H D B M B – 4 0 G O D I N A

HRVATSKO PRIRODOSLOVNO DRU[TVO (OSNOVANO 1885.) Mjese~nik za popularizaciju

prirodnih znanosti

Godina 106., Broj 1049

25 KUNAPriroda izlazi od 1911. godine

ISSN 0351-0662

1–2/16.

Priroda

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016.18

E N Z I M S K A K I N E T I K A

Zoran RADI�, San Diego, Sjedinj ene Ameri�ke Države

Kolinesteraze su porodica serinskih hidrolaza koju �ine dvije vrste enzima; acetilkolinesteraze (AChE) i buti-rilkolinesteraze (BChE). Alosterija je pojam koji je pr-

vobitno uveden da ozna�i unutarmolekulske interakcije izme-�u dva prostorno odvojena dijela makromolekule (allos stereos, gr�. ����� ����, drugi objekt, tj. drugi prostor ili drugo mjesto). Dok naša krvna plazma obiluje molekulama butirilko-linesteraza, �ija fiziološka funkcija nije sasvim jednozna�no utvr�ena, molekule acetilkolinesteraza poznate su ve� dugo kao klju�ni enzimi za prijenos živ�anih impulsa u kralježnjaka bez �ega održanje života nije mogu�e.

Struktura ovih približno 65 000 Da velikih proteina evoluirala je u izuzetno u�inkovit katalizator hidrolize neurotransmitera acetilkolina – acetilkolinesteraze ubrzavaju razgradnju ovih važnih malih molekula, a time i prijenos živ�anih impulsa, za oko 13 redova veli�ine, tj. oko 10 000 000 000 000 puta (10 bilijuna puta). Reguliranje kataliti�kog mehanizma djelovanja AChE i njegovo razumijevanje na molekulskoj razini stoga su bili i ostali od posebnoga znanstvenog interesa.

Polazne pretpostavke

Godine 1966. Jean-Pierre Changeux (sl. 1.), tada mladi tridese-togodišnji francuski neurobiolog i doktorand u laboratoriju po-znatoga geneti�ara, nobelovca i filozofa, Jacquesa Monoda, iznio je pretpostavku da bi se interakcija biološki aktivnih mo-lekula, npr. toksi�noga alkaloida d-tubokurarina iz porodice

kurarea ili molekula lijeka Flaxedila, s acetilkolinesterazama mogla zbivati izvan kataliti�koga mjesta enzima. Dakle, pret-postavio je da se radi o tzv. alosteri�koj inhibiciji. Kako u to vrijeme nije bilo podataka o prostornoj gra�i molekula acetil-kolinesteraza, Changeuxov zaklju�ak temeljio se na nizu detalj-nih kineti�kih pokusa kojima je istraživao utjecaj molekulama d-tubokurarina na aktivnost ovih enzima. Prvi detaljni i su-stavni opis alosteri�kih interakcija dali su upravo Jacques Mo-nod, Jeffries Wyman i Jean-Pierre Changeux godinu dana pri-je. Danas je taj opis poznat pod nazivom MWC-model.*

Pri tome je Changeux uvidio da treba razlikovati dva oblika alosterije, tercijarni (koji se zbiva izme�u dva mjesta vezanja unutar jedne proteinske podjedinice enzima) i kvaterni (koji se zbiva izme�u više jednakih ili sli�nih proteinskih podjedinica enzima). Kod kolinesteraza rije� je o alosteri�koj interakciji unutar jedne proteinske podjedinice, dakle o tercijarnoj aloste-riji. S vremenom se pokazalo da posebice male organske aro-matske kationske molekule alosteri�ki utje�u na funkciju ace-tilkolinesteraza. Dapa�e, �ak je i specifi�no odstupanje od Michaelis-Mentenove kinetike pri kataliziranju hidrolize ace-tilkolina, poznato kao »inhibicija supstratom«, protuma�eno kao alosteri�ki efekt.

50 godina ALOSTERIJE U KOLINESTERAZA

* MWC-model (Monod-Wyman-Changeuxov model) poznat je i kao uskla�eni ili simetrijski model, a opisuje alosteri�ke promjene proteina koji su izgra�eni od identi�nih podjedinica. Suprotan tome modelu je sekvencijalni model.

Slika 1. Autor alosteri�ke pretpostavke acetilkolineste raze Jean-Pierre Changeux i autor ovoga �lanka (u pozadini).

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016. 19

E N Z I M S K A K I N E T I K A

Važnu ulogu u oblikovanju ove pretpostavke odigrala je hrvat-ska znanstvenica, prva predsjednica Hrvatskoga biokemijskog društva, prof. dr. sc. Elsa Reiner u suradnji sa svojim britanskim kolegom Normanom Aldridgeom i suradnicima sa zagreba�ko-ga Instituta za medicinska istraživanja i medicinu rada. Oni su razvili jednostavan kineti�ki model prema kojem se hidroliza acetilkolina usporava kada se druga molekula acetilkolina veže za enzim izvan njegovoga kataliti�kog mjesta, tj. kada se veže u njegovo alosteri�ko mjesto. Nadalje, pretpostavili su da se i neki od kovalentnih inhibitora acetilkolinesteraza, npr. orga-nofosfati, mogu reverzibilno vezati u acetilkolinesterazno alo-steri�ko mjesto i tako je reverzibilno inhibirati, dok �e u isto vrijeme njihovo vezanje u kataliti�ko mjesto uzrokovati kova-lentnu inhibiciju. Sve ove pretpostavke i danas imaju važnu ulogu u dizajniranju novih regulatornih i antidotskih molekula koje �e pomo�i pri lije�enju trovanja organofosfornim pestici-dima i živ�anim bojnim otrovima. Naime, izgradnja jednostav-noga i to�nog modela mehanizma alosteri�kih interakcija nei-zostavan je temelj razvoja modernih terapeutika.

Maske su pale

Treba imati na umu da pokusima enzimske kinetike, kako je primjerice radio Changeux, možemo jedino saznati koji od niza mogu�ih mehanizama nije u pitanju, tj. da takvi pokusi mogu poslužiti za eliminaciju odre�enog mehanizma. Stoga se valja-nost pretpostavki o alosteri�kim mehanizmima djelovanja kolin-esteraza po�ela razjašnjavati tek 1991. godine kada je prvi puta odre�ena tercijarna struktura acetilkolinesteraze, tj. kada je do atomskih detalja odre�ena prostorna gra�a ovog proteina. Za potvrdu i objašnjenje mehanizma djelovanja na atomsko-mole-kulskoj razini potrebni su i strukturni dokazi.

Ve� su prvi rezultati kristalografskih istraživanja acetilkoline-steraze iz ribe Torpedo californica (vrsta elektri�ne raže) možda

mogli dati informacije o položaju alosteri�koga mjesta u enzi-mu, no to se nije dogodilo. Naime, autori su pretpostavili da je jednodnevna dijaliza koncentrata izoliranoga proteina dovolj-na za njegovo potpuno pro�iš�enje. Ali, to nije bilo tako. Do-biveni uzorak sadržavao je i reverzibilno vezane molekule de-kametonija koje se nije uspjelo ukloniti nakon izolacije enzima iz elektri�noga organa ribe. Za izolaciju korišten je postupak poznat kao afinitetna kromatografija pri kojem su se acetilko-linesteraze specifi�no, reverzibilno vezale na kolonu za pro�i-š�avanje, dok se ostali proteini, koji su �inili ve�inu sadržaja tkiva iz kojeg je enzim izoliran, nisu vezali. Nakon što je kolo-na s vezanom kolinesterazom temeljito isprana puferom, kroz kolonu je propušten dekametonij (mala organska molekula molekulske mase od 258 Da) da bi se acetilkolinesteraza veza-la na dekametonij u otopini, umjesto na kolonu. Iz tako dobi-vene otopine acetilkolinesteraze, koja je reverzibilno inhibira-na dekametonijem, trebalo je ukloniti dekametonij. Kako se radi o molekuli koja je oko 200 puta manja od enzima, kori-štena je dijaliza. No, u�inkovitost dijalize bila je ograni�ena relativno velikim afinitetom dekametonija za reverzibilno ve-zanje AChE. Autori su pretpostavili da je enzim �ist pa su elektronsku gusto�u, koja je tijekom ra�unske analize zaostajala u jednom dijelu molekule, umjesto dekametoniju pripisali mo-lekulama vode (sl. 2.). Drugim rije�ima, da pretpostavka o �isto�i enzima nije bila pogrešna, ve� tada se moglo odrediti položaj alosteri�kog mjesta u molekuli acetilkolinesteraze. Ipak, poslije je pokazano da opažena elektronska gusto�a ne potje�e od molekula vode ve� od vezane molekule dekameto-nija, koja je premostila dva vezna mjesta i specifi�nom elek-trostatskom interakcijom povezala dva triptofanska ogranka u molekuli proteina: Trp84 u kataliti�kome i Trp279 u alosteri�-kome mjestu. Zbog toga su 1996. godine prvi kristalografski podatci o strukturi acetilkolinesteraze, koji su u Protien Data

Slika 2. Acetilkolinesteraza ribe Torpedo ca-

lifornica (PDB kôd »1ace«) s molekulom de-kametonija superponiranom iz strukture »1acl« te pove�ani prikaz otvora aktivnog mjesta. Molekula enzima prikazana je kao providna Connollyeva površina kroz koju se nazire crveni proteinski kostur. Naran�asti/sivi dio površine pokazuje položaj otvora ak-tivnoga središta enzima u kojemu je ruži�asto obojena elektronska gusto�a koja je prvobit-no pripisana molekulama vode. Poslije je utvr�eno da se radi o molekuli dekametonija koju prikazuju žuti (C), plavi (N) i crveni (O) štapi�i. Kataliti�ko mjesto enzima i pripadaju-�i aktivni serin nalaze se neposredno iza sre-dišnjega dijela molekule dekametonija koja povezuje Trp84 u blizini kataliti�koga mjesta i alosteri�ko mjesto (Tyr70, Tyr121, Asp72, Trp279). Trp279 nalazi se neposredno iza natpisa »Alosteri�ko mjesto«.

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016.20

Bank† bili pohranjeni pod kodnim nazivom »1ace«, uklonjeni i zamijenjeni s novima pod kodnim nazivom »2ace«. Ovi po-datci zaista predstavljaju �istu acetilkolinesterazu.

Iako su molekule dekametonija još 1991. godine mogle ukazati na položaj alosteri�koga mjesta, njegov položaj odre�en je na drugi na�in, neovisno o dekametoniju – mutagenezom amino-kiselina acetilkolinesteraze, i to supstitucijom skupa aromat-skih prstenova bo�nih ogranaka Trp279, Tyr70 i Tyr121 i ani-onskoga aspartata Asp72 s manjim, alifatskim i nenabijenim ograncima, pri �emu je ovako mutirani enzim izgubio mogu�-nost reverzibilnog vezanja alosteri�kih liganada koji su u pravi-lu pozitivno nabijeni te imaju jedan ili više aromatskih prsteno-va u svojoj strukturi.

Ova anegdota pokazuje kolika je važnost vizualizacije prostor-ne gra�e molekula za spoznaju njihove funkcije. To�no odre�i-vanje prostornih koordinata atoma koji izgra�uju makromole-

kule ne predstavlja i potpunu spoznaju njihovih funkcija. I danas Protein Data Bank, kao najve�a baza podataka o prostor-noj gra�i makromolekula sadržava velik broj neodgonetnutih tajni o njihovim funkcijama. Dobar dio tih tajni može se otkri-ti samo strpljivim izu�avanjem i prikladnom vizualizacijom po-hranjenih podataka. Zbog toga, u svrhu što bolje vizualizacije Protein Data Bank svima koji se time žele baviti daje na korište-nje niz vrijednih softverskih alata (http://pdb101.rcsb.org/).

Posljednja u nizu korekcija struktura kolinesteraza dogodila se krajem sije�nja 2016. godine kada je struktura kodne oznake »5dtg« zamjenjena s popravljenom strukturom »5hcu«.

Struktura acetilkolinesteraze s flaksedilom vezanim u aloste-ri�kom mjestu, a isto tako i strukture acetilkolinesteraze u kompleksima s drugim ligandima, reverzibilno vezanim u alo-steri�ko mjesto, razriješene 2003. godine, potvrdile su kineti�ke pretpostavke o njihovom vezanju u alosteri�ko mjesto enzima. Tako�er je dokazano i da se dvije molekule supstrata acetilko-lina istovremeno vežu za enzim, jedna u njegovo kataliti�ko, a druga u alosteri�ko mjesto (sl. 3.). Kona�no, nedavno smo dr. sc. Cheung i ja uspjeli pokazati da se organofosfati, kovalentni inhibitori acetilkolinesteraza, mogu istodobno vezati i reverzi-bilno u njihovo alosteri�ko mjesto i kovalentno u njihovo kata-liti�ko mjesto. Osim toga, pokusima raspršenja rentgenskoga zra�enja u otopinama ljudske AChE ukazano da se njena kva-terna struktura mijenja nakon kovalentnog vezanja pojedinih inhibitora u prostorno udaljenom kataliti�kom mjestu enzima.

Finale

Strukturne promjene, koje su posljedica funkcijske aktivnosti acetilkolinesteraza, nepobitno dokazuju njihovu tercijarnu, a po svemu sude�i i kvaternu alosteriju. Upravo onako kako su to

TKO JE AUTOR OVOG �LANKA?

Dr. sc. Zoran Radi� radi kao associate adjunct professor na Farmaceutskom fakultetu Kalifornijskog sveu�ilišta San Diego u La Jolli, Kalifornija, SAD. Doktorsku disertaciju iz podru�ja biokemije izradio je pod vodstvom prof. dr. sc. Else Reiner na Institutu za medicinska istraživanja i medicinu rada u Zagrebu i na Kalifornijskom sveu�ilištu u La Jolli gdje mu je mentor bio prof. dr. sc. Palmer Taylor, a obranio ju je na PMF-u Sveu�ilišta u Zagrebu gdje je i izabran u zvanje znanstvenog savjetnika. Od po�etka svojega istraživa�-kog rada bavi se kolinesterazama, prvo s kineti�kom analizom interakcije enzima s ligandima, a zatim i njihovom molekulskom strukturom. Trenutno vodi svoj laboratorij, a voditelj je znanstvenih projekata u kojima sudjeluju i istraživa�i iz Zagreba. Imao je priliku sura�ivati s nizom me�unarodnih znanstvenika me�u kojima se isti�u nobelovac Barry K. Sharpless sa Scri-ppsovog istraživa�kog instituta u La Jolli i prof. Jean-Pierre Changeux s pariškog Instituta Pasteur.

† Protein Data Bank (PDB) je kristalografska baza podataka u kojoj su pohranjeni strukturni podatci bioloških makromolekula poput proteina i nukleinskih kiselina. Te podatke uglavnom se dobiva difrakcijom rentgenskog zra�enja na monokristalnim uzorcima, NMR-spektroskopijom, a sve više i elektronskom kriomikroskopijom.

Slika 3. Stereo-prikaz otvora aktiv-noga središta strukture acetilkoline-steraze miša (PDB kôd »2ha4«) s dvije reverzibilno vezane molekule acetilkolina – jedna u blizini kataliti�-koga serina (ruži�asta), a druga, in-hibitorna, u alosteri�kome mjestu (plava). Kataliti�ko mjesto enzima i pripadaju�i aktivni serin nalaze se neposredno iza ruži�aste molekule acetilkolina, iznad Trp86. Trp286 na-lazi se neposredno iza natpisa »Alo-steri�ko mjesto«.

E N Z I M S K A K I N E T I K A

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016. 21

Changeux, Reiner, Aldridge, Taylor i ostali pretpostavili ve� prije pola stolje�a – i to samo na temelju eksperimentalnih podataka o kataliti�koj aktivnosti tih enzima. A što je s butirilkolinesteraza-ma? �lanovi ove porodice ne zaostaju u funkcijskim alosteri�kim efektima, ali kristalografski dokazi o tome tek trebaju uslijediti. Sama �injenica da je kataliza hidrolize acetilkolina butirilkoline-sterazom ubrzana u milimolarnom rasponu njegovih koncentra-cija ukazuje da je i to alosteri�ki protein. Ova �injenica može se iskoristiti i u terapijske svrhe, a na tome naš tim upravo radi.

Literatura1. M. Harel, D. M. Quinn, H. K. Nair, I. Silman, J. L. Sussman, The

x-ray structure of a transition state analog complex reveals the mole-cular origins of the catalytic power and substrate specificity of acetyl-cholinesterase. J. Am. Chem. Soc. 118 (1996) 2340–2346.

2. J. P. Changeux, Responses of acetylcholinesterase from Torpedo marmorata to salts and curarizing drugs. Mol. Pharmacol. 5 (1966) 369–392.

3. J. Monod, J. Wyman, J. P. Changeux, On the nature of allosteric transitions: a plausible model. J. Mol. Biol. 12 (1965) 88–118.

4. J. P. Changeux The feedback control mechanisms of biosynthetic L-threonine deaminase by L-isoleucine. Cold Spring Harb. Symp. Qu-ant. Biol. 26 (1961) 313–318.

5. J. Monod, J. P. Changeux, F. Jacob, Allosteric proteins and cellular control systems. J. Mol. Biol. 6 (1963) 306–329.

6. P. Taylor, S. Lappi, Interaction of fluorescence probes with acetylcho-linesterase. The site and specificity of propidium binding. Biochemi-stry 14 (1975) 1989–1997.

7. W. N. Aldridge, E. Reiner, Acetylcholinesterase. Two types of inhi-bition by an organophosphorus compound: one the formation of phosphorylated enzyme and the other analogous to inhibition by su-bstrate. Biochem. J. 115 (1969) 147–162.

8. Z. Radi�, N. A. Pickering, D. C. Vellom, S. Camp, P. Taylor, Three distinct domains in the cholinesterase molecule confer selectivity for acetyl- and butyrylcholinesterase inhibitors. Biochemistry 32 (1993) 12074–12084.

9. J. L. Sussman, M. Harel, F. Frolow, C. Oefner, A. Goldman, L. Toker, I. Silman, Atomic structure of acetylcholinesterase from Tor-pedo californica: a prototypic acetylcholine-binding protein. Science 253 (1991) 872–879.

10. A. Shafferman, B. Velan, A. Ordentlich, C. Kronman, H. Gros-feld, M. Leitner, Y. Flashner, S. Cohen, D. Barak, N. Ariel, Su-bstrate inhibition of acetylcholinesterase: residues affecting signal transduction from the surface to the catalytic center. EMBO J. 10 (1992) 3561–3568.

11. Y. Bourne, P. Taylor, Z. Radi�, P. Marchot, Structural insights into ligand interactions at the acetylcholinesterase peripheral anionic site. EMBO J. 22 (2003) 1–12.

12. Y. Bourne, Z. Radic, G. Sulzenbacher, E. Kim, P. Taylor, P. Marc-hot, Substrate and product trafficking through the active center gorge of acetylcholinesterase analyzed by crystallography and equilibrium binding. J. Biol. Chem. 281 (2006) 29256–29267.

13. D. K. Blumenthal, X. Cheng, P. Taylor, Z. Radi�, Conformational changes of human AChE in solution upon reversible and covalent li-gand binding revealed by small angle X-ray scattering. XIIth Interna-tional Meeting on Cholinesterases, ElChE, Španjolska, S01–10 (2015).

Me�unarodno prepoznati doprinos u istraži-vanju kataliti�kog mehanizma djelovanja koli-nesteraza postigli su i hrvatski znanstvenici, posebice dr. sc. Elsa Reiner sa svojim surad-nicama dr. sc. Mirom Škrinjari�-Špoljar i dr. sc. Verom Simeon-Rudolf, postavivši 1960-ih godina temelje istraživanja ovih enzima u Hrvatskoj, a kontinuitet je održan do danas. Organizacijom prvoga me�unarodnog znan-stvenog skupa o kolinesterazama u Splitu 1975. godine dr. sc. Reiner uspješno je zapo-�ela me�unarodnu suradnju i time promovi-rala hrvatsku znanost u svijetu. Taj doga�aj prerastao je u kontinuirani niz znanstvenih konferencija koje se održavaju diljem svijeta. Dvanaesti skup iz toga niza održan je 2015. godine u Španjolskoj, a sljede�i je planiran za 2018. godinu i održat �e se u �eškoj.

Danas su u Hrvatskoj istraživanja kolinestera-za pretežno zastupljena u sklopu istraživa�-koga projekta Dizajn, sinteza i evaluacija novih antidota kod otrovanja sa živ�anim bojnim otrovima i pesticidima koji financira Hrvatska zaklada za znanost (www.CHOLINESTERASE.imi.hr; voditeljica dr. sc. Zrinka Kovarik). Cilj ovog projekta razvoj je nove generacije pro-tuotrova pri lije�enju trovanja visokotoksi�-nim organofosfornim (OP) spojevima koji se upotrebljavaju kao pesticidi ili kemijsko bojno oružje (sarin, tabun, VX, soman). Naime, tok-si�nost OP spojeva primarno je posljedica inaktivacije acetilkolinesteraze, enzima esen-cijalnog za prijenos živ�anih impulsa u kraljež njaka. Ovaj projekt primjenjuje multi-disciplinarni pristup koji uklju�uje in silico, in vitro i in vivo istraživanja pri razvoju novih

molekula protuotrova �ije oblikovanje se te-melji na kristalografski odre�enim struktura-ma kolinesteraznih makromolekula. Ovim pristupom istraživanje se proširuje i na ra-zvoj u�inkovitih bioloških �istila u terapiji za detoksifikaciju OP spojeva koji uklju�uju i upotrebu butirilkolinesteraze, enzima srod-nog acetilkolinesterazi. Projekt realizira in-terdisciplinarni tim znanstvenika iz Zagreba (Institut za medicinska istraživanja i medici-nu rada i Institut Ru�er Boškovi�) i San Diega (Kalifornijsko Sveu�ilište u San Diegu, La Jolla, SAD). Rezultati �etverogodišnjih istra-živanja proširit �e spoznaje ne samo u po-dru�ju razumijevanja kataliti�kog mehaniz-ma djelovanja kolinesteraza, nego �e imati i utjecaj na razvoj novih oblika terapije kod trovanja OP spojevima.

ISTRAŽIVANJE KOLINESTERAZA U HRVATSKOJ

E N Z I M S K A K I N E T I K A

KAKO ]ETE POSTATI PRETPLATNIK »PRIRODE«?

1. Po{aljite nam svoju adresu obi~nom po{tom (̂ asopis Priroda, Hrvatsko prirodoslovno dru{tvo, Trg žrtava fašizma 10, 10000 Zagreb), telefo-nom (01-468-0240) ili elektroničkom po{tom (priroda hpd.hr).

2. ̂ ekajte da vam do|e prvi broj Prirode s uplatnicom. Kada je uplatite, postali ste na{ pretplatnik!

ŽELITE LI KUPITI OVAJ BROJ »PRIRODE« JAVITE NAM SE TELEFONOM (01-468-0240)

ILI ELEKTRONIČKOM POŠTOM (priroda hpd.hr). POŽURITE BROJ PRIMJERAKA JE OGRANIČEN.

ŽELITE LI PODRŽATI ČASOPIS »PRIRODA«, JEDAN OD STARIJIH ČASOPISA ZA POPULARIZACIJU

ZNANOSTI U SVIJETU, POSTANITE NAŠ PRETPLATNIK!