PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN ĐÔNG LẠNH

PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN ĐÔNG LẠNH

Kiểm tra vi sinh vật là một trong những công tác cần thiết phải tiến hành khi đánh giá chất lượng các sản phẩm thủy sản đông lạnh, các chỉ tiêu về vi sinh vật của các sản phẩm thủy sản đông lạnh được đề ra 1 cách nghiêm ngặt, buộc các nhà sản xuất và kiểm tra chất lượng sản phải nghiêm chỉnh thực hiện, đặc biệt là các sản phẩm thủy sản đông lạnh xuất khẩu. Bởi vì vi sinh vật cá khả năng gây độc và gây bệnh truyền nhiễm rất nguy hiểm. Các chỉ tiêu vi sinh vật cần kiểm tra đối với sản phẩm thủy sản đông lạnh bao gồm:

1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí2. Tổng số coliform3. Số Escherichia coli4. Số staphylococcus aureus5. Số Salmonella6. Số Shigella

PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH (không chỉ kiểm tra vi sinh mà còn kiểm tra hóa học, kiểm tra cảm quan)

4.1. Phương pháp lấy, vận chuyển và bảo quản mẫu kiểm vi sinh

4.1.1. Lấy, vận chuyển và xử lý mẫu

4.1.1.1. Kế hoạch lấy mẫu

4.1.1.1.1. Lấy mẫu kiểm tra lô hàng

Lượng mẫu kiễm tra lô hàng tùy thuộc vào từng sản phẩm cụ thể, nhưng không được ít hơn yêu cầu kiểm nghiệm.

Ứng với từng loại thực phẩm kèm theo một lượng xác định sẽ được giới hạn một số lượng vi sinh vật nhất định cho phép

tồn tại trong mặt hàng đó. Thông thường thì đối với vi sinh vật gây bệnh, yêu cầu đặt ra là “không có” hoặc “không phát

hiện” trong một khối lượng thực phẩm xác định.

Để nhận biết các mẫu thực phẩm không đạt yêu cầu, người ta thường thực hiện lấy mẫu và ghi nhận kết quả theo các cấp

độ đã được thiết lập như sau:

� Cấp 1: cách lấy mẫu cổ điển, trong đó việc đánh giá kết quả kiểm nghiệm chỉ dựa trên một giá trị duy nhất của mẫu.

� Cấp 2: kế hoạch lấy mẫu loại 2 được dùng cho các thử nghiệm tính vi sinh vật gây bệnh. Kết quả được coi là không đạt

khi một trong số tổng số mẫu đã lấy bị phát hiện có vi sinh vật gây bệnh.

� Cấp 3:

s Kết quả đạt yêu cầu khi:

Mật độ vi sinh nhỏ hơn thông số giới hạn dưới (có thêm điều kiện).

Mật độ vi sinh lớn hơn thông số giới hạn dưới và nhỏ hơn thông số giới hạn trên.

s Kết quả không chấp nhận khi mật độ vi sinh cao hơn giới hạn trên.

Thông thường giới hạn trên cao hơn ít nhất 10 lần so với giới hạn dưới.

4.1.1.1.2. Lấy mẫu kiểm tra vệ sinh công nghiệp

Lượng mẫu phải đủ để phân tích, thông thường trọng lượng mẫu tối thiểu được qui định như sau:

� Dạng rắn (phần thịt): 200 g.

� Dạng lỏng (nước dùng trong chế biến): 500 ml.

4.1.1.2. Phương tiện lấy mẫu và dụng cụ chứa mẫu

4.1.1.2.1. Phương tiện lấy mẫu

Để lấy mẫu hoặc khui mở bao bì, cấn thiết phải sử dụng:

� Phương tiện phù hợp.

� Dụng cụ được chế từ vật liệu dễ làm sạch, dễ khử trùng, không tác động lên mẫu hoặc bị mẫu tác động.

� Với các loại thực phẩm không bao gói, phải dùng dụng cụ vô trùng để lấy mẫu.

Trong thời gian lấy mẫu, nếu cần thiết dùng đến nhiệt kế, thì phải sử dụng các nhiệt kế chuẩn với biên độ 30 - 100 oC có

mức chính xác ± 1oC.

4.1.1.2.2. Dụng cụ chứa mẫu

Dụng cụ chứa mẫu phải bảo vệ được mẫu tránh bị nhiễm và tránh các thay đổi do các yếu tố lý học, hoá học, sinh học,…

gây ra.

Dùng các bình chứa bằng thủy tinh, túi nhựa, hộp nhựa hoặc kim loại chuyên dụng. Trường hợp cần thiết, thì các dụng

cụ này phải gắn thêm nhiệt kế để đo nhiệt độ bên trong khi đến phòng thí nghiệm.

Với các mẫu thực phẩm mau hư hỏng thì phải dùng những thùng cách li.

Dụng cụ chứa mẫu phải khô, sạch, vô trùng và có kích thước đủ lớn để chứa được lượng mẫu đến 200 g.

Khi cần thiết dùng băng keo để dán thùng chứa mẫu thì nên dùng băng dính đủ chắc để không làm thay đổi mẫu bên

trong.

4.1.1.3. Lấy mẫu

4.1.1.3.1. Lấy mẫu kiểm tra lô hàng

Việc lấy mẫu phải do những người thạo công tác lấy mẫu thực hiện. Nhân viên phân tích tại phòng thí nghiệm cũng phải

có những kiến thức cần thiết về kỹ thuật lấy mẫu để có những khuyến cáo phù hợp trong trường hợp việc lấy mẫu được thực

hiện bởi những người không chuyên.

Khi lấy mẫu cần phải đảm bảo những mẫu lấy mang tính đại diện cho lô hàng hoặc cho hoạt động cần kiểm tra và lượng

mẫu lấy đủ để tiến hành việc phân tích.

Thường mẫu được lấy một cách ngẫu nhiên và bất kỳ.

Mẫu kiểm từ thực phẩm không bao gói hoặc mẫu của một lô hàng lớn cần được cân lấy ít nhất 200 g hoặc không lấy ít

hơn 2 đơn vị sản phẩm.

Với sản phẩm bao gói, phải lấy những mẫu bao bì chưa mở.

4.1.1.3.2. Lấy mẫu nước

Trước khi lấy mẫu nước cần phải xác định vị trí lấy mẫu.

Thực hiện:

� Dùng đèn cồn đốt nhẹ xung quanh miệng vòi nước để khử trùng.

� Mở van cho nước chảy khoảng 2 phút, điều chỉnh van sao cho nước chảy đầy miệng vòi, không bắn tung tóe.

� Dùng bình xịt cồn khử trùng tay.

� Dùng đèn cồn đốt nhẹ xung quanh miệng bình thủy tinh chứa mẫu (bình phải được khử trùng trước khi lấy mẫu).

� Mở nắp bình, nhanh chóng hứng nước từ vòi, lượng nước vào khoảng 2/3 thể tích bình chứa, không để nước chảy tràn

ra miệng hoặc bắn ra ngoài, vặn kín nắp bình.

� Dùng cồn khử trùng bình đã chứa mẫu rồi cho bình vào túi PE vô trùng. Ghi thẻ để nhận diện mẫu và vòi nước, cho thẻ

vào túi chung với

bình chứa mẫu. Buộc kín miệng túi bằng dây thun hoặc bấm bằng kim bấm.

� Cho mẫu vào thùng cách nhiệt có chứa đá xay nhỏ phủ quanh túi mẫu. 4.1.1.3.3. Lấy mẫu bán thành phẩm trên dây

chuyền

Xác định vị trí và thời điểm lấy mẫu trước khi tiến hành:

STT Công đoạn Thời điểm lấy mẫu

1 Tiếp nhận nguyên liệuNguyên liệu sau khi tiếp nhận từ đại lý,

chưa qua rửa sơ bộ.

2 Các công đoạn rửa Sau khi rửa xong, đang để ráo nước.

3 Các công đoạn chế biến Lấy mẫu ngay trong khi đang sản xuất.

4 Công đoạn xếp khuôn Trong các khuôn đã xếp sản phẩm.

5 Các công đoạn có gia nhiệtTrước và / hoặc sau khi gia nhiệt, sau khi

làm nguội.

6 Công đoạn chờ đông Trước, trong và / hoặc sau khi chờ đông.

Thực hiện:

� Dùng cồn khử trùng tay nhân viên lấy mẫu.

� Dùng kẹp vô trùng, lấy một khối lượng mẫu nhất định cho túi PE, không để mẫu chạm vào miệng túi. Dùng kim bấm

bấm kín miệng túi.

� Ghi tên mẫu và công đoạn lấy mẫu vào thẻ nhận diện mẫu. Dùng kim bấm bấm thẻ này vào miệng túi chứa mẫu.

� Sau đó, cả mẫu và thẻ được cho chung vào một túi PE khác, cột kín miệng túi bằng dây thun hoặc bấm kín bằng kim

bấm.

� Cho túi mẫu vào thùng cách nhiệt, cho đá xay nhỏ phủ quanh túi mẫu.

4.1.1.3.4. Lấy mẫu vệ sinh không khí

Xác định vị trí và thời điểm lấy mẫu trước khi tiến hành:

Vị trí: cần chú ý những khu vực có mức độ ô nhiễm cao.

Thời điểm lấy mẫu: trước và / hoặc trong khi đang sản xuất.

Thực hiện:

� Dùng cồn khử trùng tay và bề mặt vị trí cần lấy mẫu.

� Đặt đĩa Petri có chứa môi trường thạch thích hợp (đã khử trùng) vào vị trí cần lấy mẫu. Để hở hoàn toàn đáy đĩa và gác

gờ nắp lên gờ đáy đĩa Petri.

� Sau khoảng thời gian quy định (15 - 30 phút), đậy nắp lại, cho đĩa vào túi PE vô trùng. Dùng kim bấm bấm kín miệng

túi.

� Ghi nhận thời gian và địa điểm lấy mẫu vào thẻ nhận diện mẫu. Dùng kim bấm bấm thẻ này vào miệng túi chứa mẫu.

� Sau đó, cả mẫu và thẻ được cho chung vào một túi PE khác, cột kín miệng túi bằng dây thun hoặc bấm kín bằng kim

bấm.

� Cho túi mẫu vào thùng cách nhiệt, cho đá xay nhỏ phủ quanh túi mẫu.

Ngoài những loại mẫu được lấy như trên, tùy thuộc vào quy định của mỗi xí nghiệp, còn có thể tiến hành lấy những loại

mẫu như: tay / găng tay công nhân; bề mặt dụng cụ, thiết bị tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm;…

4.1.1.4. Ghi nhãn và hồ sơ mẫu

4.1.1.4.1. Ghi nhãn trên mẫu

Mẫu cần được ghi nhãn ngay trước hoặc sau khi lấy mẫu.

Nhãn phải ghi cho phù hợp với hồ sơ lấy mẫu.

Nhãn ghi phải chịu được ánh sáng, không thấm nước.

Nhãn đã ghi không được thay đổi và tẩy xoá trong thời gian bốc xếp, bảo quản và vận chuyển.

Nhãn phải có kích thước đủ lớn để ghi nhận mọi thông tin cần thiết.

4.1.1.4.2. Ghi nhãn trên vật dụng chuyển mẫu

Trên vật dụng chuyển mẫu, nhãn cần được ghi:

� Tên, địa chỉ, số điện thoại của người nhận. Nếu cần gửi lại, tên người gửi cũng phải được ghi trên nhãn.

� Các chú ý cần thiết khác như: dể vỡ, thực phẩm cần trữ lạnh, mẫu kiểm nghiệm, mặt tên,…

4.1.1.4.3. Hồ sơ mẫu

Mỗi mẫu phải được đính kèm theo một hồ sơ mẫu, xác định rõ mẫu phù

hợp với nhãn ghi trên mẫu hoặc thùng chứa mẫu.

Hồ sơ mẫu được coi là hợp lệ khi có chữ ký của người lấy mẫu và người chủ lô hàng thực phẩm có mẫu được lấy.

Hồ sơ mẫu cần có những thông tin sau:

� Người yêu cầu phòng thí nghiệm thực hiện lấy mẫu để phân tích: tên, địa chỉ, số điện thoại,..

� Tên, địa chỉ, số điện thoại của người lấy mẫu.

� Địa điểm và thời gian lấy mẫu.

� Thông tin về thực phẩm được lấy mẫu: tính chất thực phẩm, ngày sản xuất, thời hạn sử dụng, điều kiện bảo quản, dạng

bao bì,…

� Nguyên nhân lấy mẫu: kiểm tra, bị khiếu nại,…

� Phương pháp lấy mẫu: lấy ngẫu nhiên trong lô hàng, lấy ngẫu nhiên từ số mẫu có sẵn,…

� Các chỉ tiêu cần phân tích: E.coli, Salmonella, Shigella,…

Ngoài ra còn có thêm nhiều thông tin khác.

4.1.1.5. Vận chuyển và bảo quản mẫu

Mẫu sau khi lấy, cần chuyển về phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt. Khi vận chuyển, bảo quản cần đảm bảo sao cho

không có biến đổi đáng kể nào xảy ra trước khi phân tích. Mẫu cần được bảo quản tốt để chống lại sự nhiễm khuẩn và

những thay đổi trong thành phần vi sinh vật. Đồng thời việc vận chuyển mẫu cần thu xếp sao cho mẫu về đến phòng thí

nghiệm trong vòng 18 giờ và như vậy việc phân tích có thể bắt đầu trong vòng 24 giờ kể từ khi lấy mẫu.

Đối với những mẫu thực phẩm mau hư hỏng thì cần được vận chuyển nhanh, bảo quản trong những thùng cách li đóng

kín có kèm theo phương tiện làm lạnh hoặc thùng nhựa chứa đá (hoặc băng khô CO2 rắn) để duy trì

nhiệt độ của mẫu (nhiệt độ mẫu càng thấp càng tốt). Tránh để mẫu tiếp xúc

trực tiếp với đá hay băng để không bị đông đá.

Đối với các mẫu hàng đông lạnh, cần được đưa vào các bình chứa đã làm lạnh từ trước và giữ trong trong ngăn đá ngay

sau khi lấy mẫu. Chúng được chuyển đi trong các thùng cách li. Nếu thời gian vận chuyển quá lâu làm xảy ra hiện tượng rã

đông, cần dùng băng khô làm chất hạ nhiệt.

Khi vận chuyển mẫu dạng khô hoặc đồ hộp thì không cần thiết làm lạnh, có thể vận chuyển trong các túi nylon, song

trong thời gian vận chuyển và bảo quản mẫu không được để nhiệt độ vượt quá 45oC và không giữ mẫu trong môi trường có

độ ẩm quá cao.

4.1.2. Tiếp nhận mẫu tại phòng thí nghiệm

Người gửi mẫu tới phòng thí nghiệm phải thông báo trước cho phòng thí nghiệm thời điểm mẫu đến. Đống thời phòng

thí nghiệm cũng cần được thông báo về loại mẫu sẽ kiểm và các phép phân tích cần thực hiện.

Khi đến phòng thí nghiệm, mẫu phải được kiểm tra:

� Nhãn ghi trên mẫu có phù hợp với số của hồ sơ mẫu trong sổ theo dõi không.

� Nhiệt độ và thời gian khi mẫu đến, riêng với nhiệt độ thì:

s Đo nhiệt độ ngay trên mẫu chính: nhúngnhiệt kế vào dung dịch hypochlorine chứa không dưới 100 mg / l chlorine

hoạt tính (mục đích để khử trùng) hoặc dung dịch khử trùng chứa halogen có tính sát khuẩn tương đương. Sau đó tráng lại

nhiệt kế bằng nước vô trùng, lau khô bằng khăn vô trùng trước khi sử dụng.

s Đo nhiệt độ trên một mẫu phụ (mẫu phụ được xử lý như mẫu chính).

� Bình chứa mẫu có rò rỉ không, có được đóng kỹ không, có bị nứt, thủng gây nhiễm vào mẫu không.

� Với mẫu đóng gói dạng chân không, cần kiểm tra kỹ tình trạng chân không trong mẫu: có khí tạo ra trong các bao bì

kín không, bao bì có hở,

thủng hoặc nứt không, điều kiện lý tính bên trong có bình thường không,…

� Nếu bao bì bị hư hỏng cần ghi nhận vào báo cáo phân tích. Trong trường hợp nhận thấy bằng cảm quan mẫu đã bị hỏng

hoặc bị nhiễm trong thời gian vận chuyển có thể xem xét và từ chối nhận mẫu, trừ khi muốn thẩm tra lại kết quả phân tích

về mặt vi sinh.

� Kiểm tra những mẫu nghi ngờ gây dịch bệnh.

Khi chấp nhận mẫu, thì mẫu được bảo quản tránh khỏi các tác nhân hoá, lý, cơ học có thể làm biến đổi mẫu. Phòng thí

nghiệm cần có đầy đủ phương tiện trữ lạnh đủ lớn để chứa mẫu và mẫu lưu.

4.1.3. Xử lí mẫu sơ bộ tại phòng thí nghiệm

Do mẫu được lấy về một lượng khá lớn so với lượng đem đi phân tích, đồng thời còn kèm theo nhãn, bao bì,…hoặc

trường hợp cần phải rã đông mẫu,…nên mẫu cần được xử lí sơ bộ trước khi tiến hành phân tích.

4.1.3.1. Xác định hệ vi sinh vật bên trong các loại thực phẩm rắn

Khử trùng bề mặt sản phẩm bằng bản kim loại đốt nóng hoặc ngọn lửa.

Dùng dụng cụ vô trùng gỡ bỏ các nhãn hiệu trên bề mặt.

Lấy một lượng mẫu bên trong, ít nhất khoảng 10 g.

Chuyển mẫu vào bao, rót dịch pha mẫu và cân, tỷ lệ mẫu : dịch pha mẫu là 1 : 9.

Đồng nhất mẫu trong túi dập mẫu trong 30 giây với mẫu dễ dập và 1 phút với mẫu khó dập.

Pha loãng mẫu ở nồng độ thích hợp để tiến hành phân tích ngay.

4.1.3.2. Xác định hệ vi sinh vật bề mặt các loại thực phẩm rắn

Đánh dấu một khu vực bề mặt mẫu bằng khuôn và dao mổ, lấy một lớp mỏng bề mặt dày 1 - 2 mm với diện tích tối thiểu

là 10 cm2.

Cho vào bao, pha loãng theo tỉ lệ 1 : 9, 10 g + 90 ml dung dịch pha loãng.

Đồng nhất mẫu trong túi dập mẫu trong 30 giây với mẫu dễ dập và 1 phút với mẫu khó dập.

1 ml dịch pha loãng tương đương với số vi sinh vật trên 1 / 100 bề mặt đã chọn (1 ml ứng với 0,1 cm 2 khi bề mặt lấy

mẫu là 10 cm2) và có thể

dùng để cấy vào trong hoặc lên trên các cơ chất tương ứng.

4.1.3.3. Xác định hệ vi sinh vật trong các loại thực phẩm lỏng

Trộn mẫu bằng cách đảo ngược chai 10 lần (hoặc theo hướng dẫn cụ thể tuỳ từng phương pháp). Dùng pipetman cấy

chuyển vào môi trường thích hợp. Có thể pha loãng mẫu nếu cần.

Sau khi lấy mẫu và xử lý sơ bộ, mẫu cần được phân tích càng sớm càng tốt, thời gian phân tích tối đa trong vòng 24 giờ

kể từ khi lấy mẫu.

4.2. Quá trình phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật

Sau đây là một số vi sinh vật thường được kiểm tra trong hàng thủy sản:

4.2.1. Tông sô vi khuân hiếu khí

4.2.1.1. Định nghĩa và nguyên tắc

Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxi phân

tử.

Qui trình phân tích bao gồm các bước: cân mẫu, đồng nhất mẫu, pha loãng mẫu, chuyển và phân phối đều một thể tích

xác định mẫu lên bề mặt môi trường rắn trong đĩa Petri, ủ ở điều kiện nhiệt độ và thời gian quy định.

4.2.1.2. Môi trương và hoa chất

Môi trường Plate Count Agar (PCA) có pH 7,0 ± 0,2. Ngoài ra có thể

sử dụng các môi trường khác: Tryptose Glucose Agar, Nutrient Agar.

Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water).

4.2.1.3. Qui trinh phân tích

4.2.1.3.1. Chẩn bị mẫu trước khi phân tích

Trước khi tiến hành phân tích, thực hiện việc đồng nhất mẫu như sau:

� Đối với mẫu rắn:

s Cân chính xác 10 g mẫu vào trong bao PE, thêm vào lượng mẫu này 90 ml dung dịch SPW pha loãng.

s Thực hiện đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Thời gian dập mẫu không quá 2,5 phút.

s Thực hiện đồng nhất mẫu trong trường hợp không có máy dập mẫu:

Xay nhuyễn mẫu trong điều kiện vô trùng.

Cân chính xác 10g mẫu, cho vào bình tam giác. Bổ sung vào trong bình 90 ml nước SPW đã được hấp khử trùng. Lắc

đều trong 2 phút.

� Đối với mẫu dạng lỏng: hút 10ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước SPW đã được hấp khử trùng, lắc đều.

Sau khi được làm đồng nhất bằng một trong các phương pháp trên, dung

dịch mẫu thu được có độ pha loãng là 10-1 so với ban đầu.

Nếu cần, thì tiến hành pha loãng dịch mẫu đến độ pha loãng cần thiết.

4.3.1.3.2. Cấy mẫu

Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa 25 - 250 tế bào vi sinh vật trong 1 ml để cấy lên đĩa Petri. Dùng pipet

vô trùng hoặc pipetman với đầu tip vô trùng chuyển 1 ml dung dịch pha loãng đã chọn vào giữa đĩa.

Ứng với mỗi độ pha loãng cấy ít nhất 2 - 3 đĩa.

Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 - 15 ml môi trường PCA đã được đun chảy và ổn định ở 45oC. Trộn đều dịch mẫu với

môi trường bằng cách xoay

tròn đĩa Petri ngay sau khi đổ môi trường. Đặt các đĩa trên mặt phăng

ngang cho thạch đông đặc.

Lật ngược và ủ các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 30 ± 1oC trong 72 giờ.

4.3.1.3.3. Cách tính kết quả

Chọn các đĩa có số đếm từ 25 - 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu

được tính như sau:

A (CFU / g hay CFU / ml) = N / ( n1Vf1 + …+ niVfi)

Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu.

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên đĩa đã chọn.

ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i.

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa.

fi: độ pha loãng tương ứng.

Các kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí thường được biểu diễn dưới dạng số mũ của cơ số thập phân.

4.2.2. Nhóm Coliforms và giông Escherichia coli

4.2.2.1 Định nghĩa Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E. coli

Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí

hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid khi được ủ ở 37oC

trong môi trường canh Lauryl Sulphate và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt.

Nhóm Coliforms gồm 4 giống: Escherichia với 1 loài duy nhất là E. coli, Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter.

Tính chất sinh hoá đặc trưng của nhóm này đựơc thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges

Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi chung là IMViC.

Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44oC

trong môi trường canh E.

coli medium (EC).

Coliforms phân (E.coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indol khi được ủ 24 giờ ở 44,5oC trong canh

Trypton.

E. coli là Coliforms phân, cho kết quả thử nghiệm IMViC là (+ + - -).

4.2.2.2. Định lương Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E. coli băng phương pháp MPN

4.2.2.2.1. Nguyên tắc

Phương pháp MPN được dùng trong những thực phẩm có chứa lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân

và E. coli với mật độ thấp.

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc:

� Mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân.

� 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa

môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham.

� Lặp lại 3 đến 5 ống với mỗi nồng độ pha loãng.

� Theo dõi và ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính (sinh hơi và đổi màu) ở mỗi nồng độ pha loãng.

� Dựa vào bảng MPN, suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1 g ( hoặc 1 ml) mẫu ban đầu.

4.2.2.2.2. Môi trương và hoa chất

Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB ( canh Lauryl Sulphate).

Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL).

Môi trường lỏng E. coli ( E.coli medium, canh EC).

Các môi trường lỏng trên được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử

dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham.

Canh Tryptone và canh MR-VP.

Môi trường rắn Simmon Citrate Agar ( thạch Simmon Citrate).

Dung dịch nước muối pepton SPW ( Saline Pepton Water).

Thuốc thử Kovac’s, Methyl Red, a - napthol.

4.2.2.2.3. Qui trinh phân tích

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoá hoặc pha loãng mẫu ở độ loãng cần thiết.

a. Định lương Coliforms

Cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10 ml canh LSB.

Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3.

Ủ ở 37oC. Ghi nhận số ống có kết quả (+) (có sinh hơi).

Dùng que cấy vòng cấy chuyển ?dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống chứa canh BGBL.

Ủ ở 37 ± 1oC trong 48 giờ.

Ghi nhận số ống có kết quả (+) ứng với mỗi độ pha loãng.

b. Định lương Coliforms chịu nhiệt

Dùng que cấy vòng cấy chuyển một vòng dịch mẫu từ các ống canh

LSB (+) sang môi trường canh EC, ủ ở 44,5 ± 0,2oC trong 24 ± 3 giờ.

Đếm số lượng các ống cho kết quả (+) ở mỗi độ pha loãng.

c. Định lương Coliforms phân

Cấy ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB. Ủ các đĩa này ở 37oC

trong 24 giờ.

Chọn khuẩn lạc Coliforms phân hay E.coli giả định (đặc điểm: tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím) có đường kính

lớn hơn 1 mm, cấy chuyền vào canh Trypton, ủ ở 44,5 ± 0,2oC trong 24 giờ.

Nhỏ thuốc thử Kovac’s vào các ống nghiệm đã ủ. Phản ứng dương tính khi có màu đỏ xuất hiện trong môi trường

trong vòng vài phút.

Ghi nhận số lượng các ống cho kết quả (+) trên môi trường Trypton

ứng với mỗi độ pha loãng.

d. Định lương E. coli

Cấy ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch EMB. Ủ các đĩa này ở 37oC trong

24 giờ.

Chọn khuẩn lạc E. coli giả định (đặc điểm: tròn, dẹt hình đĩa,có ánh kim tím) có đường kính lớn hơn 1 mm và cấy

vào các môi trường MRVP, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử nghiệm IMViC.

Ống cho kết quả (+) trong canh EC và khuẩn lạc E. coli giả định trên môi trường EMB cho kết quả thử nghiệm

IMViC là + + - - là ống có E. coli (+). Ghi nhận ống nghiệm có E. coli (+) cùng với độ pha loãng.

4.2.2.2.4. Cách đoc kết quả

Tra bảng MPN để tính mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN / g hay MPN / ml mẫu ban đầu

chưa pha loãng.

4.2.2.3. Định lương Coliforms, Coliforms phân băng phương pháp đếm khuẩn lạc


Cấy một lượng nhất định mẫu đã được đồng nhất hóa lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose, muối mật,....

Ủ ở 37 ± 1oC trong 24 - 48 giờ.

Đếm số khuẩn lạc Coliforms lên men lactose và sinh acid thông qua đặc điểm: khuẩn lạc có màu đỏ đến màu đỏ đậm,

đường kính > 0,5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật.

Việc khăng định Coliforms được thực hiện bằng cách nuôi cấy khuẩn lạc trên trên môi trường canh chọn lọc BGBL.

Để định lượng Coliforms phân, thực hiện tương tự nhưng thay đổi nhiệt độ ủ là 44oC.


Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA).

Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB).

Môi trường canh Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL).

Môi trường canh EC Broth và môi trường canh Trypton Broth.

Thuốc khử Kovac’s hay Indol.

4.2.2.3.3. Quy trinh phân tích

Đồng nhất hóa và pha loãng mẫu sao cho tổng tế bào Coliforms ít hơn 100 trong 1ml dung dịch pha loãng.

Chuyển 1 ml dịch mẫu pha loãng vào đĩa Petri. Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5 ml môi trường TSA (đã đun

chảy và ổn định ở 45oC).

Lắc tròn đĩa petri để trộn đều dịch mẫu với môi trường.

Để ở nhiệt độ phòng 1 - 2 giờ để hồi phục các tế bào bị tổn thương.

Thêm vào mỗi đĩa 10 - 15 ml môi trường thạch VRB (45oC) lên trên môi trường TSA.

Chờ môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 ± 1oC trong 24 - 48 giờ.

Làm tương tự với 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với mỗi nồng độ pha loãng.

Thử nghiệm khăng định Coliforms:

� Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc bị nghi ngờ là Coliforms.

� Trường hợp khăng định Coliforms tổng số:

s Dùng que cấy vòng cấy sang các ống chứa môi trường BGBL.

s Ủ các ống nghiệm ở 37 ± 1oC trong 24 - 48 giờ.

s Kết quả khăng định (+) khi Coliforms tăng trưởng làm đục môi trường và sinh hơi trong ống Durham.

� Trường hợp khăng định Coliforms phân:

s Dùng que cấy vòng cấy sang các ống chứa môi trường EC.

s Ủ các ống nghiệm ở 44oC trong 24 - 48 giờ.

s Các khuẩn lạc cho kết quả (+) trên EC được thực hiện thử nghiệm Indol ở 44oC. Thử nghiêm khăng định Coliforms

phân chỉ được xem là (+) khi vừa (+) trên môi trường EC vừa (+) trên thử nghiệm Indol.

� Tính tỉ lệ khăng định là tỉ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả (+) với khuẩn lạc được dùng trong thử nghiệm khăng định.


Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ khăng định, tính mật độ Coliforms, Coliforms phân theo công thức sau:

A (CFU / g hay CFU / ml) = (NR) / (n1vf1 +…+ nivfi)

Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm được.

ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng.

v: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa.

fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm.

R: tỉ lệ khăng định.

4.2.2.4. Định lương E. coli băng phương pháp đếm khuẩn lạc


Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose, ủ ở

44oC trong 24 giờ.

Đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng của Coliforms.

Khăng định các khuẩn lạc đã đếm là E. coli bằng thử nghiệm IMViC.


Môi trường canh Tryptone Soya Agar (TSA) và môi trường thạch Violet Red Bile Agar (VRB).

Môi trường canh Lactose Tryptone Lauryl Sulphate Broth (LST Broth).

Môi trường canh Tryptone Broth và môi trường canh MR - VP Broth.

Môi trường thạch Simmon Citrate.

Thuốc khử Kovac’s.

4.2.2.4.3.Qui trinh phân tích

Mẫu được đồng nhất pha loãng và định lượng tương tự như phần Coloforms phân, riêng bước khăng định được tiến hành

như sau:

� Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ là E. coli. Dùng que cấy vòng cấy sang môi trường canh EC, ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24 giờ.

� Chọn các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) và dùng que cấy vòng cấy sang các môi trường sau : canh Tryptone, canh MR-

VP, thạch Simmon Citrate.

� Ủ các môi trường trên ở 44 ± 0,5oC trong 24 giờ.

� Thực hiện thử nghiệm IMViC và ghi nhận số khuẩn lạc E. coli (+).


Tính tỉ lệ khăng định và tính mật độ E. coli (CFU / ml hay CFU /mg) theo công thức tương tự mục 4.2.2.3.4 ở trên.

4.2.3. Staphylococcus aureus


Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu,

gram dương, có thử nghiệm coagulase, phosphatease (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose.

Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15 %

NaCl.

Hầu hết các dòng đều tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, có thể tổng hợp enterotoxin trong môi

trường có nhiệt độ trên 15oC.

S. aureus có thể nhiễm vào trong thực phẩm qua con đường tiếp xúc giữa người với thao tác trong quá trình chế biến

thực phẩm.

S. aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các

khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập.

4.2.3.2. Môi trương và hoá chất

Môi trường canh Mannitol Salt Broth (MSB).

Môi trường thạch máu.

Môi trường thạch Baird Parker Agar (BPA).

Môi trường thạch Tellurite Glycine Agar (TGA).

Môi trường Brain Heart Infusion (BHI).

Huyết tương thỏ.

4.2.3.3. Phân tích định tính Staphylococcus aureas

Cấy 2 ml dung dịch vào mẫu ống nghiệm chứa 8 ml môi trường MSB, trộn đều và ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Dùng que cấy vòng cấy ria dịch mẫu từ ống (+) (môi trường chuyển từ đỏ sang vàng) lên môi trường phân lập (thạch

TGA), ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus trên môi trường phân lập: có màu đen nhánh, sáng, tròn, lồi, đường kính 1 - 1,5

mm có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc .

Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy vào ống môi trường BHI, ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3 ml huyết tương và ủ ở 37oC trong 24 giờ để thử phản ứng đông kết.

Thực hiện thêm một ống đối chứng không được cấy dịch vi sinh vật.

Mẫu được kết luận là có S. aureus khi thử nghiệm coagulase (+) (có sự xuất hiện của khối đông trong khi ống đối chứng

không có).

4.2.3.4. Định lương S. aureus băng phương pháp đếm khuẩn lạc

4.2.3.4.1. Đồng nhất mẫu và pha loãng

Cân chính xác 10 ± 0,1 g mẫu ttrong túi PE vô trùng, thêm 90 ml dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu bằng máy dập

mẫu khoảng 30 giây.

Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp, sao cho khi cấy một thể

tích xác định lên đĩa BPA sẽ xuất hiện khoảng 10 - 100 khuẩn lạc / đĩa.

4.2.3.4.2. Phân lập trên môi truơng chon loc

Cấy 0,1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường BPA.

Dùng que cấy tam giác thủy tinh trải đều mẫu lên bề mặt môi trường cho đến khi khô. Cấy mẫu trên 3 đĩa môi trường

BPA có độ pha loãng khác nhau. Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu.

Lật ngược đĩa, ủ ở 37 ± 1oC trong 24 - 48 giờ đối với môi trường BPA và 24 giờ đối với môi trường thạch máu.

Trên môi trường thạch BPA:

� Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 0,5 - 1 mm, lồi,

đen bóng có vòng sáng rộng khoảng 1 - 2 mm bao quanh. Đánh dấu trên

mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm trên và tiếp tục ủ đến 48 giờ.

� Sau 48 giờ, khuẩn lạc S. aureus có đường kính 1 - 1,5 mm, màu đen

bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng 2 - 4 mm quanh khuẩn lạc. Có một số dòng S. aureus có thể không tạo

các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần đếm và đánh dấu cả hai dạng khuẩn lạc.

Trên môi trường thạch máu, sau 24 giờ ủ, S. aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục, lồi có màu xám hay vàng nhạt,

đường kính 1 - 2 mm.

4.2.3.4.3. Khẳng định

Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc

trưng từ môi trường thạch BPA lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37oC.

Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Tính tỉ lệ khăng định dựa trên

số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng. Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu.

Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối dòng huyết tương hình thành (mọi mức độ đông kết đều được xem là (+)). Kết quả

là (-) khi không có

hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy.


Mật độ S. aureus trong mẫu được tính như sau:

Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = [ 10 (NtHt + NaHa) ] / ( F1 + F2)

Trong đó: F: độ pha loãng.

Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng.

Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng.

Ht: tỉ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khăng định (+) so với khuẩn lạc đặc trưng.

Ht: tỉ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khăng định (+) so với khuẩn lạc không đặc

trưng.

4.2.3.5. Định lương S. aureus băng phương pháp MPN

Phương pháp này được dùng để định lượng mẫu có mật độ S. aureus

thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao.

Dung dịch mẫu được pha loãng ở 3 mức: 10-1, 10-2, 10-3; thực hiện với hệ thống 9 ống nghiệm (3 lần lặp lại ở mỗi độ pha

loãng).

Cấy 1 ml dịch mẫu có độ pha loãng khác nhau vào ống nghiệm có chứa 10 ml môi trường canh MSB, ủ ở 37 oC trong 48

giờ.

Chọn các ống (+) (môi trường bị đục) tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn,

ủ ở 37oC trong 48 giờ.

Chọn các khuẩn lạc đặc trưng để thực hiện thử nghiệm khăng định S.

aureus (tiến hành tương tự như phương pháp đếm khuẩn lạc).

Tra bảng MPN, suy ra mật S. aureus độ trong mẫu (MPN / g hay MPN / ml).

4.2.4. Salmonella


Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di động,

không tạo bào tử, lên men glucose và sinh acid, không lên men saccharose và lactose, không phân giải ure, hầu hết các

chủng đều sinh H2S.

Salmonella khi phân tích định tính được phát hiện qua 4 bước:

� Bước tăng sinh: tuỳ theo đặc tính của mẫu, cần chọn qui trình tăng sinh phù hợp. Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi

trường tăng sinh là 1 : 9 (tuỳ từng trường hợp cụ thể tỷ lệ này có thể thay đổi).

� Bước tăng sinh chọn lọc: các môi trường tăng sinh chọn lọc thường để phát hiện Salmonella trong mẫu thực phẩm là

Rappaport Vassiliadis (RV), Selenite Cystein Broth, Tetrathionate Mueler Kauffmann Broth (TT),…

� Bước phân lập: môi trường XLD được khuyến khích sử dụng để phân lập Salmonella, nhằm tách và nhận dạng

Salmonella khỏi quần thể vi sinh vật khác trong mẫu.

� Bước khăng định: thực hiện các thử nghiệm sinh hoá và huyết thanh đặc trưng của Salmonella để xác nhận lại các

khuẩn lạc Salmonella.


Nước pepton đệm ( Buffered Peptone Water, BPW).

Tetrathionate Mueler Kauffmann Broth (TT).

Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD).

Thạch Hektoen Entric Agar (HE).

Thạch Bismuth Sulphite Agar (BS) và Triple Sugar Iron (TSI).

Thạch Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS).

Canh Rappaport Vassiliadis Soya Pepton (RV).

Canh Malachite Green Magnesium Chloride (canh RV cải tiến).

Canh Urea, Tryptone, Lysine Decarboxylase.

Canh Phenol Red Broth Base gồm 3 loại: Mannitol, Sucrose, Sorbitol.

Thuốc thử Kovac’s và kháng huyết thanh Salmonella đa giá.

4.2.4.3. Qui trinh phân tích định tính Salmonella trong thực phẩm

4.2.4.3.1. Tăng sinh

Đối với các loại mẫu thông thường:

� Cân 25 g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225 ml dung dịch BPW.

� Đồng nhất mẫu bằng Stomacher và ủ ở 37 ± 1oC trong 18 - 24 giờ.

Đối với một số thực phẩm có chứa các chất có thể gây độc hoặc ứng chế sự tăng trưởng của Salmonella, cần thực hiện

qui trình tăng sinh đặc biệt:

� Đối với mẫu gia cầm tươi sống: đặt mẫu vào bao PE lớn, thêm 1 lít môi trường tăng sinh BPW, lắc bằng máy lắc

khoảng 30 giây để môi trường thấm được vào trong toàn bộ mẫu.

� Đối với sữa khô: cho 25 g mẫu vào túi PE vô trùng, thêm 225 ml môi trường BPW, để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng,

sau đó lắc cho sữa tan hết.

� Đối với dừa và các mẫu có hàm lượng chất béo cao: đồng nhất mẫu với BPW, thêm vào 2 - 3 giọt Triton X - 100 và ủ

tăng sinh.

4.2.4.3.2. Tăng sinh chon loc

Lắc đều dịch tăng sinh, chuyển 0,1 ml sang 10 ml môi trường tăng sinh RV đã được ủ ấm đến 42 oC. Ủ ở 42oC ± 0,2oC

trong 18 - 24 giờ.

Mỗi môi trường tăng sinh chọn lọc được ủ ở một nhiệt độ nuôi cấy khác nhau và mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng

trên một đặc điểm phát triển của Salmonella.

4.2.4.3.3. Phân lập và nhận diện

Dùng que cấy vòng cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng

sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc như XLD, HE, …

Các biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường chọn lọc khác nhau

là khác nhau, thể hiện ở hình thái khuẩn lạc Salmonella, ví dụ:

� Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hoặc không có tâm đen.

� Môi trường HE: khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh

lục, có hoặc không có tâm đen.

� Môi trường BS: khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim tím. Môi trường xung

quanh khuẩn lạc chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển màu đen nếu kéo dài thời gian ủ.

� Môi trường BPLS: khuẩn lạc màu hồng nhạt, trong suốt, xung quanh khuẩn lạc môi trường có màu đỏ.

Sau khi cấy, các đĩa được ủ ở 37oC trong 22 - 26 giờ.

4.2.4.3.4. Khẳng định

Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc bị nghi ngờ là Salmonella, cấy sang môi trường không chọn lọc, ủ 37oC trong 18 - 24 giờ. Các

khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được dùng cho các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh.

Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm sinh hóa như sau:

� Thử nghiệm H2S (TSI hay KIA): xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường, có hiện tượng làm vỡ thạch môi trường

(do sinh hơi).

� Thử nghiệm LDC (+): môi trường chuyển thành màu như ban đầu.

� Thử nghiệm Urea (-): môi trường giữ nguyên màu vàng cam.

� Lên men mannitol, sorbitol (+): môi trường chuyển sang màu vàng.

� Thử nghiệm Indol và VP: (-).

Các thử nghiệm kháng nguyên được thực hiện song song với mẫu đối chứng bằng dung dịch nước muối sinh lý. Phản

ứng (+) khi chủng thử nghiệm tạo ngưng kết với kháng huyết thanh nhưng không có ngưng kết với nước muối sinh lý.

4.2.4.3.5. Báo cáo kết quả

Báo cáo kết quả là “có” hay “không có” Salmonella trong 25 g mẫu.

4.2.5. Shigella


Shigella là trực khuẩn gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, cho thử

nghiệm catalase (+), lên men glucose không sinh hơi, không lên men lactose, không sinh H2S, không có enzyme lysine

decarboxylase.

Giống Shigella gồm 4 loài:

� S. dysenteriae không lên men mannitol, thuộc nhóm kháng huyết thanh A.

� S. flexneri thuộc nhóm kháng huyết thanh B.

� S. boydii lên men mannitol sinh hơi, thuộc nhóm kháng huyết thanh C.

� S. sonnei lên men mannitol, thuộc nhóm kháng huyết thanh D.

Shigella là tác nhân gây bệnh shigellosis, là bệnh nguy hiểm lây lan rất nhanh từ người sang người qua đường thực phẩm

(thịt băm, thủy sản,..) và nước uống. Shigella gây ngộ độc thực phẩm với liều lượng là rất thấp.

Shigella được phát hiện bằng cách cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường lỏng không chọn lọc, sau đó chuyển vào

môi trường tăng sinh chọn lọc. Dịch khuẩn sau khi tăng sinh chọn lọc được cấy phân lập trên ít nhất 2 đĩa môi trường thạch

khác nhau. Khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra bằng thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh.


Canh Tryptose Soya và Gram Negative (GN).

Dulcitol Phenol Red Broth (DPR).

Lysine Decarboxylase Broth (LD).

Mannitol Phenol Red Broth (MPR).

Thạch Hektoen Enteric (HE) và Triple Sugar Iron (TSI).

Thạch Deoxycholate Citrat Agar.

Thạch MacConkey (MAC) và Xylose Lysine Desoxycholate (XLD).

Môi trường Tergitol - 7 Agar (T7A).

Môi trường thử nghiệm tính di động.

Thuốc thử oxidase và catalase.

Kháng huyết thanh gồm 4 loại: polyvalent A, B, C, D.

4.2.5.3. Qui trinh phân tích

4.2.5.3.1. Tăng sinh

Tăng sinh: lấy 25 g mẫu cho vào túi dập mẫu, thêm 225 ml canh Tryptone Soya, đồng nhất mẫu, đo pH và chỉnh về 7±

0,2, buộc chặc miệng túi, ủ ở 37oC trong 16 - 20 giờ.

Tăng sinh chọn lọc: chuyển 0,1 ml dịch tăng sinh sang 10 ml canh tăng sinh GN, ủ ở 37oC trong 16 - 20 giờ.

4.2.5.3.2. Phân lập

Dùng que cấy vòng cấy dịch tăng sinh lên các đĩa môi trường thạch chọn lọc. Sử dụng ít nhất hai loại môi trường thạch

phân lập khác nhau, một số môi trường thông dụng như: T7A, XLD, HE, MAC,…

Ủ các đĩa môi trường ở nhiệt độ 37oC trong 24 - 48 giờ.

Biểu hiện của Shigella trên các môi trường phân lập như sau:

� Môi trường T7A: khuẩn lạc Shigella có màu xanh nhạt.

� Môi trường HE: khuẩn lạc Shigella có màu xanh nhạt, trong suốt.

� Môi trường XLD: khuẩn lạc Shigella có màu đỏ, trong suốt.

� Môi trường MAC: khuẩn lạc Shigella có màu nâu đỏ, trong suốt.

4.2.5.3.3. Khẳng định Shigella băng thử nghiệm sinh hoa và huyết thanh

Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập, cấy lên môi trường thạch không chọn lọc, ủ ở 37oC trong 20

- 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng để tiến hành các thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết

thanh.

Thử nghiệm sàng lọc:

� Cấy ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường TSI, cách cấy như sau: trước hết cấy ria trên mặt nghiêng, sau đó đâm

sâu xuống ống nghiệm.

Ủ ống ở 37oC trong 24 giờ.

� Khăng định Shigella: Shigella cho màu đỏ trên mặt nghiêng, màu vàng ở phần đáy ống nghiệm và không tạo H2S trong

môi trường.

Thử nghiệm khăng định :

� Shigella được khăng định bằng các thử nghiệm sinh hóa ứng với các kết quả:

Thử nghiệm sinh hóa Kết quả Thử nghiệm sinh hóa Kết quả

Simmon citrate - Salicine -

Arginine decarboxylase - Xylose -

Lisine decarboxylase - Cellobiose

Urease - Adonitol -

Malonate - Dulcitol -

MR + Inositol -

VP -

4.2.5.3.4. Khẳng định Shigella băng thử nghiệm kháng huyết thanh

Thực hiện thử nghiệm kháng huyết thanh bằng huyết thanh đa giá A, B, C, D từ các dòng được nuôi cấy trên môi trường

thạch không chọn lọc.

Tiến hành song song với mẫu đối chứng (dùng nước muối sinh lí).

Phản ứng (+) khi chủng thử nghiệm tạo ngưng kết với kháng huyết thanh nhưng không có ngưng kết với nước muối sinh

lý.

4.2.5.3.5. Báo cáo kết quả

Kết quả báo cáo là “có” hay “không có” Shigella trong 25 g mẫu.

PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN ĐÔNG LẠNH

Documents

Transcript of PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN ĐÔNG LẠNH