IDENTIFICACIÓN DE LOS POSIBLES ACTIVADORES DE LOS GENES fbpA yIDENTIFICACION DE LOS POSIBLES ACTIVADORES DE LOS GENES fbpA y fbpC INVOLUCRADOS EN LA RESPUESTA DE
Mycobacterium tuberculosis AL TRATAMIENTO CON ISONIACIDA
IBETH CRISTINA ROMERO CALDERON
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para obtener el título de MAGISTER EN CIENCIAS BIOLOGICAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
1
IDENTIFICACION DE LOS POSIBLES ACTIVADORES DE LOS GENES fbpA y fbpC INVOLUCRADOS EN LA RESPUESTA DE
Mycobacterium tuberculosis AL TRATAMIENTO CON ISONIACIDA
____________________________________
____________________________
2
Nota de Aprobación
____________________________ ____________________________
____________________________ ___________________________ Dr. Raúl Potou Dr. Fredy Gamboa Jurado Jurado
3
NOTA DE ADVERTENCIA
Articulo 23 de la resolución No 13 de julio de 1946:
La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus tesis de grado.
4
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. John Walker, Director de este trabajo, quien con su orientación,
paciencia, dedicación y exigencia constantes, ha contribuido no sólo al
desarrollo de esté proyecto, sino que ha hecho posible mi crecimiento
profesional y personal al brindarme la oportunidad de hacer parte de su
grupo de investigaciones; lo mismo que su valiosa amistad, motivación y
confianza brindadas. GRACIAS.
A, Rafael Góngora “Don Raffa”, amigo y compañero de trabajo quien con
sus sabios consejos, su apoyo y asesoría continua, ha contribuido a la
culminación de éste trabajo, siendo protagonista en su desarrollo. Gracias
Rafita.
A Carolina Vergel, por la confianza brindada, al permitirme continuar
desarrollando éste proyecto que nació como una pequeña idea, además por
su asesoría y ayuda a pesar de la distancia.
A todos mis amigos y compañeros de UB&BM, especialmente LuzDa, Caro
G., Monic, Leyder y Claris, quienes me han brindado su valiosa amistad y
me han enseñado el valor que ella tiene; también por su ayuda durante la
realización del proyecto.
5
Al CIDEIM, por las facilidades y el apoyo brindado lo que contribuyó al buen
desarrollo y culminación de este trabajo de tesis.
También agradezco al Programa Especial para la Investigación y
Entrenamiento en Enfermedades Tropicales (TDR) de la Organización
Mundial de la Salud (WHO), por el soporte financiero [Project Development
Grant (PDG) Code A40270]; así mismo al Instituto Colombiano para el
Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología "Francisco José de Caldas"
(COLCIENCIAS) [Centro Colombiano de Investigación en Tuberculosis
CCITB, Código No.431].
Al Laboratorio de Investigaciones en Micobacterias de la Universidad del
Estado de Colorado (CSU, USA), especialmente a los Drs. John Belisle,
Richard Slayden y Patrick Brennan por proveer el entrenamiento y
reactivos para los estudios de expresión realizados previos a esta
investigación los cuales dieron soporte a ésta; así mismo a la Dra. Karen
Dobbos por las fracciones de proteína citosólicas gentilmente donados y
facilitar los análisis por espectrometría de masas de algunas de unas de las
proteínas aisladas.
Functional Genomics Facility, Universidad de Glasgow, U.K.) por realizar la
gran mayoría de los análisis de espectrometría de masas.
6
DEDICATORIA
y ser la luz que me ha guiado en este
sendero, proporcionándome sabiduría y
mi vida.
comprensión en todos los momentos de mi
vida, quienes con su fé y constante apoyo
me han ayudado a alcanzar la cumbre
siendo los artífices de éste nuevo logro; a
ellos este trabajo como una pequeña
muestra de mi amor y gratitud.
A mi hermanita Martha, mi amiga y
consejera; quien con su cariño, ternura y
apoyo constantes, me ha enseñado que la
perseverancia es el camino que lleva a
escalar las cumbres del éxito. Gracias por
ser mi fortaleza en los momentos más
difíciles de mi vida.
ayuda permanentes contribuyendo no sólo
en mi formación profesional sino personal.
Ibeth Cristina.
P ág.
RESUMEN 13
1 INTRODUCCIÓN 15 2 MARCO TEÓRICO 18 2.1 El Impacto de la Tuberculosis sobre la salud humana 18 2.2 Biología y Clasificación del género Mycobacterium 24 2.3 Patogénesis y manifestaciones clínicas de la enfermedad 26 2.4 Diagnóstico 32 2.4.1 Métodos convencionales 32 2.4.2 Métodos moleculares 37 2.4.3 Otras técnicas 38 2.5 Inmunología de la Tuberculosis 39 2.6 Fisiología y metabolismo 41 2.7 Genoma de Mycobacterium tuberculosis 50 2.8 Tratamiento y resistencia a drogas 52 2.8.1 Respuesta al tratamiento con isoniacida (INH) 58 2.9 Antígeno 85 un posible blanco de nuevas drogas 61 3 OBJETIVOS 67 3.1 Objetivo General 67 3.2 Objetivos Específicos 67 4 MATERIALES Y METODOS 69 4.1 Materiales 69 4.1.1 Micobacterias 69 4.1.2 Extracto de proteínas 69
4.1.3 Iniciadores para PCR 71 4.2 Métodos 72 4.2.1 Extracción de ADN de Mycobacterium tuberculosis 73 4.2.2 Ensayos de PCR 74 4.2.3 Análisis del producto de amplificación 74
8
4.2.4 Clonación de los promotores de los genes fbpA y fbpC 75 4.2.5 Ensayos de unión al ADN “pull down asssay” 76 4.2.6 Separación de proteínas mediante electroforesis en eles de
poliacrilamida 78
4.2.7 Detección de proteínas 80 4.2.8 Identificación de proteínas utilizando espectrometría de masas
(EM) y bioinformática 80
5 RESULTADOS 83 5.1 Aislamiento y clonación de las regiones promotoras de los genes
fbpA y fbpC 83
5.2 Ensayos de unión a ADN “pull down assay” 87 6 DISCUSION 106 7 CONCLUSIONES 116 8 PERSPECTIVAS 117 9 ANEXOS 119 10 BIBLIOGRAFIA 145
9
P ág.
ANEXO 1. Geles de Agarosa 119 ANEXO 2. Purificación de bandas de ADN a partir de geles de agarosa
de bajo punto de fusión, con el Kit Wizard Sv Gel Y “PCR Clean Up System” de Promega.
122
ANEXO 3. Ligación de productos de PCR a vector pGEM-T EASY de Promega.
123
ANEXO 4. Transformación de células competentes 124 ANEXO 5. Extracción de Plásmidos – Miniprep – con el kit Wizard de
Promega. 128
ANEXO 6. PCR-COLONY (confirmación de insertos dentro de las células transformadas).
131
ANEXO 7. Separación de Proteínas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida.
133
ANEXO 8. Tinción con Plata. 139 ANEXO 9. Secuenciación, región promotora del gen fbpA. 141 ANEXO 10. Secuenciación región promotora del gen fbpC. 143 ANEXO 11. Dominio HTH (Hélice giro Hélice) de unión a ADN de la
proteína hipotética C3 de M. tuberculosis. 144
10
Pág.
Tabla 1. Clasificación de las Micobacterias según Runyon. 27 Tabla 2. Complejos enzimáticos de los sistemas FAS-I y FAS-II. 49 Tabla 3. Clasificación funcional de los genes de Mycobacterium
tuberculosis. 51
Tabla 4. Principales fármacos de uso contra la tuberculosis. 55 Tabla 5. Iniciadores usados para amplificar la región promotora corriente. 71 arriba de los genes fbpAC.
Tabla 6. Programas de PCR. 75
Tabla 7. Identificación de proteínas con alta afinidad por los promotores 102 de los genes fbpA (A1-A6) y fbpC (C1-C7) de Mycobacterium
tuberculosis por espectrometría de masas (EM).
11
LISTA DE FIGURAS P
ág. Figura 1. Incidencia global de tuberculosis 2004. 19 Figura 2. Tasa total de incidencia de tuberculosis en Colombia 2005. 23 Figura 3. Representación esquemática de la envoltura de M. tubercuolosis 25 Figura 4. Fotografía del cultivo de micobaterias en medio Lowenstein Jensen. 26 Figura 5. Mycobacterium tuberculosis en esputo. Coloración de Ziehl-
Neelsen. 34
35
Figura 7. Representación esquemática de la pared celular de M.tuberculosis. 45 Figura 8. Esquema de la estructura primaria del PG bacteriano. 46 Figura 9. Esquema del proceso de acetilación de la INH. 62 Figura 10. Secuencia de las regiones promotoras de los genes fbpA y fbpC 72 Figura 11. Esquema del ensayo de unión a ADN “pull down assay”. 79 Figura 12. Cuantificación de la expresión de los genes fbpABC e iniBAC 84 Figura 13. Análisis electroforético de la región promotora de los genes fbpA y
C de M. tuberculosis amplificada por PCR a partir de ADN genómico.
85
Figura 14. Análisis electroforético de la región promotora de los genes fbpA y C de M. tuberculosis amplificada por PCR a partir de ADN plasmídico.
86
Figura 15 Alineamiento múltiple entre las secuencias nucleótidicas de los clones A1, A2 y el promotor del gen fbpA.
87
Figura 16. Alineamiento múltiple entre las secuencias nucleótidicas de los clones C1, C2 y el promotor del gen fbpC.
88
Figura 17. Ensayo de proteínas de unión a ADN “pull-down” usando el extracto citosólico preabsorbido y ADN región promotora del gen fbpA. SDS-PAGE (gel homogéneo al 10%) teñido con plata.
89
Figura 18. Ensayo de proteínas de unión a ADN usando el extracto citosólico preabsorbido y ADN región promotora del gen fbpA
90
Figura 19. Ensayo de proteínas de unión a ADN usando el extracto citosólico preabsorbido y ADN región promotora del gen fbpC.
91
Figura 20. Ensayo de proteínas de unión a ADNusando el extracto citosólico preabsorbido y ADN región promotora del gen fbpA.
93
Figura 21. Alineamiento múltiple entre las secuencias patrón del motivo de unión al ZN familia citidina deaminasa y la secuencia de la proteína hipotética Rv0828c de M.tuberculosis (C7).
99
Figura 22 Comparación estructural de la proteína hipotética C3 de M. tuberculosis y la proteína MarR de E. coli (1jGS).
101
12
RESUMEN
uno de los candidatos más promisorios como nuevo blanco de
medicamentos. Este antígeno comprende tres proteínas distintas (Ag85A,
B, C) codificadas por los genes fbpA,B y C, los cuales están involucrados no
sólo en la biosíntesis de la pared celular, sino también en la patogénesis
debido a que poseen un dominio de unión a fibronectina que se une a los
macrófagos durante la infección; además están implicados en la respuesta al
tratamiento con isoniacida (INH), un anti-micobacteriano de uso clínico. El
objetivo del presente trabajo fue identificar las proteínas con alta afinidad por
la región promotora de los genes fbpA y C, posibles activadores involucrados
en la sobre-expresión de éstos genes en respuesta al tratamiento con INH.
La region promotora corriente arriba [ región 5’ no traducida (UTR)] de los
genes fbpA y C biotinilada fue usada junto con perlas magnéticas cubiertas
con estreptavidina en los ensayos de unión al ADN para aislar proteínas
con alta afinidad apartir de extractos citosólicos de M. tuberculosis tratado
con INH. El análisis por 1-SDS-PAGE de las fracciones aisladas reveló 6
polipéptidos (A1-A6; Mr 61-28 kDa) con alta afinidad por el promotor fbpA y 7
más (C1-C7; Mr 97-15 kDa) con especificidad por el promotor fbpC. La
identificación de todas las proteínas por espectrometría de masas [LC-ES-
13
medicamentos, respuesta a estres, metabolismo y división celular; los cuales
incluyen proteínas de choque térmico (como el antígeno groEL2), proteínas
con unión a ADN (transposasas y represores); oxidoreductasas
(catalasas/peroxidasas), enzimas metabólicas (Malato deshidrogenasa, y
Enoil-CoA hidratasa) y proteínas conservadas (FtsK/SpoIIIE). De éstas la
proteína hipotética C3, que pertenece a la familia de represores MarR
demuestra un mayor potencial como posible regulador de los genes fbpA y C
y es uno de los principales candidatos para los estudios de validación
funcional usando sistemas de plásmidos reporteros y de esta forma
determinar si la proteína tiene algún efecto sobre el promotor de los genes
fbps; es decir confirmar su función en la regulación de estos y para futuras
investigaciones dirigidas a la manipulación genética y evaluación de blancos
terapéuticos.
14
1. INTRODUCCION
Debido al incremento en la incidencia global de la tuberculosis, así como al
incremento de aislados del agente causante Mycobacterium tuberculosis
multirresistentes a drogas en uso clínico (Bloom & Murria, 1992), es urgente
encontrar blancos para desarrollar nuevas medicamentos para el tratamiento
de esta enfermedad que permitan revertir o evitar resistencia a los fármacos
en uso.
Dentro de los candidatos más promisorios como blancos para medicamentos
esta el complejo antígeno 85, compuesto por tres proteínas distintas
(trehalose dimycolyl transferasas) codificadas por los genes fbpA, fbpB, y
fbpC e involucradas en el último paso de la biosíntesis de la pared celular,
particularmente en la síntesis de ácidos micólicos (Belisle et al., 1997).
Adicionalmente, estas enzimas parecen estar jugando un papel importante
en la patogenicidad de la micobacteria, debido a que poseen un dominio de
unión a fibronectina, el cual es responsable de la unión a los macrófagos
humanos durante el inicio de la infección. Estudios de inactivación génica
han demostrado que estos genes y sus proteínas son importantes para la
construcción de una pared micobacteriana normal, así como para el
crecimiento celular (Jackson et al., 1999; Armitige et al., 2000; Harth et al.,
2002).
15
Por otro lado, estudios de expresión usando microarreglos, al igual que las
aproximaciones proteómicas han demostrado la sobre-expresión de los
genes fbpABC en respuesta al tratamiento con Isoniacida (INH) (Garbe et al.,
1996; Wilson et al., 1999). A pesar de que los genes del antígeno 85 están
bien caracterizados (Content et al, 1991; Ohara et al, 1997), el mecanismo
por el cual su expresión es regulada aún es desconocido.
Recientemente se demostró que la sobre-expresión del gen fbpC no puede
explicarse por la presencia de algún tipo de mutación en el promotor o en el
gen mismo (Ramaswamy et al., 2003). Es así como se plantea entonces la
existencia de un mecanismo de retroalimentación positiva, en el cual estos
genes son sobre-expresados como respuesta al descenso en la síntesis de
ácidos micólicos maduros (Wilson et al., 1999), como un mecanismo de
compensación esencial para la biosíntesis de la pared y la integridad celular,
sin el cual la micobacteria no sería viable. Por tanto el entendimiento del
mecanismo de regulación de estos genes (fbpABC), puede proveer
información importante para el desarrollo de nuevas medicamentos anti-
tuberculosis, además de contribuir al entendimiento global de éste patógeno.
En análisis previos usando PCR en tiempo real (qRT-PCR) e inmunoblot se
confirmó una diferencia en los niveles de expresión (a nivel mRNA y nivel
proteíco) de los genes fbpA y fbpC en células tratadas con concentraciones
16
dos veces mayores a la concentración inhibitoria mínima (CIM) de INH,
comparada con las células control (no tratadas). Se determinó que el gen
fbpA tuvo una mayor expresión (5.44 veces) seguido por el gen fbpC (3.47
veces) en tanto que el fbpB presentó un nivel de expresión similar al control
sin medicamento. Aunque a nivel proteico las diferencias en expresión de
fbpA y fbpC no son tan marcadas como a nivel del mRNA, cabe resaltar que
sí se logra notar un aumento en la cantidad de antígeno 85 presente en las
células tratadas con 2x CIM de (INH) y una disminución en las células
tratadas con la mitad del CIM.
Teniendo en cuenta lo anterior, en este trabajo se caracterizó
molecularmente los promotores de los genes fbpA y fbpC de M. tuberculosis
los cuales fueron utilizados para aislar e identificar proteínas con alta afinidad
de unión por esta región promotora, siendo posibles reguladores de estos
genes y estando involucradas en el mecanismo de retroalimentación positiva;
las cuales debido a su importancia a nivel celular, pueden ser un nuevo
blanco de medicamentos contra la tuberculosis.
17
2. MARCO TEORICO
2.1. El impacto de la tuberculosis (TB) sobre la salud humana.
La tuberculosis (TB) es una enfermedad re-emergente que constituye uno
de los problemas de salud pública de mayor gravedad a nivel mundial debido
al constante incremento en las tasas de morbilidad y mortalidad (Clarck-
Curtiss & Haydee 2003; Garocica et al., 2005). La Organización Mundial de
la Salud (OMS) estima que alrededor de 9 millones de nuevos casos de TB
son diagnosticados anualmente. Aunque la probabilidad de desarrollar la
enfermedad activa es tan sólo de un 5-10% para la mayoría de infectados;
es de resaltar que de los individuos con TB activa al menos 2 millones de
personas en el mundo mueren cada año por causa de ésta enfermedad
(Nachega et al., 2003; WHO 2005 y 2006).
Para el año 2004 199 de los 211 países que participan en el programa de la
OMS sobre vigilancia, planificación y financiación de la lucha mundial contra
la TB, reportaron casos, en donde el 81% del total de casos nuevos se
presentaron en Asia y África, el 17% en Latinoamérica y sólo el 2% en
Norteamérica. A pesar que América Latina se ubica en el tercer lugar de
incidencia para ésta enfermedad; la tuberculosis constituye un serio
problema de salud en la región. Cada año se notifican cerca de 250.000 -
18
300.000 nuevos casos de los cuales mueren alrededor de 20.000 (Potter et
al., 2005; WHO 2005); siendo Brasil, Perú y México los países que tienen
las mayores incidencias (Organización Panamericana de la Salud., 2004)
(Figura 1).
Se estima que entre 2002 y 2020, cerca de 150 millones de personas
enfermarán y 36 millones morirán de tuberculosis, si no se fortalecen las
medidas existentes para el control de la enfermedad (WHO 2005).
Figura 1. Incidencia global de tuberculosis 2004. Tomado y modificado de: WHO: Global Tuberculosis Control. 2005.
19
Muchos factores han contribuido al resurgimiento y progresión de la
tuberculosis que se empezó a darse a partir de 1985. En primer lugar la
pandemia del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), debido al
incremento en la propagación del Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)
el cual afecta el sistema inmune de las personas, que permite tanto una
reactivación de una antigua infección así como un aumento de la
susceptibilidad a una nueva. Se ha estimado que cerca de un tercio de los
aproximadamente 40 millones de casos de VIH en el mundo se encuentran
co-infectados con ésta micobacteria y que el riesgo de desarrollar una TB
clínica es del 10% por año para este grupo de individuos (Buitrago et al.,
1999).
Los cambios sociales que van acompañados de un aumento del índice de
pobreza, la inmigración de personas desde áreas de alta incidencia, que
conduce al hacinamiento en las grandes urbes son un segundo factor
importante. Es claro cómo las tasas más altas de enfermos y fallecidos se
registran en los países más pobres; en los cuales el riesgo de desarrollar TB
es 50 veces mayor que en los países desarrollados (Garcia-Garcia et al.,
2000; Smith 2003). Así mismo la falla en los sistemas de control de la Salud
Pública y la escasa asignación de recursos para la investigación de nuevas
medicamentos, nuevos métodos diagnósticos y vacunas en estos países
contribuyen en gran medida al recrudecimiento de la enfermedad.
20
Otro factor desencadenante ha sido la aparición de cepas del bacilo
multirresistentes (MDR) a los agentes antimicrobianos utilizados para
controlar la enfermedad; lo cual ha sido debido en gran parte a esquemas de
terapia incorrectos e incumplimiento en los tratamientos (Bloom & Murray
1992; WHO, 2002 y 2005), es así como la OMS en su programa de vigilancia
mundial en tuberculosis ha reportado una prevalencia de cepas de M.
tuberculosis con MDR primaria del 1,4% (rango 0-14%) en tanto que la MDR
secundaria ha sido mucho mayor del 13% (rango 0-54%) (Tobón 2001;
Sharma & Mohan 2004b; Said-Fernández et al., 2005). A pesar de que la
implementación de medidas de control ha sido baja lo cual predice niveles de
MDR altos, en Colombia los resultados de las encuestas de vigilancia
epidemiológica realizadas no corresponden a lo esperado; en la primera
(1999) se muestra una MDR de tan sólo 0,5% y para la segunda encuesta
(2000) hubo un ligero aumento 1,5%, éstos reportes previos en el país hacen
sospechar que existen regiones con una prevalencia e incidencia de
resistencia a medicamentos superior al promedio nacional como es el caso
de Buenaventura (Valle del Cauca) en el cual se ha descrito una MDR inicial
del 6% (Chaparro et al., 2004; Moreira et al., 2004).
En Colombia al igual que en muchos países de América Latina, el deterioro
de las condiciones socioeconómicas ha favorecido el incremento y extensión
de los factores de riesgo relacionados con la tuberculosis; factores entre los
que se encuentran, la migración y desplazamiento de población afectada por
21
los conflictos armados agudizando los problemas de hacinamiento no sólo en
las grandes urbes. Adicionalmente, la inestabilidad social, el acceso
inoportuno ó inadecuado al tratamiento son factores que fomentan el
desarrollo de precarias condiciones de vida y que favorecen la diseminación
de los casos.
No obstante, la situación de la tuberculosis en Colombia según el último
reporte de SIVIGILA (2005) es alentadora; en el 2005 la tasa de incidencia
presentó una leve disminución de 0.8% en relación a la del año 2004 (19,8 y
19.97 por 100.000 habitantes respectivamente). Lo cual evidencia la
importancia de incrementar las estrategias de control como son la búsqueda
activa de sintomáticos respiratorios, el diagnóstico, la notificación oportuna
de los casos, el tratamiento y un punto muy crítico el seguimiento
permanente a los casos y a sus contactos y más si se tiene en cuenta que de
los 9.118 casos nuevos de tuberculosis reportados, 84,1% correspondían a
tuberculosis pulmonar, 0,5% tuberculosis meníngea y el 15,4% restante a
otras formas extrapulmonares (Castiblanco & Espinosa 2006,).
Estos reportes permiten dividir el país en 3 zonas principales de acuerdo al
riesgo de contagio (Figura 2), resaltando que los departamentos de
Amazonas, Arauca, Casanare, Guainía, Guaviare, Huila, Meta, Putumayo,
Quindío, Guajira y Valle del Cauca y el distrito de Barranquilla continúan
22
siendo los de mayor riesgo con incidencias mayores a 30 casos por cada
100.000 habitantes (Castiblanco & Espinosa 2006).
Figura 2. Tasa total de incidencia de tuberculosis, Colombia, 2005 Tomado de: Sistema de Vigilancia en Salud Pública, SIVIGILA 2006. Boletín
Epidemiológico Quincenal, Vol. 11 No. 06 Marzo 30 de 2006. Tuberculosis y lepra año
2005.
23
Las micobacterias pertenecen a la familia Mycobacteriaceae, género
Mycobacterium y orden Actinomycetae (con forma de hongo) y son
consideradas formas de transición entre las eubacterias y los hongos.
El género Mycobacterium está integrado por bacilos largos de 3-5 µm de
longitud y 0.2-0.6 µm de ancho; con morfología variable encontrándose
formas cocoides pequeñas así como bacilares largas, no esporulados ni
flagelados con abundantes gránulos citoplasmáticos. La mayoría son
aerobios estrictos como Mycobacterium tuberculosis y microaerófilos como
M. bovis. No producen endotoxinas, exotoxinas, ni enzimas histolícas
conocidas. (Wayne & Kubica 1986).
La envoltura de las micobacterias es una estructura compleja que está
compuesta de la cápsula, la membrana plasmática y la pared celular,
estructuras que proveen protección contra factores múltiples externos y dan
soporte a la célula; además de poseer mecanismos que permiten el
transporte de iones y moléculas para el mantenimiento celular (Figura 3)
(Brennan & Draper 1994; Gorocica et al., 2005).
24
Figura 3. Representación esquemática de la envoltura; 1. Cápsula, 2 y 3.
Pared celular: 2. capa electrón-transparente compuesta por arabinogalactano y
ac.micólicos, 3. capa electrón densa compuesta de peptidoglicano; 4. Membrana.
Plasmática.
Tomado y modificado de: Brennan P. & Draper P. 1994. Tuberculosis.
El género Mycobacterium comprende especies patógenas, oportunistas y
saprofitas. En 1950 Timpe y Runyon propusieron una clasificación útil de
Mycobacterium en cuatro grupos, la cual ha servido de guía para la
identificación y el estudio de éste género. Esta clasificación se basaba en la
velocidad de crecimiento (rápido o lento, según sea superior o inferior a una
semana), producción de pigmento en presencia o ausencia de luz
(fotocromógeno, escotocromógeno y no cromógeno) (figura 4) (Casal &
Casal 2000; Garcia-Garcia et al., 2005).
25
Figura 4. Fotografía del cultivo de Micobacterias crecidas en el medio Lowenstein Jensen. Lado A se observa M. tuberculosis, bacteria no cromógena
de crecimiento lento y en el lado B, una bacteria no tuberculosa fotocromógena el
M. marinum.
Tomado de: Archivo Imágenes de micobacterias, Grupo de TB- CIDEIM.
En la tabla 1 se presenta una clasificación modificada de la original de
Runyon, la cual incluye los miembros del género Mycobacterium de
importancia humana (Casal & Casal 2000).
2.3. Patogénesis y Manifestaciones clínicas de la enfermedad
La TB es una enfermedad crónica y altamente infecciosa producida
principalmente por Mycobacterium tuberculosis, aunque otras micobacterias
fenotípica y genéticamente similares como M. bovis, M. africanum y M.
microtti pueden también causarla.
Tomado y modificado de: Casal & Casal 2000.
Las micobacterias se transmiten a través de pequeñas gotas de secreciones
respiratorias y saliva aerosolizadas por la tos, el estornudo o el habla. Una
vez en el exterior las gotas se evaporan y quedan constituidas solamente por
27
un núcleo pequeñísimo con pocos bacilos tuberculosos viables, que pueden
permanecer suspendidas en el aire durante períodos prolongados. (Clarck-
Curtiss & Haydee 2003; Smith 2003; Bonfioli et al., 2005).
Es importante resaltar que para que se produzca la infección, se requiere de
la confluencia de varios factores exógenos como la presencia de bacilos
viables y en alta concentración en la muestra del enfermo, el grado de
intimidad con el paciente y el ambiente donde se produce el contacto, pues el
hacinamiento y los ambientes cerrados aumentan el riesgo de contraer la
enfermedad. (Araujo et al., 2004).
Adicionalmente también existen unos factores endógenos asociados como la
susceptibilidad genética y la inmunidad celular del hospedero. Ha sido
reconocido que algunas poblaciones parecen tener un alto grado de
vulnerabilidad a la TB. Algunos estudios han permitido identificar que existe
un incremento en el riesgo relativo de transformación de una infección latente
a una enfermedad activa en hospederos humanos que presentan
polimorfismos en el gen NRAMP1, el cual codifica para un transportador de
hierro transmembranal localizado en el endosoma tardío.
A nivel del microorganismo uno de los genes cuya implicación en la
patogénesis de la TB ha sido evaluado es el gen D de la fosfolipasa C
micobacteriana (plcD); los polimorfismos en éste gen han sido fuertemente
28
asociados con una variación en la presentación clínica, siendo muy común la
forma de TB extratorácica (Schluger & Rom 1998; Yew & Leung 2006).
De otra parte, se sabe que las enfermedades que causan alguna alteración
de la inmunidad celular favorecen el desarrollo de la TB activa o tienen un
efecto negativo sobre la progresión de la enfermedad. Este es el caso del
VIH/SIDA; en el cual los pacientes presentan inmunosupresión, lo que
favorece el desarrollo no sólo de formas pulmonares sino también extra-
pulmonares cuyas manifestaciones varían según el grado de compromiso de
la inmunidad celular. Es así como en pacientes parcialmente comprometidos
(conteos de CD4+ > 200/mm3) (Sharma et al., 2005), la tuberculosis presenta
el patrón típico de infiltrados en el lóbulo superior con cavitación, sin
adenopatías importantes; en tanto que en las fases avanzadas de la
infección por VIH se observa una enfermedad no cavitaria, extrapulmonar,
difusa, diseminada y rápidamente progresiva que a menudo es mortal (Lawn
et al., 2002; Bonfioli et al., 2005).
La progresión de la TB en general puede presentar 5 estadios o fases:
♦ Fase I: El comienzo, luego de que la micobacteria ingresa al alvéolo,
puede ser destruida por los macrófagos alveolares activados, que liberan
citoquinas y quimoquinas favoreciendo la formación del fagolisosoma
(maduración fagosomal) y el desarrollo de la respuesta inmune innata
29
(Fenton et al., 1996; Macmicking et al., 1997; Clarck-Curtiss & Haydee
2003; Stenger 2005).
♦ Fase II: Conocida también como la fase de simbiosis porque el bacilo
evade los mecanismos bactericidas se establece en el interior del
macrófago inactivo sin causarle daño formando el tubérculo mejor
conocido como complejo de Ghon, 2-8 semanas después de su ingreso
(Smith 2003).
♦ Fase III: Se da por primera vez la necrosis caseosa, en la cual se
presenta tanto la lesión tisular (respuesta de hipersensibilidad retardada
debida a estimulación antigénica crónica) como una activación de
macrófagos alveolares, destrucción de micobacterias intracelulares y
liberación de antígenos bacilares presentados a las células T para
estimular una respuesta inmune celular (Dannenberg & Rook 1994). A
éste punto la enfermedad es leve y frecuentemente asintomática y la
única evidencia de infección es la positividad de la prueba cutánea de
hipersensibilidad a la tuberculina.
♦ Fase IV: Es determinante para la progresión de la enfermedad desde el
punto de vista clínico. En esta fase la respuesta inmune celular juega un
papel importante, o se logra controlar la progresión de la infección al
destruir las micobacterias presentes en las lesiones tuberculosas-
caseosas o granulomas (macrófagos activos) o las micobacterias siguen
multiplicándose intracelularmente y se diseminan a otras zonas del
30
de meninges, riñones, ganglios linfáticos, pleura, sistema osteo-articular y
miliar; con síntomas y signos que dependen del sistema afectado y del
daño causado en cada uno de ellos. Por otro lado la bacteria también
puede permanecer dentro del granuloma caseoso en un estado de
latencia por años esperando la oportunidad para volver a replicarse
activamente; (Casal & Casal 2000; Donald & Schoeman 2004; Sharma &
Mohan 2004a; Toth et al., 2004; Enberg et al., 2006).
♦ Fase V : Hay formación de cavidades cuando las paredes de los
bronquios se rompen debido a la carga bacilar en los tubérculos y a la
respuesta inmune agresiva, lo cual permite la descarga de todo el
material caseoso con micobacterias vivas y muertas en las vías aéreas lo
que contribuye a la diseminación del bacilo a otras partes del cuerpo así
como también al ambiente externo permitiendo transmisión e infección de
un nuevo huésped por intermedio de la tos, la saliva o el estornudo del
paciente infectado (Dannenberg & Rook 1994; Smith 2003).
Es importante resaltar que la TB pulmonar afecta el aparato respiratorio
inferior, donde el flujo aéreo es mayor favoreciendo el depósito de los
bacilos inhalados y contribuyendo a los signos y síntomas que durante las
primeras fases de la enfermedad, suelen ser inespecíficos y consisten
principalmente en fiebre, sudoración nocturna, pérdida de peso, anorexia,
malestar general y debilidad. Posteriormente se presenta tos con
31
expectoración purulenta y hemoptisis debido a la ruptura de algunos vasos
sanguíneos y en algunos casos más críticos se cursa con disnea (Frieden et
al., 2003; Campbell & Bah-Sow 2006).
2.4. Diagnóstico
Dentro de las estrategias para combatir a la TB, el diagnóstico subyace como
uno de los pilares más importantes, debido a que permite la atención e inicio
del tratamiento minimizando los riesgos de contagio y dispersión de la
enfermedad. El diagnóstico de la TB se ha basado en la historia clínica y el
análisis radiológico de los pacientes; así como la aplicación del test de la
tuberculina o PPD y la identificación del M. tuberculosis por métodos
microbiológicos, citopatológicos o histopatológicos en la muestra (esputo
fresco, lavado gástrico, orina, líquido pleural, líquido cefalorraquídeo, líquido
articular, biopsia de tejido, sangre entre otros), proveniente del paciente
sospechoso de tener la enfermedad.
2.4.1. Métodos convencionales
♣ La baciloscopía: Es la metodología más ampliamente aceptada en la
investigación microbiológica de tuberculosis. Está basada en la afinidad
que poseen las micobacterias por ciertos colorantes formando complejos
32
estables con ellos, reteniendo el colorante aún después de su exposición
al alcohol ácido o ácidos minerales. La baciloscopía (BK) con la tinción
microbiológica de Ziehl–Neelsen (ZN) es la prueba de oro para el
diagnóstico de tuberculosis activa (pacientes bacilíferos); es una técnica
sencilla, económica y permite observar a los bacilos tuberculosos de color
rojo sobre un fondo azul (Figura 5). Sin embargo, su sensibilidad es
variable y es en este sentido en donde se han observado las mayores
limitaciones, pues este sistema necesita >104 micobacterias para arrojar
un diagnóstico positivo, además, no permite diferenciar entre las especies
de micobacterias (Guevara et al., 2003.).
Por otra parte, las tinciones empleando fluorocromos como la auramina o la
rodamina están siendo cada vez más utilizadas pues además, de la rapidez
diagnóstica que ofrecen han demostrado la misma eficacia que la de tinción
de ZN para detectar las micobacterias, que aparecen de color amarillo o
naranja brillante contra un fondo verdoso al ser observadas en un
microscopio de luz ultravioleta (Figura 6) (Grosset et al., 2000).
33
resaltando la condición ácido alcohol resistente de las micobacterias. M. tuberculosis
aparece como un pequeño filamento rojo sobre un fondo azul (flecha).
Tomado y modificado de: Archivo Imágenes de micobacterias, Grupo de TB-CIDEIM.
♣ El cultivo: Es una técnica más sensible que la baciloscopía, produce
resultados positivos hasta con una concentración de 10 bacilos/ml de
muestra, pero su gran limitante es el tiempo requerido para obtener el
resultado, ya que toma en promedio entre 3 y 6 semanas para ser
informado. Existen diferentes medios de cultivo para el aislamiento de
micobacterias, que garantizan un buen soporte nutritivo para su
crecimiento; éstos pueden ser sólidos o líquidos, selectivos y no
selectivos. El medio Lowenstein-Jensen es históricamente el más
utilizado en los laboratorios clínicos de diagnóstico, es un medio sólido
elaborado a base de huevo y contiene verde de malaquita, que inhibe el
crecimiento de la flora bacteriana asociada (Sierra et al., 2004).
34
Figura 6. Mycobacterium tuberculosis en pulmón. Muestra directa de esputo coloreada
con auramina-rodamina. M. tuberculosis aparece como un pequeño filamento amarillo
fluorescente sobre un fondo verde (flecha).
Tomado y modificado de: www-medlib.med.utah.edu/STAINS/STAIN020.html. (en
http//images.google.com).
Ante las limitaciones en tiempo que presentan los cultivos tradicionales, se
han implementado otros sistemas de cultivo líquido automatizado o semi
automatizado (BACTEC 460TB), en los cuales se emplea ácido palmítico
marcado con C14 como fuente de carbono. El crecimiento de M. tuberculosis
se puede manifestar en 10 días al medir la liberación de CO2 radiomarcado
que se desprende una vez se haya metabolizado el sustrato, la
radioactividad es detectada y se traduce en índice de crecimiento. Sin
embargo una de las limitaciones que presentan éste tipo tecnologías ha sido
la contaminación al ambiente por la radioactividad que se puede generar
dado que en la mayoría de laboratorios de diagnóstico no se cuenta con la
infraestructura necesaria que permita una adecuada disposición final de los
radioisótopos evitando la contaminación radioactiva (Guevara et al., 2003).
Basados en lo anterior se han generado nuevos sistemas no-radiométricos
como el BACTEC9000 (Becton Dickinson), que funciona midiendo
fluorométrica o colorimétricamente, los cambios en la presión de gas,
producción de CO2 y consumo de O2. En términos generales estos nuevos
sistemas permiten detectar micobacterias en aproximadamente 14 y 21 días
mediante la aparición de fluorescencia de color naranja al exponer los tubos
a la luz UV (365nm) (Pfyffer et al., 1997).
Indirectos
♣ Las pruebas inmuno-serológicas: Se basan en la evaluación de la
respuesta inmune celular (la prueba cutánea de la tuberculina o del PPD
(derivado proteico purificado) y/o respuesta inmune humoral como en los
enzimoinmunoensayos (EIE, ELISA) que permiten evidenciar la presencia
de anticuerpos circulantes dirigidos específicamente contra antígenos de
la micobacteria indicando una infección activa. Para el diagnóstico de
una infección latente se han desarrollado pruebas derivadas del ELISA,
como ELISPOT y QuantiFERON®–TB Test (QFT-G) en las cuales se
mide la cantidad de interferón gama (IFNγ) producido por las células
sanguíneas totales o por células mononucleares de sangre periférica
previamente estimuladas con derivados proteicos purificados de
tuberculosis (PPD) o antígenos más específicos de la micobacteria como
36
ESAT-6 y CPF-10 (Mazurek et al., 2005; Shams et al., 2005; Nahid et al.,
2006; Yew & Leung 2006).
2.4.2. Métodos Moleculares
En la actualidad, las técnicas basadas en la amplificación de ácidos
nucleicos por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
parecen ser una de las mejores alternativas para una específica y rápida
identificación no sólo de M. tuberculosis, sino de otras especies
micobacterianas, aplicándolas directamente sobre las muestras lo que facilita
la identificación de aquellos microorganismos de difícil cultivo. La PCR se
fundamenta en la amplificación de una región blanco de ADN, utilizando un
par de cebadores que inician la síntesis de las dos hebras del ADN a partir
del molde. La secuencia blanco comúnmente utilizada en la detección de M.
tuberculosis, es la secuencia de inserción IS6110 específica para éste
complejo (M. tuberculosis). Recientemente se han venido empleando otras
secuencias blanco como el gen hsp65 que codifica una proteína de choque
térmico de 65 KDa y el gen 16s rARN cuya secuencia es conocida en las
distintas especies de micobacterias y a pesar de que es bastante
conservado, tiene regiones variables con secuencias nucleotídicas
específicas de género y especie (Guevara et al., 2003; Heginbothom et al.,
2003).
37
Hoy en día se cuenta con una gran variedad de técnicas moleculares
ampliamente utilizadas y comercializadas (RFLPs [Restricción Fragment
Length Polymorphism(s)], PCR en tiempo real o “test” de PCR Amplicor-
Roche) desarrolladas a partir de la tradicional PCR con variaciones que
incluyen fases de hibridización, secuenciación y restricción, las cuales han
aumentado significativamente la especificidad en el diagnóstico y han
eliminado el riesgo de falsos positivos (Pfyffer 1999).
2.4.3. Otras técnicas
Finalmente es importante mencionar que se han desarrollado otras técnicas
de diagnóstico con diversos fundamentos, como la cromatografía de gases
en la cual la identificación se basa en el perfil de ácidos grasos de las
micobacterias y la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) para la
detección de ácidos micólicos en muestras sanguíneas o de orina (Guevara
et al., 2003).
Los análisis del patrón proteómico de las micobacterias; así como la
aplicación de herramientas basadas en la tecnología SELDI-TOF-MS o
Espectrometría de Masas en "Tiempo de Vuelo" mediante
Desabsorción/Ionización por Láser de Superficie Mejorado (Surface-
Enhanced Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry)
tienen un gran potencial en el estudio de la TB, dado que permiten identificar
38
antígenos o proteínas únicas (biomarcadores) de M. tuberculosis en
muestras de pacientes. Esta tecnología se ha ensayado con éxito en la
detección y caracterización de proteínas asociadas con formas específicas
de cáncer de próstata, ovario y colon, así como en la detección de
microorganismos patógenos como Mycobacterium tuberculosis (Steyn et al.,
2002).
2.5. Inmunología de la TB
La tuberculosis es el prototipo de infección en la cual la respuesta inmune de
tipo celular es esencial para su control; siendo el macrófago alveolar la
célula clave porque libera enzimas proteolíticas y otros metabolitos
micobactericidas, produce un patrón característico de mediadores solubles
(citoquinas) en respuesta a M. tuberculosis, incluyendo interleuquinas (IL-1,
IL-6, IL-10), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), entre otros. Estos
factores tienen un potente efecto inmunoregulador y median muchas de las
manifestaciones clínicas de la TB como por ejemplo la fiebre inducida por la
IL-1. Los macrófagos también intervienen en el procesamiento y
presentación de antígenos micobacterianos a los linfocitos T (LT) CD4+; en
asociación con las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad
(Barnes et al., 1994; Stenger 2005).
39
Los macrófagos pueden interactuar directamente con las micobacterias; por
medio de los receptores del macrófago como los toll-like (TLR-2) y el
receptor de manosa (MR) que reconoce el peptidoglicano y el
lipoarabinomanano (LAM). También pueden interactuar indirectamente
debido a que al bacilo se unen moléculas del hospedero como anticuerpos o
factores del complemento (C3b), que son reconocidas por el macrófago a
través de receptores específicos como CR1 (CD35) molécula presente en el
macrófago que reconoce el C3b unido a carbohidratos de superficie de la
micobacteria (Rojas- Espinosa et al., 2004).
En la misma línea de ideas, es importante resaltar el papel que desempeñan
los LT CD4+ y su diferenciación a los subtipos Th1 y Th2 después de la
presentación antigénica. Estas poblaciones de células T son definidas por el
perfil de citoquinas que secretan y es así que el subtipo Th1 produce
principalmente IL-2 e INF-γ, que activa los macrófagos y otras células para la
destrucción de patógenos intracelulares como M. tuberculosis. En tanto, el
subtipo Th2 produce IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 que estimulan principalmente la
inmunidad humoral y se han asociado con inmunidad a infección por
parásitos extracelulares, enfermedades alérgicas (Barnes et al., 1994).
Por otro lado es importante resaltar que citoquinas como la IL-10 e IL-13
antagonizan la acción del IFN-γ e inhiben la activación de los macrófagos,
40
por lo que el desarrollo excesivo o incontrolado de células Th2 se puede
asociar a deficiencias en la inmunidad celular contra microorganismos
intracelulares. Además se ha demostrado que la polarización de la respuesta
inmune hacia el subtipo Th1 juega un papel muy importante en la defensa
contra la micobacteria, pues la presencia de éste subtipo celular y de
moléculas como IL-2 e IFN-γ ha sido asociada con un curso benigno de la
enfermedad y una mejoría clínica (Barnes et al., 1993; Condos et al., 1998).
Aunque la infección tuberculosa se asocia con una intensa respuesta celular
mediada por LT CD4+, la subpoblación citolítica CD8+ también se encarga de
la defensa contra muchos patógenos intracelulares debido a que pueden lisar
directamente las células infectadas con el bacilo de una manera antígeno
específica. Además, cabe destacar que la respuesta celular está
estrechamente relacionada con la respuesta humoral ya que las citoquinas
(IL-2, IL-4 e IL-5) intervienen en el crecimiento y diferenciación de las células
B y por tanto en la producción de anticuerpos que reconocen
específicamente los antígenos de los microorganismos infectantes (Araujo et
al., 2004; Yew & Leung 2006).
2.6. Fisiología y Metabolismo
El metabolismo de las micobacterias es muy variado. Se puede encontrar
desde micobacterias de crecimiento rápido y en medios simples, las de
41
crecimiento lento y que necesitan medios más ricos, hasta M. leprae el cual
no se ha podido cultivar en medios sin células. En general estos
microorganismos tienen una velocidad de crecimiento mucho más lenta que
el resto de las bacterias, con un tiempo de duplicación celular de 14 a 20
horas, requiriéndose de tres a seis semanas para observar los primeros
indicios de colonias. La temperatura ideal para su crecimiento es de 32 a
37°C, y su pH óptimo está entre 6.5 y 6.8; además, su crecimiento es
favorecido con una atmósfera de 5-10% de CO2 (Wayne & Kubica 1986).
Las micobacterias crecen en medios de cultivo sintéticos que contengan
glicerol como fuente de carbono, lípidos, agentes que inhiban el crecimiento
de microorganismos contaminantes (como la carbenicilina, polimixina,
piperacilina, anfotericina B) y sales de amoníaco como fuente de nitrógeno.
Obtienen su energía mediante la oxidación de compuestos de carbono;
sintetizan niacina, reducen nitratos, producen urea y catalasa, dan pruebas
positivas de aril–sulfatasa. El hierro es esencial para su crecimiento, por lo
que cuenta con un mecanismo único de transporte, el mycobactín quelante
liposoluble con gran afinidad por el hierro. Además, se sabe que éstos
microorganismos son capaces de asimilar un amplio rango de metabolitos
del hospedero (carbohidratos, proteínas y en mayor cantidad lípidos) los
cuales son utilizados para la síntesis de macromoléculas dentro de sus vías
metabólicas. Las micobacterias son generalmente resistentes a agentes
químicos y a la desecación debido a su cápsula, pero son altamente
42
Ratledge 1994).
En este orden de ideas, la cápsula es uno de los componentes estructurales
de la envoltura que además, de proteger a la bacteria del ataque de los
antimicrobianos, también interactúa directamente con elementos de la
respuesta inmune. La cápsula está compuesta principalmente de proteínas y
polisacáridos y sólo una pequeña parte son lípidos. Los polisacáridos
capsulares consisten principalmente en un glucano, un arabinomanano y un
manano; las proteínas capsulares son una mezcla compleja de polipéptidos,
algunas de ellas son proteínas secretorias como la superoxido dismutasa y la
alcohol deshidrogenasa, pero otras son proteínas asociadas a la pared
celular o las proteínas citoplasmáticas. Los lípidos forman entre el 2 y 5% de
la cápsula, principalmente fosfolípidos como el fosfatidilinositolmanósido
(PIM), lipo-oligosacáridos, glicolípidos, ácidos micólicos los cuales son los
responsables de las características antigénicas de las micobacterias (Steck
et al., 1978; Brennan 1989; Ortalo-Magné et al., 1995; Gorocica et al., 2005).
Otro de los componentes estructurales que posee la envoltura es la
membrana plasmática, que como la de otras bacterias cumple básicamente
la función de protección osmótica y el transporte de iones y moléculas a la
célula. Su estructura está constituida por una bicapa lipídica clásica, a la que
están asociadas proteínas y algunos lipopolisacáridos, lipoarabinomanano
43
cardiolipinas y fosfatidiletanolaminas (PE) (Brennan & Draper 1994;
Gorocica P. et al., 2005).
La pared celular de la micobacteria, localizada por debajo de la cápsula y
separada por el espacio periplásmico es una de las más complejas entre los
microorganismos conocidos. Es dos veces más gruesa y fuerte que la de las
otras bacterias (Gram positivas y negativas) y constituye una verdadera
coraza lipídica difícilmente penetrable, la cual es requerida por la bacteria
para crecer y sobrevivir en el hospedero; además, le otorga a la micobacteria
no sólo su tamaño y su forma sino también su típica resistencia a la acción
del alcohol y los ácidos (Brennan & Draper 1994; Gorocica et al., 2005).
La base estructural de la pared de las micobacterias es el esqueleto insoluble
(mAGP), formado por la unión covalente entre el peptidoglicano (PG), el
arabinogalactano (AG) y los ácidos micólicos que son el mayor constituyente
de la pared confiriéndole un carácter altamente hidrofóbico a ésta estructura;
además del core o complejo mAGP la pared está compuesta por moléculas
como el PIM, el LM, el LAM, algunas proteínas y algunos lípidos libres como
la trehalosa dimicolato (TDM) o formando parte del fthiocerol dimicocerosato
(DIM) (Figura 7) (Besra & Chatterjee 1994; Gorocica et al., 2005).
44
Figura 7. Representación esquemática de la pared celular de M. tuberculosis.
Tomado y modificado de: Gorocica et al. 2005.
El PG, es una estructura macromolecular encontrada en la superficie de la
membrana citoplasmática de las bacterias, cuya función es la de preservar la
integridad celular; el PG está íntimamente involucrado en el crecimiento y la
división celular. Este es un polímero constituido por unidades repetidas y
alternadas de N-acetilglucosamina (GlcNAc) y el ácido N-glucolilmurámico
(MurNGly) unidas por enlaces β,1-4 y asociadas a cortas cadenas peptídicas
(L-alanina-ácidoD-glutámico-ácido mesodiaminopimélico (o L-Lisina)-D-
alanina) a través del MurNGly o N-acetilmurámico que en micobacterias
posee ácidos glicólicos en lugar de grupos acetilo como en las otras
denominándose ácido N-glucolilmurámico (MurNGly) (Figura 8) (Brennan
2003).
45
Figura 8. Esquema de la estructura primaria del PG bacteriano. γ-D-
Glu: ácido-D-glutámico; n: número de amino ácidos en el puente
dependiendo del organismo; (D-Ala): D-alanina. Tomado y modificado de: (Heijenoort 2001).
Durante la división celular, las bacterias forman su nueva pared; para ello las
autolisinas, enzimas producidas por la propia bacteria, rompen la “pared
vieja”, formando brechas o espacios en ésta; a nivel de esas brechas o
aberturas es donde se agrega el peptidoglicano de la nueva pared en
formación. En el citoplasma se lleva a cabo el ensamblaje de la unidad
monomérica (GlcNAc-MurNAc-pentapéptido-pirofosforil decaprenol) primer
paso en la síntesis del PG a partir de fructosa 6-fosfato; a esta unidad se une
un transportador lipídico de membrana, el bactoprenol el cual la transporta a
través de la membrana citoplasmática. Una vez en el espacio periplásmico,
46
estas unidades son colocadas en las brechas ya formadas. El paso final y
fundamental para una correcta función de la pared es la unión los
monómeros de PG entre si, por medio de un enlace peptídico entre la D-
Alanina de un tetrapéptido y el ácido diaminopimélico (DA) de otro
adyacente. Este proceso lo catalizan enzimas denominadas
transpeptidasas. Al peptidoglicano se le unen los otros componentes que
integran la pared como el AG y los ácidos micólicos (Heijenoort 2001a,b).
El arabinogalactano (AG) es otra de las moléculas del complejo mAGP y
representa el 35% de la pared. Está compuesto exclusivamente de D-
galactofuranosas y D-arabinofuranosas dos azúcares muy raros en la
naturaleza; distribuidos en 3 cadenas de arabinano (27 D-arabinofuranosas)
unidas a un núcleo de homogalactano (32 D-galactofuranosas). La región
galactano del AG se une al GlcNAc del PG, mientras que los ácidos
micólicos lo hacen al D-arabinofurasil terminal (Besra & Chatterjee 1994;
Gorocica et al., 2005).
El tercer componente del core, los ácidos micólicos (AM) son α-alquil β-
hidroxiácidos de alto peso molecular (C70-C90) que se encuentran
principalmente esterificando al AG, pero también de forma libre unido a
trehalosas para formar los dimicolatos de trehalosa (TDM) o los
monomicolatos de trehalosa (MMT). En M. tuberculosis se han encontrado
47
tres clases estructurales diferentes de éstos ácidos grasos, los α-micolatos
que no poseen grupos funcionales oxigenados y los ceto y metoxi-micolatos
los cuales poseen grupos funcionales oxigenados adicionados al β-
hidroxiácido (Wheeler & Ratledge 1994; Glickman et al., 2000; Takayama et
al., 2005).
Entre los genes involucrados en la transferencia de ácidos micólicos están
los que codifican para el complejo del antígeno 85 (Ag85) que está
constituido por los antígenos 85A, 85B, 85C, codificados por los genes fbpA,
fbpB y fbpC2, respectivamente. Estos antígenos son proteínas ligadoras de
fibronectina que catalizan la transferencia de micolatos a trehalosa, un paso
necesario para la síntesis de la trehalosa 6,6'- dimicolato (TDM) y el complejo
mAGP (Chacón et al., 2004).
La síntesis de los AM, como la de cualquier ácido graso, ocurre dentro de
ciclos repetitivos de condensación y elongación bajo el control de dos
sistemas de sintetasas de ácidos grasos denominados FAS-I, complejo
presente en eucariontes y procariontes avanzados y el FAS-II encontrado en
plantas y bacterias. El sistema FAS-I es un polipéptido sencillo que lleva
acabo la síntesis de “novo” de cadenas cortas (C16-C26) de acil-CoA ésteres a
partir de acetil-CoA y malonil-CoA; éstos acil-CoA son el punto de partida del
sistema FAS-II para la producción de los AM (α-metoxi, y ceto-micolatos). El
48
sistema FAS-II, cataliza el mismo tipo de reacciones que a diferencia de
FAS-I está compuesto por muchas otras enzimas separadas que funcionan
como un sistema completo y en micobacterias es incapaz de realizar síntesis
de novo (Tabla 2) (Barry et al., 1998; Kremer et al., 2002; Veyron-Churlet et
al., 2004; Takayama et al., 2005).
Finalmente una disrupción en la biosíntesis de alguno de los componentes
de la pared, especialmente el complejo mAGP puede destruir la integridad de
la pared celular. De hecho algunos de los medicamentos anti-tuberculosos
más efectivas, como la Isoniacida y el Etambutol afectan la biosíntesis de
dos de los componentes principales, los ácidos micólicos y el AG
respectivamente.
Tabla 2. Complejos enzimáticos de los sistemas FAS-I y FAS-II
49
a Dehidrasa e isomerasa involucradas en la vía de síntesis de meroácidos, no han sido
identificadas. Tomado y modificado: Takayama et al., 2005.
2.7. Genoma de Mycobacterium tuberculosis
Los estudios de comparación genómica fueron iniciados en la década de los
70’s usando ensayos de hibridización ADN-ADN con el cromosoma total.
Estos estudios han permitido determinar que las especies del género
Mycobacterium presentan un contenido elevado de G+C (61-71%) en su
ADN; lo cual es compartido por otros géneros relacionados que también
poseen ácidos micólicos en la pared celular, como Nocardia y Rhodococcus
(Araujo et al., 2004).
El genoma de M. tuberculosis (cepa de referencia H37Rv), consiste de 4.4
x106 pares de bases (pb), contiene aproximadamente 4,000 genes agrupados
en 11 categorías de acuerdo con su función (Tabla 3) y gracias a los
avances que se han hecho en éste campo, cada vez se conoce más la
función de muchos de los productos génicos (Smith 2003). Una
característica interesante del genoma de H37Rv es que más de 200 genes
anotados codifican enzimas involucradas en el metabolismo de lípidos, lo
cual comprende aproximadamente el 6% del total del genoma, pues si bien
las micobacterias están compuestas de una gran cantidad de lípidos,
glicolípidos y lipoglicanos en su pared, se había asumido que M. tuberculosis
adquiere los lípidos por transporte de ellos desde el tejido del hospedero
50
antes que sintetizarlos (Clarck-Curtiss & Haydee 2003). Esto se ha
relacionado con la habilidad de éste patógeno de crecer en los tejidos del
hospedero infectado, en donde los ácidos grasos pueden ser su mayor
fuente de carbono (Smith 2003).
Tabla 3. Clasificación funcional de los genes de M. tuberculosis
Tomado y modificado de: Camus et al., 2002.
Una segunda e inusual característica es la presencia de un gran número de
genes (4% del total) que codifican para los miembros de dos grandes familias
de proteínas conservadas: las familias PE y PPE (Cole et al., 1998). La
familia PE que presenta un motivo repetitivo característico prolina-glutamato,
consiste de 100 proteínas con un dominio N-terminal conservado de 110
amino ácidos y la familia PPE, aunque el dominio N-terminal es diferente,
presenta un motivo repetitivo, característico prolina-prolina-glutamato. Las
51
funciones de las proteínas PE y PPE no son conocidas, aunque han sido
relacionadas con la variación antigénica de M. tuberculosis durante la
infección (Brennan & Delogu 2002); además, se ha demostrado que algunas
proteínas PE de la subfamilia PE-PGRS están localizadas en la pared y la
membrana celular del Mycobacterium (Banu et al., 2002; Clarck-Curtiss &
Haydee 2003).
La genómica comparativa ha conducido a la identificación de un número de
inserciones y deleciones en el cromosoma, las cuales en su mayoría son el
resultado de transposiciones que involucran la secuencia de inserción
IS6110. Adicionalmente se ha podido estimar que M. tuberculosis tiene cerca
de 13 factores sigma, proteínas que dan la especificidad transcripcional a la
RNA polimerasa y otras 22 proteínas reguladoras que se activan e
intervienen en la transducción de señales ambientales en la célula (Cole
2002; Smith 2003). Es así como los estudios genómicos han sido
herramientas que han contribuido al entendimiento de las bases moleculares
de la patogénesis, la virulencia, la variación entre los diferentes aislados y en
general de todos los procesos moleculares y la evolución de las
micobacterias.
52
La TB es una enfermedad transmisible, prevenible y curable. En la mayoría
de los países el tratamiento sigue los lineamientos de la Organización
Mundial de la Salud a través de la estrategia DOTS (directly observed
treatment, short course) implementada en 1995. El ultimo se basa en la
supervisión de la ingesta del medicamento y su administración gratuita,
asegurando así el cumplimiento de todo el esquema terapéutico (WHO,
2006).
El tratamiento de tuberculosis presenta dos características: La primera es
que se basa en un régimen terapéutico múltiple, el cual asocia diferentes
fármacos con el fin de asegurar su eficacia al actuar sobre las distintas
poblaciones de bacilos presentes en el organismo infectado: bacilos en
división activa (en cavidades pulmonares) y en crecimiento lento (en
macrófagos), además evita la progresiva aparición de resistencia a los
distintos fármacos del grupo. La segunda característica es garantizar la
erradicación de los bacilos de crecimiento lento, para lo que se recomienda
tratamientos prolongados de hasta seis meses tras la negativización del
esputo (Gillespie 2002; Coll 2003).
Como las micobacterias presentan una resistencia natural a numerosos
antibacterianos por el hecho de poseer una pared tan compleja, muy
hidrófoba con una permeabilidad reducida para un gran número de
compuestos, el tratamiento se realiza con antimicrobianos específicos (con
53
actividad antituberculosa), los cuales se dividen en dos grupos. Los
antimicrobianos de primera línea con propiedad bactericida incluyen los
agentes más efectivos, menos tóxicos y de menor costo como; isoniacida
(INH), rifampicina (RIF), pirazinamida (PZA), estreptomicina (ST) y etambutol
(EMB), el cual aunque es bacteriostático tiene la propiedad de prevenir la
resistencia a los otros fármacos de primera línea (Tabla 4). Los agentes de
segunda línea comprende medicamentos de menor acción antituberculosa y
de mayor toxicidad, como etionamina (ETA) y protionamida, morfozinamida
(un derivado de la pirazinamida), cicloserina y terizidona, kanamicina,
capreomicina y ácido paraaminosalicílico (PAS), quinolonas (ofloxacina y
ciprofloxacina), rifamicinas, clofazamina, thioacetazona, imipenem y
ampicilina/ clavulanato (Zhang & Amzel 2002; Coll 2003; Del Olmo
Fernández et al., 2005; Nahid et al., 2006).
La aparición de resistencia constituye el problema principal del tratamiento;
se ha sugerido que las bacterias usualmente la adquieren mediante
diferentes mecanismos como son la modificación del blanco debido a una
mutación en la secuencia del gen que lo codifica; sobre-expresión del blanco,
la inactivación del fármaco, el aumento del eflujo y la activación de vías de
detoxificación (Zhang & Amzel 2002).
Clínicamente la resistencia se divide en primaria y adquirida. La resistencia
primaria se presenta al menos a un medicamento de primera línea
54
(monoresistencia) en pacientes que nunca han recibido tratamiento previo,
al ser infectados con una cepa resistente; cuando la resistencia es al menos
a dos de los medicamentos más efectivas en la terapia antimicobacteriana
(RIF y INH) en ausencia o presencia de resistencia a otras medicamentos se
conoce como multiresistencia (MDR).
Tabla 4. Principales fármacos de uso contra la tuberculosis, su modo de acción y mecanismos de resistencia por parte de M. tuberculosis.
55
KasA b-cetoacil ACP sintasa
Rifampicina (RIF) Inhibe transcripción RNA pol rpoB RNA pol (derivado Rifamicinas) (síntesis de mRNA) subunidad b subunidad b
Pirazinamida (PZA) desconocido FAS-I? pncA * enzima pirazinamidasa (derivado sintético de fas I ? nicotinamida) Etambutol (EMB) Inhibe síntesis Arabinosil embCAB Arabinosil transferasa (derivado de etilendia- de AG y LAM de transferasa mina) pared celular Estreptomicina (ST) Inhibe síntesis 16S rRNA rrs 16S rRNA (aminoglucósido) de proteínas Proteína RpsL Proteína ribosomal S12
ribosomal S12 Etionamida (ETA) Inhibe síntesis enoil ACP InhA enoil ACP reductasa (derivado del ácido de ácidos micólicos reductasa etaA * monooxigenasa isonicotínico) Fluoroquinolonas Inhibe síntesis ADN girasa girA y girB ADN girasa (FQs) de ADN (Topoisomerasa II) Cicloserina Inhibe síntesis D-alanina: alrA D-alanina: (Análogo de D-alanina) de PG alanina sintasa dadB alanina sintasa
(D-Ala-D-Ala) Acido paraamino Inhibe síntesis Desconocido Desconocido Desconocido salicílico (PAS) Acido fólico
Amikacina/ Inhibe síntesis de 16S rRNA rrs 16S rRNA Kanamicina/ proteínas Capreomicina
Fármaco Mecanismo
KasA b-cetoacil ACP sintasa
Rifampicina (RIF) Inhibe transcripción RNA pol rpoB RNA pol (derivado Rifamicinas) (síntesis de mRNA) subunidad b subunidad b
Pirazinamida (PZA) desconocido FAS-I? pncA * enzima pirazinamidasa (derivado sintético de fas I ? nicotinamida) Etambutol (EMB) Inhibe síntesis Arabinosil embCAB Arabinosil transferasa (derivado de etilendia- de AG y LAM de transferasa mina) pared celular Estreptomicina (ST) Inhibe síntesis 16S rRNA rrs 16S rRNA (aminoglucósido) de proteínas Proteína RpsL Proteína ribosomal S12
ribosomal S12 Etionamida (ETA) Inhibe síntesis enoil ACP InhA enoil ACP reductasa (derivado del ácido de ácidos micólicos reductasa etaA * monooxigenasa isonicotínico) Fluoroquinolonas Inhibe síntesis ADN girasa girA y girB ADN girasa (FQs) de ADN (Topoisomerasa II) Cicloserina Inhibe síntesis D-alanina: alrA D-alanina: (Análogo de D-alanina) de PG alanina sintasa dadB alanina sintasa
(D-Ala-D-Ala) Acido paraamino Inhibe síntesis Desconocido Desconocido Desconocido salicílico (PAS) Acido fólico
Amikacina/ Inhibe síntesis de 16S rRNA rrs 16S rRNA Kanamicina/ proteínas Capreomicina
*KatG, PncA y etaA no son blancos, están involucrados en la activación de las prodrogas
INH, PZA y ETA respectivamente. Tomado y modificado de: Zhang & Amzel 2002.
Información adicional integrada de referencias 20,31,46, 47 y 59.
La resistencia secundaria o adquirida, es aquella que se desarrolla en
pacientes que han recibido quimioterapia antituberculosa, debido a la
selección de cepas mutantes resistentes, en la mayoría de los casos
motivado a un tratamiento inadecuado o incumplimiento de la terapia
(Nachega & Chaisson 2003; Sharma & Mohan 2004b).
Estudios genéticos han demostrado que la resistencia a medicamentos
antituberculosos se debe predominantemente a mutaciones cromosómicas
espontáneas en los genes que codifican los blancos o enzimas implicadas en
la activación del fármaco. A diferencia de otras bacterias no se han
reportado mecanismos de adquisición de genes de resistencia vía plásmidos
o transposones y es importante resaltar que no se conoce alguna alteración
genética que por sí misma, dé lugar al fenotipo MDR; éste se da por la
acumulación de mutaciones individuales en varios genes, cada uno de los
cuales es responsable de la resistencia a un antibiótico particular (Gillespie
2002; Coll 2003); sin embargo estudios recientes han sugerido que las
mutaciones en el gen katG codón 315 están fuertemente asociadas con el
fenotipo MDR (Hazbón et al., 2006).
56
Se han descrito mutaciones puntuales, deleciones o inserciones
responsables de resistencia a fármacos de primera línea y a algunos de
segunda línea; existen dos tipos de mutaciones bien conocidos: las que
ocurren en los genes que codifican las enzimas encargadas de convertir el
pro-fármaco a su forma activa (ejemplo katG/INH) originando productos
inactivos y las mutaciones en los blancos bioquímicos del medicamento, lo
que conlleva a una reducción en la unión del fármaco con el blanco (ejemplo
girasa/FQs) (Musser 1995; Zhang & Amzel 2002; Coll 2003; Said-Fernández
et al., 2005), así por ejemplo:
♣ Isoniacida (INH): En el 42-58% de las cepas resistentes se encuentran
mutaciones en el gen katG, el cual codifica para una catalasa-peroxidasa
que convierte la INH en la forma activa, siendo más frecuente la
sustitución de la serina 315 por treonina (S315T) (Tabla 4; ver sección
2.8.1).
♣ Rifampicina (RIF): Un 95% a 98% de las cepas resistentes presenta
mutaciones en el gen rpoB, el cual codifica para la enzima blanco RNA
polimerasa subunidad b, generalmente localizadas en un corto segmento
de aproximadamente 81 pb, que incluye los codones 507 a 533 del gen
rpoB. Las mutaciones más frecuentes están en codones para asparagina
516, histidina 526 y serina 531.
♣ Pirazinamida (PZA): Entre el 72-97% de las cepas resistentes poseen
mutaciones dispersas en el gen estructural pncA o en el promotor de la
piracinamidasa que convierte la PZA en ácido piracinoico la forma activa.
57
♣ Fluoroquinolonas (FQ) Entre el 75-94% de los aislados resistentes han
presentado mutaciones en los genes girA y girB (que codifican para las
subunidades de la enzima girasa, la cual es el blanco de los FQs). En
cepas resistentes a ofloxacina, se han descrito mutaciones en los
codones 89 (Asp-His), 90 (Ala-Val) y 94 (Asp-Gly) del gen girA.
2.8.1. Respuesta al tratamiento con isoniacida (INH)
La isoniacida (INH) o ácido isonicotínico de hidracida introducido en 1952,
es un agente bactericida sintético de primera línea, debido a que demuestra
actividad específica contra M. tuberculosis y baja actividad contra otras
micobacterias. Este fármaco presenta bajos costos por dosis, baja
hepatotoxicidad y una muy buena bio-disponibilidad una vez que entra a la
micobacteria vía difusión pasiva a través de la envoltura bacteriana (Slayden
& Barry 2000; Whitney & Wainberg 2002).
INH es un pro fármaco que requiere la activación celular para producir un
derivado potente capaz de oxidar o acilar enzimas del bacilo y ejercer su
actividad antimicobacterial. Todo esto ocurre en un proceso en el cual el
medicamento es oxidado por una hemoproteína de 80 kDa conocida como
hidroxiperoxidasa I, que pertenece a la familia de enzimas con actividad
catalasa/peroxidasa (CP) y está codificada por el gen katG. Una vez activa
la INH puede inhibir la síntesis de ácidos micólicos dado que sus blancos
58
principales son la 2-trans-enoil ACP reductasa (InhA) y la β-cetoacil-ACP-
sintasa (KasA), enzimas que hacen parte del sistema FAS-II y catalizan la
síntesis de ácidos micólicos al participar en la elongación de los precursores
de cadena corta como el ácido hexacosanoico (C26:0) para generar los α-
alquil β-hidroxiácidos de cadena larga (Nagy et al., 1997; Slayden & Barry
2000; Vilcheze et al., 2000; Takayama et al., 2005 ).
La resistencia a INH en M. tuberculosis ha sido asociada principalmente a
mutaciones puntuales en el gen katG que conducen a una alteración de la
actividad catalasa/peroxidasa indispensable para la activación del fármaco.
Una mutación puntual (AGC-ACC) en el codon 315 de katG que conlleva a
un cambio en la hidroxiperoxidasa I de una serina por una treonina
(Ser315Thr) es la alteración más comúnmente asociada a resistencia,
aunque se han descrito otras mutaciones más en éste gen originando
sustituciones de aminoácidos (a.a.) importantes en la proteína (Arg463Leu,
Thr275Pro, Leu587Met, Met1Ala, Asp63Glu, His108Gln, Ala350Ser,
Gli629Ser). Por otro lado polimorfismos en los genes que codifican los
blancos del fármaco también juegan un papel importante como mecanismo
de resistencia, en el gen inhA que codifica para 2-trans-enoil ACP reductasa
(InhA) se ha reportado una mutación puntual en el nucleótido 280 (T-G) que
genera la sustitución Ser94Ala, además de posibles polimorfismos en su
región reguladora que originan una sobre-expresión de gen. En el gen kasA,
59
(Asp66Asn, Gli269Ser, Gli312Ser, Fen413Leu, Arg121Lis, Gli387Asp)
también han sido descritas (Musser 1995; Slayden & Barry 2000; Whitney &
Wainberg 2002; Coll 2003; Cohen et al., 2004).
Es importante resaltar que M. tuberculosis ha desarrollado otro mecanismo
de defensa en respuesta al tratamiento con INH, generando cambios en los
patrones de expresión de proteínas involucradas o relacionadas con las vías
metabólicas que el medicamento afecta y de ésta forma compensar el daño,
al sintetizar los productos inhibidos. Es así que mediante el uso de la
hibridación con microarreglos, marcaje metabólico y proteómica se ha
demostrado la sobre-expresión de un grupo de genes que codifican para
componentes del sistema Fas-II (acpM, kasA, kasB, fabD, accD6), además
de proteínas secretadas por el bacilo como el complejo antígeno 85,
compuesto por tres trehalosas dimycolyl transferasas (fbpA, B y C)
involucradas en la transferencia de ácidos micólicos (AM) a partir de una
trehalosa 6-monomicolato (TMM) a otra (TMM) y al arabinogalactano (AG)
para formar la trehalosa 6,6’-dimicolato (TDM) y el complejo mAGP. Estos
procesos forman parte de los últimos pasos en la producción de ácidos
micólicos y construcción de la pared celular, como mecanismos de
retroalimentación positiva que se presentan cuando la bacteria censa una
depleción de los AM maduros, por acción de la INH. Lo anterior pone en
peligro la integridad de la micobacteria y es por eso que estas enzimas son
indispensables para el buen funcionamiento y estructuramiento de la pared
60
celular y por tanto son esenciales para la sobrevivencia micobacteriana
(Garbe et al., 1996; Belisle et al., 1997; Wilson et al., 1999; Takayama et al.,
2005).
Muchos otros genes son inducidos por la exposición a INH, el ahpC cuyo
producto una alquil-hidroxiperoxido reductasa reduce peróxidos orgánicos a
sus correspondientes alcoholes, jugando un papel importante en la
respuesta de estrés a peróxidos; su sobre-expresión se da para compensar
la pérdida de la actividad catalasa/peroxidasa como consecuencia de los
polimorfismos que se presentan en el gen katG (Zhang et al., 1996; Wilson et
al., 1999; Slayden & Barry 2000; Whitney & Wainberg 2002).
Recientemente se ha descrito que la sobre expresión de la enzima arilamida
N-acetiltransferasa (NAT) de M. tuberculosis y en M smegmatis incrementa la
resistencia a INH; ésta enzima puede acetilar el fármaco transfiriendo un
grupo acetilo a partir del acetil CoA dentro de la región nitrógeno-terminal de
la INH que en su forma acetilada es inactiva; probablemente NAT compita
con KatG por el fármaco (Figura 9) (Sandy et al., 2005).
2.9. Antígeno 85 un posible blanco de nuevos fármacos
El complejo antígeno 85, está compuesto por tres proteínas Ag85A (fbpA),
Ag85B (fbpB) y Ag85C (fbpC), codificadas por los genes fbpA, fbpB, y fbpC ,
61
los cuales están localizados en loci separados dentro del genoma de M.
tuberculosis y han sido bien caracterizados no sólo en éste bacilo sino
también en otras especies de micobacterias (Content et al., 1991; Belisle et
al., 1997; Kremer et al., 2002). Este grupo de proteínas comparten la misma
función, aunque existen algunas diferencias en la especificidad de Ag85A y
Ag85C en relación a Ag85B (Artimige et al., 2000), además están
cercanamente relacionadas compartiendo del 68 – 80% de identidad en su
secuencia de amino ácidos (Jackson et al., 1999; Takayama et al., 2005).
Figura 9. Esquema del proceso de acetilación de la INH. A. Proceso de
activación del fármaco por la catalasa/peroxidasa (producto del KatG). El
asterisco en el N terminal denota una especie oxidada. B. La enzima
arilamida N-acetiltransferasa (NAT), transfiere un grupo acetilo a la INH,
generando un fármaco inactivo. Tomado y modificado de: Sandy et al.,
2005.
62
Este complejo proteico es catalogado como un muy atractivo blanco para
diseño de nuevos fármacos antituberculosos debido a las características
particulares que presenta:
♣ El complejo antígeno 85 hace parte de la familia de proteínas de unión a
fibronectina que están consideradas como potenciales factores de
virulencia (Ratliff et al., 1998, Abou-Zeid et al., 1998) pues en
Mycobacterium tuberculosis al igual que en otros microorganismos la
habilidad de unión a la fibronectina y a otras proteínas de la matriz
extracelular aumenta la virulencia de organismos patógenos (Patti et al.,
1994). Esta propiedad sugiere que el complejo antígeno 85 juega un rol
importante en la interacción de la micobacteria con los macrófagos y su
sobrevivencia dentro del hospedero; particularmente el Ag85B cuyos
niveles de mRNA se incrementan durante las primeras 24h de infección,
cuando la micobacteria entra al fagocito mononuclear-macrófago, además
de inducir la liberación de TNF-α al formar complejo con la fibronectina de
las células del hospedero (Wilkinson et al., 2001; Islam et al., 2004).
♣ Está involucrado en una de las vías metabólicas esenciales para el
bacilo como es la síntesis de los ácidos micólicos, necesaria para
mantener la integridad de la pared celular y el crecimiento de la bacteria.
Los estudios de inactivación de los genes que codifican para las proteínas
del complejo antígeno 85 sugieren que la inhibición de los tres genes
63
puede afectar profundamente el crecimiento micobacteriano; por ejemplo
la disrupción del gen fbpA, conlleva a una diferencia significativa en el
crecimiento con respecto a la cepa control en el medio sintético sauton y
en cultivo de macrófagos humanos, igualmente, la interrupción del gen
fbpC afecta el contenido total de micolatos en la pared celular en un 40%
en comparación a la cepa silvestre, lo que lleva a un aumento en la toma
o difusión de algunas sustancias por la micobacteria, afectando entonces
la permeabilidad de la pared celular (Jackson et al., 1999, Armitige et al.,
2000; Harth et al., 2002 ; Nguyen et al., 2005).
♣ La dilucidación de la estructura de cada una de estas proteínas por
cristalografía, no sólo ha revelado los residuos (altamente conservados
en las tres proteínas) en los cuales se encuentra el sitio activo y de unión
con los sustratos (trehalosas monomicolatos y ácidos micólicos) sino
también ha ilustrado el modo de interacción con su sustrato respectivo.
Este información permite la posibilidad de diseñar potentes inhibidores
de su actividad micoliltransferasa (anti-TB). Por otro lado la identificación
de la región N-terminal como la responsable de la interacción con
fibronectina, sugiere otra estrategia por medio de la cual se inhiba ésta
interacción como lo es diseñando péptidos (anti-TB vacunas) contra ésta
región que bloqueen la unión del antígeno 85 con la fibronectina del
macrófago y de ésta forma la adhesión y fagocitosis de la micobacteria,
eliminando una de los principales modos de entrada usada por
64
(Zhang & Amzel 2002; Ronning et al., 2004).
♣ Estudios proteómicos y de expresión usando microarreglos, han
demostrado que los genes fbpABC contribuyen con el fenotipo resistente
pues se sobre-expresan en respuesta al tratamiento con Isoniacida (INH)
(Garbe et al., 1996; Wilson et al., 1999; Ramaswamy et al., 2003);
aunque el mecanismo p