del proceso.

Capítulo I


54

La cinética de fermentación se siguió por gravimetría y se ajustó al modelo exponencial de

Gompertz modificado por Zwietering y col., 1990, evaluando el área bajo la curva, la

velocidad específica de crecimiento y el valor de ordenada máximo de la asíntota:

y = A exp {-exp [(µmax∙e/A) ∙ (λ-t) +1]}

y = pérdida de peso (g) a tiempo t (h)

A = pérdida de peso máxima o valor asintótico, cuando t ∞

µmax = tasa máxima de crecimiento (h-1)

λ = fase de latencia (h)

Tanto a los 8 como a los 15 días las cepas L1 y L2 no completaron la fermentación

alcohólica, dejando hasta un 25% del azúcar sin metabolizar; la cepa L3 mostró un

comportamiento intermedio y la L4 fue la más rápida, de tal forma que el contenido de azúcar

residual fue inferior a 20 g/L y a 2 g/L a los 8 y 15 días, respectivamente.

Se observó una relación inversa entre la concentración de azúcar y la vitalidad de la cepa:

las más vitales a los 15 días, L1 y L2, no agotaron el azúcar del medio, mientras que las

menos vitales, L3 y sobre todo, L4, lo consumieron casi por completo. La capacidad de

metabolizar el azúcar es fundamental en vinificación e inherente a cada cepa por lo que es

muy importante la elección de la adecuada; no obstante, en vinificaciones difíciles, el uso de

algunos coadyuvantes mejoraría notablemente el "remanente de vitalidad" y considerando que

los problemas de fermentación aparecen en el último tercio del proceso, interesa que las cepas

agoten el azúcar completamente y, además mantengan la mayor vitalidad posible en

prevención de problemas adicionales.

La rehidratación con compuestos antioxidantes (glutatión o ácido ascórbico), con

vitaminas (ácido nicotínico y FH4) o el ácido pirúvico, mejoraron la actividad metabólica de

las cepas; por otra parte el recuento en placa no discriminó entre los distintos tratamientos. En

algunos casos, existió concordancia entre la vitalidad medida por el desprendimiento de CO2 y

la actividad metabólica medida por fluorescencia. No obstante, una cepa puede ser

metabólicamente activa y poco vital o viceversa.

El comportamiento de los activadores fue diferente dependiendo de la cepa estudiada y del

momento de muestreo. Los resultados de vitalidad fueron muy dispares, obteniendo valores

positivos y negativos en función de la cepa y activador evaluados, a excepción del ácido

ascórbico, que mejoró la vitalidad en todas las condiciones evaluadas. Este activador también

consiguió mejorar la actividad metabólica así como la tasa máxima de crecimiento (µmax) y el

consumo de azúcares.

Cuando los resultados de vitalidad se enfrentaron con los de azúcares residuales, se

observó que la cepa L4 mejoró su vitalidad manteniendo los niveles de azúcar residual por

Capítulo I


55

debajo de 2 g/L cuando fue rehidratada en presencia de ácido oleico, sin embargo al evaluar

su cinética durante toda la fermentación, disminuyó tanto el área bajo la curva (AUC), µmax así

como el valor de asíntota.

La actividad metabólica, mejoró con glutatión, al igual que con ergosterol, que además

de mejorar el perfil cinético en la cepa L3 (µmax, AUC y el valor de asíntota), aumentó el

consumo de azúcar en L1 y L2.

El comportamiento fermentativo de las 4 cepas elegidas fue muy variado. Algunos aditivos

como los ácidos ascórbico, oleico, nicotínico o el ergosterol mejoraron el perfil cinético

aumentando el consumo de azúcar y la cantidad de glicerol y disminuyendo el etanol formado.

No obstante, en tres de las cepas ensayadas ningún activador logró situar la concentración

de azúcar residual en valores aceptables. L4 agotó el azúcar sin necesidad de activadores y

estuvo poco influida por ellos, pero sí se consiguió con algunas moléculas un menor grado

alcohólico y un mayor contenido en glicerol.

Para concluir, el mejor binomio levadura- activador se obtuvo para la cepa L4 rehidratada

con ácido ascórbico, en parámetros de mejor cinética fermentativa, vitalidad y niveles de

azúcar residual, glicerol y etanol.

Capítulo I


56

Capítulo I


57

Capítulo I


58

Capítulo I


59

Capítulo I


60

Capítulo I


61

Capítulo II

Capítulo II


65

6. Capítulo II:

"Estudio de dos cepas vínicas rehidratadas con diferentes

activadores en condiciones de enlentecimiento fermentativo"

En virtud de los resultados del trabajo anterior, en este se planteó estudiar, en condiciones

de enlentecimiento fermentativo, el comportamiento de dos levaduras comerciales

rehidratadas en presencia de cinco activadores metabólicos a diferentes dosis. La vitalidad,

actividad metabólica, el carácter fructo-/glucofílico y el nitrógeno fácilmente asimilable (NFA)

fueron evaluados. A priori todo aditivo que disminuye las necesidades de nitrógeno asimilable

sería bueno ya que se evitaría añadirlo en forma de sal (DAP).

Se eligieron las cepas L2 y L4 por su bajo o elevado consumo de azúcares, respectivamente,

y por presentar un perfil de vitalidad y comportamiento cinético dispar (Capítulo I). Las cepas

se rehidrataron en presencia de tween 80 (0,3 g/L) + ergosterol (4,5∙10-2 g/L); ácido

nicotínico (5,0∙10-3 g/L), tween 80 (0,3 g/L) + ácido oleico (2,9∙10-2 g/L); manganeso (MnII)

(1,5 g/L) y ácido tetrahidrofólico (FH4) (0,56 g/L) (Sigma®). Estas cepas se seleccionaron por

su comportamiento más extremo durante el proceso de fermentación (Capítulo I); así L2

presentó un comportamiento cinético deficiente, contrariamente a L4. Algunos activadores

mostraron un efecto modulador en las variables del proceso. Cada aditivo se ensayó a tres

dosis diferentes: Normal (N) (Capítulo I), y mitad (0,5Ny doble (2N) de la misma. Además, se

probó un producto comercial (PC), Super Start (Laffort®) el cual asocia factores de crecimiento

y de supervivencia, siendo rico en esteroles, vitaminas, cortezas y ácidos grasos; se añadió a

la dosis indicada por el fabricante.

La rehidratación y fermentación se llevaron a cabo en las mismas condiciones que el

capítulo anterior, y se empleó un mosto sintético con un exceso de azúcar y ácidos orgánicos,

con el fin de lograr condiciones de enlentecimiento fermentativo a través de estrés osmótico y

ácido.

En la cepa L2 ningún activador a ninguna dosis logró disminuir la concentración de azúcares

reductores por debajo de 70 g/L tras 15 días. Sin embargo, bajo estas condiciones, se

consiguió mejorar el consumo de azúcar de esta cepa mediante ergosterol (N), MnII (N) y el

producto comercial (PC) tras 8 y 15 días de fermentación.

En cuanto a L4, su perfil de consumo de azúcares fue mejor que el de L2 alcanzando un

valor mínimo de 27 g/L en el tratamiento con ergosterol (N). Este activador mejoró la

vitalidad de las dos cepas y la dosis normal estimuló el consumo de azúcares, en la cepa L2 y

en L4, mejoró su discrepancia de consumo fructosa/ glucosa, determinada como la diferencia

entre el valor absoluto de fructosa residual y el de glucosa, a las dosis normal y doble.

La vitalidad de la cepa L2 aumentó en presencia de ácido oleico y la mitad de dosis y la

normal disminuyeron la concentración de etanol. MnII estimuló el consumo de azúcares en las

Capítulo II


66

dos cepas estudiadas, siendo el mejor activador para la cepa L4 en cuanto a su vitalidad y

consumo de azúcar junto a FH4.

El ácido nicotínico mostró los peores resultados de vitalidad respecto a L4, empeoró su

consumo de azúcares y no consiguió aumentar la concentración de NFA, lo cual hubiera sido

deseable.

La dosis 0,5N de MnII disminuyó significativamente la concentración de NFA en la cepa L2

y FH4 la aumentó en L4.

El preparado comercial sólo arrojó resultados positivos para la cepa L2, mejorando su

perfil de consumo de azúcares.

No hubo relación dosis- respuesta respecto a los parámetros estudiados para ninguna cepa

en condiciones de enlentecimiento fermentativo. Además, ninguno fue capaz de agotar los

azúcares reductores, quizá debido a la gran sinergia entre la disminución del pH intracelular y

la presión osmótica, que superaron barreras infranqueables para todos los activadores.

La variable más relevante en una fermentación vínica es la depleción de azúcares

residuales. Considerando estos resultados junto con los de vitalidad, consumo y/o producción

de FAN y la evolución del perfil fructofílico/ glucofílico, el ergosterol a determinadas dosis

mostró un efecto favorable, por lo que sería un buen activador comparado con los compuestos

e iones ensayados.

Se reitera el elevado grado de cepa- dependencia, confirmado además por la separación en

el plano al llevar a cabo el análisis de componentes principales usando todas las variables

analizadas, excepto la vitalidad: los distintos tratamientos aumentaron la dispersión de los ejes

respecto a sus respectivos controles, especialmente en L4.

Capítulo II


67

Study of two wine strains re-hydrated with different activators in

sluggish fermentation conditions

Patricia Díaz- Hellína, Juan Úbedaa, Ana Brionesa*

aTecnología de Alimentos. IRICA. Universidad de Castilla La Mancha.

Avda. Camilo José Cela 10.

Edifico Marie Curie- 13071 Ciudad Real – Spain

e-mails: {patricia.diazhellin; juan.ubeda; ana.briones} @uclm.es

*corresponding author: Telf. +34 926295300-Ext. 3424; Fax: +34 926295318

e-mail: [email protected]

mailto:[email protected]

Capítulo II


68

Abstract

Rehydration of active dry yeasts is essential in wine fermentation. To help yeast cells

withstand the extreme conditions during alcoholic fermentation adjuvants are added to the

must. However, few commercial activators are added directly to the yeast rehydration water,

even though this might render hydration more efficient due to a favourable osmotic gradient.

The effect of five "metabolic activators" added directly to the water to rehydrate two

commercial wine yeast strains, in sluggish fermentation conditions was evaluated; these

conditions were achieved by acid and osmotic stress. Cell vitality, sugar consumption, glycerol,

ethanol and nitrogen contents at 8 and 15 days of process were determined. Furthermore,

discrepancy in glucose and fructose consumption was also measured. Ergosterol at certain

doses generally showed a favorable effect, so that it could be considered a good activator

compared with other molecules involved in essential metabolic cycles.

Key words: active wine dry yeasts, fructose-glucose consumption, metabolic activators,

sluggish fermentation, Saccharomyces cerevisiae.

Capítulo II


69

Introduction

The manufacture of active dry yeasts (ADY) involves fed-batch biomass production and

subsequent dehydration. Both are highly stressful processes, because wine Saccharomyces

cerevisiae strains, adapted to anaerobic must fermentations, suffer oxidative stress when they

are grown under aerobic conditions. Oxidative metabolism of sugars favors high biomass yields

but also causes increased oxidation damage of cell components1 and the accumulation of

several intracellular metabolites such as trehalose and glycogen, which play a key role in cell

growth2.

It’s been observed on different occasions the ADY failing to impose in the inoculated

fermentation tanks due to the stress suffered by the cells in the stages of production,

dehydration, rehydration and inoculation of grape musts in suboptimal conditions3.

Environmental conditions such as temperature, water hardness, sugar concentration, agitation,

and rehydration duration force yeasts to undergo extensive metabolic modifications and

changes in gene expression4.

One of the most important objectives during winemaking is the achievement of complete

alcoholic fermentation, so that the residual fermentable sugar is less than 2 g/L5. The

completion of the fermentation then allows the winemaker to begin the finishing operations,

and more importantly, allows the wine to be stored under conditions of restricted contact with

air, avoiding the resulting destructive oxidation reactions and microbial growth6.

Many factors are responsible for the occurrence of stuck and sluggish fermentation such as

vitamin, magnesium, nitrogen and oxygen deficiencies and the presence of ethanol, toxic fatty

acids, acetic acid or sulphites may be involved such as temperatures extreme and high sugar

concentration. The effects related to these factors are numerous and include decrease in

intracellular pH, inhibition of key enzyme activities, and alteration of the plasma membrane.

These may induce decreases in the metabolism of the yeast cell, viability and fermentation

rate. Furthermore, occurrence of stuck or sluggish fermentation could be the result of

interactions of these factors6.

Yeast rehydration could be the key to avoiding stuck and sluggish fermentations. A better

understanding of the yeast stress response to rehydration and inoculation will lead to

improvements in the handling efficiency of ADY in winemaking and presumably to better

control of fermentation startup7.

On the other hand, some supplementations in must or rehydration water may increase the

stress tolerance of S. cerevisiae cells significantly, and this finding is important for the

production and use of active dry yeast8. “Fermentation activators” belong to two major groups:

growth factors affecting cell multiplication and activity, and survival factors such as membrane

sterols, which help yeast cells to tolerate toxic compounds9,10. There are currently very few

Capítulo II


70

commercial fermentation activators available and they are added directly to grape must. Of

these, inactive dry yeasts “hulls” are widely used because they have a favorable effect on the

fermentation rate and the duration of the process11,12. However, other compounds added in

low amounts to small volumes of rehydration water might prove more effective, due to a

favorable osmotic gradient. Although such water supplements are still too expensive to use on

an industrial scale, compound products containing varying proportions of these supplements

are available, and ensure its ease of use. The influence of calcium and magnesium ions on

resistance to dehydration in Saccharomyces cerevisiae was investigated by Trofimova et al.8;

the authors concluded that both ions may increase the dehydration stress tolerance and could

be important for the stabilization of the cell membranes. Díaz- Hellín et al.13 studied the effect

of nine activators added to the rehydration water on the kinetics and metabolism of four

commercial dry active yeasts; they found that some activators have the potential to greatly

increase residual cell vitality in difficult winemaking conditions. Landolfo et al.14 found that

ergosterol and oleic acid addition to fermentation media results in the increase in cell viability

and superoxide activity, and the reduction in trehalose accumulation, proteinase A activity and

production of acetic acid. Those results confirm the hypothesis that the supplementation of

lipid nutrients mitigates oxidative stress and oxidative damage in wine strains of S. cerevisiae

during growth under unfavorable conditions. Nicotinic acid is a coenzyme that participates in

some important metabolic routes like glycolysis; it also improves ethanol tolerance and cell

viability15. Manganese is an essential transition metal; it can act independently of proteins to

either defend against or promote oxidative stress 16. Tetrahydrofolic acid acts as a coenzyme

of a great number of enzymatic reactions related to radical transport and it is an intermediary

in aminoacid, purine and pyrimidine metabolism.

Following the research begun by Díaz- Hellín et al.13, the aim of this research was to study the

behavior of five activators (ergosterol, nicotinic acid, oleic acid, manganese and tetrahydrofolic

acid) respecting yeast vitality, metabolic activity and the fructophilic / glucophilic character of

two commercial yeasts strains in sluggish fermentation conditions. Those molecules were

added directly to the yeast rehydration water in three different doses; on the other hand, stuck

fermentation media was aimed by stressful conditions (acid and osmotic).

Materials and Methods

Yeast strains and metabolic activators tested

Two commercial yeast strains (L2 and L4) belonging to Saccharomyces cerevisiae were

assayed in sluggish fermentation conditions. L2 was chosen by showing a deficient kinetic

fermentation profile and because it was not able to consume sugars; whiles the other one (L4)

consumed all sugars of media and its slope, specific rate, and the asymptotic value in the

curve of CO2 production were the highest13 .

Capítulo II


71

Yeast strains were rehydrated in a physiological solution (NaCl 0.9% (w/v)) at 35 ºC, with

gentle mixing by inversion for 30 minutes. Five activators that improved the behavior of the

studied yeasts were selected13; some for their involvement in different metabolic cycles and

others because they are cell membrane components that enhance membrane plasticity and

thus favor nutrient transport (ergosterol or oleic acid, in Tween 80); vitamins (nicotinic acid,

tetrahydrofolic acid), which play a role in energy-generating reactions through the biochemical

oxidation of carbohydrates, fats and proteins; and finally manganese, a component of certain

ATP-dependent coenzymes and reactions.

The five compounds were added individually to the rehydration water: Tween 80 (0.3 g/L) +

ergosterol (4.5·10-2 g/L); nicotinic acid (5·10-3 g/L); Tween 80 (0.3 g/L) + oleic acid (2.8·10-2

g/L); manganese (1.5 g/L); and tetrahydrofolic acid (FH4) (0.6 g/L) (Sigma®). This dose is

referred as normal (N). Moreover, two other doses, half (0.5N) and twice (2N) the

aforementioned were also tested.

A commercial preparation rich in sterols, vitamins, ashes and fatty acids - Super Start

(Lafort®)-, was used as positive control, at the dose recommended by the manufacturer,

referred as normal (N). Strains rehydrated with physiological solution were used as negative

controls.

Microfermentations

Rehydrated yeast cells were inoculated at a concentration of 106 cells/mL into 200 mL of

synthetic stuck fermentation media (125 g/L glucose, 125 g/L fructose, 3 g/L YNB with amino

acids, plus 3 g/L each of malic, citric and tartaric acid) at pH 3.7. Duplicate fermentations were

carried out at 28 ºC for 15 days, in 250-mL Erlenmeyer flasks fitted with Müller valves filled

with H2SO4. Sampling was carried out at 8 and 15 days of fermentation.

Cell vitality

ADY fermentative activity can be measured early and easily by rehydration indicators,

particularly changes in pH, redox potential and CO2 released17,18,19

Cell vitality was measured at 8 and 15 days of fermentation. A µTrac 4200 Microbiological

Analyzer (SY-LAB instruments, Austria) was used. This apparatus measures every two minutes

variations in impedance in a 0.2% KOH solution caused by absorption of the CO2 released by 5

mL of YPD broth (10g/L yeast extract, 20g/L glucose and 20g/L peptone) inoculated with

3.3∙106 cells/ mL. The decline in impedance is reflected in negative exponential growth

curves. The point of inflection in these ones corresponding to an impedance value (M) = -15

(25ºC) was selected as the detection time (DT). Measurements were performed in triplicate,

and kinetics was monitored for up to 24 hours. Comparisons were made using relative

measurements (dM): for this purpose, each yeast was rehydrated in physiological solution both

Capítulo II


72

alone and with the selected activator; and the following formula was applied: dM= (MH2O-

Mm)/MH2O, where MH2O was the DT with physiological solution and Mm was the DT for

rehydrated water supplemented with the activator studied. Values are means from triplicate

samples of duplicate fermentations.

Measurement of glucose/fructose, glycerol and ethanol

Glucose, fructose, glycerol and ethanol were measured at 8 and 15 days of fermentation. They

were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) using a Jasco cromatograph

(Japan) equipped with a refractive index detector (Jasco RI-1530). Chromatographic

separation was performed in a BioRad HPX-87H (300 x 7.8 mm) column thermostatized at 25

ºC. Sulphuric acid (0.245 g/L) was used as the mobile phase; flow rate was 0.5 mL/min.

Values are means from duplicate samples of duplicate fermentations.

Measurement of amino acidic Nitrogen

The free amino nitrogen (FAN) was measured at the end of the process in fermentation broth:

the absorbance at 340 nm of the OPA (o-phthaldialdehyde) derivates was determined20.

Values are means from duplicate samples of duplicate fermentations.

Statistical treatment

A one-factor ANOVA to test for significant differences among the rehydrate yeasts with

different dose of activator was applied (Duncan test; p ≤ 0.05). Principal Component Analysis

to know if the samples could be differentiated in a high-dimensional data space was applied. In

both statistical treatments SPSS version 17.0 was used.

Results and discussion

Evaluation of the cell vitality

The vitality of the two selected yeast strains, rehydrated and supplemented with each of the

five different activators at three different doses was evaluated.

Vitality is a measure of CO2 production per unit of time based on the initial cell number, thus

providing an indication of yeast’s fermentation activity at any given moment. Figure 1 shows

the dM values for each dose-activator-yeast strain combination after 8 and 15 days of process

for L2 (Figure 1 A and C) and L4 (Figure 1 B and D) compared with de negative control

(represented by Y- axis). Positive values of dM, corresponding to detection times (DT) lower

than the negative control, indicates a greater vitality under the evaluated conditions.

http://en.wikipedia.org/wiki/Dimension_(metadata)

Capítulo II


73

*

*

*

*

* *

*

*

*

*

*

-0,4 -0,2 0 0,2 0,4

c

b

a

*

* *

*

*

*

*

*

*

*

*

-0,4 -0,2 0 0,2 0,4

c

b

a

*

*

*

*

*

*

*

*

* *

*

*

*

-0,4 -0,2 0 0,2 0,4

c

b

a

*

*

*

* *

*

*

*

*

-0,4 -0,2 0 0,2 0,4

c

b

a

A) B)

C) D)

*

*

Figure 1. Relative measurements of Impedance, dM, for L2 (A, C) and L4 (B, D), rehydrated in the presence of

different additives.

ergosterol, nicotinic acid, tetrahydrofolic acid, manganese, oleic acid and a commercial product

(C.P.) tested at different doses (a: 0.5N; b: N, c: 2N) after 8 (A, B) and 15 (C, D) days’ fermentation. Positive values

indicate an improvement in vitality compared to negative control (represented by Y-axis).

*Results with statistically significant differences compared to the negative control (p ≤ 0.05).

At the 8th day of the process (Figure 1A), all activators and tested doses, except for

tetrahydrofolic acid (at any dose) and double dose of ergosterol, improved significantly vitality

of L2. This good behavior was more pronounced at the 15th reaching values above 0.2.

Surprisingly, ergosterol 2N invested the vitality significantly at the 15th, while tetrahydrofolic

acid continued misbehaving. In contrast, L4 performance was more erratic (Figure 1B). Some

compounds such as ergosterol and manganese significantly enhanced the overall vitality at any

dose. Both compounds achieved the higher values of vitality on days 8 and 15 respectively,

while others, such as nicotinic acid and oleic acid gave the worst results and didn’t improve it

either after 8 or 15 days.

In any case the results for L4, so much positive as negatives, were more extreme than the

obtained for L2. On the other hand, the commercial preparation (positive control) gave good

results only for the L2 strain, and to a lesser extent, for the L4 strain at the 8th day of the

process.

There was no dose-response relation with respect to the vitality of any strain or compound

tested, so we should consider that each strain needs a specific preparation and dosage. In any

Capítulo II


74

case, ergosterol was the most suitable for both strains; moreover, oleic acid was the best for

L2 and manganese for L4.

Fermentation metabolites and residual sugars

Residual sugars and major metabolites at different fermentation times using different dose-

activators were determined (Tables 1 and 2).

Table 1 gathers residual sugars, ethanol and glycerol production after 8 and 15 days’

fermentation, for L2 strain rehydrated with 5 activators at three different dosages.

Additionally, on day 15th, free amino nitrogen (FAN) was analyzed in fermentation broth.

Table 1. Residual sugars (g/L); glycerol (g/L); ethanol (w/v) and free amino nitrogen (FAN) (mg/L) content in must

fermented by L2 strain at 8 and 15 fermentation’ days. Values are means from duplicate fermentations ± standard

deviation.

*Results with statistically significant differences compared to the negative control (p ≤ 0.05).

There was no activator at any dosage to diminish reducing sugars concentration, after 15 days,

below 70 g/L for L2. Nevertheless, under these sluggish conditions, sugar consumption was

improved by normal (N) dose of ergosterol, manganese (N) and the commercial product (CP)

after 8 and 15 days of fermentation.

As can be observed in Table 2, the greater dispersion of data was showed by L4 especially at

8th day of fermentation. Sugars consumption with L4 strain successfully improved (in relation

with the negative control) in the presence of ergosterol (N) and tetrahydrofolic acid (2N) in

both sampling periods, being the sugar concentration below 28 g/L.

Capítulo II


75

Table 2. Residual sugars (g/L); glycerol (g/L); ethanol (w/v) and free amino nitrogen (FAN) (mg/L) content in must

fermented by L4 strain at 8 and 15 fermentation’ days. Values are means from duplicate fermentations ± standard

deviation.

* Results with statistically significant differences compared to the negative control (p ≤ 0.05).

Considering sugar consumption and vitality results, ergosterol would be suitable to improve

both parameters. It is known that in fungi membrane lipids as ergosterol are highly important

for fermentation process. Changes in either of these membrane features can significantly

disturb the membrane's function and alter the activity of membrane-associated enzymes and

transporters; hence its early incorporation into the cell membrane would be positive in

functionality throughout the process.

After consumption of sugar, ethanol is also a parameter to be considered. Under these

conditions it is remarkable the behavior of half (0.5N) and double (2N) doses of oleic acid in

both strains, giving lower alcohol content than the negative control. The rest of the activators

did not cause an appreciable variation of the ethanol production.

One-Way ANOVA analysis, for both strains and activators at different doses, after eight and

fifteen days of fermentation, was carried out. As can be observed in Table 1, L2 strain showed

a significantly lesser sugar consumption when it was rehydrated in presence of FH4 (0.5N), at

the 15th day of the process. Table 2 shows significant differences for L4 strain. Ergosterol (N),

FH4 (0.5N and 2N) and Mn II (2N) significantly contributed to higher sugar consumption, in

contrast to results observed for oleic acid (0.5N and 2N), both of them at the 15th day of the

process. It is remarkable that none activator at any dose could improve fermentation process

until sugar exhaustion for any strain.

Free amino nitrogen (FAN) consumption is another parameter that is gaining attention in

recent years. There are studies showing a large variability in the up-take21, 22. Many factors

affect the assimilation of nitrogen compounds from a mixture. These include culture conditions,

medium composition and yeast strain 23. Sinergy between yeasts, doses and additives affected

Capítulo II


76

up-take of FAN. Both negative controls gave similar FAN results, but L2 treated with FH4 (0.5

N) and Mn II (0.5N) and L4 rehydrated with oleic acid (N) significantly increased or decreased

FAN content (Tables 1 and 2). For L4 strain any doses of FH4, ergosterol and nicotinic acid

increased not significantly FAN concentration. At the opposite pole, all additives at any doses

except FH4 decreased FAN content in L2 (Table 1).

Evaluation of discrepancy in the consumption of glucose and fructose

In grape must there is equal content in glucose and fructose, and it is known that

Saccharomyces sp. shows a preference by glucose in a diauxic up-take24. This fact causes

sometimes a discrepancy in the consume of juice sugars, because residual sugars in fermented

must usually contains more fructose than glucose, for that reason wine strains with a

fructophilic character are desirables25. If fermentation is completed successfully, leaving less

than 2 g/L of total sugars, there will be a little more glucose than fructose; on the contrary, in

case of sluggish fermentation, the majority residual sugar is fructose. The authors assumed

that those compounds that act as metabolic activators could exert a beneficial effect on the

uptake of fructose under these special conditions.

This study evaluated the effect of the activators tested on the discrepancy in the consumption

of both sugars in stuck fermentation conditions. Figure 2 shows the discrepancy in the

fructose-glucose consumption from 8 through 15 days of fermentation regarding the negative

control (represented on X-axis). Positive histograms are related to an improvement in the

uptake of fructose respecting to glucose. On the contrary, negative bars involve a worsening in

its consumption.

Figure 2. Variation in fructose- glucose discrepancy percentage of L2 ( ) and L4 ( ) from 8th to 15th day of the

fermentation, compared with negative control (represented by the X axis). Positive values indicate an improvement in fructose- glucose discrepancy consumption at the 15th day in comparison to the 8th day.

-45

-35

-25

-15

-5

5

15

% o

f Fru

cto

se/

Glu

co

se d

iscrep

an

cy

Capítulo II


77

A number of samples with a negative impact corresponding to L4 can be observed. This means

that its up-take generally worsened in time, reaching extremes with oleic and nicotinic acid at

0.5N and 2N doses. However, its profile improved with ergosterol at 2N dose, somewhat at the

normal dose, N. It is noticeable that oleic and nicotinic acid were activators that worsened L4

vitality, a parameter that was improved in the presence of ergosterol. L2 behavior was

generally neutral or less negative than L4 at any dose of nicotinic acid, manganese and oleic

acid. CP gave bad results for both strains.

Finally, the values of parameters studied for both yeasts with or without activators were

subjected to principal component analysis (PCA). The spatial distribution of samples and the

variance accounted for each principal component are shown in Figure 3. PC1 and PC2

explained up to 78.7% of the accumulated variance. The variable that most contributed to

explaining the variance of PC1 (54.2%) was FAN. On the other hand, glucose, fructose,

ethanol and glycerol explained PC2 variance (24.5%).

Figure 3, shows that both strains, with and without activators, were separated by PC1 axis, L4

located at the lower plane whereas L2, at the top, left media containing high values of free

amino nitrogen (FAN).

L4 and L2 clusters were separated by PC2 in terms of glucose and fructose consumption as

well as glycerol and ethanol production. There were only some exceptions, L4 treated with

oleic acid at 2N dose and to a lesser extent with 0.5N, both appeared in the area dominated by

L2, while L2 rehydrated with FH4 at 0.5N, was far away of L2 cluster.

With this statistical approach the different and specific behavior manifested in both strains is

re-confirmed.

Capítulo II


78

Figure 3. Principal component analysis (PCA) of the two yeasts tested, with all activators at all concentrations evaluated. (■) L2 and (▲) L4 negative controls (rehydrated in presence of physiological solution); a: L4 rehydrated

with oleic acid (2N); b: L2 rehydrated with tetrahydrofolic acid (0.5N); c: L4 rehydrated with oleic acid (0.5N).

Capítulo II


79

Conclusions

There wasn’t a dose-response relation with regard to the studied parameters for any strain and

almost any activator tested in sluggish fermentation conditions. Moreover, none of them could

exhaust residual sugars, possibly because of the power-full synergy among intracellular pH

decrease and osmotic stress.

In general, the strong specificity of the dose-response binomial was very marked since the

factors analyzed clearly discriminated the two strains in the two main PCA components

indicating the need for a comprehensive analysis of individual behavior of each strain before

the widespread use of a "universal" activator in the hydration stage.

Moreover, the variable more relevant on a wine fermentation is the depletion of reducing

sugars. Considering these results together to cell vitality, low consume and/or production of

free amino nitrogen and the evolution of fructophilic/ glucophilic profile, ergosterol at certain

doses generally showed a favorable effect, it could be considered a good activator compared

with other substances and metal ions involved in essential metabolic cycles.

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http://sauwok5.fecyt.es/apps/DaisyOneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=DaisyOneClickSearch&colName=WOS&SID=Z23L@mf3P2MfNLlFE3m&author_name=Sablayrolles,%20JM&dais_id=14022847

http://sauwok5.fecyt.es/apps/OneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=OneClickSearch&colName=WOS&SID=W1345OPgBPkIBjOK25@&field=AU&value=Feng,%20S

Capítulo II


81

20. Dukes BC, Butzke CE (1998) Rapid determination of primary amino acids in grape

juice using an o-phthaldialdehyde/N-acetyl-L-cysteine spectrophotometric assay.

American Journal of Enology and Viticulture 49: 125-134

21. Hernández-Orte P, Ibarz MJ, Cacho J, Ferreira V (2005) Effect of the addition of

ammonium and amino acids to musts of Airen variety on aromatic composition and

sensory properties of the obtained wine. Food Chemistry 89: 163–174

22. Carrau FM, Medina K, Farina L, Boido E, Henschke PA, Dellacassa E (2008)

Production of fermentation aroma compounds by Saccharomyces cerevisiae

wineyeasts: Effects of yeast assimilable nitrogen on two model strains. FEMS Yeast

Research 8: 1196–1207

23. Henschke P, Jiranek V (1993) Yeasts- Metabolism of nitrogen compounds. In Wine

Microbiology and Biotechnology. Ed by G. Fleet. Harwood academic publishers.

Switzerland, pp 77- 164

24. Boulton RB, Singleton VL, Bisson LF, Kunkee RE (1998) Principles and practices of

winemaking (Chapman & hall Food Science Book. Aspen Publication. Gaithersburg,

Maryland)

25. Berthels NJ, Cordero R, Bauer F, Thevelein J M, Pretorius IS (2004) Discrepancy in

glucose and fructose utilisation during fermentation by Saccharomyces cerevisiae

wine yeast strains. FEMS Yeast Research 4: 683-689

Capítulo III

Capítulo III


85

7. Capítulo III:

"Expresión del gen Hxt3 mediada por activadores metabólicos en

condiciones óptimas y de enlentecimiento fermentativo en S.

cerevisiae"

El objetivo de este trabajo fue estudiar la relación entre la expresión del gen Hxt3,

implicado en el transporte de hexosas y la discrepancia en el consumo fructosa/ glucosa. Este

gen se eligió porque se expresa tanto en presencia de altas como de bajas concentraciones de

azúcares.

El estudio se llevó a cabo en dos medios de fermentación: medio I- óptimo (mosto sintético

de características similares al natural) y medio II- mosto de parada fermentativa (condiciones

alcanzadas mediante estrés ácido y osmótico).

Ambos fueron inoculados con la cepa L4, seleccionada por su buen comportamiento

fermentativo, rehidratada en presencia de tres activadores metabólicos: tween 80 +

ergosterol, ácido tetrahidrofólico y ácido ascórbico, elegidos por su capacidad de mejora en los

parámetros de fermentación descritos en los capítulos precedentes.

La expresión del gen Hxt3 (a los 2 y 12 días de fermentación) se cuantificó mediante qRT-

PCR. Para normalizar su expresión se utilizó como gen marcador el de la actina (Act1), cuya

expresión no varía independientemente del tratamiento al que se someta a la muestra. La

cinética fermentativa, vitalidad y los metabolitos mayoritarios se evaluaron en distintos puntos

del proceso.

Coincidiendo con los datos expuestos en los capítulos I y II, ninguno de los tratamientos

mejoró la vitalidad de la cepa L4 en las condiciones estudiadas. No obstante, cabe destacar

que las células crecidas en condiciones de enlentecimiento fermentativo fueron

significativamente más vitales que las otras, factor que podría estar relacionado con el

consumo de azúcares residuales, ya que una cepa que consume menos azúcar permanece más

vital (como ya se dedujo en el Capítulo I). La finalidad del tratamiento con activadores

metabólicos es precisamente mejorar el consumo de glucosa y fructosa manteniendo o

mejorando la vitalidad celular. La importancia del agotamiento de azúcares con un buen nivel

de vitalidad para evitar problemas durante el proceso fermentativo es un concepto extendido

en enología.

Si el proceso fermentativo se completa, dejando menos de 2 g/L de azúcares residuales,

habrá menos glucosa que fructosa. Por el contrario, en condiciones de parada fermentativa, la

mayor proporción de azúcar residual es fructosa. Por ello son deseables valores bajos de

discrepancia fructosa/ glucosa. Esta variable o diferencia entre el consumo de ambos azúcares,

Capítulo III


86

disminuyó con todos los activadores metabólicos evaluados en todas las condiciones

estudiadas.

Las curvas de consumo de glucosa y fructosa mostraron que todos los tratamientos con

activadores disminuyeron el área bajo la curva de la fructosa en el medio de fermentación

óptimo; en el medio de parada únicamente el ergosterol consiguió disminuir este parámetro.

El ergosterol aumentó el área bajo la curva en la gráfica de producción de CO2 así como la

tasa máxima de crecimiento (µmax) de la cepa L4 en los dos medios estudiados y redujo el área

bajo la curva de consumo de la fructosa y glucosa en el medio de parada fermentativa.

El ácido ascórbico destacó por mejorar la discrepancia fructosa/ glucosa, al reducirla al

mínimo a los doce días del proceso en el mosto óptimo, asimismo, disminuyó el grado

alcohólico a los doce días del proceso.

Respecto al estudio de la expresión del gen Hxt3 en fermentaciones óptimas o en

situaciones de parada, se comprobó que el ergosterol no modificó su nivel de expresión

durante el proceso fermentativo. En cambio, el ácido ascórbico y FH4 aumentaron su

expresión, especialmente en el medio óptimo.

Considerando que el ácido ascórbico mejoró la discrepancia fructosa/ glucosa y la expresión

del gen Hxt3, ambos parámetros podrían estar directamente relacionados, aunque la mejora

de su expresión no se tradujo en una mejora para superar las condiciones desfavorables de

parada fermentativa.

Capítulo III


87

Hxt3 gene expression in a S. cerevisiae strain mediated by metabolic

activators under sluggish and optimal fermentation conditions

Patricia Díaz- Hellína, Victoria Naranjob, Juan Úbedaa, Ana Brionesa*

a Tecnología de Alimentos. IRICA. Universidad de Castilla La Mancha.



e-mails: {patricia.diazhellin; juan.ubeda; ana.briones} @uclm.es

b ProBioVet S.L.

IRICA (Planta 3. Laboratorio 6). Universidad de Castilla La Mancha.



[email protected]

*corresponding author: Telf. +34 926295300-Ext. 3424; Fax: +34 926295318

e-mail: [email protected]



Capítulo III


88

Abstract

When exposed to mixtures of glucose and fructose, as occurs during the fermentation of grape

juice into wine, S. cerevisiae uses these sugars at different rates. Moreover, glucose and

fructose are transported by the same hexose transporters (HXT), which present a greater

affinity for glucose, so that late in fermentation fructose becomes the predominant sugar. In

order to solve the problems this entails, optimally just a few commercial fermentation

activators are available. The aim of this study was to investigate the relation between Hxt3

gene expression and fructose/glucose discrepancy in two different media inoculated with a

commercial wine strain of S. cerevisiae in the presence of three metabolic activators.

Fermentation kinetics, vitality and major metabolites were also measured. Rehydration with

ergosterol improved the area under the curve (AUC) and the growth rate (µmax) in both studied

media. Also, the fructose/glucose discrepancy values were improved with all activator

treatments, highlighting rehydration in the presence of ascorbic acid. The yeast rehydration

process was demonstrated to influence Hxt3 expression under the studied conditions.

Tetrahydrofolic acid treatment greatly influenced Hxt3 gene expression, especially on the 12th

day of the fermentation process. To a lesser extent, ergosterol and ascorbic acid also improved

this parameter.

Keywords: S. cerevisiae, wine yeast, fructose/glucose discrepancy, yeast vitality, Hxt3, qRT-

PCR.

Capítulo III


89

1. Introduction

Grape musts with high sugar content are frequent in Mediterranean viticulture areas. This

creates a serious problem, especially for white wines, since yeasts are not only under osmotic-

thermal stress but also from ethanol and depletion of assimilable nitrogen. Also, during

fermentation of a high-sugar-containing medium lacking lipid nutrients, wine yeasts undergo

oxidative stress and oxidative damage to cell membranes and proteins (Landolfo et al., 2010).

Such stressful situations during fermentation can cause changes in the yeast’s metabolism,

which can be evidenced by accurate measures of kinetic parameters and sugar consumption

capacity. In particular, one parameter that provides an accurate picture of cell physiology is

cell vitality, defined as CO2 production per unit of time (Rodríguez- Porrata et al., 2008). So

called “fermentation activators” are used in winemaking to avoid the aforementioned

problems. Actually, few commercial fermentation activators are available and they are added

directly to grape must. However, other compounds added in small amounts to small volumes

of rehydration water might prove more effective, due to a favourable osmotic gradient.

Landolfo et al. (2010) found that addition of ergosterol and oleic acid to fermentation media

resulted in increases in cell viability and superoxide activity, and reductions in trehalose

accumulation, proteinase A activity and production of acetic acid, results that confirm the

hypothesis that supplementation with lipid nutrients mitigates oxidative stress and oxidative

damage in wine strains of S. cerevisiae during growth under unfavourable conditions. Folates

are cofactors for the one-carbon metabolism occurring in cells. They are involved in the

biosynthesis of nucleotides and therefore crucial during cell division (Hjortmo et al., 2008).

Vitamin C or L-ascorbic acid acts as a scavenger of reactive oxygen species (ROS), thereby

potentially protecting cells from harmful oxidative products. While most eukaryotes synthesize

ascorbic acid, yeast cells produce erythro-ascorbic acid instead. The actual importance of this

antioxidant substance for yeast is still a subject of scientific debate (Branduardi et al., 2007).

When exposed to mixtures of glucose and fructose, as occurs during the fermentation of grape

juice into wine, S. cerevisiae uses these sugars at different rates (Berthels et al., 2004; Júnior

et al., 2008). As a result the ratio between the concentration of glucose and fructose changes,

so that late in fermentation fructose becomes the predominant sugar. This is reported to be

one of the causes of arrested or so-called stuck fermentation (Gafner and Schütz, 1996). The

first stages of fermentation imply active cell duplication in parallel to different rates of glucose

and fructose consumption (fructose/glucose discrepancy). Nevertheless, later stages of

alcoholic fermentation are conducted by non-growing, metabolically active and sometimes

nitrogen starved yeast cells. Hence, in the last phase of the fermentation process, residual

fructose must be fermented by these yeast cells under conditions in which ethanol levels are

increasing rapidly and most nutrients are being slowly depleted (Salmon et al. 1993; Bauer

and Pretorius 2000). The molecular basis of the differential utilization of glucose and fructose

in fermentation by S. cerevisiae, in general, is not known. There are only two steps in the

fermentation pathway, transport and phosphorylation, in which differences could occur that

would explain the fructose/glucose (F/G) discrepancy (Berthels et al., 2008). Berthels et al.

Capítulo III


90

(2008) concluded that the F/G discrepancy in wine yeast strains correlates with the kinetic

properties of hexokinase-mediated sugar phosphorylation; they also determined that a higher

fructose/glucose phosphorylation ratio and a lower Km (affinity constant) might serve as

markers for selection and breeding of wine yeast strains with a reduced tendency for sluggish

fructose fermentation. Glucose and fructose are transported by the same hexose transporters

(HXT) in the plasma membrane. HXT6 and HXT7 are high-affinity carriers, whereas HXT1 and

HXT3 are low-affinity carriers (Zimmermann and Entian, 1997). In seeking the precise basis

for differences in the rate of glucose versus fructose utilization, steps in the metabolism of

hexoses prior to the formation of fructose 1,6-bisphosphate are implicated. In particular, this

includes the systems for sensing extracellular sugars, their transport across the plasma

membrane and phosphorylation as part of the first steps in glycolysis (Liccioli et al., 2011).

In S. cerevisiae, hexose uptake is largely mediated by facilitated diffusion (Bisson and

Fraenkel, 1983), in which 20 genes (Hxt1 to Hxt17, Gal2, Sfn3 and 2) encode related proteins.

Some of these HXT transporters have relatively low affinity (high Km) for hexose, whilst others

are considered high affinity (low Km), but all have the ability to transport both glucose and

fructose. Importantly, whether they are high- or low- affinity systems, all have a greater

affinity for glucose than for fructose. The expression of each Hxt gene is regulated by

environmental factors, especially the extracellular hexose concentration (Ozcan and Johnston,

1995).

The aim of this study was to investigate the effect of three metabolic activators (ergosterol,

tetrahydrofolic acid and ascorbic acid) in Hxt3 gene expression and fructose /glucose

discrepancy in a commercial wine strain of S. cerevisiae. The study was carried out using two

different fermentation media: I - optimal fermentation medium and II - stuck fermentation

medium (achieved by acid and osmotic stress). For this purpose, fermentation kinetics, vitality,

residual sugars, ethanol and glycerol were analysed and Hxt3 gene expression was quantified.

2. Material and methods

2.1. Yeast strain and metabolic activators tested

A commercial wine strain, “L4”, previously studied by Díaz- Hellín et al. (2012), was used in

this work. It was chosen for its sugar consumption capacity and fermentation kinetics. L4 is a

rapid starter leading to constant and complete fermentation between 15 and 30ºC. Moreover,

it has the ability to metabolize large amounts of malic acid, producing significant amounts of

esters and high levels of alcohol.

L4 was rehydrated in a sterile physiological solution at 35ºC for 30 min. Three activators that

improved L4 fermentation parameters (Díaz- Hellín, et al., 2012) were added to the

rehydration water: tween 80 (0.30 g/L) + ergosterol (4.50∙10-2 g/L); tetrahydrofolic acid (FH4)

(1.12 g/L) and ascorbic acid (1.76∙10-2 g/L) (Sigma®).

Capítulo III


91

2.2. Microfermentations

Rehydrated yeast cells were added at a concentration of 2∙106 cells/mL into 100 mL of sterile

synthetic must: “I” - optimal fermentation medium (125 g/L glucose, 125 g/L fructose, 3 g/L

YNB, 3 g/L malic acid, 2 g/L citric acid and 0.5 g/L tartaric acid) or “II” - stuck fermentation

medium (125 g/L glucose, 125 g/L fructose, 3 g/L YNB, 3 g/L each of malic, citric and tartaric

acid) at pH 3.7.

Triplicate fermentations were carried out at 28ºC for 12 days, without shaking, in 125-mL

bottled flasks fitted with Müller valves for all studied conditions. A negative control (yeast

rehydrated in physiological solution) was also processed.

2.3. Cell vitality

Cell vitality was measured on the 12th day of fermentation using a µ-Trac 4200 Microbiological

Analyzer (SY-LAB instruments, Austria). This apparatus measures variations in impedance in a

0.2% KOH solution caused by absorption of the CO2 released by 5 mL of YPD broth (10 g/L

yeast extract, 20 g/L glucose and 20 g/L peptone) inoculated with 5.106 cells/ mL. The decline

in impedance is reflected in negative exponential growth curves. The point of inflection

between cell adaptation and the first third of the exponential phase corresponding to an

impedance value (M) = - 15 (30 ºC) was selected as the detection time (DT). Measurements

were performed in triplicate, and the kinetics were monitored for up to 24 h. A one-way

ANOVA to test for significant differences among the yeasts rehydrated with different activators

was applied (Duncan test; p ≤ 0.05; SPSS 17.0).

2.4. Fermentation kinetics and mayor metabolites

The fermentation kinetics were monitored by gravimetric measurement of CO2 production,

weighing flasks twice a day until the 12th day of fermentation. Kinetic parameters were

measured for all conditions tested. Experimental data were fitted to a modified Gompertz

equation (Zwietering et al., 1990):

y = A. exp {-exp [(µmax∙e/A)∙(λ-t) +1]} [1]

where y = growth at time t (h), A = asymptote value, when t: ∞, µmax = maximum growth

rate (h-1) and λ = lag time (h).

Also, the area under the curve (AUC) was determined.

Moreover, glucose, fructose, glycerol and ethanol were measured at 2, 5, 8, 10 and 12 days of

fermentation by HPLC using a BioRad HPX-87H 300 x 7.8 mm column and a refractive index

detector. Sulphuric acid (0.245 g/L) was used as the mobile phase and the oven temperature

was 25º C. Fructose/glucose discrepancy was also determined. This parameter was obtained

by subtracting fructose to glucose concentration values (g/L) in all studied fermentation media

and the AUC was measured.

Capítulo III


92

2.5. qRT-PCR analysis

Total RNA from S. cerevisiae cells was extracted using an RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia,

CA, USA) according to the manufacturer’s instructions. Sampling was carried out on days 2

and 12 of the fermentation process. Potential residual DNA remaining was removed using the

RNase-Free DNase Set (Qiagen) during the RNeasy procedure. RNA quality was checked by

agarose gel electrophoresis. Hxt3 gene-specific oligonucleotide primers were designed using

Primer3 software (Rozen and Skaletsky, 2000). Act1 is one of the most frequently used

reference genes in S. cerevisiae studies, because its expression is considered relatively stable

under the conditions investigated (Teste et al., 2009). For that reason Actin (Act1) was used

as a reference gene for normalization. Primers were synthesized by Integrated DNA

Technologies Inc (Coralville, IA, USA) and used for real-time RT-PCR as shown in Table 1.

Real-time RT-PCR assay was performed using the Power SYBR® Green RNA-to-CT™ 1-Step Kit

(Applied Biosystems, USA) in a total volume of 25 µl and the 7500 Fast Real-Time PCR System

(Applied Biosystems). All reactions were performed in duplicate. Control reactions were

performed using the same procedures, but without RNA added to control for contamination of

the PCR reaction. Amplification conditions consisted of 48º C for 30 min, 95ºC for 10 min,

followed by 40 cycles at 95 ºC for 15 s and 60 ºC for 30 s. A dissociation curve was run at the

end of the run. Results were recorded as relative gene expression changes after normalizing

for Act1 gene expression using the 2-ΔΔCt method (Livak and Schmittgen, 2001). Briefly, the

relative abundance of each mRNA transcript was calculated as the ratio of the value from L4

treated samples to the value from controls after Act1 correction for each of the two time

points, producing a fold change value. In all cases, the mean of the duplicate values was used

and data for control samples were compared using one-way ANOVA (Duncan test; p ≤ 0.05;

SPSS 17.0).

Table 1. Genes and primers used for quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis.

3. Results and Discussion

3.1. Vitality

One measure that provides an accurate picture of cell physiology is vitality, a measure of CO2

production per unit of time based on cell number, thus providing an indication of the yeast’s

fermentation activity at any given moment. Figure 1 shows the effect on vitality of ergosterol,

tetrahydrofolic (FH4) and ascorbic acid on the L4 strain in both optimal and sluggish media.

Low values of detection time (DT) are desirable; the lower the DT, the more vital the strain.

Díaz- Hellín et al. (2012) found that the vitality of the L4 strain varied markedly as a function

Capítulo III


93

of the activator used. The control strain was sluggish, with a DT of 24 h after 15 days of

fermentation.

As can be observed, none of the treatments improved L4 vitality in the studied conditions

compared with the control. In fact, rehydration with ergosterol and ascorbic acid significantly

increased L4 detection time when it was grown in medium “I”.

Figure 1. Effect of the various additives studied on cell vitality. Detection time (h) on the 12th day of the fermentation process for the L4 strain rehydrated in the presence of the three activators tested in “I” medium: optimal fermentation medium; and “II” medium: sluggish fermentation medium.

Control: control (rehydrated in physiological solution).

Treatments: tween 80 + ergosterol, tetrahydrofolic acid and ascorbic acid.

Values are means of n= 3 ± standard deviations. Lower-case superscript letters indicate significant differences in detection time between treated and control samples (P ≤ 0.05, one way ANOVA).

Nevertheless, tetrahydrofolic acid significantly augmented L4 DT in the other evaluated

medium. It is noteworthy that yeast cells grown in sluggish fermentation medium (II) were

statistically more vital than their counterparts. This fact could be related to glucose/fructose

consumption, since a strain that consumes less sugar remains more vital. As a matter of fact,

the aim of the metabolic activator treatment is to improve glucose/ fructose consumption,

maintaining or improving residual cell vitality.

3.2. Kinetics and glycerol-ethanol production

An effective way of analysing fermentation behaviour is by measuring kinetic parameters such

as CO2 production, the area under the curve (AUC) at a pre-established time, specific growth

rate, lag phase and asymptotic value during the stationary phase. The experimental data

displayed a good fit to Zwietering’s modification of the Gompertz model, based on the equation

outlined in materials and methods (2.4).

Another fermentation indicator is the determination of major compounds such as ethanol or

glycerol.

The AUC of the L4 strain rehydrated with ergosterol was 66% greater when fermented in

medium “I” compared to medium “II” (Table 2). Among medium “I” samples (optimal

fermentation medium), ergosterol improved this parameter 17% compared to the control, a

b,c

a

e

a

c,d

b

d,e

a

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

I II

Dete

cti

on

tim

e (

h)

Capítulo III


94

percentage that was increased in medium “II” (sluggish fermentation medium); specifically,

ergosterol had an AUC 26.6% higher than the control. Díaz- Hellín et al. (2012) found an

increase in µmax when L4 was rehydrated in the presence of ergosterol. Comparing µmax

between both media, it was twice as high in medium “I”. Again, rehydration with ergosterol

improved this parameter, by 17% and 33% in media “I” and “II”, respectively. Meanwhile, the

asymptotic value of the control was 30% higher in medium “I”. Such results are expected

since the evaluated medium was more suitable.

Table 2. Kinetic parameters and glycerol/ ethanol production by the L4 strain on the 12th day of fermentation under the studied conditions (“I” medium: optimal fermentation medium; and “II” medium: sluggish fermentation medium). Area under the curve (AUC); maximum specific rate (µmax); residual glucose (R. Glucose); residual fructose (R. Fructose); asymptote value (A); glycerol (Glyc.) and alcoholic grade (ºAlcoholic). Control: Control (rehydrated with physiological solution). Treatments: Rehydration in the presence of tween 80 + ergosterol. tetrahydrofolic acid (FH4) or ascorbic acid. Values are means of n= 3 ± standard deviations.

Alcohol content was decreased in L4 fermentation medium when it was supplemented with

ascorbic acid (Díaz- Hellín et al., 2012). Under the studied conditions, any treatment was

capable of modifying alcohol concentration in the fermentation medium compared with its

control. On the contrary, ergosterol rehydration increased the alcoholic grade by 20% in

medium “II”.

3.3. Sugar consumption

In grape must there are equal amounts of glucose and fructose, and it is known that

Saccharomyces sp. shows a preference for glucose in diauxic up-take (Boulton et al., 1998).

This fact sometimes causes a discrepancy in the consumption of juice sugars, because residual

sugars in fermented must usually contain more fructose than glucose; for this reason wine

strains with a fructophilic character are desirable (Berthels et al., 2004). If fermentation is

completed successfully, leaving less than 2 g/L of total sugars, there will be a little more

glucose than fructose; on the contrary, with sluggish fermentation, the majority residual sugar

is fructose. Thus, low fructose/glucose discrepancy levels are desirable.

Capítulo III


95

Table 3. Fructose/glucose discrepancy of the L4 strain during the fermentation process under the studied conditions (“I” medium: optimal fermentation medium; and “II” medium: sluggish fermentation medium). Treatments: rehydration in the presence of tween 80 + ergosterol, tetrahydrofolic acid (FH4) or ascorbic acid. Control: Control (rehydrated with physiological solution). Values are means of n= 3 ± standard deviations.

As can be seen in Table 3, fructose/glucose discrepancy values were improved with all

activator treatments, especially rehydration in the presence of ascorbic acid, which profoundly

reduced this parameter at the end of the process in medium “I” (optimal fermentation

medium). The same trend was observed in medium “II” (sluggish fermentation medium),

where the discrepancy was reduced by almost half, perhaps related to its antioxidant capacity

(Branduardi et al., 2007). Greater discrepancies were obtained between the 8th and 10th days

of the process when samples were fermented in sluggish fermentation medium, except with

ergosterol and ascorbic acid. In addition, glucose and fructose consumption remained almost

constant at the end of the process in medium "I" (Table 2), independent of the treatment.

However, ergosterol and ascorbic acid treatment decreased glucose and fructose levels when it

was fermented in medium "II".

On the other hand, Liccioli et al., (2011) studied the area under the curve (AUC) of

fermentation of individual or combined sugars. The authors ranked 20 strains for their ability

to consume fructose relative to glucose. They found that the strain Fermichamp showed the

highest ratio between glucose and fructose AUC. The above mentioned strain and Bordeaux

Red were located at the opposite ends of the chart, and they were the only two strains

significantly different from the mean.

Glucose and fructose AUC was also evaluated in this work (Table 4). Low values of AUC were

desirable for both sugars, but especially in fructose consumption. Activator treatments

decreased fructose AUC in all samples fermented in medium “I” compared to the control.

Capítulo III


96

Table 4. Area under the curve (AUC) of glucose and fructose consumption by the L4 strain on the 12th day of

fermentation under the studied conditions (“I” medium: optimal fermentation medium; and “II” medium: sluggish fermentation medium). Treatments: rehydration in the presence of tween 80 + ergosterol, tetrahydrofolic acid (FH4) or ascorbic acid. Control: Control (rehydrated with physiological solution). Values are means of n= 3 ± standard deviations.

In addition this parameter also decreased during fermentation in medium “II” when the strain

was rehydrated with ergosterol. In contrast, the other metabolic activators tested gave no

positive results. Glucose AUC results were more homogenous, especially ergosterol treatment

in both studied media.

3.4. Hxt3 expression

The relationship between Hxt3 gene expression and the fructose /glucose discrepancy was

studied. Different methods can be used to determine the expression level of a target gene in a

test sample relative to a reference gene. For this purpose, the 2-ΔΔCt method was selected

(Livak and Schmittgen, 2001).

Figure 2 summarizes Hxt3 expression under the evaluated conditions. Each bar was obtained

as a result of normalization against the selected reference gene (Act1) and calculation the fold

difference in expression. As can be seen in that figure, FH4 treatment greatly influenced Hxt3

gene expression, especially on the 12th day of the fermentation process. In particular, its gene

expression increased 2 fold compared with the control in medium “I”. This also occurred, to a

lesser extent, in medium “II”, where the increase in expression was almost 1.5 fold. Both

values were statistically significant compared with the 2nd day. Meanwhile, the ergosterol and

ascorbic acid treatments produced different trends. Hxt3 expression remained nearly constant

with ergosterol as well as with ascorbic acid. Compared with the control, ascorbic acid

increased Hxt3 expression in both studied media; this was particularly noteworthy in medium

“II”. This activator also improved the fructose/glucose discrepancy, which could be related to

better sugar transport achieved by higher expression of Hxt3. Based on this data, it can be

concluded that the yeast rehydration process influences Hxt3 expression under the studied

conditions.

Capítulo III


97

I)

II)

Figure 2. Quantitative Hxt3 (GenBank accession number NM_001180653.1) gene expression analysis in L4 strain samples rehydrated in the presence of three metabolic activators (tween 80 + ergosterol, tetrahydrofolic and ascorbic acid) on the 2nd and 12th days of the fermentation process in “I” medium: optimal fermentation medium; and “II” medium: sluggish fermentation medium.

Quantification was performed using qRT-PCR analysis. For all samples scored, the fold change was calculated by the 2(-

ΔΔCt) method (Livak and Schmittgen, 2001). Three experimental replicates were done for each analysis. In addition, each sample was carried out in duplicate. Amplification efficiencies were validated and normalized against Act1. Bars show average value ± S.D. for mRNA ratios of treated to control samples. Lower-case superscript letters indicate significant differences in mRNA levels between different treatments in both studied media (P ≤ 0.05, one way ANOVA).

a a

a

a,b

b

a

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

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Ergosterol FH4 Ascorbic Acid

Fo

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han

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3

3,5

Ergosterol FH4 Ascorbic Acid

Fo

ld c

han

ge

Capítulo III


98

4. Conclusions

The importance of sugar exhaustion and maintenance of vitality in order to avoid additional

complications during the wine fermentation process is well known. In this context, yeast cells

grown in sluggish fermentation media were statistically more vital than the others, a fact that

could be related to glucose/fructose consumption, since a strain that consumes less sugar

remains more vital.

In this work it has also been demonstrated that under suboptimal conditions ergosterol was

the only metabolic activator that could improve the kinetic parameters. This activator also

decreased glucose/ fructose consumption as well as the fructose/glucose discrepancy under

sluggish fermentation conditions.

Meanwhile, fructose/glucose discrepancy values were improved by all the activator treatments

and particularly by rehydration in the presence of ascorbic acid, which greatly reduced this

parameter at the end of the process.

The yeast rehydration process was also demonstrated to influence Hxt3 gene expression under

the studied conditions. FH4 treatment greatly influenced Hxt3 gene expression, especially on

the 12th day of fermentation. Finally, ascorbic acid increased Hxt3 gene expression in both

studied media; the increase was particularly noteworthy in the sluggish fermentation medium.

Taking into account that this activator also improved the fructose/glucose discrepancy, it can

be concluded that the two parameters are positively correlated.

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Capítulo IV

Capítulo IV


103

8. Capítulo IV:

"Variabilidad en los lípidos de membrana en cepas de S. cerevisiae

rehidratadas en presencia de activadores metabólicos"

En este capítulo se estudió la composición lipídica de membrana de dos cepas de S.

cerevisiae, L2 y L4, elegidas por su bajo o elevado consumo de azúcares, respectivamente, así

como por presentar perfiles de vitalidad muy dispares. Tras su rehidratación en presencia de

ergosterol, ácido tetrahidrofólico (FH4) y manganeso (MnII), a tres dosis distintas, se

cuantificaron los fosfolípidos (ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina y el

binomio fosfatidilinositol- fosfatidilserina), los lípidos neutros (escualeno, ésteres de esteroles,

triacilgliceroles (TAG), lanosterol, ergosterol y ácidos grasos) y los ácidos grasos libres,

evaluándose además la viabilidad y cinética fermentativa.

Las cepas se rehidrataron siguiendo el protocolo habitual. La viabilidad se evaluó mediante

citometría de flujo, y la cinética de fermentación se determinó por lectura de la densidad óptica

a 600nm a intervalos de 20 minutos (placas de microtitulación) de un mosto sintético de

características similares al convencional, en las condiciones previamente descritas. Se estudió

el tiempo de latencia (T-Lag), el tiempo de duplicación (T-d), la velocidad específica de

crecimiento (µmax), y el valor de asíntota (Nmax). Los lípidos de membrana de las dos cepas

recién rehidratadas se extrajeron y cuantificaron mediante cromatografía en capa fina de alta

resolución (HPTLC) y cromatografía de gases (GC).

En general, la cepa L2 presentó una mayor viabilidad y tardó menos en alcanzar la fase

estacionaria que L4 en todas las condiciones estudiadas; este hecho podría ser un factor

intrínseco de la cepa, o bien estar relacionado con el sistema de producción de cada compañía

o con las condiciones de conservación. No obstante, no se observó mucha disparidad entre los

resultados intra-cepa, y todas presentaron viabilidades similares. La rehidratación con

ergosterol y Mn II aumentó la viabilidad en L2, mientras que L4 sólo aumentó su viabilidad

cuando se rehidrató con MnII.

Por otra parte, la velocidad específica de crecimiento (µmax) y la población máxima (Nmax)

fueron superiores en L4, independientemente del tratamiento realizado. Se observó una

relación inversa entre el tiempo de latencia y la tasa máxima de crecimiento: la cepa que inició

más tarde la división celular, L4, fue la más preparada para crecer rápidamente. Quizá las

condiciones fisiológicas, la estructura celular y el transporte de nutrientes sean más idóneos

cuanto más lenta es la adaptación inicial al medio. Por otra parte, se consiguió aumentar la

tasa de crecimiento de una buena cepa, L4, con ergosterol lo cual sería de interés en

condiciones de fermentación difíciles, como por ejemplo a una temperatura muy baja.

La membrana de L2, presentó mayor contenido en fosfolípidos, mientras que la de L4 era

más rica en lípidos neutros llegando, en ocasiones, a duplicar su concentración respecto a L2.

Capítulo IV


104

El ergosterol y el FH4 aumentaron la concentración de ciertos fosfolípidos como

fosfatidilcolina y fosfatidilinositol- fosfatidilserina y de casi todos los lípidos neutros en la cepa

L2. En contraposición, ciertas dosis de FH4 y de Mn II disminuyeron el contenido de

fosfolípidos en la cepa L4.

En L4 casi todos los activadores y prácticamente todas las dosis provocaron un efecto

negativo en el contenido de escualeno, ésteres de esterol, TAG, y ácidos grasos, aunque en la

mayoría de los casos no significativamente.

En base a los resultados cinéticos, y a la composición en fosfolípidos y lípidos neutros, el

ergosterol fue el activador de elección entre los tres estudiados, aunque no se encontró una

relación dosis- respuesta. Por otra parte, hay que resaltar que las dosis mitad y normal, no

aumentaron su concentración en la membrana.

La comparación inter-cepas, resultó en un mayor contenido en C 16:0 y sobre todo C 16:1

para L4 y en C 18:1 y de forma muy destacada, C 18:2 para L2; en cambio la membrana de

L2 era más rica en los ácidos grasos de 18 átomos de carbono. Un hecho a destacar es la

ausencia o el bajo contenido porcentual de algunos saturados (C 10:0, C 12:0 y C 14:0) en L4.

El tratamiento con activadores metabólicos consiguió aumentar o disminuir la producción

de ácidos grasos, pero no dieron lugar a una variación porcentual en la síntesis de estos

compuestos, suceso que podría tener lugar tras alcanzar un número superior de generaciones.

En este estudio se valoró el resultado con la levadura recién rehidratada, pero habría que

buscar otro punto de muestreo y poder analizar mejor el efecto de los activadores en el

metabolismo lipídico de las levaduras. Teniendo en cuenta que el tiempo de latencia no suele ir

más allá de las 12 horas, podrían esperarse cambios más importantes en este intervalo.

Capítulo IV


105

Membrane lipid variability in Saccharomyces cerevisiae wine strains

rehydrated in the presence of metabolic activators

Running title: Lipid variability in wine yeast rehydrated with metabolic activators

Patricia Díaz-Hellína, Sergio Gómez-Alonsoa, Anna Borrullb, Nicolas Rozèsb, Ricardo

Cordero-Oterob, Juan Úbedaa*

aTecnología de Alimentos, IRICA, Universidad de Castilla–La Mancha,

Avda. Camilo José Cela, 10,

Edificio Marie Curie –13071 Ciudad Real – Spain

e-mails: {patricia.diazhellin; sergio.gomez; juan.ubeda} @uclm.es

b Departament de Bioquímica i Biotecnologia, Universitat Rovira i Virgili, Marcel·lí Domingo,

s/n, 43007 – Tarragona, Spain

e-mails: {anna.borrull; nicolasrozes} @urv.cat; [email protected]

* Corresponding author: Tel. +34 926 295300 – Ext. 4324; Fax: +34 926 295318. e-mail:

[email protected]



Capítulo IV


106

Abstract

Slight variations in lipid composition of wine yeasts membranes can alter some essential

functions including selective nutrient transport and ion permeability. The absence of oxygen

during alcoholic fermentation inhibits fatty acid desaturation and sterol biosynthesis, thereby

reducing the stress-resistance of yeast cells.

In this work, membrane lipids in two commercial active dry yeasts strains rehydrated in the

presence of three activators (ergosterol, tetrahydrofolic acid and manganese II) were studied.

Each of them was assayed at three different concentrations. The effect of these activators in

the phospholipid, neutral lipid and fatty acid content in cell membranes was assessed. Also,

cell viability and fermentation kinetics were determined.

Ergosterol was found to shorten the lag phase and improved cell viability and membrane lipid

composition; tetrahydrofolic acid raised neutral lipid levels; and manganese II increased cell

viability and modified phospholipid composition and linoleic acid concentration. All activators

interacted with yeasts in a strain-dependent way.

Keywords: Saccharomyces cerevisiae, membrane lipids, fatty acids, active dry yeasts,

metabolic activators.

Capítulo IV


107

1. Introduction

Wine yeasts suffer osmotic–thermal, nutritional, anaerobic and toxic stress during alcoholic

fermentation. Nutritional stress typically occurs in highly sugar, poor available nitrogen musts,

whereas anaerobic–toxic stresses take place in the presence of ethanol and short- and

medium-chain fatty acids. Those stressing conditions usually lead to stuck or sluggish

fermentations.

Inoculation with active dry yeasts (ADYs) is a common winemaking practice. On rehydration,

ADYs recover their ability to ferment sugars in the must. The dehydration–rehydration process

is cell-damaging; thus, cells lose nucleotides, ions and most soluble cellular components

(Rapoport, Khrustaleva, Chamanis, & Beker, 1995). However, most rehydrated cells keep their

reproductive ability if they are grown under optimum conditions after rehydration (Rodríguez

Porrata et al., 2008). ADY manufacturers address this problem marketing “fermentation

activators”, including growth factors, which affect cell replication, and survival factors,

molecules that yeasts are unable to produce under anaerobic conditions (Rodríguez-Porrata, et

al., 2010).

The plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae is about 7.5 nm thick and exhibits

cytoplasmic invagination in some regions. The lipid composition of this membrane strongly

influences its tolerance to various types and/or levels of stress, as well as its resistance to

toxic compounds such as ethanol, acetic acid, acetaldehyde and medium-chain fatty acids

(Bisson, 1999). In addition, lipid composition of the plasma membrane plays a prominent role

in the adaptive response of cells (Sajbidor, 1997). Thus, small changes on it can alter some

essential functions such as ion permeability or transport (Keenan, Rose, & Silverman, 1982;

Hazel & Williams, 1990).

Some environmental factors (e.g. temperature, oxygen availability, growth rate and the

presence of sterols) can modify the lipid bilayer and/or unsaturated fatty acid composition of

yeast cell membranes during alcoholic fermentation. The effect of these modifications includes

reducing membrane fluidity and altering some essential functions (particularly selective

transport of sugars and amino acids) (Henschke & Rose, 1991).

Sterols take part in the construction and maintenance of eukaryotic membranes by regulating

their permeability and fluidity in addition to their ethanol resistance and plasma H+-ATPase

activity (Deytieux, Mussard, Biron, & Salmon, 2005). It should be pointed out that ergosterol

plays a different role depending on its concentration in the medium (Rodríguez, Low, Bottema,

& Parks, 1985). Thus, trace contents of this sterol help trigger cell replication, whereas high

levels enable active growth and membrane synthesis. The remarkable enrichment of the

plasma membrane in ergosterol parallels the preferential location of cholesterol in the plasma

membrane of animal cells (Lange, Swaisgood, Ramos, & Steck, 1989). Secretory vesicles are

second highest in ergosterol concentration, suggesting that these vesicles contribute to the

flow of ergosterol from the endoplasmic reticulum to the plasma membrane (Zinser et al.,

Capítulo IV


108

1991). On the other hand, Soubeyrand et al. (2005) found the in situ addition of sterols during

rehydration enhance the fermentation capacity of yeasts.

Phospholipids (particularly phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine and, to a lesser

extent, phosphatidylserine and phosphatidylglycerol) improve membrane fluidity (Walker,

1998).

The unsaturation degree of fatty acids largely influences physical properties of the cell

membrane (Avery, Howlett, & Radice, 1996). Oleic (C18:1), palmitoleic (C16:1), palmitic

(C16:0) and stearic (C18:0) are the main fatty acids in cell membranes (Daum, Lees, Bard, &

Dickson, 1998). Besides, fluidity is also governed by the packing degree of these acids. Thus,

the less unsaturated and long-chained a fatty acid is, the tighter it packs and the less

disordered and fluid is the resulting structure. By contrast, the more unsaturated the acid is,

the greater is the fluidity of the membrane and the more easily it can adapt to adverse

conditions such as a high ethanol concentration or low temperature during fermentation

(Guilloux-Benatier, Fur, & Feuillat, 1998). Saccharomyces cerevisiae yields saturated and

monounsaturated fatty acids of 16 and 18 carbon atoms, but it is unable to produce

polyunsaturated acids (PUFAs) (Yazawa, Iwahashi, Kamisaka, Kimura, & Uemura, 2009).

Non-polar lipids such as triacylglycerides (TAGs) provide an energy pool for the synthesis of

membrane lipids (Grillitsch et al., 2011).

The absence of oxygen during alcoholic fermentation suppresses fatty acid desaturation and

sterol biosynthesis, thereby reducing the ability of cells to adapt to the dramatic environmental

changes involved in the process (Rodríguez- Vargas, Sánchez- García, Martínez- Rivas, Prieto,

& Randez- Gil, 2006).

Díaz-Hellín, Úbeda, & Briones (2012) found rehydration of some commercially available yeast

strains with different metabolic activators, such as ergosterol or ascorbic acid, to increase their

fermentation capacity and sugar consumption. Both genetic and membrane transport factors

must play an important paper.

The main purpose of this work was to study the membrane lipid composition of two

commercial active dry wine yeasts strains following rehydration in the presence of three

metabolic activators: ergosterol, tetrahydrofolic acid (FH4) and manganese II. To this end,

phospholipids (PLs), neutral lipids (NLs) and fatty acids (FAs) composition of yeasts cell

membranes was determined. Yeast viability and fermentation kinetics was also measured.

2. Materials and methods

2.1. Yeast strains and metabolic activators

Two different commercially available active dry yeasts (ADYs) designated L2 and L4 and three

activators were selected because they improved the behavior of the studied yeasts (Díaz-

Hellín, Úbeda, & Briones, 2012). Ergosterol is a cell membrane component that enhances

membrane plasticity and thus favors nutrient transport; tetrahydrofolic acid plays a role in

Capítulo IV


109

energy-generating reactions through the biochemical oxidation of carbohydrates, fats and

proteins; and finally manganese is a component of certain ATP-dependent coenzymes and

reactions.

An appropriate amount of each yeast strain was rehydrated in 0.9% (w/v) physiological

solution at 35 ºC for 30 min in the presence of 4.5·10–2 g/L ergosterol + 3.0·10–2 g/L Tween

80, 0.56 g/L tetrahydrofolic acid (FH4) or 1.51 g/L manganese II (Sigma®). The activators

were used at normal dose (N) in addition to half-dose (0.5N) and double dose (2N) for kinetic

studies and viability. For lipid membrane assays, normal dose (N) and half-dose (0.5N) were

used.

Rehydrated cells in the presence of Tween 80 or 0.9% (w/v) physiological solution were used

as controls for each treatment.

2.2. Flow cytometry analysis

Following rehydration, viable cell counts were carried out in duplicate using flow cytometry on

CyFlow SPACE equipment (Partec GmbH. Münster, Germany) and the Funga LightTM CFDA AM/

propidium iodide Yeast Vitality kit (Invitrogen. Carlsbad, CA, USA).

2.3. Growth kinetics

Growth kinetics was examined using a sterile synthetic must (250 g/L glucose, 250 g/L

fructose, 4.15 g/L YNB aa, 3 g/L malic acid, 2 g/L tartaric acid and 0.5 g/L citric acid, at pH

3.7). The initial concentration of viable cells was 5∙106 cells/mL. Tests were performed in

microtitration plates and involved reading the optical density (OD) at 600 nm at 20 min

intervals until stationary growth was reached. Plates were read with a Polar Star Omega ELISA

instrument (BMG Labtech GmbH. Ortenberg, Germany). Each determination was performed in

octuplicate.

2.4. Lipid extraction from rehydrated yeast cells

Prior to lipid extraction, a solution of 100 µL of methanol and 20 µL of EDTA 0.1 mM was

added to the pellet of rehydrated yeast cells with 1 g of 0.5 mm glass beads (Biospec

Products- Bartlesville. OK, USA) in Eppendorf’s tubes and then mixed for 5 min in a Mini-

Beadbeater- 8 (Qiagen- Hilden, Germany). Lipid extraction was performed in four steps: The

first one involved extracting the organic layer with 200 µL of methanol and 600 µL of

chloroform under stirring on an Orbit M60 vortexer for 1 h, followed by centrifugation at 5000

rpm for 1 min. This procedure was repeated three times with different extractant

combinations: 300 µL methanol + 600 µL chloroform, 450 µL methanol + 450 µL chloroform

and 600 µL methanol + 300 µL chloroform. The volume of organic layer extracted in each run

was placed in a glass tube that was cleaned with one-fourth of the total extract volume of a

0.88% (w/v) KCl solution. This was followed by vortexing, cooling at 4 ºC for 10 min and

centrifugation at 3000 rpm for 5 min. The organic phase was collected and finally concentrated

Capítulo IV


110

to dryness under a nitrogen stream in a Supelco® solid-phase evaporator. The resulting

residue was dissolved in a 2:1 (v/v) chloroform/methanol mixture and stored in an amber-

coloured vial with a glass insert.

2.5. Separation and quantification of Phospholipids (PLs) in cell membrane by High

Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC)

Phospholipids (phosphatidic acid (PA), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylcholine

(PC), phosphatidylinositol and phosphatidylserine (PI+ PS)) were separated by one-

dimensional High Performance Thin Layer Cromatography (HPTLC) on silica gel plates (10 × 20

cm, 200 µm) (Merck. Darmstadt, Germany) with chloroform, acetone, methanol, glacial acetic

acid and water (50:15:10:10:5, v/v/v/v/v). Samples were loaded by using a Linomat semi-

automatic applicator and the mobile phase was held in a Camag® semi-automatic cell. After

charring the plate with 10% CuSO4 in 8% H3PO4 and heating it at 180 ºC for 4 min (Redón,

Guillamón, Mas, & Rozès, 2008) PLs were identified using known standards: phosphatidic acid,

phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylinositol and phosphatidylserine

(Sigma®). Calibration curves by applying standards to every plate at a concentration of 0.5, 1,

2 or 4 µg/ µL were constructed. An image of the plate was acquired with an Image Scanner

from Amersham Biosciences (Piscataway, NJ, USA). Each spot of the image was quantified with

the software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), using the previous

standards as references. All phospholipids were determined in triplicate.

2.6. Separation and quantification of Neutral lipids (NLs) in cell membrane by Thin Layer

Chromatography (TLC)

Neutral lipids (NLs) (squalene, sterol esters, lanosterol, ergosterol and free fatty acids) were

separated by one- dimensional TLC on silica gel plates (10 × 20 cm, 250 µm) from Merck

(Darmstadt, Germany). Each plate was developed in three steps with (1) 50:50 (v/v) methyl

tert-butyl ether (MTBE)/glacial acetic acid, (2) 80:20:1 (v/v/v) hexane/MTBE/glacial acetic acid

and (3) pure hexane. Plates were processed as described in section 2.5, and Sigma® standards

(squalene, cholesteryl oleate, diolein, triolein, lanosterol, ergosterol and ethyl oleate) were

used to quantify NLs: calibration curves were constructed from the application of standards to

every plate at a concentration of 0.5, 1, 2 or 4 µg/ µL.

2.7. Quantification of fatty acids (FA) in cell membrane by Gas Chromatography (GC)

Following rehydration, saturated fatty acids (SFAs, C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 and C18:0)

and unsaturated fatty acids (UFAs, C14:1, C16:1, C18:1, C18:2 and C18:3) were measured.

Also, mean fatty acids chain length (ChL) was determined in order to ease the interpretation of

the results. ChL was calculated according to the following equation: ChL = Σ (Ci·nC,i)/ Σ Ci,

where Ci corresponds to the “i” fatty acid concentration and nC,i is the number of carbon atoms

in the mentioned acid.

Capítulo IV


111

Sedimented cells (108 cells/ mL) in sealed tubes with a Teflon- lined screw cap were saponified

using 1 mL of 5% Na OH in 50% methanol/ water (Rozès, García-Jares, Larue, & Lonvaud-

Funel, 1992) and placed in a dry bath (100 ºC) for 30 min. After that, the saponified material

was cooled at room temperature and 2 mL of 6 M HCl and 1 mL of BCl3 were added in order to

obtain methylated free fatty acids. Then, samples were heated at 80º C in the water bath for

10 min. At that point, fatty acids methyl esters were extracted with 1 mL of hexane; samples

were vortexed for 30 s and the organic phase was collected after centrifugation (3000 rpm, 3

min). The extraction step was repeated again, and then the combined organic phase extract

was washed with 5 mL of MiliQ water to remove excess HCl. Finally, the organic extract was

dried with anhydrous sodium sulphate (Na2SO4).

Fatty acid methyl esters were separated on a gas chromatograph Model 6890 equipped with a

7863 autosampler (Agilent. Santa Clara, CA, USA), a split/splitless injector and a flame

ionization detector (FID). The capillary column used (50 m long × 0.25 mm i.d.) was coated

with a 0.25 µm thick film of SGL-1000 (acidified polyethylenglycol) stationary phase,

(Sugelabor. Madrid, Spain). The carrier gas was helium at 1 mL/min, the injection volume 3 µL

and the split ratio 8:1. The injector and detector temperatures were both 250 ºC. The

temperature programme was as follows: 100 ºC (held 3 min), 15 ºC/min ramp to 210 ºC and

holding for 20 min. Heptanoic acid (20 mg/mL) and heptadecanoic acid (40 mg/mL) were used

as internal standards. The amounts of fatty acids found were related to cell dry weights and

expressed as percentages of total fatty acids. The determinations were performed in triplicate.

2.8. Statistical analysis

Changes in membrane lipid composition upon rehydration of the ADYs in the presence of the

metabolic activators were checked by one-way analysis of variance (ANOVA) at the 95%

significance level (p ≤ 0.05), using Duncan’s test (SPSS v. 17.0). Data were processed in

triads (i.e. each sample was compared with its corresponding control).

3. Results and Discussion

3.1. Cell viability

In a previous work, Díaz-Hellín, Úbeda, & Briones (2012) found that rehydration of L2 in the

presence of glutathione and glycerol increased cell viability in this yeast strain after 15 days of

fermentation. Likewise, L4 exhibited an increase of viability after rehydration in presence of

tetrahydrofolic acid (FH4) and ascorbic acid.

As can be seen in Figure 1, L2 exhibited higher viability than L4 in all studied cases. This

could be a consequence of a specific strain factor since viability percentages hardly vary

compared with controls in both strains. Numerous extrinsic variables in relation with the

transport and the conservation of the dry yeasts could influence this parameter too.

Capítulo IV


112

* * * * * *

* * *

* * *

* * * *

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Via

bilit

y (

%)

[Activator]

Figure 1. % of viability of L2 ( ) and L4 ( ) strains after rehydration with ergosterol (Erg.) + Tween 80; FH4 and Mn II at half (0.5N), normal (N) and double (2N) doses. Controls: Tween 80 (rehydration with Tween 80) and Blank (rehydration with physiological solution). Values are means of n = 2 ± standard deviations. (*) Significantly different from the control (p ≤ 0.05, n= 2).

By exception, ergosterol and manganese increased L2 viability in a statistically significant

manner while L4 exhibited significantly increased viability when rehydrated in the presence of

manganese irrespectively of its dose, contrary to what happened with ergosterol, which

produced a significant decrease.

3.2. Growth kinetics

Besides the lag period and the asymptotic value, another valuable parameter of the growth

curve is the maximum specific growth rate (µmax). Since the logarithm of the absorbance is

used, µmax is given by the slope of the line when the organisms grow exponentially (Zwietering,

Jongenburger, Rombouts, & Van't Riet, 1990). In this work, the growth kinetics of the two

yeast strains in terms of initial population (N0), maximum population (Nmax), specific growth

rate (µmax), lag time (T-Lag) and duplication time (T-d) were examined.

L2 reached the stationary growth phase after 38 h of incubation, and L4 after 83 h (data not

shown). As viability, the lag time (T- Lag) was strain-dependent. Thus, L2 rehydrated in 0.5 N

ergosterol exhibited a shorter lag phase than both the control and the samples rehydrated with

ergosterol at the other two doses (Table 1).

It also affected the duplication rate, which was higher than the control and the other evaluated

samples. Similar differences were observed in L4 rehydrated with a 0.5 N or N dose of

ergosterol. As can be seen from Table 1, µmax and Nmax for L4 (0.44 h–1 and 0.12, respectively)

Capítulo IV


113

doubled the values for L2 (0.22 h–1 and 0.06, respectively) and none of the activators

succeeded in increasing them in either strain.

Rehydration in the presence of the tested activators had effect on either µmax or Nmax; thus, the

strain that started cell division later (L4), grew faster. This could be a result of the fact that the

slower the yeast adaptation to the medium, the most adequate the fermentation conditions

(physiological conditions, cell structure or nutrient transport).

Table 1. Growth kinetics of L2 and L4 strains rehydrated with ergosterol + Tween 80, FH4 or Mn II at half (0.5N), normal (N) and double (2N) doses measured by means of optical density at 600 nm. Controls: Tween 80 (rehydration with Tween 80) and Blank (rehydration with phisiological solution). N0- initial population, Nmax- maximum population, µmax- maximum specific growth rate (h–1), T-lag- lag time (h) and T-d- duplication time (h). Values are means of n = 8 ± standard deviation.

3.3. Phospholipids and neutral lipids

Overall, PLs contents were higher in L2 than in L4 irrespective of the particular rehydration

treatment (Figures 2A and 2B). On the other hand, the NLs content was invariably higher in

L4 (Figures 3A and 3B).

The ergosterol treatment significantly increased the content in phosphatidylcholine and

phosphatidylinositol–phosphatidylserine in L2 membrane (Figure 2A), as well as those in all

neutral lipids except lanosterol (Figure 3A). Worth special note is the accumulation of

ergosterol in L2 treated with this activator, and also the increase in sterol esters resulting

Capítulo IV


114

from esterification of sterols. On the contrary, ergosterol had influence neither the composition

nor the concentration of the L4 strain phospholipids, exception done for PA, whose

concentration diminished significantly (Figure 2B).

A)

B)

Figure 2. Concentration (µg/mg dry weight) of phosphatidic acid (PA), phosphatidylethanolamine (PE),

phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylinositol + phosphatidylserine (PI + PS) determined by TLC in L2 (A) and L4

(B) strains.

Treatments: ( ) ergosterol, 0.5N; ( ) ergosterol, N; ( ) FH4, 0.5N; ( ) FH4, N; ( ) Mn II, 0.5N; ( ) Mn II, N.

Controls: ( ) Tween 80 (rehydration with Tween 80); ( ) Blank (rehydration with physiological solution). Values are

means of n= 3 ± standard deviations.

(*) Significantly different from the control (p ≤ 0.05, n = 3).

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0

2

4

6

8

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12

PA PE PC PI+PS

µg

/m

g d

ry w

eig

ht

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0

2

4

6

8

10

12

PA PE PC PI+PS

µg

/m

g d

ry w

eig

ht

Capítulo IV


115

FH4 increased the contents in phospholipids and some neutral lipids (squalene, sterol esters

and lanosterol) of L2. By contrast it caused a slight decrease in the PL concentration of L4 at

half-dose (0.5N), but increased them at the normal dose (N) but never overcoming

significantly the value of the control.

Manganese II affected significantly neutral lipids in both yeasts; thus, it decreased the

contents in all PLs of L4 and almost all of them in L2 (except PA) (Figures 2 and 3).

Based on the kinetic study results, T-lag, (Table 1), ergosterol was the most efficient

activator. Therefore, its presence can have a beneficial effect on both yeasts. Ergosterol has

been found to accumulate in cells during the initial fermentation stage (Higgins, Beckhouse,

Oliver, Rogers, & Dawes, 2003); also, it is added together with some amino acids and vitamins

to some yeast preparations in order to accelerate the fermentation (Pozo-Bayón, Andújar-

Ortiz, & Moreno-Arribas, 2009). As stated above, this compound was the most efficient

activator for both yeast strains.

Tween 80 had an unexpected effect: whereas L2 was unaffected by its presence, L4 exhibited

increased amounts of all neutral lipids (Figure 3).

Capítulo IV


116

A)

B)

Figure 3. Concentration (µg/mg dry weight) of squalene, sterol esters, triacylglycerides (TAG), lanosterol, ergosterol and fatty acids (FA) determined by TLC in L2 (A) and L4 (B) strains. Treatments: ( ) ergosterol, 0.5N; ( )

ergosterol, N; ( ) FH4, 0.5N; ( ) FH4, N; ( ) Mn II, 0.5N; ( ) Mn II, N.

Controls: ( ) Tween 80 (rehydration with Tween 80); ( ) Blank (rehydration with physiological solution). Values are means of n= 3 ± standard deviations. (*) Significantly different from the control (p ≤ 0.05, n = 3).

3.4. Fatty acid composition

The composition of plasma membrane is especially relevant to the production of industrial

yeast strains in submerged stirred cultures; thus, enriching cell membranes with linoleic acid

(C18:2) and ergosterol has been found to improve their ethanol tolerance (Rose, 1993).

Table 2 lists the proportions of membrane fatty acids in the yeasts after rehydration with the

different activators. Overall, the activators had little impact on such proportions. L2

membranes had higher contents in C18 fatty acids (stearic, oleic, linoleic and linolenic) than L4

membranes irrespective of the particular treatment; therefore, this variable is strain-

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3

4

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7

8

9

Squalene Sterolesters

TAG Lanosterol Ergosterol FA

µg

/m

g d

ry w

eig

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0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Squalene Sterolesters

TAG Lanosterol Ergosterol FA

µg

/m

g d

ry w

eig

ht

Capítulo IV


117

dependent since already it is known. By contrast L4, contained greater amounts of C16:0 and

C16:1. Rehydrating with manganese II (N) or FH4 at any dose significantly increased the

content in C18:2 of L4. In same manner, N dose of FH4 increased C14:1 of L2. By contrast, the

presence of ergosterol decreased the content in C18:3 of L4.

Table 2. % composition of fatty acids (C14:1, C16:0, C16:1, C18:0, C18:1, C18:2 and C18:3) in L2 and L4 strains rehydrated with ergosterol + Tween 80 (A1), FH4 (A2) and Mn II (A3) at half (0.5N) and normal (N) doses. Controls: Tween (rehydration with Tween 80) and Blank (rehydration with physiological solution). Values are means of n = 3 ± standard deviation.

(*) statistically significant differences of the treated sample respect to its control/blank (one-way ANOVA; p ≤0.05; n = 3).

As can be seen in Table 3, the contents in saturated (SFAs) and unsaturated fatty acids

(UFAs) were similar (i.e. treatment-independent) in all samples, with no significant differences

among activators or doses. Nevertheless, L2 showed a lesser SFA and higher UFA content than

L4. Moreover, mean Chain length (ChL) was similar in both strains. Besides, only ergosterol (N

dose) caused a statistically significant change (a decrease) in ChL, and exclusively in L2.

Capítulo IV


118

Table 3. % (µg/mg dry weight) of saturated (SFA, C16:0, C18:0) and unsaturated (UFA, C14:1, C16:1, C18:1, C18:2 and C18:3) fatty acids and chain length [ChL= Ʃ (Ci·nC,i)/Ʃ Ci] of L2 and L4 strains after rehydration with ergosterol +

Tween 80; FH4 and Mn II at half (0.5N) and normal (N) doses. Controls: Tween 80 (rehydration with Tween 80) and Blank (rehydration with physiological solution). Values are means of n = 3 ± standard deviation.

(*) statistically significant differences of the treated sample respect to its control/blank (one-way ANOVA; p ≤0.05; n = 3).

In summary, metabolic activators treatment modified (increased or decreased) the production

of fatty acids in both yeasts, but failed to alter their proportions.

Capítulo IV


119

4. Conclusions

Both strains showed different viability, L2 exhibited the highest viability in all cases. This could

be a consequence of a specific strain factor. Numerous extrinsic variables in relation with the

transport and the conservation of the dry yeasts could influence this parameter too.

Rehydration in the presence of the tested molecules caused no substantial change in cell

viability, which suggests that maybe yeasts require a longer exposure time.

Ergosterol was proved to be the most efficient of the three activators assayed. Based on the

kinetic results, 0.5N dose reduced the lag time of both yeast strains. It also improved cell

viability and membrane lipid composition; tetrahydrofolic acid raised neutral lipid levels; and

manganese II increased cell viability and modified phospholipid composition and linoleic acid

concentration. All activators interacted with yeasts in a strain-dependent way.

Though already it is known, content of membrane fatty acids is strain-dependent. Overall, the

activators had little impact on such proportions. L2 cell membranes had higher contents in C18

fatty acids (stearic, oleic, linoleic and linolenic) than L4 cell membranes.

Also, although ergosterol treatment resulted in cellular accumulation of this lipid, it also

happened when using just physiological solution for rehydration. A quantitative analysis for

lipids revealed the presence of not only free but also esterified ergosterol (as sterol esters).

These changes in neutral lipid composition make yeasts more robust and efficient in industrial

processes.

It should be noted that the target parameters were assessed on freshly rehydrated yeasts.

Taking into account that the above-described changes occur within the first 24 h of cell

growth, it would therefore be interesting to perform another subsequent sampling in order to

ensure that the effect of the treatment is diluted by an excessive number of generations.

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Bacterial Growth Curve. Applied and Environmental Microbiology, 56 (6), 1875–1881.

Conclusiones generales

Conclusiones Generales


125

9. Conclusiones generales

1) Los activadores se comportaron de diferente manera dependiendo de la cepa estudiada

y del punto de muestreo. Los resultados de vitalidad fueron muy dispares, obteniendo

valores positivos y negativos en función de la cepa y activador evaluados, excepción del

ácido ascórbico, que mejoró la vitalidad en cuatro cepas de Saccharomyces cerevisiae

comerciales. Este compuesto mejoró además la actividad metabólica así como la tasa

máxima de crecimiento (µmax) y el consumo de azúcares en las cepas estudiadas.

2) El mejor binomio levadura- activador se obtuvo para la cepa L4 rehidratada con ácido

ascórbico, en parámetros de mejor cinética fermentativa, vitalidad y niveles de azúcar

residual, glicerol y etanol.

3) El ergosterol mejoró la vitalidad de dos cepas comerciales de Saccharomyces

cerevisiae. Asimismo su dosis N mejoró el perfil de consumo de azúcares en condiciones

de parada fermentativa, en la cepa L2. En cuanto a la cepa L4, este activador consiguió

mejorar su discrepancia de consumo fructosa/ glucosa a dosis N y 2N.

4) El preparado comercial sólo arrojó resultados positivos para la cepa L2, mejorando su

perfil de consumo de azúcares en condiciones de parada fermentativa.

5) No hubo relación dosis- respuesta para ninguna cepa ni activador en las condiciones

estudiadas.

6) Se demostró un elevado grado de cepa- dependencia en todos los estudios y

condiciones evaluadas, confirmado además por la separación en el plano al llevar a

cabo un análisis de componentes principales (PCA).

7) La adición de ergosterol disminuyó la fase de latencia y mejoró el perfil lipídico de la

cepa L2, aumentando la concentración de algunos fosfolípidos (PL), lípidos neutros (NL)

y ácidos grasos (FA) saturados e insaturados, en la membrana celular de esta LSA. Por

el contrario, en el caso de la cepa L4, el tratamiento con activadores provocó una

disminución en la concentración de lípidos, concretamente PL y NL.

8) La rehidratación de la cepa L4 en presencia de ácido ascórbico ha demostrado influir

en el transporte de azúcares (concretamente en el gen Hxt3) y mejorar el perfil de

consumo fructosa- glucosa.

9) Los resultados evaluados mostraron un elevado grado de cepa- dependencia. Se

concluye por tanto que no existe un activador universal, de tal forma que el mismo

Conclusiones Generales


126

compuesto puede dar resultados contradictorios en función de la cepa, variable y dosis

analizadas.

10) Se propone la idea del diseño de activadores "a la carta", es decir, que en caso de

formular un preparado mono-sustancia habría que ensayar cada molécula-dosis para

cada cepa de levadura y continuar profundizando en el estudio de parámetros que

definen la bondad de un proceso fermentativo.

11) Ningún activador fue capaz de transformar una cepa deficiente en una adecuada, pero

sí de modular su actividad.

12) Por los resultados obtenidos en esta investigación, se abren nuevas hipótesis de

trabajo: una basada en el estudio del binomio producción-desecación, tratando las

cepas con cualquier activador y analizando el efecto que tiene en los parámetros

prácticos de fermentación (cinética y metabolitos mayoritarios); la otra consistiría en

ensayar el efecto de estos activadores sobre el binomio fructofilia-glucofilia a distintos

tiempos de fermentación ya que este desequilibrio es motivo de interés tecnológico y,

paralelamente, efectuar un estudio de expresión génica.

Publicaciones y comunicaciones en

congresos

Publicaciones y comunicaciones en congresos


128

10. Publicaciones y comunicaciones en congresos

10.1. Publicaciones

Autores (p.o. de firma): P. Díaz- Hellín, J. Úbeda, A. Briones.

Título: Improving alcoholic fermentation by activation of Saccharomyces species during the

rehydration stage.

Ref. Revista: LWT- Food Science and Technology.

Artículo Fecha: Aceptado Junio 2012. Publicación Enero 2013.

DOI: 10.1016/j.lwt.2012.06.011

Autores (p.o. de firma): P. Díaz- Hellín, J. Úbeda, A. Briones.

Título: Study of two wine strains re-hydrated with different activators in sluggish fermentation

conditions.

Ref. Revista: European Food Research and Technology.

Artículo Fecha: Enviado Enero 2013.

Autores (p.o. de firma): Patricia Díaz-Hellín, Sergio Gómez- Alonso, Anna Borrull, Nicolas

Rozès, Ricardo Cordero-Otero, Juan Úbeda.

Título: Membrane lipid variability in Saccharomyces cerevisiae wine strains rehydrated in the

presence of metabolic activators.

Ref. Revista: Food Chemistry.

Artículo Fecha: Enviado Enero 2013.

Autores (p.o. de firma): Patricia Díaz-Hellín; Victoria Naranjo; Juan Úbeda; Ana Briones.

Título: Hxt3 gene expression in a S. cerevisiae strain mediated by metabolic activators under

sluggish and optimal fermentation conditions.

Ref. Revista: Food Microbiology.

Artículo Fecha: Enviado Febrero 2013.

10.2. Comunicaciones en congresos

10.2.1. Congresos nacionales

AUTORES: P. Díaz- Hellín.

TÍTULO: "Metabolismo fermentativo de Saccharomyces cerevisiae".

TIPO DE PARTICIPACIÓN: Póster.

CONGRESO: I Jornadas Doctorales de Castilla La Mancha.

LUGAR DE CELEBRACIÓN: Ciudad Real.

FECHA: Febrero de 2010.

AUTORES: Patricia Díaz- Hellín Patiño.

TÍTULO: "Mejora de la actividad fermentativa de levaduras en el proceso de vinificación".

TIPO DE PARTICIPACIÓN: Comunicación oral.

CONGRESO: Ciencia Joven 2011.


FECHA: Mayo 2011.



129

AUTORES: Juan Úbeda, Patricia Díaz- Hellín, Ana Briones.

TÍTULO: "Mejora de la fermentación vínica mediante la activación de Saccharomyces sp. en la

rehidratación".


CONGRESO: XI Congreso Nacional de Investigación enológica. GIENOL 2011.

LUGAR DE CELEBRACIÓN: Jerez (Cádiz).

FECHA: Junio de 2011.

ISBN: 978-84-938945-6-6.

AUTORES: Úbeda, J., Díaz- Hellín, P., Fernández- González, M., Briones, A.I.

TÍTULO: "Vitalidad de dos cepas comerciales de Saccharomyces sp. rehidratadas en presencia

de activadores metabólicos: Relación dosis-respuesta".


CONGRESO: VII Congreso Español de la Ingeniería de los Alimentos. CESIA 2012.


FECHA: Noviembre 2012.

ISBN: 978-84-695-4196-8

AUTORES: Úbeda, J., Díaz- Hellín, P., Fernández,- González M., Briones, A.I.

TÍTULO: "Estudio de la mejora del carácter fructofílico de Saccharomyces sp. mediante el

empleo de activadores metabólicos".





ISBN: 978-84-695-4196-8

AUTORES: Mónica Fernández-González, Nuria Barrajón, Patricia Díaz-Hellín y Juan Úbeda.

TÍTULO: "Comparación de la cinética de fermentación de 27 cepas de Saccharomyces

cerevisiae vínicas en mostos muy azucarados".





ISBN: 978-84-695-4196-8

AUTORES: Mónica Fernández-González, Patricia Díaz-Hellín y Juan Úbeda.

TÍTULO: "Estudio de la eficiencia de esporulación, viabilidad y tipo sexual de las ascoesporas

obtenidas de 27 cepas de Saccharomyces cerevisiae vínicas".





ISBN: 978-84-695-4196-8



130

AUTORES: Patricia Díaz- Hellín, Victoria Naranjo, Juan Úbeda, Ana Briones.

TÍTULO: "Expresión del gen Hxt3 mediada por activadores metabólicos en condiciones óptimas

y de parada fermentativa en una cepa de S. cerevisiae".


CONGRESO: GIENOL 2013.

LUGAR DE CELEBRACIÓN: Madrid.

FECHA: 18-21 Junio 2013.

10.2.2. Congresos internacionales

AUTORES: P. Díaz- Hellín, J. Úbeda, N. Barrajón, A. Briones.

TÍTULO: "Improvement of the Fermentative Behavior of wine strains by the use of Activators".


CONGRESO: XXXIV World Congress of the International Organization of Vine and Wine 2011

(OIV 2011).

LUGAR DE CELEBRACIÓN: Oporto (Portugal).

FECHA: Junio 2011.

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