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Programma Operativo Regionale 2007IT051PO007 FSE Puglia

Percorso di Genetica

Dirigente Scolastico: Prof.ssa Giovanna Caretto D.S.G.A.: Dott. Valterluigi Carluccio Coordinatore logi. e org. e Responsabile piattaforma Ansas - Resp. Pubblicità: Prof. Rollo Antonio Facilitatore: Prof. Enrico Peccarisi

Tutor scolastiche:

Prof.ssa Maria Rosaria Arlotta Prof.ssa Alessandra Galizia Prof.ssa Luciana Tesorone Prof.ssa Patrizia Tommasi

Valentina Pesce Barbara Irno Consalvo Roberta Iovino Francesca Erroi Katia Monteduro

Gruppo di lavoro

Percorso di Genetica

Tutor d’azienda: Dott. Simone Raho

           La  scienza  della  vita:  

La genetica è la scienza che studia i meccanismi dell'ereditarietà attraverso i quali avviene la trasmissione delle caratteristiche biologiche (caratteri) da una generazione a quella successiva nelle varie specie animali e vegetali. Tutto ciò avviene mediante lo studio:

:  è  l'unità  ereditaria  fondamentale  degli  organismi  viven5.  I  geni  corrispondono  a  porzioni  di  codice  gene5co  localizzate  in  precise  posizioni  (LOCUS)  all’interno  della  sequenza  nucleo5dica  del    DNA  e  contengono  tuGe  le  informazioni  necessarie  per  la  produzione  di  una  proteina.  Essi  sono  contenu5  ed  organizza5  all’interno  dei  cromosomi,  presen5  in  tuGe  le  cellule  di  un  organismo.  Le  cellule  umane  contengono  tuGe  23  coppie  di  cromosomi,  con  la  sola  eccezione  dei  game5  che  presentano  una  singola  copia  di  ciascun  cromosoma.  

: termine  con  il  quale  si  definisce  la  forma  alterna5va  di  un  gene  

:  si riferisce all’insieme di geni che compongono il DNA di un organismo. In individui diploidi, dotati cioè di due copie di ogni cromosoma (cromosomi omologhi), il genotipo, in riferimento ad un singolo carattere, è la combinazione degli alleli di quel gene portati dall'individuo. Se i due alleli di uno stesso locus genico, posizione occupata da un gene sul cromosoma, sono uguali, l'individuo viene detto omozigote, in caso contrario eterozigote (Aa). L’omozigote può essere distinto in dominante (AA) e recessivo (aa) per un determinato gene, in base agli alleli ad esso riferiti.

: si intende l'insieme di tutte le caratteristiche Osservabili di un organismo vivente, quindi la sua morfologia, il suo sviluppo, le sue proprietà biochimiche e fisiologiche comprensive del comportamento. Si distinguono: - Dominante: carattere fenotipicamente espresso negli eterozigoti. -  Recessivo: carattere espresso unicamente negli individui omozigoti per il gene che lo controlla. -  Codominanti: caratteri controllati da due alleli ed entrambi espressi nell’eterozigote.

Diversi individui di una stessa specie presentano colorazione differente.  

Nella  prima  fase  del  ciclo  è  come  se  la  cellula  facesse  la  “fotocopia”  del  proprio  materiale  gene;co.  Tu=o  ciò  avviene  durante  la  fase  S  (sintesi)  nella  quale  ogni  cromosoma  si  duplica  formando  una  copia  di  se  stesso.  Le  due  copie  rimangono  unite  tra  loro  in  un  tra=o  de=o  centromero  nel  quale  il  DNA  non  è  ancora  completamente  duplicato.  Esse  vengono  de=e  croma5di  fratelli.      

La fase S è preceduta e seguita da due fasi dette rispettivamente G1 e G2. La fase G1 è il periodo di crescita cellulare durante la quale essa sintetizza nuove molecole e strutture citoplasmatiche. Nella fase G2, che segue la fase S, la cellula prepara a dividersi. I cromosomi che subiscono la duplicazione iniziano un processo di condensazione e spiralizzazione che li porterà ad assumere una forma sempre più compatta. La cellula inizia inoltre a costruire tutte quelle strutture che le consentiranno durante la mitosi di ripartire il suo corredo cromosomico alle cellule figlie.

Le cellule umane contengono 46 cromosomi. I geni, cioè frammenti specifici di DNA, sono i principali costituenti dei cromosomi. In un singolo cromosoma sono mediamente presenti 2.000 geni. I cromosomi X e Y, sono quelli che determinano il sesso: Nella donna sono presenti due cromosomi X, e nell’uomo un X e un Y.

sezione della  cromatina  

5 avvolgimenti  della doppia elica  

fibra di 30nm con   i  nucleosomi  strettamente  impacchettati  

parte di una sezione  di cromosoma  

sezione condensata  di un cromosoma  metafasico  

cromosoma  metafasico  

2nm  

11nm  

30nm  

300nm  

700nm  

1400nm  

Con il termine cariotipo si indica, in citogenetica, la costituzione del patrimonio cromosomico di una specie dal punto di vista morfologico. Il cariotipo di una cellula eucariota è dato dal numero e dalla morfologia dei suoi cromosomi ed è una rappresentazione ordinata del corredo cromosomico di un individuo. E’ costituito da 22 coppie appaiate, nelle quali uno dei cromosomi è di origine paterna ed uno di origine materna. I cromosomi sono distinti a seconda della lunghezza (dal più lungo al più corto) ed in base alle caratteristiche morfologiche (visibili con la tecnica del “bandeggio”). I cromosomi del sesso (XX o XY) vengono evidenziati come coppia separata.

Viene  qui  illustrato  un  ;pico  protocollo  per  I’o=enimento  di  cromosomi  metafasici  di  linfoci;  a  par;re  da  sangue  periferico.    I  passaggi  principali  sono:  Prelievo  di  sangue  e  sua  aggiunta  ad  un  terreno  di  coltura  contenente  PHA  per  s;molare  la  mitosi.  Incubazione  in  termostato  per  3  giorni    a  37°C.    Aggiunta  della  colchicina  per  bloccare  le  cellule  in  metafase.  Centrifugazione  per    raccogliere  le  cellule.  Aggiunta  di  una  soluzione  ipotonica  (a  bassa  concentrazione  salina).  Centrifugazione  e  aggiunta  di  una  soluzione  fissa;va  cos;tuita  da  metanolo  e  acido  ace;co.  I  linfoci;  vengono  preleva;  e  sparsi  su  un  vetrino.  I  cromosomi  vengono  ora  colora;  col  metodo  del  "banding"  nella  quale  assumono  una  colorazione  appunto  per  bande,  o  fasce  colorate,  ;piche.  La  piastra  metafasica  viene  fotografata  I  vari  cromosomi  vengono  ordina;  (i  cromosomi  omologhi  vengono  appaia;;  i  cromosomi  appartenen;  alla  stessa  coppia  hanno  gli  stessi  bandeggi  e  il  loro  centromero  è  nella  stessa  posizione).  

La tecnica più conosciuta in diagnosi prenatale è l’amniocentesi. Vi sono due momenti distinti della gravidanza in cui è possibile eseguire l'amniocentesi, con scopi diagnostici assai diversi. Il primo momento (amniocentesi precoce) è tra la 16ª e la 18ª settimana, quando l'amnios ha raggiunto dimensioni sufficienti perché la pratica non costituisca un rischio per il feto; il secondo momento (amniocentesi tardiva) cade dopo la 25ª settimana, quando possono verificarsi condizioni nelle quali sia richiesto il prelievo di liquido amniotico per fini diversi da quelli citogenetici. La sempre maggiore richiesta di ottenere risposte precoci ha indotto, negli ultimi anni, ad eseguire il prelievo del liquido amniotico anche in epoca inferiore alla 15ª settimana di gestazione, come valida alternativa al prelievo dei villi coriali (amniocentesi precocissima). GLI SCOPI :

-  valutazione del cariotipo, cioè dell'assetto cromosomico fetale, al fine di valutarne la normalità o al contrario per evidenziare la presenza di anomalie, o per determinazione del sesso fetale, importante nel sospetto di trasmissione ereditaria di una malattia legata al cromosoma X; -  dosaggio di alfafetoproteina o di acetilcolinesterasi, sostanze presenti in quantità superiori alla norma nel liquido quando il feto presenta un'anomalia di sviluppo del tubo neurale (anencefalia, spina bifida, encefalocele, mielomeningocele).

GRUPPO   CROMOSOMI   CARATTERISTICHE  

A   1,  2,  3   Cromosomi  grandi  con  centromeri  in  posizione  mediana.  B   4,  5   Cromosomi  grandi  con  centromeri  sub-­‐mediani.  C   6,  7,  8,  9,  10,11,12   Cromosomi  di  media  grandezza  con  centromeri  sub-­‐mediani  

D   13,  14,  15   Cromosomi  di  media  grandezza  con  centromeri  terminali.  E   16,  17,  18   Cromosomi  piccoli  con  centromeri  mediani  e  sub-­‐mediani.  F   19,  20   Cromosomi  piccoli  con  centromeri  mediani.  G   21,  22   Cromosomi  molto  piccoli  e  acrocentrici.  

Lo sviluppo del bandeggiamento ha costituito un progresso decisivo per le analisi citogenetiche e ha permesso di individuare in maniera univoca i singoli cromosomi. Vari trattamenti denaturanti consentono di colorare i cromosomi in modo riproducibile, secondo una sequenza di bande chiare e scure.

Il  numero  del  cromosoma  è  seguito  da  p  (braccio  corto)  o  q    (braccio  lungo)  e  dal  numero  della  banda,  esempio  11q23  significa,  l’estremità  del  braccio  lungo  q  del  cromosoma  11,  banda  2  soGobanda  3.  

Bandeggio GTG (G-Trypsin-Giemsa): -­‐E’   uno   dei   bandeggi   più   largamente   u5lizza5.   Consiste   nel   traGare   i  cromosomi   con   un   enzima   proteoli5co,   la   tripsina,   che   digerisce   le  proteine  istoniche.      -­‐  In  seguito  si  immergono  i  vetrini  in  una  soluzione  di  Giemsa,  una  miscela  di  azur  II  ed  azur  II  eosina,  e  questo  consente  la  visualizzazione  delle  bande  cosiddeGe  G.  

Il   bandeggio   Q-­‐Fluorescence-­‐Quinacrine   è   cos5tuito   da   una  colorazione  fluorescente.  -­‐  E’analogo  a  quello  G.    -­‐  Il  contrasto  inoltre  è  inferiore  a  quello  oGenibile  con  il  bandeggio  G.  

ANOMALIE  COSTITUZIONALI:  presen5  in  cellule  di  tuGo  il  corpo.  Spermatozoo  e  ovulo  normali,  fecondazione  anomala  o  evento  anomalo  nelle  prime  fasi  di  sviluppo  embrionale  ANOMALIE  SOMATICHE:  presen5  in  un  piccolo  soGogruppo  di  cellule  o  tessu5.  Diverse  cos5tuzioni  cromosomiche  pur  derivando  tuGe  le  cellule  dallo  stesso  zigote.  MOSAICO  GENETICO.  

Quali sono le anomalie cromosomiche

Di numero: - trisomie

- monosomie

- triploidie

- tetraploidie

Di struttura - traslocazioni

-  inversioni

- delezioni

- duplicazioni

MONOSOMIE  E  TRISOMIE   CELLULE  NEOPLASTICHE                                              (  aneuploidia  estrema)  

NON-­‐DISGIUNZIONE:  incapacità  di  cromosomi  appaia;  di  separarsi  durante  la  prima  divisione  meio;ca,  o  dei  croma;di  fratelli  appaia;  di  separarsi  nella  seconda  divisione  meio;ca.  I  due  cromosomi  o  croma;di  congiun;  migrano  ad  un  polo  e  vengono  inclusi  in  una  sola  cellula  figlia,  mentre  l’altra  avrà  materiale  gene;co  in  meno  

RITARDO  ANAFASICO:  ritardata  migrazione  del  cromosoma  durante  l’anafase,  conseguente  perdita  del  cromosoma.  Mancata  incorporazione  di  un  cromosoma  nel  nucleo  di  una  delle  cellule  figlie  

La sindrome di Down è una condizione genetica caratterizzata dalla presenza di un cromosoma in più nelle cellule di chi ne è portatore: invece di 46 cromosomi nel nucleo di ogni cellula ne sono presenti 47, vi è cioè un cromosoma in più nella coppia identificata con il numero 21.

La trisomia 13 è una grave anomalia cromosomica causata

dalla presenza di un cromosoma 13 in sovrannumero. Nei feti

affetti la morte endouterina si verifica in oltre il 95% dei casi.

La sindrome di Edwards è una malattia genetica rara. Il cariotipo dei soggetti affetti da questa sindrome presenta tre cromosomi 18 invece di due. Questa patologia si manifesta con delle malattie congenite di tutti gli organi interni che precludono il corretto sviluppo dell’individuo già durante la gravidanza; nel caso in cui la gravidanza viene portata a termine il 90% dei bambini affetti muore nei primi sei mesi di vita per problemi cardiaci.

Bilanciate: nella maggioranza dei casi non sono correlate ad un fenotipo anomalo

Sbilanciate:  sono correlate ad un fenotipo anomalo (malformazioni e/o ritardo mentale)

PORTATORE  DI  TRASLOCAZIONE  BILANCIATA:  PUO’  PRODURRE  GAMETI  NON  BILANCIATI  CHE  ORIGINERANNO  ZIGOTI  CON  TRISOMIA  PARZIALE  O  MONOSOMIA  PARZIALE  PER  DEFINITE  REGIONI  CROMOSOMICHE  

La  citogene5ca  classica.  

•  Permette di identificare riarrangiamenti cromosomici coinvolgenti non meno di 3-5 Mb.

La  citogene5ca  molecolare.  

•  Abbina la possibilità di associare l’analisi del DNA, propria delle tecniche di biologia molecolare, con l’analisi della struttura cromosomica, il cui studio è oggetto della citogenetica classica.

PermeGe  un’analisi  mirata  di  una  regione  cromosomica  consentendo  di  meGere  in  evidenza  riarrangiamen5  di  alcune  cen5naia  di  chilobasi.  

 Una  delle  principali  tecniche  di  citogene5ca  molecolare  è  la:    •  FISH  (Fluorescence  In  Situ  

Hybridiza5on)  

E’  una  tecnica  di  ibridazione  che  permeGe,  dopo  fissazione  di  metafasi  o  nuclei  in  interfase  su  vetrino,  di  iden5ficare  sequenze  specifiche  negli  acidi  nucleici.  La  FISH  consente  la  localizzazione  di  specifiche  sequenze  di  DNA  su  un  determinato  cromosoma,  regione  di  cromosoma,  o  “5po”  cellulare;  generalmente  la  morfologia  del  cromosoma,  della  cellula  o  del  tessuto  d’interesse  viene  conservata  per  permeGere  una  precisa  ed  inequivocabile    interpretazione  del  “target”.  

nucleo;di  bio;nila;  

marcatura  della  sonda  

sonda  bio;nilata  

denaturazione  della  sonda  

cromosomi  denatura;  

ibridazione  

sonda  ibridata  al  DNA  cromosomico  

avidina  fluorescinata   cromosomi  con  sonda  fluorescinata  

visualizzazione  al  microscopio  

cromosomi  con  segnali  fluorescen;  in  corrispondenza  del  segmento  di  DNA  

riconosciuto  dalla  sonda  

CCD

Metafase

CHROMOSOME  PAINTING  

applicazioni  •  Iden5ficazione  di  cromosomi  marker  e  ring;  

•  CaraGerizzazione  di  traslocazioni  complesse;  

•  Iden5ficazione  di  inserzioni  cromosomiche;  

•  Individuazione  di  riarrangiamen5  ‘crip5ci’.   finalità  •  analisi  simultanea  di  tuGo  il  corredo  cromosomico  con  un  approccio  rapido:  un  singolo  esperimento  per  lo  studio  dell’intero  cario5po;  

•  sistema  affidabile  di  caraGerizzazione  contemporanea  di  tuk  i  riarrangiamen5  cromosomici  nella  cario5pizzazione  di  cellule  neoplas5che  

M-­‐FISH  

VANTAGGI  

•  rapidità •  identificazione di

microdelezioni e riarrangiamenti complessi

•  diagnosi su nucleo

SVANTAGGI

•  costi elevati •  diagnosi non

completa