Pirosekuentziazioa aurkezpena
-
Upload
bingengutierrez -
Category
Technology
-
view
104 -
download
3
Transcript of Pirosekuentziazioa aurkezpena
![Page 1: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/1.jpg)
Pirosekuentziazioa
Xabier Arratibel, Bingen Gutierrez, Ines Martin eta Garazi Serna
![Page 2: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/2.jpg)
Oinarriak
Pirosekuentziazioa luziferasa entzimak ATP gastatuz igorriko duen argi ikusgarriaren neurketan onarritzen da.
Argi kantitatea sekuentziako nukleotido kopuruarekiko proportzionala da.
![Page 3: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/3.jpg)
DNA erauzi PCR-a burutu
◦ Mix-a Hasle biotinizatua
(Bisulfitoarekin tratatu metilazioak aztertzen bagaude) Desnaturalizatu
◦ NaOH Biotinadun harizpiak harrapatu
◦ Hutsezko ponpa◦ Estreptabidinari batu
Prozedura
![Page 4: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/4.jpg)
![Page 5: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/5.jpg)
Pirosekuentziadorea◦ 9 putzu daude dispentsadorean
Entzimen mixa, substratuen mixa, A, C, G eta T
◦ Nukleotido desberdinak ordenean sartzen dira plakan
(guk sartzen diogu sekuentzia, gure kasuan)
![Page 6: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/6.jpg)
◦ Harizpiarekin elkartzean PPi askatu
◦ ATP sulfurilasa PPi-ak ATP bihurtzeko (Adenosina 5’ fosfosulfatoaren laguntzaz)
◦ Luziferasa ATP erabiliz, luminiszentzia eragin Luziferina sustratu Oxiluziferina
◦ Apirasa Erabili ez diren nukleotidoak degradatu
◦ Argi izpiak neurtu eta informazioa batu
![Page 7: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/7.jpg)
![Page 8: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/8.jpg)
![Page 9: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/9.jpg)
![Page 10: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/10.jpg)
![Page 11: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/11.jpg)
![Page 12: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/12.jpg)
![Page 13: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/13.jpg)
![Page 14: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/14.jpg)
![Page 15: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/15.jpg)
![Page 16: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/16.jpg)
![Page 17: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/17.jpg)
http://www.labtube.tv/channel.aspx?v=137486&u=QIAGEN
http://www.qiagen.com/knowledge-and-support/videos-and-virtual-demos/videos/pyrosequencing%20cascade%20reaction/
![Page 18: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/18.jpg)
Bisulfitoaren bidezko pirosekuentziazioa
Prozedura:
•DNA erauzi.
•Bisulfitoarekin tratatu
•Demagun hau dela gure sekuentzia 5´GCATCG…….CG………..CG……CG3’o Metilatua badago 5’ GTATCC…....CG……….CG…….CG3’o Ez badago metilatua 5’ GTATTG….….TG……….TG..….TG3’
•Metilazioa kuantifikatzeko teknika.
![Page 19: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/19.jpg)
![Page 20: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/20.jpg)
•PCR burutu.
•Lagina desnaturalizatzen da.
•Hasleak guztiz biotinilizatuak.
•DNA sekuentziak hibridatu hasle espezifikoarekin. Harizpi osagarria aipatutako entzimen presentzian eratuko da.
•Harizpi bakarreko anplikoiak harrapatu egiten dira estreptabidina bidez.
![Page 21: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/21.jpg)
•Sekuentziazioa (3.pausua)
•25-30bp bitarteko sekuentziak
•Pirograma Kontrolak:
•Kontrol negatiboa
![Page 22: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/22.jpg)
Emaitzen interpretazioa SNP
Osasuntsua den batekiko alderatuz nukleotido aldaerak ikusi
![Page 23: Pirosekuentziazioa aurkezpena](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022061605/55be52d5bb61ebd3678b479a/html5/thumbnails/23.jpg)
Emaitzen interpretazioa metilazioa ikusteko
Bisulfitoaren eraginez CG ak T bihurtu metilatuta ez badaude.
Portzentaiak metilazio maila adierazten du.