H D B M B 4 0 G O D I N A

HRVATSKO PRIRODOSLOVNO DRU[TVO (OSNOVANO 1885.) Mjese~nik za popularizaciju

prirodnih znanosti

Godina 106., Broj 1049

25 KUNAPriroda izlazi od 1911. godine

ISSN 0351-0662

12/16.

Priroda

PRIRODA SIJEANJ/VELJAA 2016.62

M O L E K U L A R N A D I J A G N O S T I K A

Karmela BARII, Zagreb

Povijesni pogled na molekularnu dijagnostiku

Molekularna dijagnostika bavi se analizom nuklein-skih kiselina u dijagnostike svrhe. U akademskom i znanstvenom pogledu molekularna dijagnostika izborila se za svoj status kao interdisciplinarno podruje, a kao struno podruje profilirala se u medicinsko-biokemijskoj dje-latnosti. Molekularna dijagnostika batinik je razvoja moleku-

larne biologije, genetike i genomike (strukturne i funkcional-ne) u spoznajnom i metodolokom smislu.

Povijest razvoja ovoga znanstvenog podruja temelji se na do-stignuima koja su postignuta od 19. stoljea na ovamo u po-druju genetike, biologije, biokemije, molekularne biologije i medicine. Spomenimo samo neke: Mendelovi zakoni nasljei-vanja*, identifikacija DNA kao molekule koja moe transfor-mirati stanice, rasvjetljavanje strukture DNA, sinteza oligo-nukleotida in vitro, restrikcijske endonukleaze, lanana rekacija polimerazom** i DNA ipovi. Dananji i budui ra-

MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA:JUER DANAS SUTRA

* Gregor Mendel obrazloio je principe nasljeivanja u predavanju Versuche ber Pflanzen-Hybriden (Experiments on Plant Hybridisation) koje je odrao u dva dijela 8. i 9. veljae 1865. godine u Brnu u tamonjem prirodoslovnom drutvu.

Oswald Avery i sur. su 1944. godine eksperimentalno utvrdili da je transformirajui princip, na koji je prethodno u svojim pokusima ukazao Frederick Griffitha (poznati pokusi ispitivanja virulentnosti dva, R i S, soja pneumokoka), molekula DNA.

Strukturu DNA rasvijetlili su 1953. godine Francis Crick i James Watson.

Sa sintezom oligonukleotida zapoelo se sredinom prologa stoljea, a od 80-ih godina prologa stoljea mogue je sintetizirati dulje oligonukleotide.

Smith, Kelly i Wilcox izolirali su 1970. godine restrikcijsku endonukleazu iz klase II, HindII iz Haemophilus influenzae.

** K. Mullis, F. Faloona, S. Scharf, R. Saiki, G. Hom, H. Erlich, Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 1986, 51 Pt 1:263273.

Stephen P. A. Fodor i suradnici razvili su tehniku za pripravu minijaturnih nizova biolokih molekula. Na njihovom radu utemeljen je prvi DNA-ip, temeljna tehnika za genomske studije velikoga opsega.

Tablica 1. Metode koje se esto rabe u molekularno-dijagnostike svrhe

ANALIZA CILJANA NA POZNATE MUTACIJE DETEKCIJA NEPOZNATIH MUTACIJA DETEKCIJA VARIJACIJA U BROJU KOPIJA

Southern blot / Polimorfizam duljina restrikcijskih fragmenata (RFLP)

Gradijentna gel-elektroforeza Southern blot

Test ligacije oligonukleotida Konformacijski p olimorfizam jednolanane DNA (SSCP) MLPA multipla ligacija uz amplifikaciju sonde

Sekvenciranje Analiza heterodupleksa SNP ip

Pirosekvenciranje Denaturirajui HPLC

Lanana rekacija polimerazom u stvarnom vremenu

PRIRODA SIJEANJ/VELJAA 2016. 63

M O L E K U L A R N A D I J A G N O S T I K A

zvoj molekularne dijagnostike neodvojiv je, s jedne strane, od razvoja navedenih znanstvenih disciplina, a s druge strane, od razvoja monih tehnologija analize genoma.

Molekularna dijagnostika u klinikim laboratorijima biljei svoj uzlet u posljednja dva desetljea. Poetci su bili obiljeeni prijenosom tehnika analize genskih mutacija iz istraivakih laboratorija u kliniko okruenje. Analize nukleinskih kiselina ponajprije su bile upotrijebljene za analizu genskih mutacija kod bolesti poput hemoglobinopatije i cistine fibroze, a sam postupak temeljio se na neizravnoj detekciji genskih mutacija. Taj pristup zahtijevao je velike koliine pacijentove DNA te detaljne informacije o podruju genoma koje se analizira. e-sto su rezultati bili komplicirani za interpretaciju.

S otkriem lanane reakcije polimeraze (engl. polymerase cha-in reaction, PCR) bilo je omogueno umnaanje specifinih dijelova molekule DNA u uvjetima in vitro te analiza i izravna detekcija mutacija. Veliki broj metoda koje se od tada koriste u molekularnoj dijagnostici temelji se na analizi DNA umnoene PCR-om, a ne na analizi genomske DNA. U Tablici 1. prikaza-ne su neke od metoda koje se esto rabe u molekularno-dija-gnostike svrhe.

Nukleinske kiseline

U molekularno-dijagnostike svrhe analizira se genomska DNA ili njezini specifini dijelovi. Kod ovjeka to je makromo-lekula smjetena u staninoj jezgri (naziva se i nuklearna DNA) koju ini oko 3 milijarde parova nukleotida u stanicama s haploidnim genomom (spolne stanice). DNA se u svim eukari-otima nalazi u kompleksu sa specifinim proteinima. Taj se kompleks naziva kromatin. Kromatin se tijekom stanine dio-be strukturira u kromosome (23 para kod ovjeka). Genomsku DNA ovjeka predstavlja oko 25 do 30 tisua gena.

Kod ovjeka je osim genomske DNA prisutna i mitohondrijska DNA. Mitohondrijska DNA je kruna molekula, veliine oko 16,5 tisua nukleotidnih parova koja nosi informacije za dio mitohondrijskih proteina. Mitohondrijska DNA zanimljiva je za molekularnu dijagnostiku u onim sluajevima kada se sum-nja na bolesti povezane s varijantama mitohondrijskoga geno-ma. S obzirom na to da se mitohondrijska DNA iskljuivo na-sljeuje od majke, njezina analiza esto se rabi u forenzici. Openito, kad se radi o molekuli DNA, onda se metodama koje se koristi za molekularnu dijagnostiku utvruje izravno (sekvenciranje) ili neizravno (temeljem veliine restrikcijskih fragmenata nakon digestije restrikcijskim endonukleazama ili hibridizacijom sa sljedno-specifinim sondama).

Osim molekule DNA, bilo nuklearne ili mitohondrijske, za molekularnu dijagnostiku vane su molekule RNA, i to one

koje pripadaju klasi glasnikih RNA molekula (mRNA). One prenose informaciju pohranjenu u genomu do sustava za sinte-zu proteina, osiguravajui tako sintezu proteina po uputama pohranjenim u genima. Kad se radi o molekulama mRNA, za molekularnu dijagnostiku vana je informacija o koliini odre-ene mRNA. Koliina mRNA govori o genskoj ekspresiji i e-sto je kljuna informacija u dijagnostici tumorskih bolesti, od-nosno praenju uinkovitosti antitumorske terapije. U tom kontekstu analizira se ekspresija onkogenskih RNA, RNA mo-lekula tumorskih supresorskih gena ili RNA za fuzijske protei-ne koji nastaju genskim translokacijama (primjerice bcr-abl kod mijeloine leukemije). Osim prethodno navedenih, u novi-je vrijeme sve vee dijagnostiko znaenje daje se posebnoj kla-si molekula RNA koje imaju regulatornu funkciju, takozvanim mikroRNA.

Osim staninih nukleinskih kiselina, nuklearne i mitohondrij-ske DNA te molekula RNA, u molekularnoj dijagnostici kori-ste se i nukleinske kiseline prisutne u cirkulaciji, tzv. cirkulira-jue nukleinske kiseline. Njihova prisutnost u cirkulaciji rezultat je raspada stanica, ali i drugih procesa, zahvaljujui ko-jima dospijevaju u cirkulaciju.

Dijagnostika i procjena terapije

U nastavku e biti navedene neke od bolesti za iju se dijagno-stiku koristi analiza nukleinskih kiselina. Cistina fibroza naj-ea je genska bolest bijelaca (jedan sluaj na oko 2500 novo-roenadi). Nasljeuje se autosomno recesivno. Bolest pogaa egzokrine ljezde, a ponajprije se manifestira problemima u funkciji dinoga i probavnoga sustava. Bolest je u oko 70 % sluajeva rezultat mutacije F508 (delecija od tri nukleotida koja kodiraju fenilalanin) u genu CFTR. Preostalih oko 30 % slua-jeva odnosi se na vie od 1200 razliitih mutacija u navedeno-me genu. Gen CFTR kodira kloridni kanal, protein odgovoran za transport kloridnih iona kroz staninu membranu.

Miine distrofije su bolesti skeletnih miia. Uzrokovane su mutacijama koje se nasljeuju autosomno dominantno, autoso-mno recesivno ili spolno vezano. Mutacije su prisutne u razlii-tim genima koji kodiraju proteine izvanstaninoga matriksa, transmembranske proteine i proteine sarkoleme, citoplazmat-ske proteaze te proteine jezgrine membrane. Najea su dva oblika miinih disrofija, Duchennova i Beckerova. One su re-zultat cijeloga spektra razliitih mutacija, delecija, duplikacija, tokastih mutacija ili mutacija prekrajanja, u genu za distrofin, to ima za posljedicu potpuni izostanak ili male koliine distro-fina smanjene funkcije.

Sindrom fragilnoga x-kromosoma posljedica je dinamine mu-tacije u genu FMR1, koja podrazumijeva promijenjeni broj tri-pleta nukleotida CGG u regulatornom dijelu navedenoga gena

PRIRODA SIJEANJ/VELJAA 2016.64

M O L E K U L A R N A D I J A G N O S T I K A

to se reflektira na opseg njegove ekspresije. Sindrom je pove-zan s mentalnom retardacijom i smatra se da je znaajno pove-zan s autizmom.

Huntingtonova bolest teka je neurodegenerativna bolest uzro-kovana dinaminom mutacijom u genu za protein huntingtin. Radi se o promjeni broja tripleta nukleotida CAG u kodirajuoj regiji gena. Zahvaljujui promijenjenom broju navedenih triple-ta nastali protein ima vie aminokiseline glutamina to utjee na njegova svojstva i funkciju i posljedino dovodi do neurode-generativnih promjena.

Molekularna dijagnostika bitan je dio sveukupne prenatalne dijagnostike. Iz korionskih resica ili amnijske tekuine mogua je izolacija nukleinskih kiselina i potom njihova analiza s ci-ljem utvrivanja nasljednih bolesti.

Podruja medicine u kojima je analiza nukleinskih kiselina zau-zela znaajno mjesto svakako su dijagnostika malignih bolesti i praenje uspjenosti antitumorske terapije. Ilustrativan je pri-mjer kronine mijeloine leukemije. Kod te bolesti, u oko 95 % sluajeva, prisutan je takozvani Philadelphia-kromosom nastao razmjenom genetskoga materijala kromosoma 9 i 22. Ova tran-slokacija dijelova kr