Plūsmas citometrija
description
Transcript of Plūsmas citometrija
Arnis Strods
01.11.2013.
Plūsmas citometrija (Flow cytometry)Cytos=šūna; metria=mērījums (no latīņu val.)
Asins šūnas Hromosomas
Aļģes Protozoji
Tehnika mikroskopisku daļiņu saskaitīšanai un analizēšanai, suspendējot tās šķidruma plūsmā un analizējot šādu plūsmu ar dažādiem detektoriem.
Nedaudz vēstures
• 1934 - pirmais mēģinājums šūnu skaitīšanai plūsmā - Andrew Moldavan
• 1963 - pirmais analītiskais instruments
• Komerciāli pieejami plūsmas citometri kopš 1970tajiem gadiem
Mūsdienu plūsmas citometri spēj analizēt vairākus simtus tūkstošušūnu dažu sekunžu laikā
Phywe AG of Gottingen – 1969Pirmais komerciālais plūsmas citometrs, kas uzbūvēts ap Zeiss fluorescento mikroskopu
Priekšrocība salīdzinājumā ar tradicionālajām mikroskopijas
metodēm
Šūnu virsmas raksturošana Šūnu ploīdijas noteikšana Šūnas cikla pētījumi Intracelulārā Ca++ līmeņa noteikšana Membrānas potenciāla mērījumi pH mērījumi Mitohondriju funkcionalitātes novērtēšana u.c.
PlūsmaOptikaElektronika
Sistēmas pamatdaļas:
BD FACSAria II
Nesējšķīduma trauks zem spiediena
filtrs
parauga iešprices kamera
mēģene ar paraugu
Flow Cell
Nesējšķīduma plūsma Parauga plūsma
mijiedarbības punkts
atsevišķi pilieni
atkritumu trauks mēģenes vai plate savākšanai
(Suspensija – monodispersa sistēma)
parauga plūsmaSheath plūsma
lāzeru stari
Sheath plūsmaparauga plūsma
Sheath plūsma
lāzeru stari
Sheath plūsma
zems parauga spiediens augsts parauga spiediens
Hidrodinamiskā fokusēšana – process, kas fokusē parauga plūsmu nesējšķīdumā (sheath)
sheath fluid pievadi
parauga pievads
Violet Laser (405 nm)
Blue Laser (488 nm)
Red Laser (635 nm)
Optical fibers Prisms Focuslenses
Flow Cell
564–606 nm
750–810 nm
> 670 nm
SSC
515–545 nm
1 optical fiberper laser
Eritrocīti
T šūna
Monocīts
Neitrofilaisgranulocīts
Bazofilais granulocīts
Eozinofilais granulocīts
7 – 10 m10 – 15 m
10 – 20 m
Koherents gaismas avots (488 nm)
Izkliede uz priekšuForward scatter (FSC)Šūnu izmērs (488 nm)
Forward scatter (FSC)
mēra pa ienākošās gaismas asi
proporcionāls šūnu izmēram / šūnu virsmai (tikai ideāli apaļām šūnām)
Sānu izkliedeSide scatter
(SSC)Granularitāte (488 nm)
Side scatter (SSC)
mēra 90O leņķī no ienākošās gaismas
proporcionāla šūnu «kompleksumam» (granularitātei)
Fluorescence - process, kurā ķīmisks savienojums emitē gaismu pēc gaismas vai cita elektromagnētiskā starojuma absorbcijas.
= 488 nm
Emitētā fluorescences gaisma
Antiviela
Ierosinošā gaisma
Fluorohroma molekula
520 nmHO
CO2H
O
C
Fluorohroms – absorbē ienākošās gaismas enerģiju.Atbrīvo absorbēto enerģiju:- ar vibrāciju un izkliedē siltumu- emitē fotonu ar lielāku viļņa garumu (mazāku enerģiju)
Ethidium
PE
cis-Parinaric acid
Texas Red
PE-TR Conj.
PI
FITC
600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 514 610 632488 Ierosinošie lāzeri
Fluorohromi, spektri
Zilais (488nm) Sarkanais (633nm) Violetais (408nm)/nearUV (375nm)
Katram fluorohromam raksturīgs konkrēts optimālais ierosināšanās gaismas diapazons.
Svarīgi iepazīties ar pieejamā instrumenta iespējām...
495 nm 520 nm
Stokes Shift is 25 nmFluoresceinmolecule
Flu
ores
cnec
e In
tens
ity
Wavelength
Iespēja paraugā izšķirt specifiskas šūnu populācijas, kas ekspresē interesējošos marķierus
Liu et al., 2005. Mining the complement system for lupus biomarkers. Clinical and Applied Immunology Reviews
FITC
FIT
C
101 104103 102
Relatīvā fluorescences intensitāte
Not
iku
mu
sk
aits
FITC
FITCFIT
C
FITC
FITC
FITCFIT C
FITC
Fluorescences intensitāte ir proporcionāla pie šūnām saistīto antivielu skaitam:
Negatīvā populācija
Pozitīvā populācija
Savāktā fluorescences gaisma
Filtru veidi:
Time ~ 3.2 s
Time ~ 3.2 s Time ~ 3.2 s
V
1
2
3
Pulse
e-
e-
12
3 12
3
Gaismas signāli tiek pārvērsti elektroniskā signālā ar fotodetektoru palīdzību:1)Fotodiode – spēcīgāka signāla uztveršanai (FSC fotodiode)2)Fotopavairotājs (PMT - PhotoMultiplier Tube) – vājāku signālu detekcijai
(SSC un fluorescences signāli)
PMT tuvākā skatā:
Impulsa veidošanās
Galvenie datu attēlošanas veidi:
«Dot plots» Histogramma
FACSAria izmanto FACSDiVa programmatūru un datus var saglabāt FCS 2.0 vai FCS 3.0 failu veidā
• WinMDI, FlowJo, WinList, Weasel• CyFlogic• Infinicyt
• Flowing Software...un arī Excel
Citas brīvpieejas programmas:
FACS – Fluorescence Activated Cell SortingPlūsmas citometrijas viens no variantiem, kad iespējams šūnas ne tikai kvantitatīvi un kvalitatīvi detektēt, bet arī pēc šīm īpašībām fiziski atdalīt vienu no otras.
2. Tiek pielikts spriegums pjezokristālam
3. Atdalās lādēti pilieni
4. Deflekcijas plātnes pievelk vai atgrūž lādētos pilienus
5. Nelādētie pilieni nonāk atkritumos
6. Tiek savākti lādētie pilieni, kas satur interesējošās daļiņas
(Vibrācija ar frekvenci 90000 Hz/s – tik pat daudz pilienu veidojas sekundes laikā!)
Plūsmu iespējams sadalīt 2 vai 4 daļās
1. Paraugs ģenerē gaismas izkliedi un fluorescentos signālus. Tiek pieņemts lēmums, balstoties uz šķirošanas stratēģiju
Un šādi dabā
Šķirot iespējams:stobriņos – 2 vai 4 virzienos reizē
Šķirot iespējams:stobriņos – 2 vai 4 virzienos
uz platēm – 384, 96, 48, 24, 6 bedrīšu
• Šķiro tikai 1 populāciju uzreiz• Var nodefinēt:
dažādas populācijas bedrītēsprecīzu šūnu skaitu bedrītē
Precizitāte 99%
Šķirot iespējams:stobriņos – 2 vai 4 virzienosuz platēm – 384, 96, 48, 24, 6 bedrīšu
uz mikroskopa slaidiem
Izkārtojums uz slaida:
Šķirot iespējams:stobriņos – 2 vai 4 virzienosuz platēm – 384, 96, 48, 24, 6 bedrīšuuz mikroskopa slaidiem
custom device – nodefinējam savu izkārtojumu uz kaut kā ko var uzlikt uz plašu paliktņa, piemēram,
petri trauks, apakštasīte, utt.utjp.(max – 25 kolonnas, 60 rindas)
???
Arnis Strods [email protected]
Dalāmies!