PENGARUH MINUMAN BUBUK KAKAO LINDAK BEBAS … · detoksifikasi dalam tubuh melibatkan kerja enzim...

PENGARUH MINUMAN BUBUK KAKAO LINDAK BEBAS LEMAK TERHADAP AKTIVITAS ENZIM ANTIOKSIDAN

DAN ENZIM DETOKSIFIKASI PADA ERITROSIT DAN PLASMA MANUSIA

FITRI HASANAH

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2007

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Pengaruh Minuman Bubuk Kakao Lindak Bebas Lemak terhadap Aktivitas Enzim Antioksidan dan Enzim Detoksifikasi pada Eritrosit dan Plasma Manusia adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Agustus 2007

Fitri Hasanah NRP F251050081

RINGKASAN

FITRI HASANAH. Pengaruh Minuman Bubuk Kakao Lindak Bebas Lemak Terhadap Aktivitas Enzim Antioksidan Dan Enzim Detoksifikasi Pada Eritrosit Dan Plasma Manusia. Dibimbing oleh MAGGY T. SUHARTONO dan FRANSISKA R. ZAKARIA

Bubuk kakao bebas lemak merupakan produk substandar dalam pengolahan kakao yang belum banyak dimanfaatkan. Kakao non fermentasi mendominasi hampir semua pengolahan kakao di Indonesia. Bubuk kakao bebas lemak non fermentasi memiliki kandungan polifenol sebesar 4,43 gr/ 100 gr. Kandungan polifenol yang berupa flavonoid ini berpotensi sebagai antioksidan dalam menangkal radikal bebas. Sistem Pertahanan Tubuh Enzimatik terhadap radikal bebas melibatkan berbagai enzim, salah satunya adalah katalase. Sistem detoksifikasi dalam tubuh melibatkan kerja enzim fase I (sitokrom P-450) dan enzim fase II (glutation S-transferase) untuk mengeluarkan toksin atau senyawa asing sehingga tidak membentuk senyawa metabolit radikal dalam tubuh. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak terhadap aktivitas enzim katalase dan sitokrom P-450 serta glutation S-transferase pada eritrosit maupun plasma manusia. Selama 25 hari sebanyak 18 responden wanita yang sehat dibagi dalam dua kelompok, yaitu kelompok kakao (n = 9) dan kelompok kontrol (n = 9), di mana kelompok kakao mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak yang diberi susu skim dan gula, sedangkan kelompok kontrol hanya mengkonsumsi minuman susu skim dan gula saja. Selama penelitian berlangsung makanan dan kesehatan responden di bawah kontrol peneliti. Pengambilan darah responden dilakukan sebelum dan sesudah pelaksanaan intervensi untuk kemudian dilakukan analisa terhadap aktivitas enzim katalase dengan metode kalorimetri dan sitokrom P-450 serta glutation S-transferase dengan metode spektrofotometri. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak selama 25 hari menghasilkan peningkatan secara nyata (p < 0,05) terhadap aktivitas enzim antioksidan katalase pada eritrosit dari 999,64 U/ mg protein menjadi 1020,03 U/ mg protein dan pada plasma dari 539,23 U/ mg protein menjadi 584,18 U/ mg protein. Peningkatan juga terjadi pada enzim glutation S-transferase pada eritrosit dari 0,083 nmol/ min/ mg protein menjadi 0,217 nmol/ min/ mg protein dan pada plasma peningkatan dari 0,129 nmol/ min/ mg protein menjadi 0,293 nmol/ min/ mg protein. Sementara itu enzim detoksifikasi sitokrom P-450 mengalami penurunan secara nyata (p < 0,05) pada eritrosit dari 5,43 nmol/ mg protein menjadi 1,59 nmol/ mg protein dan pada plasma dari 2,11 nmol/ mg protein menjadi 0,78 nmol/ mg protein. Secara keseluruhan dari hasil penelitian ini bisa disimpulkan bahwa bubuk kakao bebas lemak yang berasal dari perkebunan di Indonesia dapat meningkatkan sistem pertahanan tubuh secara enzimatis terhadap serangan radikal bebas.

Kata kunci: bubuk kakao lindak bebas lemak, katalase, sitokrom P-450, Glutation

S-transferase, flavonoid, antioksidan, detoksifikasi

ABSTRACT Fitri Hasanah. The Effects of Fat Free Bulk Cocoa Powder Drinks Consumption on Antioxidant and Detoxification Enzyme Activity in Human Erythrocyte and Plasma. Under the supervision of MAGGY T. SUHARTONO and FRANSISKA R. ZAKARIA

The fat free cocoa powder is substandard product from cocoa processing. Fat free unfermented cocoa powder have about 4,43 gr/ 100 gr of polyfenol. Cocoa is rich in flavonoid with antioxidant activity. Enzymatic defence system in humans consists of: catalase, superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxide (GPx). Detoxification metabolism consists of two phases that enable man to excreate out toxic from the body. This system need enzyme such as cytochrome P-450 and glutation S-transferase (GST). The aim of this research was to determine the effect of Indonesian fat free cocoa powder drink consumption on the antioxidant enzymes activity namely catalase and on the detoxification enzyme namely cytochrome P-450 and GST in human erythrocyte and plasma. Eighteen women healthy subjects were recruited and divided into two groups, control subjects (n = 9) and cacao subjects (n = 9). Cocoa powder drinks containing cocoa (50 %), skim milk (25 %) and sugar (25 %) was given to the groups. The control group received only water contain skim milk (50 %) and sugar (50 %). The criteria of the respondents were healthy according medical diagnosis and signed the informed of consent. Both cocoa and experimental group received medical check up at the beginning and at the end of the intervention. The activity of catalase was analyzed based on calorimetry and spectrofometry. Their peripheral blood were withdrawn to analyze activity of catalase, cytochrome P-450 and GST. The result showed that there was a significant increased in activity catalase of erythrocyte from 999,64 U/ mg protein to 1020,03 U/ mg protein and also on plasma from 539,23 U/ mg protein to 584,18 U/ mg protein. The activity of GST in erythrocyte was a significant increased from 0,083 nmol/ min/ mg protein to 0,217 nmol/ min/ mg protein and also on from 0,129 nmol/ min/ mg protein to 0,293 nmol/ min/ mg protein. The result showed that there was a significant decreased in cytochrome P-450 of erythrocyte from 5,43 nmol/ mg protein to 1,59 nmol/ mg protein and also on plasma from 2,11 nmol/ mg protein to 0,78 nmol/ mg protein. In conclusion, the Indonesian fat free cocoa powder has increased human defences system from free radical attact that may damage the cell. Keyword: cocoa, flavonoid, catalase, Cytochrome P-450, Glutathione S-

transferase (GST), antioxidant, detoxification

© Hak cipta milik IPB, tahun 2007 Hak cipta dilindungi

Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam

bentuk apa pun, baik cetak, fotokopi, microfilm, dan sebagainya

PENGARUH MINUMAN BUBUK KAKAO LINDAK BEBAS LEMAK TERHADAP AKTIVITAS ENZIM ANTIOKSIDAN

DAN ENZIM DETOKSIFIKASI PADA ERITROSIT DAN PLASMA MANUSIA

FITRI HASANAH

Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada Departemen Ilmu Pangan

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2007

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Nugraha Edi Suyatma, DEA

Judul Penelitian : Pengaruh Minuman Bubuk Kakao Lindak Bebas Lemak

terhadap Aktivitas Enzim Antioksidan dan Enzim

Detoksifikasi pada Eritrosit dan Plasma Manusia

Nama Mahasiswa : Fitri Hasanah

NRP : F251050081

Disetujui

Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria, MSc Ketua Anggota

Diketahui Ketua Program Studi Ilmu Pangan Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof.Dr.Ir.Betty Sri Laksmi Jenie,MS Prof.Dr.Ir. Khairil Anwar Notodiputro,MS Tanggal Ujian: 08 Agustus 2007 Tanggal Lulus: 20 Agustus 2007

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil”alamin, Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga penelitian dan penulisan tesis ini dapat diselesaikan dengan baik. Judul tesis ini adalah “Pengaruh Minuman Bubuk Kakao Lindak Bebas Lemak terhadap Aktivitas Enzim Antioksidan dan Enzim Detoksifikasi pada Eritrosit dan Plasma Manusia”, yang merupakan syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Tim Riset Unggulan Terpadu XII (RUT) tahap II tahun 2006 yaitu Bapak Dr. Ir. Misnawi (Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia di Jember) dan Ibu Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria, M.Sc. (Dosen Pascasarjana Ilmu Pangan IPB) atas bantuan dana penelitian.

Penghargaan dan terima kasih penulis haturkan kepada Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono sebagai ketua komisi pembimbing dan Ibu Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria, M.Sc selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan dorongan, pengarahan, saran serta motivasi selama penulis menyelesaikan studi. Terimakasih juga kepada Bapak Dr. Ir. Nugraha Edi Suyatma, DEA selaku penguji yang telah banyak memberi sarannya.

Kepada semua responden atas keikhlasan dan kerjasamanya selama penelitian berlangsung juga disampaikan rasa terima kasih yang mendalam. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada tim kakao, yaitu Welli, Eris, Retno, Erni, dan Femi serta teman-teman mahasiswa pascasarjana program studi ilmu pangan khususnya angkatan 2005, dan semua pihak yang telah memberikan bantuan selama penelitian berlangsung. Terimakasih juga diucapkan kepada teman-teman di Pondok PCH atas kebersamaannya. Tak lupa untuk seluruh rekan-rekan seperjuangan di KMNU IPB, Forum WACANA IPB, PMII semoga kita bisa terus berjuang dan berkarya.

Akhirnya ungkapan terima kasih yang dalam disampaikan kepada Ayahanda Yakin Sabri HS, BA dan Ibunda Husnaini, SPd atas seluruh pengorbanan dan doa yang telah diberikan, juga kepada adik-adik dan keluarga besar di Bengkulu. Tak lupa kepada H. Mahir Moh. Soleh LC “Zaujy al-Mustaqbal bi al-Hubb wa al-Da’am wa al-Du’a” beserta keluarga. Semoga Allah SWT memberikan balasan amal baik kepada mereka semua dengan pahala yang tak terhingga.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Agustus 2007

Fitri Hasanah

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bengkulu pada tanggal 15 Juli 1983 sebagai anak pertama dari empat bersaudara, dari Bapak Yakin Sabri HS, BA dan Ibu Husnaini, SPd. Tahun 2001 penulis lulus dari SMU Negeri 3 Bengkulu dan pada tahun yang sama penulis meneruskan pendidikan Sarjana di Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Universitas Muhammadiyah Malang. Pada tahun 2005 penulis lulus dari Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Universitas Muhammadiyah Malang. Tahun 2005 penulis diterima di Sekolah Pascasarjana IPB pada program studi Ilmu Pangan. Selama menyelesaikan studi di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, penulis aktif dalam berbagai organisasi diantaranya yaitu Keluarga Mahasiswa Nahdlatul Ulama (KMNU) SPs IPB, Forum Mahasiswa Pascasarjana IPB dan Pergerakan Mahasiswa Islam Indonesia (PMII).

DAFTAR ISI

Halaman DAFTAR ISI ......................................................................................................... v

DAFTAR TABEL ................................................................................................. vi

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... vii

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... viii

PENDAHULUAN..…………………….……………………………………….... 1 Latar Belakang……….....……………………………………………….. 1 Tujuan Penelitian ………………………………………………………. 3 Hipotesis Penelitian …………………………………….…….…………. 3 Manfaat Penelitian …………………………………………………….... 4 TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................................... 5 Kakao......................................................................................................... 5 Flavonoid Pada Kakao.............................................................................. 8 Antioksidan............................................................................................. 10 Radikal Bebas dan Kerusakan Sel........................................................... 12 Sistem Pertahanan Tubuh Nonenzimatik.................................................. 15 Sistem Pertahanan Tubuh Enzimatik........................................................ 15 Metabolisme Xenobiotik dan Detoksifikasi Senyawa Beracun................ 17 Metabolisme Senyawa Bioaktif................................................................ 23 Komponen Darah...................................................................................... 25 Eritrosit..................................................................................................... 25 Plasma ..................................................................................................... 26 METODOLOGI................................................................................................... 27 Tempat dan Waktu Penelitian.................................................................. 27 Bahan dan Alat......................................................................................... 27 Alur penelitian ......................................................................................... 28 Metode Penelitian..................................................................................... 29 HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................................ 37 Keadaan Umum Responden..................................................................... 37 Aktivitas Enzim Antioksidan Katalase pada Eritrosit............................... 42 Aktivitas Enzim Antioksidan Katalase pada Plasma................................ 47 Aktivitas Enzim Sitokrom P-450 pada Eritrosit........................................ 53 Aktivitas Enzim Sitokrom P-450 pada Plasma......................................... 59

Aktivitas Enzim Glutation S-transferase pada Eritrosit............................ 65 Aktivitas Enzim Glutation S-transferase pada Plasma.............................. 69

SIMPULAN DAN SARAN ................................................................................ 75 Simpulan.................................................................................................. 75 Saran......................................................................................................... 75

DAFTAR PUSTAKA.......................................................................................... 77 LAMPIRAN.......................................................................................................... 87

DAFTAR TABEL

Nomor Halaman

1. Kandungan polifenol produk kakao ………………………………………. 6

2. Jenis-jenis Reactive Oxygen Species dan radikal bebas

yang berperan pada kerusakan sel ................................................................. 10

3. Data antropometri responden sebelum dan sesudah intervensi ..................... 38

4. Menu makan pagi dan makan malam responden yang

disiapkan oleh peneliti selama intervensi berlangsung ................................ 40

DAFTAR GAMBAR

Nomor Halaman

1. Kakao …......……………………………………………………………….... 6

2. Struktur kimia flavonoid ….…………………………………….……… ...... 6

3. Pembagian kelas Flavonoid …………………………………………….………...... 8

4. Pembagian kelas Flavonoid ...................................................................................... 10

5. Metabolisme Xenobiotik di tubuh ..……………………………………...... 19

6. Diagram alir penelitian................................................................................... 28

7. Grafik Aktivitas Enzim Katalase pada Eritrosit Kelompok

Perlakuan sebelum dan sesudah intervensi .................................................... 43

8. Grafik Aktivitas Enzim Katalase pada Eritrosit Kelompok

Kontrol sebelum dan sesudah intervensi ....................................................... 43

9. Grafik Aktivitas Enzim Katalase pada Plasma Kelompok

Perlakuan sebelum dan sesudah intervensi .................................................. 48

10. Grafik Aktivitas Enzim Katalase pada Plasma Kelompok

Kontrol sebelum dan sesudah intervensi ....................................................... 48

11. Grafik Kadar Sitokrom P-450 pada Eritrosit Kelompok


12. Grafik Kadar Sitokrom P-450 pada Eritrosit Kelompok

Kontrol sebelum dan sesudah intervensi ........................................................ 55

13. Grafik Kadar Sitokrom P-450 pada Plasma Kelompok


14. Grafik Kadar Sitokrom P-450 pada Plasma Kelompok

Kontrol sebelum dan sesudah intervensi ........................................................ 60

15. Reaksi GSH dan CDNB ................................................................................. 66

16. Grafik Aktivitas Enzim Glutation S-transferase (GST) pada

Eritrosit Kelompok Perlakuan sebelum dan sesudah intervensi .................... 67


Eritrosit Kelompok Kontrol sebelum dan sesudah intervensi ....................... 67


Plasma Kelompok Kontrol sebelum dan sesudah intervensi ..........................71


Plasma Kelompok Kontrol sebelum dan sesudah intervensi ......................... 71

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Halaman

1. Informed concent

Pernyataan kesediaan menjadi responden penelitian………………............. 88

2. Kuisioner kesehatan fisik, pola makan dan

kebiasaan konsumsi makanan jajanan ........................................................ 89

3. Jadwal penelitian ....................................................................................... 100

4. Data-data hasil penelitian .............................................................................. 101

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Kakao merupakan bahan pangan yang apabila diolah ke dalam bentuk

produk seperti bubuk kakao memiliki citarasa yang enak sehingga banyak disukai

oleh masyarakat. Lemak kakao merupakan bagian yang paling banyak diambil

dari tanaman ini karena bernilai ekonomis tinggi. Pada saat pemisahan lemak

kakao, bubuk kakao itu sendiri tertinggal menjadi produk substandar yang belum

banyak dimanfaatkan. Padahal hasil penelitian menunjukkan bahwa bubuk kakao

bebas lemak tadi memiliki kandungan polifenol yang berpotensi sebagai sumber

antioksidan. Oleh karena itu masih perlu terus digali pemanfaatan kakao bebas

lemak sebagai produk substandar sehingga memiliki nilai ekonomis yang tinggi

pula.

Indonesia adalah negara ketiga penghasil kakao terbesar di dunia setelah

Pantai Gading dan Ghana. Ada dua jenis kakao yang umum dikenal di Indonesia,

yaitu kakao mulia atau edel kakao (fine/ flavour cocoa) dan kakao lindak (bulk

cocoa). Kakao lindak mendominasi hampir seluruh perkebunan di Indonesia.

Kualitas dari produk olahan kakao yang dihasilkan sangat tergantung kepada

kualitas biji kakao dan proses pengolahan. Salah satu faktor yang sangat

menentukan adalah proses fermentasi biji kakao sebelum diolah. Cita rasa coklat

yang baik dapat diperolah bila kakao tersebut difermentasi dengan baik.

Berdasarkan data Direktorat Jenderal Bina Produksi Perkebunan (2004), kakao

Indonesia khususnya yang dihasilkan oleh petani, di pasaran internasional

dihargai paling rendah, karena didominasi oleh biji-biji tanpa fermentasi. Namun

demikian proses fermentasi itu sendiri menyebabkan kandungan senyawa kimia

dalam biji kakao menjadi berubah terutama senyawa flavonoid yang dapat

memberikan efek positif untuk kesehatan. Berdasarkan penelitian Misnawi dan

Selamat (2003) kandungan polifenol dalam biji kakao menurun sampai 50%

selama proses fermentasi. Berbagai cara dilakukan untuk menggali potensi kakao

lokal yang non fermentasi tersebut, salah satunya dengan mengekstraksi dan

memanfaatkan lemak kakao serta meneliti potensi komponen bioaktif flavonoid

pada bubuk kakao bebas lemak non fermentasi sebagai antioksidan dalam tubuh

manusia.

Dalam berbagai penelitian disebutkan bahwa aktivitas antioksidan yang

utama bisa diperoleh dari komponen-komponen seperti flavonoid, isoflavon,

flavon, antosianin dan katekin disamping vitamin C, E dan β-karoten. Biji kakao

dinyatakan sebagai bahan yang kaya akan flavonoid yang erat kaitannya sebagai

zat yang mempunyai kapasitas antioksidan bagi tubuh. Penelitian pendahuluan

telah dilaksanakan untuk mengidentifikasi adanya komponen flavonoid dan

senyawa polifenol lainnya baik pada makanan maupun minuman termasuk pada

kakao. Misnawi et al (2002) menyatakan bahwa dalam bubuk biji kakao bebas

lemak mengandung polifenol sebanyak 5-18 %. Lebih lanjut Zairisman (2006)

menyebutkan bahwa kandungan polifenol bubuk kakao bebas lemak jenis lindak

(bulk) masak non fermentasi adalah 4,43 g/ 100 g.

Keberadaan antioksidan dalam tubuh sangat berperan penting dalam

mengendalikan radikal bebas. Radikal bebas dan reactive oxygen species (ROS)

berasal dari sumber alamiah di dalam tubuh dan dari luar. Kelebihan radikal bebas

menyebabkan stress oksidatif yaitu keadaan dimana jumlah antioksidan lebih

rendah dibandingkan jumlah radikal bebas. Kondisi ini tentunya berakibat fatal

bagi kesehatan. Oleh karena itu diperlukan sistem antioksidan yang dapat

melindungi tubuh dari serangan radikal bebas, dengan cara meredam dampak

negatif senyawa ini atau bahkan langsung memutuskan rantai radikal bebas yang

terbentuk. Salah satu system pertahanan yang dibentuk oleh tubuh adalah system

enzimatik melalui enzim-enzim antioksidan misalnya katalase.

Meskipun telah banyak diketahui memiliki khasiat sebagai antioksidan

bagi tubuh, flavonoid yang terkandung pada bubuk kakao bebas lemak merupakan

senyawa asing atau xenobiotik yang apabila masuk ke dalam tubuh kita akan

dimetabolisme melalui sistem detoksifikasi yang melibatkan enzim-enzim fase I

maupun fase II, maka masih perlu dilakukan penelitian untuk melihat tingkat

keamanan bubuk kakao bebas lemak ini dalam tubuh setelah dikonsumsi oleh

manusia.

Penelitian pendahuluan yang telah dilakukan oleh Femi (2006),

menunjukkan bahwa bubuk kakao bebas lemak dari jenis lindak (bulk) masak non

fermentasi yang berasal dari perkebunan Indonesia atau kakao lokal mempunyai

kapasitas sebagai antioksidan dan mempunyai potensi sifat immunodulator pada

sel limfosit manusia secara in vitro. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian

lebih lanjut dengan manusia sebagai subjeknya (in vivo). Dengan demikian dapat

diketahui bagaimana tingkat keamanannya dalam tubuh apabila dikonsumsi

manusia, dengan melihat pengaruhnya terhadap aktivitas enzim antioksidan

katalase, sitokrom P-450 (enzim fase I) dan glutation S-transferase (enzim fase II)

serta senyawa radikal bebas dalam tubuh manusia. Selain itu penelitian ini penting

dilakukan karena diharapkan dapat meningkatkan citra kakao lindak non

fermentasi dari Indonesia di pasar dunia.

Tujuan

1. Untuk mengetahui efek minuman bubuk kakao bebas lemak terhadap aktivitas

enzim antioksidan katalase pada eritrosit dan plasma manusia.

2. Untuk mengetahui efek minuman bubuk kakao bebas lemak terhadap aktivitas

enzim detoksifikasi Sitokrom P450 (enzim fase I) dan Glutation S-transferase

(enzim fase II) pada eritrosit dan plasma manusia.

Hipotesis

1. Minuman bubuk kakao bebas lemak dapat meningkatkan aktivitas enzim

antioksidan katalase dan enzim detoksifikasi Glutation S-Transferase (GST)

pada eritrosit dan plasma manusia.

2. Minuman bubuk kakao bebas lemak tidak mengubah atau bahkan dapat

menurunkan kadar sitokrom P450 pada eritrosit dan plasma manusia.

Manfaat Penelitian

Membuktikan secara ilmiah dan memberikan informasi tentang khasiat

minuman bubuk kakao bebas lemak dari jenis kakao lokal lindak non fermentasi

terhadap kesehatan, sehingga bubuk kakao yang merupakan produk sisa

pemanfaatan lemak kakao atau substandar ini dapat dijadikan sebagai bahan

pangan yang bernilai ekonomis tinggi.

TINJAUAN PUSTAKA

Kakao

Pohon kakao (Theobroma cacao L) diperkirakan mula-mula tumbuh di

daerah Amazon utara sampai ke Amerika Tengah. Mungkin sampai ke Chiapas,

bagian paling selatan Meksiko. Orang-orang Olmec memanfaatkan pohon dan

mungkin juga membuat coklat di sepanjang pantai teluk di selatan Meksiko

sekitar 1000 tahun SM. Peradaban pertama yang mendiami daerah Mesoamerika

itu mengenal pohon “kakawa” yang buahnya dikonsumsi sebagai minuman. Bagi

suku Aztec biji kokoa merupakan “makanan para dewa” (theobroma, dari bahasa

Yunani).

Klasifikasi ilmiah kakao antara lain:

dunia : Plantae

divisi : Spermatophyta

sub divisi : Angiospermae

kelas : Dicotyledoneae

sub kelas : Dialypetaleae

bangsa : Malvales

suku : Sterculiaceae

marga : Theobroma

Gambar 1 Buah kakao jenis : theobroma cacao L

Kakao adalah biji yang diperoleh dari pohon kakao, Theobroma cacao L,

dengan ketinggian pohon 6-12 meter. Tanaman ini dapat tumbuh dengan baik

pada area 30-300 meter, pada suhu sedang yaitu berkisar 18-30 ºC dan

membutuhkan kelembaban udara yang cukup dengan curah hujan 1-5 liter/ m2 per

tahun (Weisburger 2001).

Rasa asli biji coklat sebenarnya pahit akibat kandungan alkaloid, tetapi

setelah melalui rekayasa proses dapat dihasilkan coklat sebagai makanan yang

disukai oleh siapapun. Biji coklat mengandung lemak 31%, karbohidrat 14% dan

protein 9%. Protein coklat kaya akan asam amino triptofan, fenilalanin, dan

tirosin. Meski coklat mengandung lemak tinggi namun relatif tidak mudah tengik

karena coklat juga mengandung polifenol (6%) yang berfungsi sebagai

antioksidan pencegah ketengikan.

Tabel 1 Kandungan total polifenol produk kakao

Produk Kakao Jumlah polifenol total (g /100 g) Bubuk cokelat 2,00 Cokelat batangan 0,84 Susu cokelat 0,50

Sumber: Wollgast dan Anklam (2000)

Indonesia merupakan negara ketiga penghasil kakao terbesar di dunia

setelah Pantai Gading dan Ghana. Ada dua jenis kakao yang umum dikenal di

Indonesia, yaitu kakao mulia atau edel kakao (fine/ flavour cocoa) yang berasal

dari varietas criollo dengan buah berwarna merah dan kakao lindak (bulk cocoa)

berasal dari varietas forestero dan trinitro dengan warna buah hijau. Kakao lindak

merupakan kakao kualitas kedua dan digunakan sebagai bahan komplementer

dalam mengolah kakao mulia. Meskipun termasuk kualitas kedua dan digunakan

sebagai bahan komplementer, jenis kakao lindak mendominasi seluruh

perkebunan di Indonesia (Direktorat Jenderal Bina Produksi Perkebunan, 2004).

Hal ini disebabkan karena jenis kakao ini relatif lebih tahan terhadap hama dan

penyakit, dan tingkat produksinya lebih tinggi dibanding kakao mulia (Zairisman

2006, Siregar et al 2007).

Kualitas dari produk olahan kakao yang dihasilkan sangat tergantung

kepada kualitas biji kakao dan proses pengolahan. Salah satu faktor yang sangat

menentukan adalah proses fermentasi biji kakao sebelum diolah. Cita rasa coklat

yang baik dapat diperolah bila kakao tersebut difermentasi dengan baik.

Berdasarkan Direktorat Jenderal Bina Produksi Perkebunan (2004) kakao

Indonesia khususnya yang dihasilkan oleh rakyat, di pasaran Internasional

dihargai paling rendah, karena didominasi oleh biji-biji tanpa fermentasi. Namun

demikian proses fermentasi itu sendiri menyebabkan kandungan senyawa kimia

dalam biji kakao menjadi berubah, terutama senyawa flavonoid yang dapat

memberikan efek positif untuk kesehatan. Berdasarkan penelitian Misnawi dan

Selamat (2003) kandungan polifenol dalam biji kakao menurun sampai 50%

selama proses fermentasi.

Menurut Wollgast dan Anklam (2000), kandungan polifenol total dalam

produk kakao berbeda-beda. Terdapat berbagai macam produk olahan dari biji

kakao yaitu chocolate liquor (pasta kakao), cocoa powder (bubuk coklat), cocoa

butter (mentega kakao) dan dark chocolate. Dark chocolate mengandung 15%

chocolate liquor dan 60% cocoa butter, gula dan adiktif. Sedangkan cocoa

powder (bubuk coklat) dibuat dengan menghilangkan cocoa butter dari chocolate

liquor (Vinson et al. 1999). Produk olahan kakao ini digunakan untuk berbagai

jenis olahan makanan, industri farmasi dan industri kosmetik. Bubuk kakao

banyak digunakan sebagai bahan pembuat roti, es krim, permen dan juga untuk

minuman. Cocoa butter banyak digunakan untuk industri makanan, kosmetik dan

farmasi (Pusat Penelitian Kopi dan Kakao 2004).

Bubuk kakao bebas lemak dari biji kakao non fermentasi sebagai sumber

flavonoid merupakan usaha yang sedang dirintis di Pusat Penelitian Kopi dan

Kakao Indonesia di Jember. Bubuk kakao bebas lemak tersebut adalah produk

kakao yang berbentuk bubuk yang diperoleh dari pasta kakao setelah dihilangkan

lemaknya. Bubuk kakao bebas lemak dibuat melalui proses sebagai berikut : biji

kakao basah dicuci bersih dan dioven pada suhu 50ºC sampai kadar air 7,5%.

Selanjutnya kulit ari dipisahkan, keping biji yang diperoleh dihaluskan dengan

blender (penghancur biji). Pasta kakao yang diperolah kemudian dipisahkan

lemaknya (defatting) dalam soxhlet apparatus menggunakan pelarut petroleum

benzene (titik didih 40-60ºC). Bubuk kakao yang diperoleh kemudian dihaluskan

sampai kehalusan <40 mesh dan kemudian disimpan dalam kemasan yang kedap

udara (Misnawi 2005). Berdasarkan penelitian Misnawi et al (2003) dikemukakan

bahwa dalam bubuk kakao bebas lemak dari biji kakao non fermentasi terdapat

120-180 g/kg polifenol. Bubuk kakao bebas lemak dari verietas bulk masak

berdasarkan penelitian Zairisman (2006) mengandung total fenol sebesar 4,43 gr/

100 gr. Kandungan polifenol kakao juga sangat tergantung pada proses

pengolahan dan produk akhir. Hasil penelitian Misnawi et al. (2002b) juga

mendapatkan bahwa aktifitas antioksidan polifenol biji kakao masih tetap tinggi

walaupun telah dipanaskan sampai suhu 140ºC selama 45 menit.

y

p

a

k

p

C

d

a

b

y

j

2

p

d

d

p

2

f

Rasa

yang dimilik

pigmen pew

akibat oksid

komponen l

pengawet da

Flavon

C6-C3-C6 d

dan reaksi k

aktivitas an

bioflavonoid

yang merup

jenuh yang

2000).

Flavo

phenylbenzo

dasarnya, ya

dari dua cin

piran atau p

2000). Hal i

flavonoid ad

a pahit yang

kinya yaitu

warna alami,

dasi. Adanya

lemaknya se

ari luar.

noid merupa

dan berperan

kelat pada l

ntioksidanny

d. Kompone

akan senyaw

merupakan

onoid memi

opyrones (ph

aitu tiga cin

ncin benzena

piron dengan

ini dipertega

dalah rangka

G

Flavon

g terdapat pa

flavonoid.

senyawa pe

a flavonoid d

ehingga men

akan kelomp

n dalam mek

logam (Hall

ya di dala

en antioksida

wa reaktif y

penyusun m

iliki berat

henylchromo

ncin utama y

a (A dan B)

n ikatan gan

as lagi oleh

aian cincin ka

Gambar 2 St

noid pada k

ada kakao b

Flavonoid m

emberi cita r

dalam kakao

ngurangi ke

ok senyawa

kanisme don

l 2001). Fla

am tubuh

an ini dapat

yang dapat b

membran, RN

molekul ren

ones) denga

yang saling

yang dihubu

nda yang dis

Miean dan

arbon C 6 C 3

truktur kimia

kakao

berkaitan den

memainkan

rasa dan pel

o dapat menc

ebutuhan aka

a yang memp

nor hidrogen

avonoid umu

sehingga

menetralisir

bereaksi den

NA dan DNA

ndah, dan p

an berbagai

melekat. Str

ungkan mela

sebut cincin

Mohamed

C 6 .

a flavonoid

ngan kompo

peran pentin

lindung dari

cegah keten

an penamba

punyai ciri k

n, penangkap

umnya dike

sering jug

r reaktivitas

ngan asam le

A (Hammer

pada dasarn

variasi pad

ruktur dasar

alui cincin h

n ”C” (Midd

(2001) bahw

onen kimia

ng sebagai

kerusakan

gikan pada

ahan bahan

konfigurasi

pan radikal

enal karena

ga disebut

dari ROS,

emak tidak

rstone et al

nya adalah

da struktur

r ini terdiri

heterosiklik

dleton et al

wa struktur

Flavonoid yang terpenting yang ditemukan dalam kakao adalah flavanol

yang terdiri dari monomer katekin dan epikatekin dan oligomer procianidin (CIC

2001).

Gambar 3 Struktur kimia katekin, epikatekin dan prosianidin pada kakao (Andersen dan Markham, 2006)

Flavonoid yang merupakan salah satu sub kelas dari polifenol mempunyai

7 kelas utama yaitu antochyanin, proantochyanin, isoflavone, flavanone, flavonol,

flavanol, dan flavone.

FLAVONOID

Flavanon Flavon

Luteolin Apigenin

Antosianin

Delphinidin Sianidin

Flavonol

Quercetin Kaemferol

Proantosianin

Flavanol

Epikatekin Katekin

Isoflavon

Genistein Daidzein

Polimer flavanol

ASAM FENOLIK Polifenol lainnya (non flavonoid)

Hesperetin Tangertin

POLIFENOL

R 1 =H, R 2 =OH=(+)-catekin Prosianidin

R 1 =OH, R 2 =H=(-)epikatekin

Gambar 4 Pembagian kelas flavonoid ( Murphy et al, 2003; CIC 2001)

Kakao mengandung senyawa flavonoid golongan flavanol, yang

memberikan efek yang menguntungkan bagi tubuh. Selain itu juga bisa

mengurangi resiko mortalitas dan morbiditas kardiovaskuler, kanker dan

osteoporosis dan bisa mencegah penyakit neurodegeneratif serta diabetes militus

(Grassi et al 2006). Murphy et al (2003) menyatakan bahwa mengkonsumsi

flavonoid dan prosianidin secara teratur dapat meningkatkan konsentrasi

epikatekin dan katekin di dalam plasma tetapi tidak menyebabkan oksidasi, dan

juga dapat mengurangi agregasi dan aktivasi platelet penyebab peradangan.

Prosianidin kakao bermanfaat dalam modulasi respon imun dan inflamasi pada

mamalia. Selain itu, prosianidin kakao dari kakao cair ataupun kering bisa

terdapat dalam makanan, suplemen dan obat-obatan untuk modulasi produk gen

sitokin dan kadar protein dan memberikan efek menguntungkan pada penderita

penyakit asma, peradangan akibat virus atau resiko peradangan virus (Schmitz et

al 2001). Prosianidin yang dikombinasikan dengan L-arginin meningkatkan

pengaruh fisiologis dalam memproduksi nitrat oksida pada mamalia yang

mencerna produk itu. Efeknya antara lain menurunkan tekanan darah, ketahanan

terhadap penyakit kardiovaskuler dan aktivitas antikanker (Cheuvaux et al 1999).

Pada manusia, bioavailabilitas flavonoid berkisar antara 1-26 %. Pada

tubuh kita flavonoid akan bersikulasi dalam plasma, terdapat sebagai glukoronida,

methyl dan sulfat konjugat atau kombinasi dari ketiganya yang merupakan hasil

reaksi enzim fase I dan fase II (Grassi et al 2006).

Antioksidan

Antioksidan adalah zat yang mampu memperlambat atau mencegah proses

oksidasi (Schuler, 1990). Menurut Gutteridge dan Halliwell (1996), antioksidan

adalah suatu substansi yang menghentikan atau menghambat kerusakan oksidatif

terhadap suatu molekul target. Sementara itu menurut Cillard et al (1980) dan

Schluler (1990) antioksidan adalah zat dengan kadar lebih rendah dari zat yang

mudah teroksidasi, secara nyata mampu memperlambat oksidasi zat tersebut.

Sebaliknya pada kadar tinggi zat antioksidan bersifat peroksidan atau

meningkatkan oksidasi. Antioksidan biologis adalah zat yang mampu melindungi

sistem biologis dari kerusakan akibat kelebihan oksidasi (Krinsky 1992).

Antioksidan primer adalah zat yang dapat bereaksi dengan radikal bebas atau

mengubahnya menjadi produk yang stabil, sedangkan antioksidan sekunder atau

antioksidan preventif dapat mengurangi laju awal reaksi rantai atau tahap inisiasi

reaksi oksidasi.

Ada 2 macam antioksidan yaitu antioksidan primer dan sekunder (Winarno,

1997), yaitu :

1. Antioksidan Primer

Antioksidan primer adalah suatu zat yang dapat menghentikan reaksi

berantai pembentukan radikal yang melepaskan hidrogen. Zat-zat yang termasuk

golongan ini dapat berasal dari alam seperti tokoferol, lesitin, fosfatida, dan asam

askorbat serta antioksidan buatan seperti BHA (Butylated hydroxyanisole), BHT

(Butylated hydroxytoluene), dan PG (Propylgallate).

2. Antioksidan Sekunder

Antioksidan sekunder adalah suatu zat yang dapat mencegah kerja

prooksidan sehingga dapat digolongkan sebagai sinergi. Beberapa asam organik

tertentu dapat mengikat logam-logam (sequestran), misalnya satu molekul asam

sitrat akan mengikat prooksidan Fe seperti sering dilakukan pada minyak kacang

kedelai. EDTA (Etilendiamin tetra asetat) adalah sequestran logam yang sering

digunakan dalam minyak salad.

Mekanisme kerja antioksidan dapat melalui beberapa cara, antara lain yang

dilaporkan oleh Charpentier dan Cateora (1996) adalah: 1) menghambat

terbentuknya radikal bebas, 2) menjadi perantara dalam netralisasi radikal bebas

yang telah terbentuk (scavenger), 3) menurunkan kemampuan radikal bebas

dalam reaksi oksidasi, dan 4) menghambat enzim oksidatif, misalnya sitokrom P-

450. Penghambatan reaksi radikal bebas akan melidungi hepatosit normal dari

kerusakan dan mengoptimalkan lingkungan bagi sel-sel hati untuk bergenerasi.

Menurut Shahidi (1997), antioksidan diketahui bekerja pada berbagai tahapan

oksidasi molekul lemak, yaitu dengan cara menurunkan kadar oksigen,

menangkap singlet oksigen, pencegahan tahap inisiasi reaksi rantai melalui

penangkapan radikal hidroksil, pengikatan ion logam katalisator, dekomposisi

produk utama menjadi senyawa non radikal dan pemutusan reaksi rantai untuk

mencegah kelanjutan penarikan elektron dari substrat. Antioksidan dapat berasal

dari bahan alami dan sintetik. Sumber antioksidan alami telah banyak dilaporkan

berasal dari tanaman.

Menurut Papas (1999), enzim-enzim antioksidan seperti katalase, glutathion

peroksidase, superokside dismutase, dan peroksidase merupakan lini pertama dari

sistem pertahanan tubuh yang menahan pembentukan radikal bebas. Pada lini

pertahanan kedua, antioksidan yang menangkap radikal seperti vitamin C, vitamin

E, karotenoid dan flavonoid berfungsi untuk menghambat rantai inisiasi dan atau

memecah rantai propagasi. Lini pertahanan ketiga dipegang oleh enzim

fosfolipase, protease, transferase, dan DNA repair enzyme yang berfungsi untuk

memperbaiki kerusakan membran. Lini terakhir dari sistem pertahanan tubuh

adalah proses adaptasi, dimana tubuh akan memproduksi enzim antioksidan yang

sesuai untuk ditransfer ke sisi tertentu pada waktu dan konsentrasi yang tepat.

Penelitian tentang antioksidan pada tanaman telah banyak dilakukan.

Chipault et al (1952) menguji aktivitas antioksidan dari 32 jenis rempah-rempah

dan Puspita-Nienaber et al (1992) menguji aktivitas antioksidan dari 23 jenis

ekstrak rempah-rempah asal Indonesia. Nakatani (1997) meringkas hasil

penelitian tentang aktivitas antioksidan senyawa fenolik dari berbagai tanaman,

antara lain: rosmaridifenol, rosmarikuinon, epirosmanol, dan isorosmanol dari

rosemary; karnosol dari sage; asam hidroksibenzoat dan hidroksinamat dari

oregano; thymol dan karvarol dari thyme; kapsaicin dan hidrokapcaisin dari cabe;

sesamol dan lignan dari wijen; katekin dari teh hijau; dan kurkuminoid dari

kunyit. Zhu et al (2005) menyatakan bahwa katekin, epikatekin, yang diisolasi

dari kakao dapat mengurangi kerentanan eritrosit terhadap radikal bebas penyebab

hemolisis.

Radikal bebas dan kerusakan sel

Radikal bebas dapat menyebabkan stres oksidatif. Stress oksidatif

merupakan keadaan ketidakseimbangan antara reaktif oxygen species (ROS) /

reaktif nitrogen species (RNS) dan antioksidan (Halliwell & Gutteridge 2001).

Jika radikal bebas berada dalam jumlah berlebihan dan jumlah antioksidan seluler

tetap atau lebih sedikit maka kelebihannya tidak bisa dinetralkan dan berakibat

pada kerusakan sel (Langseth 1995; Palmer & Paulson 1997). Kerusakan sel

merupakan gangguan atau perubahan yang dapat mengurangi viabilitas dan fungsi

essensial sel (Kehrer 1993). Stress oksidatif dapat menyebabkan kematian sel

secara apoptosis dan nekrosis. Menurut Zitouni et al (2005), radikal bebas juga

dapat mengganggu endotelium dan memacu terjadinya kerusakan membran,

sebagai contohnya akan meningkatkan ekresi albumin urin dan memacu diabetes.

Reaksi tidak terkendali radikal bebas terhadap komponen sel seperti asam

lemak tidak jenuh ganda (PUFA), heksosa, pentosa, asam amino dan komponen

DNA menghasilkan beberapa produk seperti : Malonaldehida atau MDA, diena

terkonjugasi, dikarbonil dan asam 15-hidroperoksi-5,8,4,13 eikosatetraenoik (15-

HPETE). MDA merupakan melekul dialdehid yang mempunyai tiga atom karbon

dan bersifat reaktif (Rice-Evan et al. 1991; Zaden et al. 1995). 1,1,3,3-

tetraetoksipropan merupakan prekusor malondialdehid sehingga sebagai larutan

standar dapat digunakan larutan tetraektoksipropan.

Malonaldehida atau MDA (C3H4O2) merupakan salah satu hasil

peroksidasi asam lemak tidak jenuh (ALTJ) terutama asam arakhidonat (Bird dan

Draper, 1984; Frankel dan Neff, 1983). Malonaldehida atau MDA dijumpai juga

sebagai produk samping biosintesis prostaglandin. Pengukuran MDA telah

digunakan sebagai indeks tidak langsung kerusakan oksidatif yang disebabkan

oleh peroksidasi lipida (Auroma 1997).

Peningkatan kadar Malonaldehida dapat ditekan dengan pemberian

antioksidan seperti vitamin C, A, dan E dan beberapa komponen bioaktif (Cho et

al. 2000; Palloza et al. 2000; Kris-Ethon & Keen 2002) yang secara keseluruhan

dapat menekan proses peroksidasi lipid.

Senyawa-senyawa yang menjadi target ROS atau radikal bebas adalah

molekul-molekul seluler dan ektraseluler antara lain: protein, asam lemak tidak

jenuh ganda, glikoprotein, lipoprotein dan bahan-bahan penyusun DNA seperti

karbohidrat dan basa purin.

Di bawah ini disajikan beberapa jenis radikal bebas dan ROS yang

berperan pada kerusakan sel.

Tabel 2 Jenis-jenis Reaktif Oxygen Species dan radikal bebas yang berperan pada kerusakan sel

Radikal bebas Lambang Non radikal Lambang

Hidrosil

Superoksida

Nitrit oksida

Lipid peroksida

OH*

O2*

NO*

LOO*

Hidrogen peroksida

Singlet oksigen

Asam hipoklorida

Ozon

H2O2 1O2

HOCl

O3

(Halliwell & Gutteridge 1999).

Berdasarkan hasil penelitian, radikal bebas dan ROS dalam tubuh makhluk

hidup berasal dari :

1. Pada organisme aerob, 95% oksigen dalam sel direduksi menjadi air oleh

rantai pernafasan pada mitokondria, proses reduksi ini melibatkan 4 elektron

dan 2 proton. Kebocoran elektron diperkirakan mencapai 1-5%, elektron yang

bocor ini bereaksi dengan oksigen membentuk radikal superoksida (O2*),

hidrogen peroksida (H2O2) dan radikal hidroksil (OH*) (Lehninger, 1993).

2. Reduksi O2 menjadi superoksida pada fagositosis. Fagositosis merupakan salah

satu sistem pertahanan humoral dalam melawan infeksi atau bahan asing yang

masuk kedalam tubuh. Dengan bantuan NADPH-oksidase, netrofil dan

makrofag (Haliwell & Gutteridge 1999).

3. Peristiwa iskemi yaitu deplesi ATP akibat kekurangan oksigen dimana terjadi

pemecahan ATP menjadi AMP, adenosine dan hipoxantin. Hipoxantin diubah

oleh xantin oksidase, menjadi asam urat dan radikal bebas seperti: superoksida,

hidrosil dan hydrogen peroksida (Greenwald 1985; Haliwell & Gutteridge

1999).

4. Reaksi Fenton dan Haber-weiss, melalui reaksi oksidasi-reduksi yang dikatalis

oleh Fe+2 dan Fe+3. Fe+2 dan Fe+3 berasal dari hemoglobin dan mioglobin

(Greenwald 1985; Zakaria 1996; Haliwell & Gutteridge 1999).

5. Radikal bebas juga dihasilkan dari reaksi metabolisme eicosanoidi yaitu

metabolisme asam arakhidonat melalui mekanisme prostaglandin atau

leukotrin. Perubahan ini menghasilkan ROS (Rise-Evan et al. 1991; Haliwell

1994).

6. Secara alamiah sel-sel tubuh baik sel normal ataupun sel kanker melakukan

apoptosis yaitu program bunuh diri. Apoptosis menjadi penting karena jika

jumlahnya menjadi berlebihan maka akan memicu kelainan. Pada saat sel

melakukan apoptosis maka semua isi sel akan keluar (Roitt 1991; Haliwell &

Gutteridge 1999).

Sistem pertahanan tubuh nonenzimatik

Sistem pertahanan tubuh nonenzimatik terhadap serangan radikal bebas

melibatkan vitamin C, vitamin E dan komponen-komponen bioaktif. Pertahanan

nonenzimatik terhadap radikal bebas dibagi atas 2 kelompok besar yaitu : sistem

pertahanan preventif dan pemutusan rantai reaksi radikal bebas (Nabet 1996).

Sistem pertahanan tubuh enzimatik

Sistem Pertahanan Tubuh Enzimatik terhadap radikal bebas melibatkan :

enzim superoksida dismutase (SOD), katalase dan glutation peroksidase (GSH-

Px) (Halliwell et al. 1992; Schmidl et al, 2000).

a. Superoksida dismutase (SOD)

Superoksida dismutase adalah metaloenzim yang mengkatalis dismutasi

radikal anion superoksida menjadi hydrogen peroksida dan oksigen. SOD tidak

stabil terhadap panas, cukup stabil pada kondisi basa. SOD masih mempunyai

aktivasi walaupun disimpan selama 5 tahun pada suhu 5 0C (http:/www.

Orthington-biochem.com). Untuk aktivitasnya SOD membutuhkan logam seperti

Zn, Cu, dan Mn sebagai kofaktor (Mc Cord & Fridovich 1969).

Aktivitas SOD dihambat oleh sianida dan H2O2, oleh karena SOD

dihambat oleh H2O2 maka dalam kerjanya SOD sangat membutuhkan katalase

(Rice-Evan et al. 1991; Haliwell & Gutteridge 1999). Aktivitas SOD (U/g

jaringan) tertinggi ditemukan didalam hati. SOD juga ditemukan pada kelenjar

adrenalin, ginjal, darah, limfa, pankreas, otak, paru-paru, lambung, usus, ovarium,

dan timus (Haliwell and Gutteridge 1999).

Aktivitas SOD diukur berdasarkan pengukuran aktivitas enzim secara

tidak langsung, salah satunya dengan metode yang dikembangkan oleh Misra dan

Fridovich (1997). Metode ini berdasarkan kepada kemampuan penghambatan

autooksidasi epinefrin menjadi adenokrom oleh SOD. Perubahan epinefrin

menjadi adenokrom menimbulkan warna coklat, makin besar kadar SOD sampel

maka makin besar penghambatan dan makin kurang intensitas warna. Warna

coklat dideteksi secara spektrofotometri.

b. Enzim Glutation Peroksidase

Glutation Peroksidase merupakan selonoprotein sebagai active site, terdiri

dari 4 sub unit protein yang dapat mengkatalis reaksi reduksi H2O2 menjadi

senyawa organik hidroperoksida (ROOH) (Rice-Evan et al. 1991; Haliwell 1994).

Glutation peroksidase menggunakan glutation tereduksi (GSH) sebagai substrat.

Glutation Peroksidase mereduksi hidroperoksida dan pada saat yang sama

glutation tereduksi mengalami oksidasi. Pada manusia, aktivitas glutation

peroksidase sebanding dengan konsentrasi selenium (Se) plasma.

Glutation Tereduksi

Glutation (L-γ-glutamil-cysteinyl-glisin) merupakan tripeptida yang

mengandung gugus sulfuhidril (-SH). Glutation merupakan salah satu sistem

antioksidan, terutama berpartisipasi dalam penghancuran H2O2 dan peroksida

organik (Greenwald 1985). Ada dua jenis glutation yaitu glutation tereduksi dan

glutation teroksidasi. Glutation banyak ditemukan dalam sitosol hati. Keberadaan

GSH di dalam sel sangat diperlukan sebagi substrat glutation peroksidase dan

sebagai senyawa konjugat detoksifikasi xenobiotik pada reaksi enzim fase II

(Hodgoson & Levi 2000).

c. Enzim katalase

Katalase merupakan enzim yang mengkatalis reaksi pemecahan senyawa

hidrogen peroksida menjadi oksigen dan air.

2H 2 O 2 Katalase H 2 O + O 2

Katalase ditemukan pada hewan dan tumbuhan tingkat tinggi. Katalase pada

mamalia disusun oleh 4 sub unit protein. Tiap unit terdiri dari satu gugus hem

dengan inti ion ferri sebagai active site. Aktivitas katalase dihambat oleh senyawa

azida, sianida dan HOCl tapi meningkat dengan meningkatnya akumulasi H2O2

(Haliwell & Gutteridge 1999).

Pada manusia, katalase ditemukan di dalam darah, ginjal, limfa, pankreas,

otak, jantung, paru-paru, adipose, kelenjar adrenal dan konsentrasi tertinggi

terdapat pada hati (± 1400 U/mg protein) ( Halliwell 1994) bersama-sama dengan

glutation peroksida (Greenwald 1985). Pada organ dan jaringan ini katalase

ditemukan di dalam peroksisom, mitokondria, dan retikulum endoplasma.

Hidrogen peroksida di dalam tubuh melalui dua mekanisme yaitu:

1. Pemecahan oleh katalase membentuk air dan molekul oksigen


2. Pemecahan oleh glutation peroksidase dengan bantuan substrat glutation

GSH- + H 2 O 2 GSH-Px GS + H 2 O

Salah satu metode penentuan aktivitas katalase adalah metode kalorimetri

yang dikembangkan oleh Sinha (1972). Metode ini menggunakan zat warna

bikromat sebagai indikator dimana ion bikromat dalam suasana asam dapat

direduksi oleh H 2 O 2 menjadi kromat. Perubahan warna yang muncul dibaca

secara spektrofotometri pada panjang gelombang 570 nm. Satu unit aktivitas

katalase adalah banyaknya H 2 O 2 yang dipakai oleh katalase permenit.

Metabolisme xenobiotik dan detoksifikasi senyawa beracun

Toksikologi dapat didefenisikan sebagai cabang ilmu yang mempelajari

tentang zat-zat yang beracun. Namun pengertian ini terus berkembang seiring

dengan semakin kompleksnya kehidupan sosial masyarakat. Selanjutnya

toksikologi tidak hanya dikaitkan dengan zat-zat yang beracun tetapi juga

mempelajari tentang pendeteksian, keberadaan, efek dan regulasi dari senyawa

toksik (Hodgoson & Levi, 2000). Toksikologi berhubungan erat dengan cabang

farmakologi/ farmasi. Hal ini bisa dijadikan dasar pengetahuan tentang

metabolisme senyawa asing atau yang lebih dikenal dengan xenobiotik (Murray et

al. 1999). Xenobiotik merupakan senyawa asing yang masuk ke dalam tubuh kita

dan bukan merupakan komponen gizi. Xenobiotik ini dikeluarkan oleh tubuh kita

melalui proses detoksifikasi (Hodgoson & Levi, 2000).

Toksikologi pangan berhubungan erat dengan keamanan pangan karena

makhluk hidup tidak lepas dari makanan. Berbagai macam makanan ternyata tidak

sepenuhnya bebas dari zat kimia toksik atau xenobiotik yang berada pada

makanan sebagai zat tambahan makanan, pencemar makanan ataupun zat toksik

alamiah. Contoh xenobiotik pangan antara lain alkohol, flavon (zat toksik

alamiah), BHA (antioksidan pangan), benzopiren yang terdapat pada daging

panggang dan lain sebagainya (Donatus 2001).

Timbulnya pengaruh bahaya atau efek toksik racun atas makhluk hidup

terjadi melalui beberapa proses. Pertama kali makhluk hidup menerima racun,

berikutnya mengalami absorbsi, distribusi racun atau metabolitnya ke tempat aksi

yaitu sel sasaran atau reseptor yang ada dalam makhluk hidup. Di dalam aksi ini,

kemudian terjadi reaksi antara racun atau metabolitnya ke tempat aksi sel sasaran

atau reseptor, dan berbagai peristiwa biokimia dan biofisika berikutnya, akhirnya

timbul pengaruh berbahaya atau efek toksik dengan wujud dan sifat tertentu. Jadi

toksisitas suatu senyawa ditentukan oleh keberadaan yang meliputi kadar dan

lama tinggal senyawa itu atau metabolitnya di tempat aksinya dan keefektifan

antar aksinya (mekanisme aksi). Reaksi yang berlangsung juga tergantung pada

kondisi makhluk hidup (Donatus 2001).

Metabolisme senyawa beracun dapat didefenisikan sebagai perubahan

hayati atau biotransformasi zat kimia toksik menjadi suatu metabolit yang secara

kimia berbeda dengan zat kimia induknya, dalam diri makhluk hidup. Hal ini

mengandung arti bahwa pertama, di dalam tubuh zat kimia toksik tersebut

mungkin mengalami perubahan struktur molekul melalui mekanisme tertentu.

Kedua, perubahan bentuk struktur tersebut akan mengakibatkan perubahan sifat-

sifat fisika-kimia yang berbeda dengan zat induk. Ketiga, bentuk ubahannya yang

disebut bentuk metabolit yang memilki sifat fisika kimia yang berbeda dengan zat

induk. Keempat, akibat perubahan sifat fisika-kimia tersebut menyebabkan

metabolit memiliki kelarutan dalam air atau lipid, aktivitas dengan jaringan atau

tempat aksi dan aktivitas intrinsik yang berbeda dengan zat induknya. Kelima,

hasil bersih berbagai perubahan biokimia tersebut adalah perubahan ketoksikan

zat induk, sehingga respon toksik makhluk hidup terhadap racun juga akan

berubah (Donatus 2001).

Beberapa langkah biotransformasi xenobiotik dalam tubuh terlihat pada

gambar berikut:

Lipofilik tinggi Lipofilik Polar Hidrofilik Polar Hidrofilik

Gambar 5 Biotransformasi xenobiotik di tubuh (Blaauboer 1996)

Hodgoson & Levi (2000) menyebutkan bahwa mekanisme pergerakan bahan

toksik melewati membran-membran khususnya pada awal masukan, merupakan

hal yang kurang menjadi perhatian dengan baik, meskipun sesungguhnya telah

XENOBIOTIK

Terakumulasi terutama dalam lemak

Reaksi Fase I (Bioaktivasi atau Inaktifasi)

Oksidasi, Reduksi, Hidrolisis

Reaksi Fase II (Bioaktivasi) Konjugasi

Mobilisasi Pengeluaran dari tubuh

Melalui Keringat Sirkulasi Plasma (melalui urin)

Enzim yang berperan: Sitokrom P-450 Flavin Containing Monooksigenase Prostaglandin Synthetase Cooxidase

Molibdenum Hidroxylase,dll

Enzim yang berperan: Glutation S-transferase

Metyl transferase Cystein Konjugate Lyase

N,O-Acyltransferase

dilakukan pada masalah khusus obat-obatan. Terdapat 4 mekanisme pokok yang

memungkinkan bahan toksik untuk melintasi membran.

1. Transpor pasif. Mekanisme ini mendominasi hampir semua bahan toksik.

Pengangkutan pasif melibatkan pergerakan campuran-campuran melewati

membran-membran lipid oleh difusi sederhana dengan koefisien pembagi air/

lipid yang sebagian besar menentukan tingkat pergerakan. Campuran-

campuran dalam bentuk yang telah diionisasi tidak menggerakan dengan

sangat cepat oleh difusi melalui membran untuk beberapa alasan. Pertama,

bentuk yang telah diionisasi cenderung memiliki daya larut lipid rendah,

sebuah faktor yang sangat penting untuk difusi membran. Kedua,

memungkinkan terjadinya interaksi ion antara xenobiotik, lipid, dan protein

dalam membran.

2. Filtrasi. Seringkali pori-pori dalam membran memperbolehkan masuknya

dengan berat molekul kurang dari 100 dalton. Molekul-molekul yang lebih

besar, bagaimanapun juga, dikeluarkan kecuali dalam banyak jaringan-

jaringan yang penyerapannya tinggi, seperti ginjal dan hati. Karena

kebanyakan bahan toksik relatif bermolekul sangat besar, jalan kecil ini

seringkali memiliki arti penting mekanisme penyerapan yang terbatas. Filtrasi

umumnya memiliki arti yang sangat penting dalam pembuangan bahan toksik,

khususnya ginjal.

3. Transpor khusus. Sejumlah sistem pengangkutan khusus, terutama sekali pada

bidang gastro intestinal, membantu dalam pengangkutan campuran endogen

melalui membran. Proses tersebut dapat membutuhkan energi dan

memungkinkan senyawa untuk melewati gradien konsentrasi (transpor aktif)

atau mungkin tidak memerlukan energi dan tidak dapat menggerakkan

senyawa melewati sebuah tanjakan/ gradien (pengangkutan yang difasilitasi).

Meskipun hasilnya bisa jadi berbeda, mekanisme ini agak mirip dan telah

didiskusikan bersama. Pada kedua masalah ini, protein pembawa yang

bergabung dengan bahan toksik telah diketahui. Protein ini membantu

pergerakan bahan toksik dari satu sisi membran ke yang lain, dan di lain sisi,

bahan kimia berpisah dari protein, yang kemudian bebas untuk mengambil

molekul bahan toksik yang lain. Penetrasi seperti itu lebih cepat daripada

difusi sederhana dan dalam hal pengangkutan aktif, dapat diproses di luar titik

yang berkonsentrasi sama pada kedua sisi membrannya.

Mekanisme ini mungkin menjadi penting dan relatif jarang terjadi dalam

bahan toksik yang memiliki bahan kimia atau struktur menyerupai bahan

kimia endogen yang berprinsip pada mekanisme pengangkutan khusus untuk

pengambilan fisiologi normal dan itu dapat menggunakan sistem yang sama.

Sebagai contoh, 5-fluorouracil diangkut oleh sistem pengangkutan timidin.

Timah dapat dipindahkan secara cepat dengan sistem pengangkutan yang

dilibatkan secara normal pada pengambilan kalsium. Sebagai mekanisme

penyerapan, sistem pengangkutan khusus ini banyak dimuat pada penyerapan

gastro intestinal. Mekanisme ini menjadi lebih besar perannya dalam

pembuangan bahan racun, bagaimanapun juga pengangkutan khusus penting

pada pemindahan xenobiotik dan metabolitnya. Sifat penting dari

pengangkutan khusus adalah mereka memperbolehkan pergerakan senyawa-

senyawa dengan daya larut lipid lebih rendah, hal ini menyangkut senyawa-

senyawa yang biasanya diharapkan untuk bergerak sangat lambat melewati

membran lipid yang sangat tinggi. Kebanyakan sistem pengangkutan aktif

dihubungkan ke energi yang menghasilkan enzim (misalnya ATPase), dan

kedua sistem pengangkutan aktif dan difasilitasi memperlihatkan sifat saturasi

(dengan kata lain, saturasi dari ketersediaan protein pembawa oleh molekul

bahan toksik). Dengan begitu, kinetik/ ilmu gerak dari sistem pengangkutan

khusus dapat dijelaskan lebih baik lagi dengan menggunakan model kinetik

enzim Michaelis-Menton.

4. Endositosis. Pinositosis (untuk cairan) dan pagositosis (untuk padat) adalah

proses pengangkutan yang dikhususkan pada permukaan membran atau

pengaliran disekeliling bahan kimia yang memungkinkan transfer yang lebih

cepat melalui membran. Hanya pada pemisahan kejadian seperti penyerapan

dari karagen (mol wt ~40.000) dalam usus memiliki mekanisme ini yang telah

ditemukan menjadi penting pada masukan awal. Setelah di dalam tubuh,

bagaimanapun juga endositosis adalah mekanisme yang sedikit umum dan

penelanan senyawa di dalam paru-paru adalah umum (pagositosis paru-paru)

Berlangsungnya metabolisme senyawa asing di dalam tubuh, dapat terjadi

di dalam hati, ginjal, usus, kulit, kelenjar kelamin, plasenta serta darah. Meskipun

hati merupakan organ utama dalam sistem biotransformasi, tetapi metabolisme

senyawa xenobiotik juga dapat berlangsung pada jaringan-jaringan di luar hati,

misalnya saja darah (Krovat et al. 2000). Setelah toksikan masuk ke dalam

sirkulasi darah, maka toksikan tersebut akan didistribusikan atau disebar ke

seluruh jaringan tubuh manusia (Donatus 2001). Menurut Hodgoson dan Levi

(2000), cairan tubuh memegang peranan penting dalam pendistribusian toksikan

dalam tubuh yang telah diabsorpsi.

Metabolisme seyawa xenobiotik terdiri dari dua fase. Pada fase satu,

toksikan bersifat lipofilik akan ditransformasikan oleh enzim-enzim fase satu

(monoksigenase) menjadi senyawa-senyawa metabolit yang bersifat polarreaktif

grup. Pada fase dua, metabolit yang terbentuk akan dikonjugasikan oleh enzim-

enzim fase dua (konjugasi) sehingga dihasilkan senyawa yang bersifat hidrofilik

dan mudah diekresikan ke luar tubuh. Namun jika metabolisme senyawa

xenobiotik menghasilkan produk yang reaktif, maka akan menimbulkan efek

toksik bagi tubuh (Hodgoson & Levi, 2000).

A. Reaksi fase satu

Reaksi-reaksi fase satu meliputi monooksigenasi mikrosom, oksidasi

mitokondria dan sitosol, kooksidasi dalam reaksi sintesis prostaglandin, reduksi,

hidrolisis dan hidrasi epoksida. Semua reaksi pada fase satu menghasilkan

metabolit atau merubah toksikan menjadi lebih polar sehingga dapat dikonjugasi

dalam reaksi-reaksi fase dua dan mudah diekresikan baik secara langsung maupun

tidak langsung setelah mengalami reaksi fase satu (Hodgoson & Levi, 2000).

Lebih lanjut, Donatus (2001) menjelaskan bahwa fungsi utama reaksi

metabolisme fase I adalah mengubah struktur senyawa asing melalui proses

oksidasi, reduksi atau hidrolisis, guna memasukkan gugus fungsional yang sesuai

bagi reaksi konjugasi fase II.

Enzim yang berperan penting dan terlibat paling dominan pada reaksi fase

I adalah enzim monoksigenase Sitokrom P-450. Berdasarkan percobaan yang

dilakukan oleh Omura dan Sato (1964), maka mereka mendefenisikan Sitokrom

P-450 sebagai suatu protein heme yang mengandung satu molekul besi-

protoporfirin IX sebagai gugus prostetik atau gugus aktifnya. Nama sitokrom P-

450 diperoleh dari kenyataan bahwa sitokrom memberikan satu spektra resapan

maksimum pada panjang gelombang 450 nm, bila tereduksi dan terkompleks

dengan karbon monoksida. Sifat ini khas diperantarai oleh adanya gugus tiolat

sebagai suatu ligan protein heme itu. Menurut Donatus (2001) Sitokrom P-450

menunjukkan selektivitas yang luas terhadap aneka ragam substrat. Keadaan ini

disebabkan oleh adanya aneka ragam isoenzim sitokrom tersebut, yang satu

dengan yang lainnya berbeda dalam struktur rantai polipeptida dan kekhasan

reaksi yang dikatalisirnya.

Induksi terhadap metabolisme fase I, terutama yang dikatalisir oleh

sitokrom P-450 mikrosomal memilki arti penting karena sistem ini sering

membentuk metabolit perantara yang reaktif atau toksik (Donatus, 2001).

Beberapa produk yang dibentuk oleh enzim ini berimplikasi pada penyebab

penyakit kanker atau karsinogenik (Shimada et al, 1996). Intermediet yang

terdapat dalam aktivasi dioksigen merupakan awal terbentuknya superoksida atau

peroksida. Mekanisme aktivasi dioksigen diketahui sebagai tahap terakhir dari

katalisis P-450, yang dimulai dengan reduksi komplek dioksigen (Benson et al,

1997).

Ada dua hal penting yang berhubungan dengan fungsi enzim sitokrom P-

450, yang pertama adalah enzim ini memiliki jalur yang kritis dan spesifik dalam

metabolisme senyawa-senyawa kimia endogenus. Kedua, Proses enzim ini

merupakan pokok dari produk-produk alami, bahkan saat ini ditambah dengan

bahan-bahan kimia seperti obat-obatan dan xenobiotik lainnya dalam senyawa-

senyawa non selektif (Guengerich 1991). P-450 dan komponennya bisa ditemukan

di kulit, mukus, paru-paru, gastrointestinal. Selain organ-organ tersebut juga telah

banyak dilakukan penelitian tentang keberadaan P-450, diantaranya di hati, ginjal,

plasenta, testis serta pada darah (Hodgoson & Levi, 2000).

B. Reaksi fase dua

Pada reaksi fase dua, senyawa yang terhidroksilasi atau senyawa lainnya

yang diproduksi dalam fase satu, diubah oleh enzim yang spesifik menjadi

berbagai metabolit polar lewat konjugasi dengan asam glukuronat, sulfat, asetat,

glutation atau asam amino tertentu lewat metilasi. Reaksi konjugasi ini membuat

molekul lebih bersifat dapat larut dalam air sehingga akhirnya dapat diekresikan

ke dalam urin dan empedu (Murray et al. 1999).

Reaksi fase dua lebih dikenal dengan reaksi konjugasi, menyangkut

penambahan gugus polar ke senyawa asing. Reaksi fase dua merupakan reaksi

biosintetik, maka dibutuhkan energi sehingga reaksi dapat berlangsung. Reaksi

penting pada fase II adalah reaksi konjugasi glutation karena sering terlibat dalam

penghilangan zat atau metabolit perantara yang reaktif, yakni yang bersifat

elektrofil. Berlangsungnya reaksi ini dikatalisir oleh enzim glutation S-transferase

(Donatus 2001).

Glutation S-transferase merupakan suatu famili enzim yang mengkatalisir

tahap awal pembentukan N-asetilsisteina (asam merkapturat) yang terutama

terdapat dalam sitosol testis, hati, ginjal, usus, kelenjar adrenal (Donatus 2001).

Enzim ini berperan dalam binding, transport dan detoksifikasi komponen

endogenus maupun eksogenus. Glutation S-transferase ditemukan dalam jumlah

yang besar pada hati, tetapi juga terdapat pada aliran darah terlebih lagi jika hati

mengalami kerusakan (Mulder et al 1999).

Sejumlah xenobiotik elektrofilik yang berpotensi beracun akan

terkonjugasi dengan glutation nukleofilik dalam reaksi berikut:

R + GSHO R – S - G

Dimana R adalah xenobiotik elektrofilik. Jika xenobiotik yang potensial beracun

tidak terkonjugasi maka molekulnya akan berada dalam keadaan bebas yang

membentuk ikatan kovalen dengan DNA, RNA atau protein sel dengan demikian

dapat mengakibatkan kerusakan sel yang serius (Murray et al. 1999).

Induksi enzim detoksifikasi glutation S-transferase merupakan mekanisme

pertahanan terhadap kanker. Prinsipnya peningkatan enzim glutation S-transferase

dapat mereduksi karsinogenesis melalui penguatan pembuangan elektrofil reaktif

(Kirlin et al. 1999). Analisis yang digunakan dengan menggunakan prinsip bahwa

GSH dapat berkonjugasi dengan 1-kloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) dengan

adanya katalis enzim glutation S-transferase dan menghasilkan produk dapat

diukur secara spektrofotometri (Habig et al. 1974).

Metabolisme Senyawa Bioaktif

Metabolisme senyawa bioaktif seperti senyawa flavonoid dalam tubuh

dipengaruhi oleh struktur kimia dan perlunya molekul itu mengalami konjugasi.

Meskipun bioavailabilitas flavonoid bervariasi antara flavonoid tipe satu dan yang

lain, mulai dari antosianin yang sangat sedikit diserap dan isoflavon yang dengan

mudah diserap, jalur dalam mekanisme absorbsi pada umumnya sama untuk

semua flavonoid. Perubahan melalui jalur metabolisme ditentukan oleh spesifitas

dan aktivitas transporter, spesifitas dan aktivitas metabolisme dan stabilitas

flavonoid (Meskin et al, 2004).

Senyawa flavonoid dalam tanaman biasanya dalam bentuk glikosida.

Glikosida flavonoid yang diasup tubuh mencapai usus halus melalui jalur

pencernaan. Senyawa flavanol seperti katekin dan proanthosianin oligomer

sebagian besar tidak terglikosolasi harus dideglikolasi. Deglikosilasi dapat terjadi

pada beberapa tempat dalam duodenum dan jejenum dalam lumen intestinal,

brush border atau hidrolase intraseluler setelah terjadinya transport flavonoid ke

dalam enterosit. Deglikosilasi adalah perlakuan awal sebelum konjugasi oleh

enzim yang terdapat dalam usus dan transport sampai serosol atau sisi mukosal.

Hal yang sama juga berlaku untuk isoflavon, aglikonnya dapat diserap dalam usus

halus. Tahap awal proses absorbsi untuk flavonoid terglikosilasi dan isoflavon

adalah deglikosilasi oleh lactase phlorizin hydrolase (LPH) yang merupakan

enzim yang terletak dalam bagian brush border dari usus halus yang bertanggung

jawab dalam hidrolisis laktosa (Meskin et al 2004).

Hasil dari reaksi deglikosilasi adalah aglikon bebas yang dapat berdifusi ke

dalam sel-sel epitel secara pasif atau secara difusi fasilitatif. Reaksi deglikosilasi

ini adalah reaksi yang spesifik dan memiliki aktivitas yang besar. Reaksi

selanjutnya yang terjadinya adalah penyerapan atau absorbsi. Penyerapan

glikosida flavonoid tidak dipengaruhi oleh perlakuan awal menggunakan β-

glukosidase dari mikroba diduga karena enzim LPH dalam usus halus

mengakatalis reaksi yang sama. Absorbsi aglikon dalam lumen tergantung pada

keberadaan komponen-komponen lain dan juga karena kelarutan atau koefisien

partisi dari flavonoid. Mekanisme absorbsi alternatif yang terjadi melibatkan

transpor glikosida flavonoid ke dalam enterosit dalam bentuk serapan melalui

fungsi transporter gula. Kedua jalur absorbsi menaikkan jumlah aglikon

intaraseluler transient yang ditemukan dalam jaringan usus halus tikus setelah

reaksi fusi in vitro dengan glukosida quarcetin atau isoflavon (Meskin et al,

2004).

Reaksi yang terjadi selanjutnya adalah konjugasi. Usus memiliki kapasitas

konjugasi tertentu termasuk oleh glukoronosyl transferase atau UGTs dan

glutation transferase. Absorbsi di usus halus menentukan transfer flavonoid dari

mukosa usus sampai darah (Kuhnle et al 2000 dalam Setiawan 2006). Ditemukan

bahwa quercetin, katekin dan genistein sebagian besar adalah dalam bentuk

glukoronidase. Enzim-enzim yang mengkatalis reaksi konjugasi di dalam usus dan

hati adalah UGT1A1 dan 1A8. Sebagian kecil flavonoid seperti katekin galloylasi

dan isoflavon melewati konjugasi usus namun hanya dalam keadaan, dosis dan

waktu tertentu (Meskin et al, 2004).

Pada reaksi glukoronidasi selama absorbsi, beberapa flavonoid mengalami

metabolisme lebih lanjut. Pada tahap ini residu glukoronida dikeluarkan dan

diganti dengan sulfat. Reaksi sulfitasi ini pada umumnya terjadi di liver. Hati

menerima flavonoid dari darah termasuk darah dari usus halus pada awal

metabolisme. Berdasarkan percobaan perfusi secara invitro dan invivo pada tikus,

flavonoid dari usus halus terutama glukoronida yang mencapai liver secara

keseluruhan terkonjugasi. Semua flavonoid yang telah terkonjugasi kemudian

disalurkan ke dalam empedu dan kembali ke usus halus tanpa mengalami

dekonjugasi lagi dan kemudian dikirim ke kolon serta diikuti deglukoronidasi atau

sulfatasi oleh mikroba dalam ileum atau kolon dan terjadi reabsorbsi flavonoid

dalam tikus enterohepatik (Meskin et al, 2004).

Darah menyalurkan flavonoid ke jaringan-jaringan tubuh. Apabila terdapat

dalam plasma aglikon memasuki jaringan perifer dengan difusi pasif atau

terfasilitasi. Konjugat glukoronida perlu disalurkan ke dalam jaringan perifer

karena senyawa tersebut bersifat hidrofilik dan berdifusi melewati membran

dengan lambat. Untuk dekonjugasi dalam jaringan, banyak sel memiliki aktivitas

β-Glukoronidase dalam fraksi lisosom dan lumen dalam retikulum endoplasma.

Dalam hati, enzim ini aktif terhadap quarcetin glukoronida. Tahap terakhir dari

metabolisme senyawa flavonoid adalah ekresi yang merupakan ekresi di ginjal.

Meskipun demikian kandungan flavonoid karena pembentukan deglikosilasi

flavonoid juga terjadi di kolon oleh mikroba (Meskin et al, 2004).

Komponen darah

Menurut Koolman dan Rohm (1996), darah menyusun sekitar 8% dari

masa tubuh manusia. Darah merupakan suatu jaringan bersifat cair yang terdiri

atas sel-sel darah dan plasma sebagai mediumnya. Plasma darah bersifat homogen

dan alkali lemah serta terdiri dari garam organik, protein, lemak, hormon, vitamin,

enzim serta zat-zat nutrisi lainnya. Sel-sel darah mamalia terdiri dari sel darah

merah atau eritrosit, keping darah atau trombosit, dan sel darah putih atau leukosit

(Hartono 1989).

Darah mempunyai berbagai fungsi di dalam tubuh manusia. Darah

merupakan alat transpor, mempertahankan lingkungan dalam tubuh agar terjaga

konstan (homeostasis) dan berperan penting pada pertahanan tubuh terhadap

benda-benda asing.

Eritrosit

Eritrosit adalah suatu sel yang berisi hemoglobin dan membawa oksigen dari

paru-paru ke seluruh tubuh disebut juga sel darah merah (red blood cell/RBC). Di

dalam tubuh manusia dalam keadaan diam sekitar 250 ml oksigen dikonsumsi dan

200 ml karbondioksida diproduksi setiap menit, selama latihan jumlah ini

meningkat sepuluh kali lipat (Anonim 2006). Warna kemerah-merahan

disebabkan oleh kandungan hemoglobin. Eritrosit berbentuk bikonkaf yang

meningkatkan area permukaan sel sehingga memudahkan difusi oksigen dan

karbon dioksida. Bentuk ini dipertahankan oleh suatu sitoskeleton yang terdiri atas

beberapa protein. Eritrosit sangat fleksibel dan dapat berubah bentuk saat

mengalir di dalam kapiler. Eritrosit yang belum matang disebut retikulosit, secara

normal terdapat 1-2% dari jumlah sel darah merah di dalam darah. Garis tengah

eritrosit manusia adalah 6-8 µm, jauh lebih kecil dibanding hampir seluruh sel

manusia. Eritrosit mengandung sekitar 270 juta molekul hemoglobin dengan

masing-masing membawa empat kelompok heme (Anonim 2006). Dalam rangka

mengikat oksigen, besi yang terdapat pada heme yang mengisi separuh jumlah

hemoglobin harus dijaga dalam bentuk tereduksi disamping sebagai agen oksidasi

endogen dan eksogen (Anonim 2006).

Plasma darah

Plasma adalah suatu larutan encer yang terdiri atas elektrolit, zat-zat

makanan, metabolit, protein, vitamin, elemen pelacak dan hormon. Plasma

mengandung banyak sekali ion, molekul anorganik, organik yang sedang diangkut

ke berbagai bagian tubuh atau membantu transpor zat-zat lain. Volume plasma

normal adalah sekitar 5 % berat badan atau secara kasar 3500 ml (berat badan 70

kg). Plasma akan menggumpal jika didiamkan dan hanya akan bertahan cair jika

ditambah antikoagulan (Ganong 2000).

Protein membentuk bagian terbesar komponen yang tidak mudah menguap

di dalam plasma darah. Konsentrasinya berkisar antara 60 dan 80 g/L. Dengan

demikian sekitar 4 % dari seluruh protein tubuh adalah protein plasma. Di dalam

plasma terdapat sekitar 100 protein yang berbeda (Koolman dan Rohm, 2001).

METODOLOGI PENELITIAN

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Teknologi

Pertanian IPB, Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan IPB,

Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Studi Primata, Bogor serta

klinik Farva Dramaga, Bogor.

Waktu yang diperlukan dari pembuatan proposal sampai pembuatan

laporan adalah selama 10 bulan yaitu dari bulan Juli 2006 sampai Juni 2007.

Bahan dan Alat

Bahan

Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini adalah bubuk biji kakao

bebas lemak yang diperoleh dari Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia di

Jember. Bubuk yang digunakan merupakan bubuk biji kakao varietas bulk masak

non fermentasi yang memiliki total fenol dan daya proliferasi limfosit yang tinggi

berdasarkan uji in vitro (Zairisman 2006 ). Bahan lain yang digunakan adalah gula

pasir, air panas, dan susu bubuk skim.

Bahan-bahan kimia yang diperlukan adalah: H2SO4 65%, metanol pro-

analisis, kloroform-etanol 96%, larutan epinefrin, buffer natrium karbonat,

potassium bikromat K 2 Cr 2 O 7 , H 2 O 2 , triton X-100 0.1 %, EDTA, TBA,

sukrosa, HCl, Gas CO, NaS 2 O 4 , albumin serum sapi (AAS), pereaksi Folin,

CuSO 4 .5H 2 O, 1 ml Na-tartarat 2 %, 98 ml Na 2 CO 3 2 % dalam 0,1 N NaOH.

Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: sentrifuge

(JOUAN, tipe CR 412), laminar air flow (Holten laminar air tipe HV 2472),

inkubator Jouan tipe IG 150, mikroskop, hemasitometer, mikroplate reader,

syringe 50 ml (Terumo), tabung sentrifuse steril, lempeng mikro 96 sumur

(Costar), membran filter (sigma), mikropipet, spektrofotometer, ultra Sentrifuge,

tabung ultrasentrifuse, ELISA Reader.

Peralatan sekali pakai yang digunakan adalah syringe 50 ml (Terumo),

Syringe 3 ml, tabung sentrifuge steril 15 dan 50 ml sekali pakai (Corning),

lempeng mikro 96 sumur (Corning), repeater (Eppendorf), dispenser tip (Marsh),

dan tabung vacutainer ukuran 9 ml dengan koagulan.

Alur penelitian

Alur penelitian yang telah dilakukan digambarkan secara skema dalam

diagram alir berikut:

Gambar 6 Diagram alir penelitian

Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan bersama-sama dengan Erniati (2007), Amri

(2007), Yuliatmoko (2007) dan Kusumaningtyas (2007) mulai dari tahap

penentuan komposisi minuman bubuk kakao bebas lemak sampai tahap

pemisahan komponen darah.

Pengambilan darah

Subyek sehat (n=18)

Inform Consent

Kelompok Kontrol (n=9) Kelompok Kakao (n=9)

SCREENING Pemeriksaan

kesehatan dan interview

25 hari AKHIR INTERVENSI

Pemeriksaan kesehatan Pengambilan darah

Analisa Aktivitas Enzim Antioksidan Katalase Analisa Enzim Detoksifikasi Sitokrom P-450

dan Glutation S-Transferase (GST) ANALISA DATA

Positif HASIL Negatif

25 hari

MULAI INTERVENSI

1. Pembuatan minuman bubuk kakao

Minuman bubuk kakao bebas lemak disiapkan dengan cara bubuk kakao

bebas lemak bulk masak non fermentasi sebanyak 4 gram dilarutkan dalam 100

ml air hangat, ditambahkan 2 gram gula dan 2 gram susu bubuk skim . Minuman

bubuk kakao dalam keadaan hangat akan diminum oleh responden

2. Persiapan responden

Responden yang terlibat dalam penelitian ini adalah mahasiswi S1 Institut

Pertanian Bogor. Pertimbangan dalam memilih subyek ini adalah kesamaan

tempat tinggal, memiliki pengetahuan tentang pangan, gizi, dan metodologi

penelitian dengan baik, serta mempunyai status gizi normal. Dengan demikian,

penelitian ini diharapkan dapat berjalan dengan baik, sosialisasinya mudah, dan

pengaruh biologisnya relatif seragam.

Jumlah subyek yang digunakan dalam penelitian ini adalah 18 orang

berjenis kelamin perempuan, umur 22-27 tahun, dibagi dalam dua kelompok.

Kelompok pertama berjumlah 9 orang meminum minuman bubuk kakao bebas

lemak selama 25 hari dan sisanya kelompok yang tidak meminum minuman kakao

bebas lemak, kelompok ini dinamakan dengan kontrol.

Kelompok kontrol ini hanya mengkonsumsi minuman yang terdiri dari

sedikit susu bubuk skim yang ditambah sedikit gula dalam 100 ml air hangat

Responden yang dipilih adalah mahasiswa yang dinyatakan sehat

berdasarkan hasil pemeriksaan kesehatan oleh Klinik Farfa Dramaga, Bogor.

3. Pelaksanaan intervensi (modifikasi dari Nurrahman, 1998)

Intervensi dilaksanakan selama 25 hari di rumah indekost mahasiswa di

kompleks perumahan IPB II Sindang Barang. Pelaksanaan dilakukan setiap hari

pada jam 07.00-08.00 WIB. Setiap responden pada kelompok perlakuan

meminum minuman bubuk kakao sebanyak 4 g/100 ml setiap hari. Minuman

bubuk kakao dipersiapkan setiap hari oleh peneliti yang sekaligus mengawasi

responden meminum minuman bubuk kakao. Semua responden akan mendapat

sarapan pagi sebelum mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak dan

makan malam dengan menu yang seragam. Seminggu sekali selama pelaksanaan

intervensi dilakukan diskusi yang melibatkan seluruh responden mengenai

penelitian dan kesehatan umum.

Sebelum pelaksanaan intervensi juga dilakukan penandatanganan surat

perjanjian (Inform consent) (lampiran 1) dan wawancara terhadap responden

dengan format kuisioner standar (lampiran 2). Kuisioner tersebut berisi

pertanyaan-pertanyaan mengenai status sosial ekonomi, pengetahuan tentang

pangan, pola konsumsi dan kebiasaan membeli makanan jajanan.

Hasil pengisian kuisioner tentang pola konsumsi dan kebiasaan membeli

makanan jajan disusun jenis makanan dan fekuensinya (per minggu per orang)

serta nilai pencemaran. Nilai pencemaran diperoleh dengan cara mengalikan

frekuensi konsumsi makanan jajanan, tempat pembelian dan jenis

pembungkusnya. Masing-masing faktor pengkali diberi skor dari 1 untuk tingkat

pencemaran rendah sampai 6 untuk pencemaran tinggi.

4. Pengukuran status gizi (Nurrahman 1998)

Pengukuran status gizi responden dilakukan secara antropometri yang

meliputi Tinggi Badan (TB) dan Berat Badan (BB). Penggolongan status Gizi

menurut “Body Mass Index” (BMI) dengan satuan Kg/m2, yaitu:

BMI = BB/TB2

Dimana: BMI < 17,0 kekurangan berat badan tingkat berat

BMI 17,0 – 18,4 kekurangan berat badan tingkat ringan

BMI 18,5 – 25,0 normal

BMI 25,1 – 27,0 kelebihan berat badan tingkat ringan

BMI > 27,0, kelebihan berat badan tingkat berat

5. Pengambilan darah

Pengambilan darah dilakukan sebelum dan sesudah responden mengalami

intervensi dengan meminum minuman bubuk kakao. Pengambilan darah

dilakukan di klinik Farfa Kampus Dramaga IPB pada jam 07.00 pagi oleh seorang

asisten tranfusi darah. Darah diambil sebanyak 35 ml dengan menggunakan jarum

Precisionglide TM steril sekali pakai, kemudian di masukkan ke dalam tabung

vacutainer steril ang mengandung koagulan. Darah yang diambil dibawa

kelaboratorium kultur jaringan bagian patologi FKH IPB untuk segera dianalisa.

Gambar 7 Proses Pengambilan Darah Responden

6. Isolasi eritrosit (Zhu et al 2005)

Darah yang telah dimasukkan dalam tabung vacutainer steril yang

mengandung koagulan dilakukan pemisahan komponen seluler dengan

sentrifugasi sampel darah dalam vacutainer pada 514 x g selama 10 menit dengan

menggunakan sentrifius dengan rotor swing. Bagian darah yang lebih berat (sel

darah merah/ eritrosit) berada di bagian bawah, sedangkan plasma darah terpisah

bagian atas. Plasma darah dan eritrosit diambil atau dipisahkan dengan

mikropipet ke dalam masing-masing tabung sentrifius yang telah disiapkan.

7. Aktivitas enzim antioksidan katalase pada plasma darah (Sinha, 1978)

Prinsip metode yang digunakan oleh Sinha menggunakan zat warna

sebagai indikator. Zat warna yang digunakan adalah potassium bikromat K 2 Cr 2

O 7 5 % dalam suasana asam asetat glasial (1:3). Ion bikromat dalam suasana

asam akan direduksi oleh H 2 O 2 menjadi kromat dan memberikan warna pada

panjang gelombang 570 nm. 1 unit aktivitas katalase dinyatakan sebagai

banyaknya H 2 O 2 dalam mol yang digunakan oleh katalase permenit.

Cr 6+ + H 2 O 2 H + Cr +3 + H 2 O +O 2

a. Ekstraksi sample

Sebanyak 3.5 ml plasma ditambahkan dengan 0.5 ml triton X-100 0.1 %,

sentrifuse pada 4000 rpm selama 5 menit suhu dingin. Supernatan digunakan

untuk menentukan aktivitas katalase.

b. Pengukuran aktivitas katalase

Sebanyak 1 ml sampel ditambahkan dengan 5 ml buffer posfat 0.05 M pH

7.0 sambil divortek. Tambahkan 4 ml H 2 O 2 0.2 M dan inkubasi selama 60 detik.

Ambil 1 ml larutan ini tambahkan 2 ml larutan warna kalium bikromat lalu

panaskan pada air mendidih selama 10 menit. Setelah dingin, serapan diukur pada

panjang gelombang 570 nm.

c. Kurva standar dan perhitungan aktivitas katalase

Kurva standar dibuat dari larutan standar H 2 O 2 30%. 1 ml larutan standar

H 2 O 2 ditambahkan dengan 2 ml larutan bikromat 5 %, panaskan dalam air

mendidih selama 10 menit kemudian dinginkan dan serapan dibaca pada panjang

gelombang 570 nm. Absorban sb y dialurkan terhadap konsentrasi H 2 O 2 sb x.

Jumlah H 2 O 2 yang dipakai katalase = 0.2 M – konsentarasi H 2 O 2 terbaca.

8. Aktivitas enzim antioksidan katalase pada eritrosit darah (Sinha, 1978)

Prinsip metode yang digunakan oleh Sinha menggunakan zat warna

sebagai indikator. Zat warna yang digunakan adalah potassium bikromat K 2 Cr 2

O 7 5 % dalam suasana asam asetat glasial (1:3). Ion bikromat dalam suasana

asam akan direduksi oleh H 2 O 2 menjadi kromat dan memeberikan warna pada

panjan gelombang 570 nm. 1 unit aktivitas katalase dinyatakan sebagai banyaknya

H 2 O 2 dalam mol yangdigunakan oleh katalase permenit.

Cr 6+ + H 2 O 2 H + Cr +3 + H 2 O +O 2

a. Ekstraksi sample

3,5 ml eritrosit ditambahkan dengan 0.5 ml Triton X-100 0.1 %, sentrifuse

pada 4000 rpm selama 5 menit suhu dingin. Supernatan digunakan untuk

menentukan aktivitas katalase.

b. Pengukuran aktivitas katalase

1 ml sampel ditambahkan dengan 5 ml buffer posfat 0.05 M pH 7.0 sambil

divortek. Tambahkan 4 ml H 2 O 2 0.2 M dan inkubasi selama 60 detik. Ambil 1

ml larutan ini tambahkan 2 ml larutan warna kalium bikromat lalu panaskan pada

air mendidih selama 10 menit. Setelah dingin, serapan diukur pada panjang

gelombang 570 nm.

c. Kurva standar dan perhitungan aktivitas katalase

Kurva standar dibuat dari larutan standar H 2 O 2 30%. 1 ml larutan standar

H 2 O 2 ditambahkan dengan 2 ml larutan bikromat 5 %, panaskan dalam air

mendidih selama 10 menit kemudian dinginkan dan serapan dibaca pada panjang

gelombang 570nm. Absorban sb y dialurkan terhadap konsentrasi H 2 O 2 sb x.

Jumlah H 2 O 2 yang dipakai katalase = 0.2 M – konsentarasi H 2 O 2 terbaca.

10. Analisis kadar sitokrom P-450 pada plasma (dimodifikasi dari Omura dan Sato,1964)

a. Fraksinasi sel

Plasma ditambah dengan 0,25 M sukrosa dalam larutan Bufer Tris-HCl 10

mM (pH 7,5) dengan perbandingan 4 kali lipat berat plasma, lalu dihomogenisasi

menggunakan homogonizer. Selanjutnya disentrifuse pada 2000 g selama 10

menit sehingga dihasilkan supernatan.

Supernatan yang terbentuk disentrifuse kembali pada 105.000 x g selama

60 menit, dihasilkan supernatan kedua yang merupakan sitosol dan endapan yang

terbentuk dilarutkan dengan 0,25 sukrosa-10 mM buffer Tris-HCl-0,1 mM buffer

EDTA (pH 7,5) sehingga menghasilkan fraksi mikrosomal. Fraksi sitosol dan

mikrosomal dianalisis kadar proteinnya dengan menggunakan metode Lowry.

b. Pengukuran kadar sitokrom P-450 pada plasma

Analisa ini menggunakan dua buah tabung, tabung untuk blangko dan

tabung untuk sample. Ke dalam masing-masing tabung dimasukkan 2 ml fraksi

mikrosomal dan ditambah 2 ml 0,1 M buffer phosfat (pH 7,6). Tabung blangko

diukur dengan spektrofotometer double beam sebagai baseline pada panjang

gelombang 500-400 nm. Sedangkan tabung sample dialirkan 20-30 gelembung

gas CO dengan kecepatan 1 gelembung tiap detik. Setelah itu ke dalam masing-

masing tabung ditambahkan 1-3 mg NaS 2 O 4 . Isi dari masing-masing tabung

dituangkan ke kuvet dan diukur pada panjang gelombang 500-400 nm.

Kadar sitoktrom P-450 diukur dengan rumus:

Kadar sitokrom P450 = (A450-A490)tereduksi – (A450-A490) baseline x f difusi

Molar extinction x tebal kuvet

11. Pengukuran aktivitas glutation S-transferase pada plasma (dimodifikasi dari Arisudana, 2003)

Aktivitas glutation S-transferase diukur dari fraksi sitosol plasma dengan

menggunakan 2 substrat yakni 1-chloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) dan glutation

dalam bentuk tereduksi (GSH). CDNB yang dibutuhkan mempunyai konsentrasi 1

mM dan GSH yang dibutuhkan dalam 1 mM dalam 0.1 M buffer fosfat (pH 6.5).

Ke dalam masing-masing kuvet dimasukkan 2700 µl buffer fosfat pH 6.5.

ke dalam kuvet sample dimasukkan fraksi sitosol 100 µl sedangkan untuk kuvet

blangko dimasukkan akuades 100 µl. selanjutnya masing-masing kuvet

ditambahkan 100 µl GSH dalam buffer fosfat. Sebelum diukur ditambahkan 100

µl 30 mM CDNB dalam etanol. Total volume akhir dalam kuvet sebesar 3 ml.

Aktivitas GST diukur pada panjang gelombang 340 nm selama 3 menit.

Perhitungan aktivitas GST = (∆ absorbansi/menit)

Ε GS-DBN x kadar protein saat pengujian

ε GS-DBN (koefisien sktensi molar) = 9.6 cm 1− mM 1−

12. Analisis kadar sitokrom P-450 pada eritrosit (dimodifikasi dari Omura dan Sato, 1964)

a. Fraksinasi sel

Eritrosit ditambah dengan 0,25 M sukrosa dalam larutan Bufer Tris-HCl

10 mM (pH 7,5) dengan perbandingan 4 kali lipat berat eritrosit, lalu

dihomogenisasi menggunakan homogonizer. Selanjutnya disentrifuse pada 1000

g selama 10 menit sehingga dihasilkan supernatan.

Supernatan yang terbentuk disentrifuse kembali pada 105.000 x g selama

60 menit, dihasilkan supernatan kedua yang merupakan sitosol dan endapan yang

terbentuk dilarutkan dengan 0,25 sukrosa-10 mM buffer Tris-HCl-0,1 mM buffer

EDTA (pH 7,5) sehingga menghasilkan fraksi mikrosomal. Fraksi sitosol dan

mikrosomal dianalisis kadar proteinnya dengan menggunakan metode Lowry.

b. Pengukuran kadar sitokrom P-450 pada eritrosit

Analisa ini menggunakan dua buah tabung, tabung untuk blangko dan

tabung untuk sample. Ke dalam masing-masing tabung dimasukkan 2 ml fraksi

mikrosomal dan ditambah 2 ml 0,1 M buffer phosfat (pH 7,6). Tabung blangko

diukur dengan spektrofotometer double beam sebagai baseline pada panjang

gelombang 500-400 nm. Sedangkan tabung sample dialirkan 20-30 gelembung

gas CO dengan kecepatan 1 gelembung tiap detik. Setelah itu ke dalam masing-

masing tabung ditambahkan 1-3 mg NaS 2 O 4 . Isi dari masing-masing tabung

dituangkan ke kuvet dan diukur pada panjang gelombang 500-400 nm.

Kadar sitokrom P450 = (A450-A490)tereduksi – (A450-A490) baseline x f difusi

Molar extinction x tebal kuvet

13. Pengukuran aktivitas glutation S-transferase pada eritrosit (dimodifikasi dari Arisudana, 2003)

Aktivitas glutation S-transferase diukur dari fraksi sitosol eritrosit dengan

menggunakan 2 substrat yakni 1-chloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) dan glutation

dalam bentuk tereduksi (GSH). CDNB yang dibutuhkan mempunyai konsentrasi 1

mM dan GSH yang dibutuhkan dalam 1 mM dalam 0.1 M buffer fosfat (pH 6.5).

Ke dalam masing-masing kuvet dimasukkan 2700 µl buffer fosfat pH 6.5.

ke dalam kuvet sample dimasukkan fraksi sitosol 100 µl sedangkan untuk kuvet

blangko dimasukkan akuades 100 µl. selanjutnya masing-masing kuvet

ditambahkan 100 µl GSH dalam buffer fosfat. Sebelum diukur ditambahkan 100

µl 30 mM CDNB dalam etanol. Total volume akhir dalam kuvet sebesar 3 ml.

Aktivitas GST diukur pada panjang gelombang 340 nm selama 3 menit.

Perhitungan aktivitas GST = (∆ absorbansi/menit)

Ε GS-DBN x kadar protein saat pengujian

ε GS-DBN (koefisien sktensi molar) = 9.6 cm 1− mM 1−

14. Pengukuran kadar protein fraksi mikrosomal dan sitosol (Lowry, 1951)

Pengukuran kadar protein dilakukan untuk menguji kandungan protein

dalam fraksi mikrosomal dan sitosol. Pengujian dilakukan dengan metode Lowry,

menggunakan albumin serum sapi (ASS) 1000 µg/ ml.

Kurva standar dibuat dengan seri pengenceran ASS yaitu 800, 600, 400,

200, 100 µg/ ml. Sebanyak 1,2 ml larutan ASS dari masing-masing pengenceran

ditambahkan 6 ml CuSO 4 alkalis (dengan komposisi 1ml CuSO 4 .5H 2 O, 1 ml

Na-tartarat 2 %, 98 ml Na 2 CO 3 2 % dalam 0,1 N NaOH). Untuk larutan sampel

sebanyak 1.2 ml larutan sample ditambah Cu alkali.

Setelah dibiarkan selama 10 menit pada suhu ruang, ke dalam setiap

tabung ditambahkan 0.3 ml pereaksi Folin, diaduk dan dibiarkan selama 30 menit.

Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 650 nm. Kadar protein

sampel ditentukan dengan menggunakan kurva standar yang dihasilkan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Keadaan umum responden

Responden yang terlibat pada penelitian ini berjumlah 18 orang responden

berjenis kelamin perempuan yang merupakan mahasiswa tingkat sarjana dan

pascasarjana di Institut Pertanian Bogor. Umur responden berkisar antara 22-27

tahun. Pemilihan responden ini bertujuan untuk meminimalkan keragaman,

dimana semua responden memiliki aktivitas yang hampir sama sehari-harinya.

Semua responden juga bertempat tinggal di kawasan yang sama, sehingga

kegiatan dan jenis makanan lain selain yang telah diatur oleh peneliti juga tidak

jauh berbeda, diharapkan keadaan gizi semua responden juga tidak jauh berbeda.

Selain itu pengontrolan juga lebih mudah dilakukan. Selanjutnya 18 orang

responden tadi dibagi dalam dua kelompok yaitu 9 orang kelompok perlakuan dan

9 orang kelompok kontrol. Kelompok perlakuan memperoleh asupan minuman

bubuk kakao bebas lemak ditambah susu skim dan sedikit gula selama intervensi

berlangsung sedangkan kelompok kontrol tidak menerima minuman bubuk kakao

bebas lemak tetapi hanya minuman susu skim yang ditambah sedikit gula.

Sebelum intervensi berlangsung seluruh responden diminta dengan sukarela

menandatangani informed concern yang berisi pernyataan kesediaan menjadi

responden penelitian dan memuat beberapa ketentuan selama penelitian

berlangsung (lampiran 1).

Sebelum menjalani intervensi, semua responden baik kelompok perlakuan

maupun kelompok kontrol mengikuti pemeriksaan kesehatan terlebih dahulu oleh

seorang dokter di Klinik Farfa Darmaga (format pemeriksaan kesehatan terdapat

pada lampiran 2 point C dan D). Adapun tujuan pemeriksaan kesehatan ini

dilakukan adalah agar dapat dipastikan bahwa responden yang terlibat memiliki

kondisi kesehatan yang baik dan tidak mengidap penyakit serius yang

mempengaruhi penelitian. Pemeriksaan kesehatan yang dilakukan meliputi

pemeriksaan kesehatan fisik, denyut nadi, laju pernafasan, tekanan darah dan suhu

tubuh. Selain itu juga dilakukan wawancara terhadap responden tentang riwayat

kesehatannya. Pemeriksaan kesehatan juga dilakukan setelah responden menjalani

25 hari intervensi oleh dokter yang sama. Hasil pemeriksaan kesehatan

menunjukkan bahwa semua responden berada dalam keadaan sehat baik sebelum

dilakukan intervensi maupun setelah intervensi selesai.

Pada saat pemeriksaan kesehatan juga diukur kondisi fisik responden

secara antropometri meliputi tinggi badan (TB) dan berat badan (BB) seperti

terlihat pada tabel 3. Ditinjau dari nilai ”Body Mass Index” (BMI), hampir semua

responden memiliki status gizi normal, meskipun ada satu responden yang

kelebihan berat badan tingkat berat (responden kode P5), satu responden

kelebihan berat badan tingkat ringan (responden kode P4) dan satu responden

kekurangan berat badan tingkat ringan (responden kode K3). Status gizi

responden secara umum tidak berubah baik sebelum intervensi maupun sesudah

intervensi.

Tabel 3 Data antropometri responden sebelum dan sesudah intervensi

Responden

Hari 0 perlakuan Setelah 25 hari intervensi Berat Badan

(kg)

Tinggi badan

(m)

BMI (kg/m2)

Berat Badan

(kg)

Tinggi badan

(m)

BMI (kg/m2)

P1 50,0 1,550 20,8 51,0 1,550 21,2 P2 53,0 1,630 19,9 54,0 1,630 20,3 P3 56,0 1,580 22,4 56,0 1,580 22,4P4 67,5 1,620 25,7 68,0 1,620 25,9 P5 70,0 1,610 27,0 71,5 1,620 27,2 P6 47,0 1,580 18,8 48,0 1,580 19,2 P7 62,0 1,625 23,5 62,0 1,625 23,5 P8 51,0 1,590 20,2 51,0 1,590 20,2 P9 53,0 1,640 19,7 53,5 1,640 19,9

Rata-rata 56,61 1,6028 22,000 57,22 1,6039 22,200 StDev 8,07 0,0295 2,866 8,15 0,0300 2,813

K1 46,0 1,560 18,9 47,0 1,560 19,3 K2 54,0 1,510 23,7 55,0 1,510 24,1 K3 43,0 1,550 17,9 43,5 1,550 18,1 K4 41,0 1,450 19,5 41,5 1,450 19,7 K5 50,0 1,530 21,4 52,5 1,530 22,4 K6 43,0 1,490 19,4 44,0 1,490 19,8 K7 54,0 1,555 22,3 54,0 1,555 22,3 K8 49,0 1,560 20,1 49,5 1,560 20,3 K9 45,0 1,450 21,4 44,0 1,460 20,6

Rata-rata 47,22 1,5172 20,511 47,89 1,5183 20,733 StDev 4,79 0,0449 1,830 5,04 0,0432 1,861

Dari tabel diatas, bisa dilihat bahwa setelah menjalani intervensi, sebagian

besar responden mengalami kenaikan berat badan dengan persentasi yang sangat

kecil dan tidak signifikan (p>0,05) yaitu sekitar 1,08 % pada kelompok perlakuan

dan 1,42 % pada kelompok kontrol. Rata-rata berat badan responden kelompok

perlakuan sebelum intervensi 56,61 ± 8,07 kg, setelah intervensi menjadi 57,22 ±

8,15 kg. Sedangkan rata-rata berat badan responden kelompok kontrol sebelum

intervensi 47,22 ± 4,79 kg, setelah intervensi 47,89 ± 5,04 kg. Peningkatan berat

badan ini diduga karena selama intervensi responden makan secara teratur setiap

pagi dan malam hari dengan menu makanan yang bergizi karena disediakan oleh

peneliti, tidak seperti biasanya, dimana kadang-kadang responden makan tidak

teratur disebabkan oleh berbagai hal. Menu makanan yang disediakan umumnya

terdiri dari makanan pokok, yaitu nasi sebagai sumber karbohidrat, lauk pauk

sebagai sumber protein dan lemak, sayur dan kadang-kadang ditambah buah

sebagai sumber vitamin dan mineral. Kenaikan berat badan responden tidak bisa

dikatakan sebagai akibat konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak selama

intervensi, karena kenaikan berat badan tidak hanya dialami oleh responden pada

kelompok perlakuan atau kelompok yang mengkonsumsi minuman bubuk kakao

bebas lemak saja, tetapi juga dialami oleh responden pada kelompok kontrol yang

tidak mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak.

Murphy et al (2003) telah membuktikan bahwa tidak terjadi perbedaan

berat badan secara nyata antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan yang

mengkonsumsi flavanol kakao dan oligomer prosianidin selama 28 hari oleh 32

responden. Menurut Heerden (2006) konsumsi kakao atau bubuk kakao bukanlah

penyebab utama kegemukan, sehingga dapat dikatakan bahwa kenaikan berat

badan yang dialami oleh responden bukanlah akibat mengkonsumsi minuman

bubuk kakao bebas lemak, tetapi mungkin karena konsumsi makanan dan

minuman lainnya. Selain itu bubuk kakao yang digunakan pada penelitian ini

adalah jenis bubuk kakao yang sudah diambil lemaknya. Misnawi (2005)

menjelaskan bahwa bubuk kakao bebas lemak adalah produk kakao yang

berbentuk bubuk yang diperoleh dari pasta kakao setelah dihilangkan lemaknya.

Selama berlangsungnya intervensi, sarapan pagi dan makan malam

responden disediakan oleh peneliti, dengan harapan asupan makanan semua

responden selama penelitian seragam sehingga dapat mengurangi terjadinya bias

karena perbedaan status gizi responden. Selain itu juga diharapkan selama

intervensi, makanan yang dikonsumsi adalah makanan dengan menu seimbang

sehingga dapat memenuhi kebutuhan gizi responden. Adapun menu yang

disajikan terlihat pada tabel berikut.

Tabel 4 Menu makan pagi dan makan malam responden yang disiapkan oleh peneliti selama intervensi berlangsung.

Hari ke- Makan pagi Makan Malam 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Nasi, soto ayam Nasi, ikan sambal, sayur Nasi, dadar telur, sayur Nasi, soto ayam, mangga Nasi, tempe sambal, sayur Nasi, telur dadar, sayur, melon Nasi, sambal udang, sayur Nasi, ikan teri sambal, sayur Nasi, ikan goreng, sayur Nasi, orek tempe, sayur, pepaya Nasi, opor ayam, sayur Nasi, telur sambal, sayur Nasi goreng telur Nasi, ayam sambal, sayur Gado-gado, tempe Nasi, pepes ikan teri, sayur Nasi uduk, telur Nasi, ayam semur, sayur Nasi, telur sambal, sayur Nasi, goreng telur, pepaya Nasi, tongkol sambal, sayur Nasi, tahu tempe sambal, sayur Lontong sayur, jeruk Nasi, ayam sambal Nasi, hati, ampela, sayur

Nasi, dendeng sapi, sayur Nasi, ayam bakar, lalap, pepaya Tumis jamur, semangka Nasi, rendang daging, sayur Nasi, ayam geprek, sayur Nasi, sambal tongkol, sayur Capcai, pepaya Nasi, ikan mas bakar, lalapan Nasi, sup daging, jeruk Nasi, rendang daging, sayur Tumis jamur, pepaya Lontong, sate ayam, semangka Nasi, ayam geprek, sayur Nasi, pepes ikan mas, lalapan Nasi, sup daging, semanka Nasi, cumi gulai Lontong, sate padang, melon Nasi, ikan baker, lalapan Nasi uduk, pecel ayam Puyunghai, jeruk Nasi uduk, pecel ayam, melon Nasi, rendang daging, sayur Tumis jamur, papaya Nasi, ikan baker, lalapan Nasi, dendeng daging, pepaya

Selama penelitian ini berlangsung, menu makan siang responden tidak

disediakan oleh peneliti. Hal ini dikarenakan aktivitas responden berbeda-beda

sehingga sangat sulit untuk mengatur makan siang dan jajanan yang dikonsumsi

responden. Meskipun demikian kepada responden diberitahukan bahwa mereka

untuk sementara waktu, selama intervensi berlangsung tidak mengkonsumsi

makanan dan minuman yang mengandung senyawa polifenol tinggi seperti

produk-produk coklat, kopi, teh dan minuman bersoda tinggi. Makanan atau

minuman yang mengandung senyawa polifenol tinggi diduga mengandung

senyawa polifenol yang sama dengan minuman bubuk kakao yang diuji, sehingga

perlu dihindari selama penelitian berlangsung guna menghindari tercampurnya

komponen flavonoid pada minuman bubuk kakao bebas lemak dengan komponen

bioaktif lainnya ketika masuk ke dalam tubuh. Selain itu responden juga diminta

untuk mencatat semua makanan yang mereka konsumsi pada kuisioner yang telah

diberikan seperti yang tercantum pada lampiran. Selain mengkonsumsi makanan

pokok berupa nasi, di siang hari responden mengkonsumsi buah dan makanan

jajanan yang dibeli di sekitar tempat tinggal dan kampus. Makan pagi dan makan

malam yang disediakan oleh peneliti juga diperoleh dari warung-warung makanan

yang ada di sekitar tempat tinggal responden, sehingga tidak terlalu jauh berbeda

dengan kebiasaan makanan harian responden (Kusumaningtyas 2007).

Selanjutnya pengambilan darah responden dilakukan dua kali yaitu hari

pertama sebelum mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak dan hari ke

25 setelah mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak. Pengambilan

darah dilakukan pagi hari pada jam 07.00 – 08.00 WIB dengan tujuan agar kondisi

fisik responden masih prima karena belum melakukan aktivitas lain. Darah yang

telah didapat dari masing-masing responden sesegera mungkin langsung dibawa

ke laboratorium untuk dilakukan analisis. Pada saat pengambilan darah setelah 25

hari intervensi, seorang responden pada kelompok kontrol dengan kode K5

berhalangan hadir, sehingga darah responden tersebut tidak bisa dianalisis.

Meskipun demikian, hilangnya data ini diharapkan tidak mempengaruhi hasil

penelitian secara keseluruhan.

Aktivitas enzim antioksidan katalase pada eritrosit

Sistem pertahanan tubuh terhadap serangan radikal bebas meliputi dua

yaitu sistem pertahanan nonenzimatik dan enzimatik. Sistem pertahanan tubuh

nonenzimatik terhadap serangan radikal bebas melibatkan vitamin C, vitamin E

dan komponen-komponen bioaktif. Sistem pertahanan tubuh enzimatik terhadap

radikal bebas melibatkan: enzim superoksida dismutase, katalase dan glutation

peroksidase (Halliwell et al. 1992; Schmidl et al, 2000).

Pada penelitian ini akan dilihat bagaimana pengaruh konsumsi minuman

bubuk kakao bebas lemak terhadap salah satu aktivitas enzim antioksidan yaitu

enzim katalase. Halliewell dan Gutteridge (1999) menyebutkan bahwa katalase

merupakan enzim yang mengkatalis reaksi pemecahan senyawa hidrogen

peroksida menjadi oksigen dan air. Katalase ditemukan pada hewan dan tumbuhan

tingkat tinggi. Katalase pada mamalia disusun oleh 4 sub unit protein. Tiap unit

terdiri dari satu gugus hem dengan inti ion ferri sebagai active site. Aktivitas

katalase dihambat oleh senyawa azida, sianida dan HOCl tapi meningkat dengan

meningkatnya akumulasi H 2 O 2 .

Enzim katalase memberikan pertahanan terhadap serangan radikal bebas

yang dapat merusak sel. Jadi semakin tinggi dan meningkat aktivitas enzim ini

maka menunjukkan semakin meningkat pula pertahanan sel terhadap serangan

radikal bebas. Kerusakan sel merupakan gangguan atau perubahan yang dapat

mengurangi viabilitas dan fungsi essensial sel (Kehrer 1993). Menurut Zitouni et

al (2005), radikal bebas juga dapat mengganggu endotelium dan memacu

terjadinya kerusakan membran, sebagai contohnya akan meningkatkan ekresi

albumin urin dan memacu diabetes.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa pengukuran rata-rata aktivitas enzim

katalase pada eritrosit kelompok perlakuan sebelum intervensi adalah sebesar

999,64 U/ mg protein, sedangkan kelompok kontrol adalah sebesar 989,77 U/mg

protein. Setelah menjalani intervensi selama 25 hari, rata-rata aktivitas enzim

katalase pada eritrosit kelompok perlakuan menjadi 1020, 03 U/ mg protein,

sedangkan kelompok kontrol menjadi 993,39 U/ mg protein. Berdasarkan hasil

penelitian ini terlihat bahwa rata-rata aktivitas enzim katalase pada eritrosit baik

pada kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol sama-sama mengalami

peningkatan. Meskipun demikian, rata-rata peningkatan pada kelompok perlakuan

lebih besar yaitu sebesar 20,387 U/ mg protein sedangkan pada kelompok kontrol

rata-rata peningkatannya hanya sebesar 3,62 U/ mg protein. Hal tersebut

diperkuat dengan analisa statistik menggunakan uji t, dimana terjadi peningkatan

aktivitas enzim katalase pada eritrosit secara nyata (p < 0,05) setelah kelompok

perlakuan mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak selama 25 hari.

Sedangkan peningkatan aktivitas enzim katalase pada eritrosit yang terjadi pada

kelompok kontrol tidak berbeda nyata (p > 0,05) setelah 25 hari.

Gambar 8 Grafik aktivitas enzim katalase pada eritrosit kelompok perlakuan

sebelum dan sesudah intervensi Gambar 9 Grafik aktivitas enzim katalase pada eritrosit kelompok kontrol

sebelum dan sesudah intervensi

Rata-rata peningkatan = 20,39 U/ mg protein


975

980

985

990

995

1000

K1 K2 K3 K4 K6 K7 K8 K9

Responden

Akt

ivita

s K

atal

ase

(U/m

g Pr

otei

n)

Sebelum Intervensi Setelah Intervensi

960

980

1000

1020

1040

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

Responden

Akt

ivita

s K

atal

ase

(U/m

g pr

otei

n)


Peningkatan ini menunjukkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao

bebas lemak telah terbukti memberikan pengaruh yang positif bagi sistem

pertahanan tubuh khususnya secara enzimatis dalam hal ini oleh enzim katalase

dalam menangkal serangan radikal bebas yang berbahaya bagi sel. Hal tersebut

diduga karena disebabkan oleh kandungan flavonoid pada minuman bubuk kakao

bebas lemak yang memiliki kapasitas antioksidan dalam tubuh. Antioksidan

adalah zat yang mampu memperlambat atau mencegah proses oksidasi (Schuler

1990). Menurut Gutteridge dan Halliwell (1996), antioksidan adalah suatu

substansi yang menghentikan atau menghambat kerusakan oksidatif terhadap

suatu molekul target. Sementara itu menurut Cillard et al (1980) dan Schluler

(1990) antioksidan adalah zat dengan kadar lebih rendah dari zat yang mudah

teroksidasi, secara nyata mampu memperlambat oksidasi zat tersebut.

Hasil penelitian ini juga didukung oleh hasil penelitian Amri (2007) yang

menyebutkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak telah terbukti

dapat menghambat laju hemolisis eritrosit. Menurut Zhu et al (2005), Eritrosit

mengandung asam lemak tak jenuh ganda dengan konsentrasi yang tinggi, oksigen

molekuler, dan ion besi sebagai ligan, oleh sebab itu eritrosit sangat mudah

diserang sehingga terjadi stress oksidatif. Bagaimanapun, sel ini memiliki sistem

antioksidan efisien yang menyumbangkan ketahanan yang luar biasa terhadap

peroksidasi ketika radikal diproduksi di dalam sel. Lebih lanjut Amri (2007)

menyebutkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak telah terbukti

secara nyata mampu menurunkan kadar MDA dan meningkatkan aktivitas anti

radikal bebas pada sel eritrosit. Malonaldehida (C3H4O2) adalah senyawa aldehida

berkarbon tiga sebagai produk peroksidasi lipid, terutama asam arakhidonat dan

pada biosintesa prostaglandin. Kadar MDA dapat digunakan sebagai indeks tidak

langsung kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh peroksidasi lipid (Pryor et al.,

1976; Frankel & Neff, 1983; Bird & Draper, 1980; Auroma, 1997 dalam Tejasari,

2000).

Berbagai sumber antioksidan alami telah banyak dilaporkan berasal dari

tanaman. Bubuk kakao bebas lemak yang digunakan dalam penelitian ini

mengandung polifenol sebesar 4,43 gr/ 100 gr (Zairisman, 2006). Antioksidan

seperti vitamin C, flavonoid, turunan asam sinamat, kumarin (Pratt & Hudson

1990), dan komponen fenolik pada umumnya merupakan antioksidan primer.

Senyawa fenol dapat berfungsi sebagai antioksidan primer karena mampu

menghentikan reaksi rantai radikal bebas pada oksidasi lipida. Polifenol dalam

bubuk kakao akan bereaksi langsung dengan senyawa peroksida radikal yang

terdapat pada membran atau di dalam sel (Kochhar & Rossell 1990). Adanya

radikal bebas dalam tubuh bisa menimbulkan penyakit degeneratif yang

berbahaya misalnya kanker, serangan jantung, diabetes militus, penyempitan

pembuluh darah dan lain-lain. Sztanske dan Pasternak (2005) telah meneliti

bahwa pasien yang mengalami gangguan gastrointestinal telah terbukti memiliki

aktivitas enzim atioksidan superoksida dismutase dan glutation peroksidase yang

lebih rendah dibandingkan dengan subjek yang normal. Selain itu Zitouni et al

(2005) juga menyebutkan bahwa aktivitas enzim antioksidan GPx, SOD dan

katalase pada penderita diabetes baik tipe I maupun tipe II terbukti lebih rendah

dibandingkan dengan subjek sehat.

Berbagai penelitian yang mendukung hasil penelitian ini juga telah

dilakukan. Salah satu komponen bioaktif pada pangan adalah karotenoid.

Karotenoid memiliki potensi sebagai antioksidan bagi sistem pertahanan tubuh

terhadap serangan radikal bebas. Hal tersebut telah dibuktikan oleh Bub (2000)

dalam penelitiannya menyebutkan bahwa karotenoid pada jus tomat terbukti

mampu menekan kadar LDL (Low Density Lipoprotein) pada 23 orang pria

dewasa sehat yang diberi konsumsi jus tomat sebanyak 330 ml/hari selama 2

minggu. Selain itu hasil penelitian ini juga menunjukkan adanya peningkatan pada

aktivitas enzim antioksidan superoksida dismutase secara nyata (7,961±216 U/ g

Hb) pada eritrosit. Dalam penelitian lainnya, Jung et al (2003) menyebutkan

bahwa suplementasi naringin telah terbukti mampu meningkatkan aktivitas enzim

antioksidan katalase, superoksida dismutase (SOD) dan glutation peroksidase

pada eritrosit dan plasma darah subjek yang menderita hiperkolesterolemik.

Naringin merupakan senyawa fenol golongan flavonoid. Selanjutnya Coscun et al

(2004) juga telah membuktikan dalam penelitiannya bahwa tikus percobaan yang

diberi injeksi flavonoid quercetin selama 16 minggu dengan dosis 50 mg/ kg/ hari

mampu meningkatkan secara signifikan aktivitas enzim-enzim antioksidan seperti

katalase, superoksida dismutase dan glutation peroksidase baik pada hati maupun

pada darahnya. Quercetin merupakan senyawa polifenol golongan flavonoid yang

berpotensi sebagai antioksidan. Lebih lanjut dalam penelitiannya Pasternak et al

(2005) menyebutkan bahwa vitamin C yang ditambah dengan elemen Zinc dan

Copper (Zn dan Co) telah terbukti mampu meningkatkan aktivitas enzim

antioksidan glutahion peroksidase dan superoksida dismutase pada jaringan tikus.

Namun demikian dalam penelitian ini, adanya peningkatan aktivitas enzim

antioksidan katalase ini tidaklah bisa semata-mata disimpulkan hanya karena

flavonoid pada bubuk kakao semata. Hal ini disebabkan karena pada kelompok

kontrol yang tidak diberi konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak pada

waktu yang sama, aktivitas enzim katalasenya juga mengalami peningkatan

meskipun secara statistik tidak berbeda nyata. Peningkatan ini bisa saja

disebabkan oleh pengaruh konsumsi makanan atau minuman lainnya yang

dikonsumsi reponden selama intervensi berlangsung. Seperti dijelaskan

sebelumnya bahwa selama penelitian ini berlangsung, makan pagi dan makan

malam responden disediakan oleh peneliti. Adapun menu yang disajikan selalu

terdiri dari karbohidrat, lemak, protein juga komponen serat, vitamin dan mineral.

Hal ini tentunya memberikan pengaruh yang positif terhadap kesehatan para

responden. Sistem pertahanan tubuh terhadap serangan radikal bebas juga

melibatkan seperti vitamin C, vitamin E dan berbagai komponen bioaktif (Nabet,

1996). Asupan makanan yang bergizi tentunya akan sangat mempengaruhi kerja

enzim-enzim antioksidan dalam tubuh. Dalam penelitiannya Rasal et al (2006)

menyebutkan bahwa tikus percobaan yang menderita diabetes ketika diberi

ekstrak daun kubis (Brassica oleracea var. gongylodes) dengan dosis 10mg/ kg/

hari secara ad libitum terbukti secara nyata mampu meningkatkan aktivitas enzim

antioksidan katalase, SOD dan glutation peroksidase pada eritrositnya

dibandingkan dengan kelompok kontrol. Kubis merupakan sejenis sayuran yang

mengandung vitamin C, vitamin E dan karoten. Komponen bioaktif yang penting

dari tanaman ini adalah sulphoraphanes dan isothiocyanates lainnya, karena

mampu meningkatkan aktivitas enzim antioksidan adalam tubuh. Selain itu

kebiasaan buruk seperti merokok telah dibuktikan ternyata mempengaruhi kerja

enzim-enzim antioksidan pada tubuh. Peltola et al (1994) menyebutkan bahwa

Merokok terbukti dapat menurunkan aktivitas katalase sebesar 16% setelah 12

jam menghisap rokok selama 5 hari.

Aktivitas enzim antioksidan katalase pada plasma

Antioksidan merupakan molekul yang dapat mengendalikan reaksi

berantai radikal bebas di dalam tubuh. Untuk menangkal reaksi radikal bebas,

tubuh mempunyai sistem pertahanan enzimatik dan nonenzimatik. Beberapa

enzim yang terlibat dalam pertahanan tubuh terhadap serangan radikal bebas

adalah katalase, superoksida dismutase dan glutation peroksidase (Gutteridge dan

Halliewell, 1994).

Seperti disebutkan di atas bahwa katalase merupakan salah satu enzim

yang berperan dalam pertahanan tubuh secara enzimatis terhadap radikal bebas.

Katalase merupakan enzim yang mengakatalis reaksi pemecahan senyawa

hidrogen peroksida menjadi air.


Katalase ditemukan pada hewan dan tumbuhan tingkat tinggi. Pada manusia,

enzim ini ditemukan dalam darah, ginjal, limfa, pankreas, otak, paru-paru,

adiposa, kelenjar adrenal dan konsentrasi tertinggi ada pada hati (± 1400 U/mg

protein) (Gutteridge & Halliewell, 1994) bersama dengan glutation peroksidase

(GPx) dan enzim antioksidan lainnya (Greenwald 1985).

Enzim ini sangat berperan dalam pertahanan tubuh terhadap serangan

radikal bebas yang dapat merusak sel. Radikal bebas merupakan suatu molekul

atau ion yang tidak stabil karena mempunyai elektron yang tidak berpasangan

pada kulit terluar. Molekul atau ion ini berusaha mencapai titik kestabilan dengan

jalan menarik elektron atau molekul lain sehingga terbentuk radikal baru. Reaksi

radikal bebas dapat berlangsung secara berantai (Gutteridge & Halliewell, 1994).

Disamping radikal bebas dikenal pula istilah Reaktif Oxygen Species (ROS) yaitu

molekul yang mengandung oksigen dan bersifat reaktif (Oberley 2001 dalam

Chalid 2000).

Gambar 10 Grafik aktivitas enzim katalase pada plasma kelompok perlakuan sebelum dan sesudah intervensi

Gambar 11 Grafik aktivitas enzim katalase pada plasma kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi


katalase pada plasma darah kelompok perlakuan sebelum intervensi adalah

sebesar 539, 228 U/ mg protein, sedangkan kelompok kontrol adalah sebesar

547,905 U/mg protein. Setelah menjalani intervensi selama 25 hari, rata-rata

aktivitas enzim katalase pada plasma darah kelompok perlakuan menjadi 584,177

U/ mg protein, sedangkan kelompok kontrol menjadi 559,487 U/ mg protein.

Berdasarkan hasil penelitian ini terlihat bahwa rata-rata aktivitas enzim katalase

pada plasma baik pada kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol sama-sama

mengalami peningkatan. Meskipun demikian, rata-rata peningkatan pada

kelompok perlakuan lebih besar yaitu sebesar 44,949 U/ mg protein sedangkan

pada kelompok kontrol rata-rata peningkatannya hanya sebesar 11,582 U/ mg



450

500

550

600

650

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

Responden

Akt

ivita

s K

atal

ase

(U/m

g pr

otei

n)


450

500

550

600

650

K1 K2 K3 K4 K6 K7 K8 K9

Responden

Akt

ivita

s K

atal

ase

(U/m

g pr

otei

n)


protein. Hal tersebut diperkuat dengan analisa statistik menggunakan uji t, dimana

terjadi peningkatan aktivitas enzim katalase pada plasma secara nyata (p < 0,05)

setelah kelompok perlakuan mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak

selama 25 hari. Sedangkan peningkatan aktivitas enzim katalase pada plasma yang

terjadi pada kelompok kontrol tidak berbeda nyata (p > 0,05) setelah 25 hari.

Kakao mengandung flavanol dan prosianidin yang potensial sebagai agen

perlindungan terhadap kardiovaskuler, berpengaruh pada fungsi platelet, mengatur

tekanan darah, produksi nitrik oksida, menghambat oksidasi dan sebagai sistem

imun (Heiss et al. 2003 dalam Yan Zhu et al. 2005). Flavonoid pada kakao dan

cokelat dikenal dengan istilah flavanol. Flavanol dapat juga ditemukan pada teh

hijau, apel, dan anggur merah. Flavanol umumnya terdapat dalam bentuk senyawa

tunggal seperti catechin dan epicatechin dan juga berbentuk senyawa oligomer

seperti procyanidin (CIC 2001). Senyawa polifenol pada kakao bersifat sebagai

antioksidan primer dalam menangakal radikal bebas. Suatu molekul akan dapat

bereaksi sebagai antioksidan primer jika dapat memberikan atom hidrogen secara

cepat kepada radikal lipida dan jika radikal yang diturunkan dari antioksidan lebih

stabil dibandingkan radikal lipida, atau dikonversi menjadi produk stabil. Radikal

bebas yang terbentuk pada reaksi senyawa fenol dengan radikal lemak selalu

distabilkan oleh delokalisasi elektron tidak berpasangan disekitar cincin aromatik

dari fenol tersebut. Menurut Hudson (1990), stabilisasi radikal fenoksil akan

mengurangi laju propagasi autooksidasi.

Hasil penelitian ini juga didukung oleh hasil penelitian Yuliatmoko (2007)

yang menyebutkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak selama

25 hari telah terbukti mampu menekan jumlah MDA dan diena terkonjugasi pada

plasma darah responden. Reaksi tidak terkendali radikal bebas terhadap

komponen sel seperti asam lemak tidak jenuh ganda (PUFA), heksosa, pentosa,

asam amino dan komponen DNA menghasilkan beberapa produk seperti:

Malonaldehida atau MDA, diena terkonjugasi, dikarbonil dan asam 15-

hidroperoksi-5,8,4,13 eikosatetraenoik (15-HPETE). Selain itu hasil penelitian

Yuliatmoko (2007) juga menyebutkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao

bebas lemak pada responden selama 25 hari telah terbukti mampu meningkatkan

atktivitas antiradikal bebas pada plasma darah. Untuk menjaga kondisi tubuh agar

tetap sehat maka jumlah antioksidan tidak boleh rendah daripada jumlah radikal

bebas. Penurunan kadar MDA sel oleh senyawa bioaktif dalam bahan pangan lain

telah diteliti. Zakaria et al (2003) melaporkan bahwa komponen bioaktif dalam

jahe dapat menurunkan kadar MDA sel limfosit baik secara in vitro maupun

secara in vivo dengan menggunakan responden manusia. Dalam penelitian lain

juga telah diteliti bahwa konsumsi buah-buahan dan sayur-sayuran yang tinggi

kandungan vitamin C dan E dapat menurunkan MDA sel pada populasi buruh

industri di Bogor (Wijaya 1997).

Penelitian yang serupa juga telah dilakukan oleh Jung et al (2003) yang

menyebutkan bahwa pemberian suplemen yang mengandung komponen bioaktif

flavonoid jenis naringin telah terbukti mampu meningkatkan aktivitas enzim

antioksidan glutation peroksidase, superoksida dismutase dan juga katalase pada

plasma darah subjek manusia yang menderita hiperkolesterolemik. Fraga et al

(2005) juga telah membuktikan dalam penelitiannya bahwa konsumsi flavanol

yang terkandung dalam coklat susu telah terbukti mampu mengurangi kolesterol

plasma, LDL, MDA dan meningkatkan vitamin E dan plasma darah responden

yang berprofesi sebagai pemain sepakbola.

Aktivitas radikal bebas yang tidak terkendali dalam tubuh bisa

membahayakan bagi metabolisme dalam tubuh kita. Keberadaan radikal bebas

yang berbahaya ini bisa memicu berbagai penyakit berbahaya terutama penyakit-

penyakit degeneratif yang berakibat fatal bahkan bisa menyebabkan kematian.

Selain itu apabila tubuh telah terserang suatu penyakit tertentu akibat tidak

terkendalinya jumalah radikal bebas yang ada, maka tentunya akan mengganggu

sistem pertahanan tubuh seperti sistem kerja enzim di dalamnya. Sebagai

contohnya hasil penelitian Sozmen et al (1998) menunjukkan bahwa aktivitas

enzim katalase dan superoksida dismutase (SOD) pada pasien hipertensi dan

jantung koroner telah terbukti jauh lebih rendah dibandingkan dengan subyek

normal.

Chalid (2000) menyebutkan bahwa mencit yang menderita tumor kelenjar

susu setelah diberi ekstrak daun cincau hijau ternyata mampu meningkat aktivitas

enzim katalasenya. Ekstrak daun cincau hijau mengandung senyawa bioaktif:

alkaloid, saponin, flavonoid, klorofil dan karotenoid. Zakaria dan Prangdimurti

(2000) juga menyebutkan bahwa tanaman cincau hijau memiliki alkaloid 0,98 %

dan total fenol 2,12 %.

Peningkatan aktivitas enzim katalase ini tentu saja dapat memperkuat

sistem pertahanan enzimatis tubuh dalam menekan terbentuknya radikal bebas.

Halliwell dan Gutteridge (1999) menyebutkan bahwa asupan senyawa antioksidan

alami yang banyak terdapat pada tanaman seperti kakao, brokoli, sawi, bunga kol,

teh, anggur mampu menekan radikal bebas dan elektrofil dalam tubuh sehingga

serangan terhadap DNA dapat dieliminasi dan penyakit-penyakit degeneratif

dapat dihindari. Tentu saja secara tidak langsung bisa mengaktifkan kerja enzim

antioksidan seperti katalase. Kakao merupakan tanaman yang mengandung

komponen bioaktif flavonoid. Lebih lanjut Grassi et al (2006) menjelaskan

bahwa pada manusia, bioavailabilitas flavonoid berkisar antara 1-26 %. Pada

tubuh kita flavonoid akan bersikulasi dalam plasma, terdapat sebagai glukoronida,

methyl dan sulfat konjugat atau kombinasi dari ketiganya.

Meskipun demikian peningkatan kerja enzim katalase pada plasma

responden dalam penelitian ini tidaklah bisa dikatakan sema-mata hanya

merupakan efek dari konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak saja. Hal ini

dikarenakan pada kelompok kontrol yang tidak menerima asupan flavonoid dari

minuman bubuk kakao juga terbukti mengalami peningkatan katalse meskipun

tidak nyata. Ini diduga bisa saja disebabkan oleh asupan makanan lainnya yang

dikonsumsi oleh responden. Makanan atau minuman yang mereka konsumsi bisa

saja mengandung komponen antioksidan lainnya. Hal ini telah dibuktikan oleh

Yuliatmoko (2007) dalam penelitiannya yang menyatakan bahwa responden yang

mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak dengan kondisi yang sama

seperti pada penelitian ini telah terbukti juga meningkat kadar vitamin C pada

plasma darahnya. Ini menunjukkan bahwa adanya korelasi yang positif antar

sistem pertahanan tubuh apabila menerima asupan makanan atau minuman yang

bergizi serta ditambah lagi dengan adanya senyawa bioaktif seperti flavonoid.

Zakaria (1996) mengemukakan bahwa sayuran dan buah-buahan yang

kaya dengan vitamin E dan vitamin C dapat berfungsi sebagai antioksidan bagi

tubuh. Selain itu selama intervensi ini berlangsung, responden juga mengurangi

konsumsi jajanan. Menurut Fardiaz dan Fardiaz (1993) dalam makanan jajanan

mengandung bahan-bahan pencemar seperti mikroorganisme, pestisida, logam

berat, zat pewarna, zat pemanis dan zat pengawet. Zakaria dan Abidin (1996)

menyatakan bahwa konsumsi makanan yang telah tercemar bahan kimia

berpotensi menaikkan pembentukan senyawa radikal dalam tubuh konsumen.

Konsumsi makanan yang berpotensi sebagai antioksidan tentunya akan

berdampak posistif pada sistem pertahanan enzimatik tubuh. Hal ini telah

dibuktikan salah satunya dalam penelitian Dragted et al (2004) yang menyebutkan

bahwa pemberian sayuran dan buah-buahan sebanyak 600 gram/hari yang terdiri

dari brokoli, bayam, bawang merah, tomat, jeruk, apel, pir selama 25 hari pada 43

orang responden yang teridiri dari pria dan wanita telah terbukti mampu

meningkatkan aktivitas enzim antioksidan SOD (984±158 U/g protein menjadi

993±U/ g protein) dan glutation peroksidase (126±21 U/ g protein menjadi

133±22 U/ g protein) pada eritrosit dan plasma darah. Dengan meningkatnya

aktivitas enzim antioksidan dalam tubuh tentunya akan semakin memperkuat

sistem pertahanan tubuh terhadap serangan radikal bebas yang merupakan pemicu

munculnya berbagai penyakit degeneratif seperti kanker, jantung koroner,

aterosklerosis dan lain-lain.

Aktivitas Enzim Detoksifikasi Sitokrom P-450 pada Eritrosit

Metabolisme senyawa xenobiotik terdiri dari dua fase. Pada fase satu,

toksikan bersifat lipofilik akan ditransformasikan oleh enzim-enzim fase satu

(monooksigenase) menjadi senyawa-senyawa metabolit yang bersifat polarreaktif

grup. Pada fase dua, metabolit yang terbentuk akan dikonjugasikan oleh enzim-

enzim fase dua (konjugasi) sehingga dihasilkan senyawa yang bersifat hidrofilik

dan mudah diekresikan ke luar tubuh. Namun jika metabolisme senyawa

xenobiotik menghasilkan produk yang reaktif, maka akan menimbulkan efek

toksik bagi tubuh (Hodgoson & Levi, 2000).

Penelitian ini bertujuan untuk melihat bagaimana pengaruh konsumsi

minuman bubuk kakao bebas lemak terhadap kadar enzim sitokrom P-450. Enzim

ini berperan penting dan terlibat paling dominan pada reaksi fase I, yang mana

dalam reaksi ini terjadi proses oksidasi, reduksi atau hidrolisis guna memasukkan

gugus fungsional yang sesuai bagi reaksi konjugasi fase II. Reaksi tersebut

berlangsung dengan efektif dalam kondisi tegangan oksigen yang rendah. Bila

tidak demikian oksigen molekuler akan bersaing dengan substrat senyawa asing

dalam proses perpindahan elektron yang dikatalisir oleh enzim tersebut (Donatus,

2001). Ada dua hal penting yang berhubungan dengan fungsi enzim sitokrom P-

450, yang pertama adalah enzim ini memiliki jalur yang kritis dan spesifik dalam

metabolisme senyawa-senyawa kimia endogenus. Kedua, Proses enzim ini

merupakan pokok dari produk-produk alami, bahkan saat ini ditambah dengan

bahan-bahan kimia seperti obat-obatan dan xenobiotik lainnya dalam senyawa-

senyawa non selektif (Guengerich 1991). P-450 dan komponennya bisa ditemukan

di kulit, mukus, paru-paru, gastrointestinal. Selain organ-organ tersebut juga telah

banyak dilakukan penelitian tentang keberadaan P-450, diantaranya di hati, ginjal,

plasenta, testis serta pada darah (Hodgoson & Levi, 2000). Selain itu pada tahun

1999, Krovat et al juga telah membuktikan bahwa Sitokrom P-450 (CYP) dan

mikrosomal epoxide hydrolase (MEH) telah terbukti teridentifikasi di sel darah

manusia.

Komponen bioaktif yang masuk dalam tubuh akan melalui jalur

bioaktivasi dan detoksifikasi dalam tubuh. Kakao memiliki komponen bioaktif

utama yaitu flavonoid. Komponen flavonoid ini mungkin akan teroksidasi oleh

sistem enzim sitokrom P-450. Seperti yang dikatakan oleh Freisleben, 1999

bahwa salah satu enzim yang mengkatalis proses okdidasi adalah sistem enzim

monooksigenase (enzim sitokrom P-450 oksidase) yang menghasilkan radikal

bebas. Sistem enzim sitokrom P-450 yang terlibat dalam biotransformasi dan

detoksifikasi xenobiotik akan memproduksi peroksida atau singlet oksigen yang

reaktif. Reaksi yang terjadi yaitu:

RH + O 2 + H 2 O → ROH + O 2* + H + / H 2 O 2

Gambar 12 Grafik kadar sitokrom P-450 pada eritrosit kelompok perlakuan sebelum dan sesudah intervensi

Gambar 13 Grafik kadar sitokrom P-450 pada eritrosit kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi

Hasil penelitian seperti ditampilkan dalam gambar 12 dan 13 di atas

menunjukkan bahwa pengukuran rata-rata kadar sitokrom P-450 kelompok

perlakuan sebelum intervensi adalah sebesar 5,43 nmol/ mg protein, sedangkan

kelompok kontrol adalah sebesar 4,82 nmol/mg protein. Setelah menjalani

intervensi selama 25 hari, rata-rata kadar sitokrom P-450 kelompok perlakuan

menjadi 1,59 nmol/ mg protein, sedangkan kelompok kontrol menjadi 3,97 nmol/

mg protein. Berdasarkan hasil penelitian ini terlihat bahwa kadar sitokrom P-450

pada eritrosit baik pada kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol sama-

sama mengalami penurunan. Meskipun demikian, rata-rata penurunan pada

kelompok perlakuan lebih besar yaitu sebesar 3,84 nmol/ mg protein sedangkan

Rata-rata penurunan = 3,84 nmol/ mg protein


01234567

K1 K2 K3 K4 K6 K7 K8 K9

Responden

Kad

ar S

itokr

om P

-450

(nm

ol/m

g pr

otei

n)


0

1

2

3

4

5

6

7

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

Responden

Kad

ar S

itokr

om P

-450

(n

mol

/mg

prot

ein)


pada kelompok kontrol rata-rata penurunan hanya sebesar 0,85 nmol/ mg protein.

Hal tersebut diperkuat dengan analisa statistik menggunakan uji t, dimana terjadi

penurunan kadar sitokrom P-450 secara nyata (p < 0,05) setelah kelompok

perlakuan mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak selama 25 hari.

Sedangkan penurunan kadar sitokrom eritrosit yang terjadi pada kelompok kontrol

tidak berbeda nyata (p > 0,05) setelah 25 hari.

Dengan demikian terlihat jelas bahwa konsumsi minuman bubuk kakao

bebas lemak tidak meningkatkan kadar sitokrom P-450 yang berarti proses

oksidasi di hati tidak meningkat dan tidak memicu terbentuknya radikal bebas.

Penurunan kadar sitokrom P-450 ini terlihat pada kedua kelompok baik kelompok

perlakuan maupun kelompok kontrol. Penurunan kadar sitokrom ini juga

didukung dengan hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Amri (2007) yang

mana konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak selama 25 hari secara nyata

mampu menurunkan kadar MDA dan meningkatkan aktivitas antiradikal bebas

pada sel eritrosit. Hal ini juga didukung dengan penelitian yang dilakukan oleh

Erniati (2007), yang menyatakan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas

lemak dapat menurunkan kadar MDA secara nyata pada sel limfosit darah

manusia. MDA merupakan salah satu parameter untuk menganalisa kadar radikal

bebas dalam tubuh. Senyawa ini merupakan produk oksidasi asam lemak tidak

jenuh oleh senyawa radikal (Conti et al. 1991).

Penurunan kadar sitokrom kelompok perlakuan yang berbeda nyata

dengan kelompok kontrol diduga karena efek positif yang didapat setelah

kelompok perlakuan mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak selama

25 hari. Seperti disebutkan dalam penelitian sebelumnya oleh Zairisman (2006)

bahwa ekstrak bubuk kakao bebas lemak dalam pelarut air mengandung senyawa

polifenol yang tinggi. Dalam penelitian lain disebutkan juga bahwa kakao

mengandung senyawa fitokimia fenolik dan kapasitas antioksidan yang lebih

tinggi dibandingkan dengan buah-buahan, sayur-sayuran, teh hijau dan teh hitam

(Lee et al 2003; Vinson et al 1995). Komponen antioksidan ini dapat menetralisir

reaktivitas dari reaktif oxygen spesies (ROS).

Berbagai penelitian telah banyak dilakukan untuk menggali potensi

flavonoid dalam menghambat enzim oksidatif yang memicu terbentuknya radikal

bebas yang berakibat fatal bagi tubuh. Li et al (1994) telah membuktikan bahwa

senyawa flavonoid jenis myricetin dan quercetin telah terbukti mampu

menghambat kerja enzim sitokrom P-450 pada fraksi mikrosomal hati manusia

sebesar 40-60%. Dengan konsentrasi sebesar 85-90 mikroM. Selain itu juga ia

juga membuktikan bahwa pemberian flavonoid jenis flavon dengan konsentrasi

2,5 mikroM juga telah terbukti menghambat kerja enzim ini. Dalam penelitian

yang lain disebutkan pula bahwa senyawa flavonoid jenis chrysin dan apigenin

mampu menghambat kerja enzim sitokrom P-450 jenis CYP1A1 flavonoid

golongan quercetin mampu menghambat sitokrom P-450 jenis CYP1A2 pada

hamster yang diberi ransum mengandung flavonoid: quercetin, apigenin dan

chrysin masing-masing sebesar 10 µM (Lautaraite et al, 2002).

Seiring dengan semakin banyaknya penyakit yang disebabkan oleh radikal

bebas seperti penyakit-penyakit degeneratif, maka semakin banyak penelitian

yang dikembangkan ke arah tersebut. Berbagai potensi bahan alami terus diteliti

dan dikembangkan untuk menghambat kerja dari enzim yang memicu terjadinya

kerusakan sel seperti sitokrom P-450 ini. Hasil penelitian menunjukkan bahwa

pemberian ginseng varietas Panax ginseng dan Panax quinquevolius telah terbukti

tidak meningkatkan aktivitas sitokrom P-450 dengan dosis masing-masing 30-100

mg/ kg dan 100-400 mg/ kg setiap harinya selama 21 hari pada fraksi mikrosomal

dari hati tikus percobaan (NCCAM, 2005). Penelitian sebelumnya juga telah

membuktikan bahwa beberapa senyawa golongan flavonoid yang diekstrak dari

akar tanaman Scutellariae telah terbukti mampu menghambat kerja enzim

sitokrom P-450 pada fraksi mikrosomal hati manusia. Lebih rinci hasil

penelitiannya adalah flavonoid golongan Baicalein dan 2',5,6',7-

tetrahydroxyflavone pada konsentrasi masing-masing 17,4 dan 7,8 µM

menghambat hepatic testosterone 6 -hydroxylation (CYP3A4). Flavonoid

golongan Oroxylin pada konsentrasi 6,1 µM mampu menghambat aktivitas

Sitokrom diclofenac 4-hydroxylation (CYP2C9) (Kim et al. 2002)

Namun demikian harus diperhatikan bahwa penurunan kadar sitokrom P-

450 pada penelitian ini juga tidak semata-mata disebabkan oleh konsumsi

minuman bubuk kakao bebas lemak saja. Hal ini terlihat juga pada kelompok

kontrol yang tidak mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak tapi juga

mengalami penurunan kadar sitokrom P-450 meskipun hasil analis statistik

menunjukkan tidak berbeda nyata pada kelompok kontrol. Penurunan kadar

sitokrom baik pada kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol juga diduga

karena pola makan responden selama intervensi. Berdasarkan hasil wawancara

dengan para responden, umumnya mereka menyatakan bahwa pola makan mereka

lebih baik selama intervensi dibandingkan dengan pola makan mereka biasanya.

Selama intervensi berlangsung, setiap menu yang disajikan selalu disediakan nasi

sebagai asupan karbohidrat, lauk sebagai protein dan lemak, sayur dan juga

kadang-kadang buah sebagai vitamin dan mineral. Selain itu selama intervensi

berlangsung, responden juga mengurangi konsumsi makanan jajanan. Menurut

Fardiz dan Fardiaz (1993), dalam makanan jajanan mengandung bahan-bahan

pencemar seperti mikoroorganisme, pestisida, logam berat, zat pewarna, zat

pemanis dan zat pengawet. Zakaria dan Abidin (1996) menyatakan bahwa

konsumsi makanan jajan yang tercemar bahan kimia berpotensi menaikkan

pembentukan senyawa radikal bebas dalam tubuh konsumen.

Meskipun kelompok kontrol juga mengalami penurunan kadar sitokrom P-

450 dalam eritrosit, namun demikian penurunan kelompok perlakuan tetaplah

lebih tinggi. Hasil analisa statistik juga memperkuat bahwa penurunan kadar

sitokrom pada kelompok yang diberi konsumsi minuman bubuk kakao bebas

lemak berbeda nyata antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol setelah

intervensi selama 25 hari. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa konsumsi

minuman bubuk kakao bebas lemak dapat menurunkan kadar sitokrom P-450

pada sel seritrosit darah manusia. Hasil penelitian ini juga menunjang hasil

penelitian serupa lainnya. Nugrahenny (2003) menyatakan bahwa tikus percobaan

yang diberi konsumsi minuman ekstrak cincau hijau selama 8 minggu secara

nyata memiliki rata-rata kadar sitokrom lebih rendah dibandingkan dengan

kelompok kontrol yang tidak diberi konsumsi minuman ekstrak cincau hijau.

Cincau hijau memiliki komponen bioaktif antara lain karotenoid, flavonoid,

polifenol yang termasuk dalam gugus fenolik.

Aktivitas enzim detoksifikasi sitokrom P-450 pada plasma

Selain untuk melihat pengaruh konsumsi minuman bubuk kakao bebas

lemak terhadap kadar sitokrom P-450 pada sel eritrosit, penelitian ini juga ingin

melihat pengaruh yang sama pada plasma darah manusia yang telah

mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak. Plasma merupakan suatu

komponen darah yang encer yang terdiri dari elekrolit, zat-zat makanan,

metabolit, protein, vitamin, elemen pelacak dan hormon. Plasma mengandung

banyak sekali ion, molekul anorganik, organik yang sedang diangkut ke berbagai

bagian tubuh atau membantu transpor zat-zat lain (Ganong, 2000).

Reaksi-reaksi fase satu meliputi monooksigenasi mikrosom, oksidasi

mitokondria dan sitosol, kooksidasi dalam reaksi sintesis prostaglandin, reduksi,

hidrolisis dan hidrasi epoksida. Semua reaksi pada fase satu menghasilkan

metabolit atau merubah toksikan menjadi lebih polar sehingga dapat dikonjugasi

dalam reaksi-reaksi fase dua dan mudah diekresikan baik secara langsung maupun

tidak langsung setelah mengalami reaksi fase satu (Hodgoson & Levi, 2000).

Lebih lanjut, Donatus (2001) menjelaskan bahwa fungsi utama reaksi

metabolisme fase I adalah mengubah struktur senyawa asing melalui proses

oksidasi, reduksi atau hidrolisis, guna memasukkan gugus fungsional yang sesuai

bagi reaksi konjugasi fase II. Enzim yang berperan penting dan terlibat paling

dominan pada reaksi fase I adalah enzim monoksigenase sitokrom P-450. Pada

penelitian ini dapat diketahui bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas

lemak selama 25 hari secara nyata dapat menurunkan kadar sitokrom P-450 pada

plasma darah.

Sitokrom P-450 merupakan salah satu enzim oksidatif, yang bisa

menghasilkan radikal bebas dalam tubuh. Untuk itu perlu dilakukan berbagai

upaya untuk menghambat kerjanya. Charpentier dan Cateora (1996) menyatakan

salah satu mekanisme yang dapat dilakukan oleh suatu antioksidan dalam

melindungi tubuh yaitu dengan menghambat enzim oksidatif, misalnya sitokrom

P-450. Penghambatan reaksi radikal bebas akan melidungi hepatosit normal dari

kerusakan dan mengoptimalkan lingkungan bagi sel-sel hati untuk bergenerasi.

Menurut Shahidi (1997), antioksidan diketahui bekerja pada berbagai tahapan

oksidasi molekul lemak, yaitu dengan cara menurunkan kadar oksigen,

menangkap singlet oksigen, pencegahan tahap inisiasi reaksi rantai melalui

penangkapan radikal hidroksil, pengikatan ion logam katalisator, dekomposisi

produk utama menjadi senyawa non radikal dan pemutusan reaksi rantai untuk

mencegah kelanjutan penarikan elektron dari substrat.

Gambar 14 Grafik kadar sitokrom P-450 pada plasma kelompok perlakuan sebelum dan sesudah intervensi

Gambar 15 Grafik kadar sitokrom P-450 pada plasma kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi



00.5

11.5

22.5

33.5

44.5

K1 K2 K3 K4 K6 K7 K8 K9

Responden

Kad

ar S

itokr

om P

-450

(n

mol

/mg

prot

ein)


00.5

11.5

22.5

33.5

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

Responden

Kad

ar S

itokr

om P

-450

(n

mol

/mg

prot

ein)


Gambar 14 dan 15 menunjukkan grafik kadar sitokrom P-450 pada plasma

kelompok perlakuan dan kontrol baik sebelum dan sesudah intervensi. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa terjadi penurunan kadar sitokrom P-450 baik pada

kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol. Rata-rata kadar sitokrom

kelompok perlakuan sebelum intervensi adalah 2,11 nmol/ mg protein dan

kelompok kontrol 2,09 nmol/ mg protein. Setelah menjalani intervensi selama 25

hari, kadar sitokrom menjadi 0,78 nmol/ mg protein untuk kelompok perlakuan

dan 1,61 nmol/ mg protein untuk kelompok kontrol. Hal tersebut menunjukkan

bahwa terjadi penurunan kadar sitokrom baik pada kelompok perlakuan maupun

pada kelompok kontrol. Rata-rata penurunan kadar sitokrom plasma pada

kelompok perlakuan adalah sebesar 1,32 nmol/ mg protein sedangkan pada

kelompok kontrol rata-rata penurunannya dalah sebesar 0,49 nmol/ mg protein.

Meskipun demikian setelah diuji secara statistik menggunakan uji t, menunjukkan

adanya perbedaan nyata penurunan kadar sitokrom antara kelompok perlakuan

dan kelompok kontrol. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa konsumsi

minuman bubuk kakao bebas lemak dapat menurunkan kadar sitokrom P-450

pada plasma darah

Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa penurunan kadar sitokrom P-

450 pada plasma mengindikasikan tidak memicu terjadinya reaksi oksidasi yang

dapat menghasilkan radikal bebas yang reaktif dan mungkin tidak menghasilkan

senyawa elektrofil. Menurut Guengerich (1997), beberapa intermediet yang

dihasilkan dari rekasi oksidasi fase I bersifat elektrofilik yang dapat bereaksi

dengan sisi nukleofilik pada makromolekul seperti DNA, RNA dan protein.

Dengan demikian minuman bubuk kakao bebas lemak bisa dikatakan bersifat

chemopreventif seperti halnya mekanisme chemopreventif dari isotiosianat yaitu

isotiosianat mampu menghambat enzim spesifik sitokrom P-450 dan

meningkatkatkan kerja enzim fase II, seperti glutation S-transferase dan quinon

reduktase (Guengerich, 1997).

Meskipun demikian penurunan kadar sitokrom P-450 pada plasma darah

ini tidaklah boleh dikatakan semata-mata disebabkan oleh konsumsi minuman

bubuk kakao bebas lemak yang diberikan terhadap responden selama 25 hari

intervensi. Hal ini dikarenakan hasil penelitian menunjukkan bahwa juga terjadi

penurunan kadar sitokrom plasma pada kelompok kontrol yang tidak diberi

perlakuan konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak. Walaupun setelah uji

statistik uji t menunjukkan penurunan pada kelompok kontrol tidak berbeda nyata

seperti halnya di kelompok perlakuan. Penurunan ini diduga salah satunya

disebabkan oleh pola makan responden selama menjalani intervensi. Dimana

umumnya pola makan responden menjadi lebih baik selama intervensi

berlangsung dibandingkan dengan pola makan mereka biasanya yang cenderung

tidak teratur. Selain itu selama intervensi berlangsung responden juga mengurangi

berbagai konsumsi makanan terutama jajanan di luar yang diberikan oleh peneliti.

Hal ini dilakukan untuk menghindari adanya bahan makanan lain yang dapat

mempengaruhi kerja dari komponen bioaktif flavonoid pada minuman bubuk

kakao bebas lemak yang diberikan juga untuk menghindari masuknya berbagai

senyawa xenobiotik dalam tubuh.

Salah satu faktor yang dapat mempengaruhi kemampuan metabolisme

xenobiotik dalam hati adalah komposisi makanan. Susunan makanan yang utama

meliputi protein, lemak dan karbohidrat. Diet atau ransum dengan protein rendah

telah terbukti mampu menurunkan kapasitas metabolisme mikrosomal terhadap

beberapa obat pada tikus (Donatus, 2001). Suprapto (2002) menyatakan bahwa

kebiasaan makan makanan dengan kadar lemak tinggi dan mengandung bahan

tambahan kimia seperti daging yang diberi ”warna” senyawa nitrit dapat berakibat

buruk terhadap kesehatan. Penelitian lain juga menyebutkan bahwa responden

yang sering mengkonsumsi minuman beralkohol terbukti dapat meningkatkan

aktivitas enzim oksidatif sitokrom P-450 pada darah manusia (Raucy, 1997). Hal

tersebut tentu saja semakin memicu pembentukan senyawa radikal bebas yang

berbahaya dalam tubuh manusia. Pengaruh buruk dari bahan tambahan kimia yang

ada dalam makanan pada umumnya tejadi melalui pengaktifan enzim fase I

(misalnya sitokrom P-450) yang menghasilkan DNA cacat. Bila gen yang cacat

ini terbawa sel ”anakan” dan tidak bisa diperbaiki maka dapat menginisiasi

terjadinya kanker.

Kakao mengandung senyawa flavonoid golongan flavanol, yang

memberikan efek yang menguntungkan bagi tubuh. Selain itu juga bisa

mengurangi resiko mortalitas dan morbiditas kardiovaskuler, kanker dan

osteoporosis dan bisa mencegah penyakit neurodegeneratif serta diabetes militus.

Pada manusia, bioavailabilitas flavonoid berkisar antara 1-26 %. Pada tubuh kita

flavonoid akan bersikulasi dalam plasma, terdapat sebagai glucuronide, methyl

dan sulfat konjugat atau kombinasi dari ketiganya yang merupakan hasil reaksi

enzim fase I dan fase II (Grassi et al 2006).

Hasil penelitian ini juga didukung oleh hasil penelitian Yuliatmoko

(2007) yang menyebutkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak

setelah 25 hari secara nyata dapat menurunkan kadar MDA pada plasma darah.

Reaksi tidak terkendali radikal bebas terhadap komponen sel seperti asam lemak

tidak jenuh ganda (PUFA), heksosa, pentosa, asam amino dan komponen DNA

menghasilkan beberapa produk seperti: Malonaldehida atau MDA, diena

terkonjugasi, dikarbonil dan asam 15-hidroperoksi-5,8,4,13 eikosatetraenoik (15-

HPETE). MDA merupakan melekul dialdehid yang mempunyai tiga atom karbon

dan bersifat reaktif (Rice-Evan et al. 1991; Zaden et al. 1995). Penelitian ini juga

didukung oleh penelitian-penelitian sebelumnya yang bertujuan menggali potensi

tanaman yang memiliki komponen bioaktif. Diantaranya adalah yang telah

dilakukan oleh Handerson et al (2000) yang membuktikan bahwa ekstrak

flavonoid dari buah hop (Humulus Lupulus) telah terbukti mampu menghambat

aktivitas enzim sitokrom P-450 pada manusia. Lebih lanjut juga disebutkan bahwa

Injeksi ekstrak bawang putih pada konsentrasi 100 mmol/ L terhadap 6

mikrosomal liver manusia secara invitro telah terbukti signifikan mampu

menghambat kerja enzim sitokrom P-450 hingga 50% (Greenbat et al 2006).

Najima et al (2006) juga telah membuktikan bahwa konsumsi isoflavon pada

responden 7 orang sehat di Jepang dengan dosis 60mg/ hari selama 5 hari

menunjukkan pengaruh yang positif pada plasma. Dimana, isoflavon golongan

daidzein, genistein, and glycitein terbukti mampu mengahambat aktivitas sitokrom

P-450 pada plasma. Penurunan terjadi dari 8,8±2,6 menjadi 6,7±1,6. Dalam

penelitian lain juga disebutkan bahwa bahwa senyawa flavonoid golongan flavon

jenis: 3-hydroxyflavone, 5-hydroxyflavone, 7-hydroxyflavone, 3,7-

dihydroxyflavone, dan 3,5,7-trihydroxyflavone (galangin) telah terbukti secara

nyata mampu menurunkan aktivitas senzim sitokrom P-450 pada sel limfosit

manusia (Zai et al, 1998).

Penurunan kadar sitokrom P-450 pada plasma darah ini juga didukung

dengan hasil penelitian terhadap kadar sitokrom P-450 pada sel eritrosit. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak

dapat menurunkan secara nyata kadar sitokrom P-450 pada sel darah eritrosit,

meskipun penurunan secara tidak nyata juga tampak pada kelompok kontrolnya.

Dengan demikian bisa kita katakan bahwa pemberian minuman bubuk kakao

bebas lemak pada responden selama 25 hari bisa menghambat kerja enzim

oksidatif sitokrom P-450 pada plasma maupun pada sel eritrosit darah manusia

tentunya diimbangi dengan pola makan yang baik pula. Hal tersebut berimplikasi

dapat menekan produksi radikal bebas dalam tubuh.

Beberapa penelitian lainnya yang juga telah membuktikan tentang potensi

bahan-bahan alami dalam menghambat kerja dari enzim oksidatif sitokrom P-450.

Salah satunya NCCAM (2004) menginformasikan bahwa pemberian suplemen

yang terdiri dari ekstrak katekin teh hijau (bebas kafein) sebesar 211±25 mg telah

terbukti mampu menurunkan aktivitas enzim sitokrom P-450 pada plasma darah

11 orang responden selama 14 hari intervensi. Akan tetapi penurunan ini tidak

signifikan secara statistik (p>0,05). Lebih lanjut Obach (2000) telah membuktikan

bahwa kandungan flavonoid yang berupa I3,II8-biapigenin pada bunga jenis

Hypericum perforatum telah terbukti mampu menghambat aktivitas enzim

sitokrom P-450 pada manusia. St. Johns wort Hypericum perforatum merupakan

jenis tanaman herba yang terdapat di wilayah Eropa dan Amerika Utara yang

lebih popular dengan sebutan St Jhon’s wort. Tanaman ini memiliki komponen

bioktif I3,II8-biapigenin, chloregenic acid, quercetin, hyperforin, hypericin.

Aktivitas enzim detoksifikasi glutation S-transferase pada eritrosit

Sistem detoksifikasi senyawa-senyawa xenobiotik melibatkan dua reaksi

yaitu reaksi Fase I dan reaksi Fase II. Pada fase satu, toksikan bersifat lipofilik

akan ditransformasikan oleh enzim-enzim fase satu (monoksigenase) menjadi

senyawa-senyawa metabolit yang bersifat polarreaktif grup. Pada fase dua,

metabolit yang terbentuk akan dikonjugasikan oleh enzim-enzim fase dua

(konjugasi) sehingga dihasilkan senyawa yang bersifat hidrofilik dan mudah

diekresikan ke luar tubuh. Namun jika metabolisme senyawa xenobiotik

menghasilkan produk yang reaktif, maka akan menimbulkan efek toksik bagi

tubuh (Hodgoson & Levi, 2000).

Pada penelitian ini juga bertujuan untuk melihat bagimana pengaruh

konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak terhadap aktivitas enzim

detoksifikasi fase II yaitu glutation S-transferase yang selanjutnya disebut sebagai

GST. Dari segi toksikologi, reaksi fase II sangat penting karena seringkali terlibat

dalam penghilangan zat atau metabolit perantara yang reaktif, yang bersifat

elektrofil. Berlangsungnya reaksi ini dikatalisir oleh enzim glutation S-transferase.

Kofaktor yang diperlukan untuk reaksi ini adalah glutation tri pepetida (GSH)

yang tersusun dari glisin, asam glutamat dan sistein. Konjugasi glutation

berlangsung dengan cara pengikatan karbon elektrofil yang ada pada substrat oleh

gugus sulfihidril nukleofil yang ada pada glutation (Donatus, 2001). Enzim fase II

merupakan sistem enzim konjugasi. Sebagai contoh dalam proses metabolisme

BHT, kecukupan sistem enzim konjugasi glutation sangat kritikal dalam

menentukan apakah metabolit yang dihasilkan dapat dikeluarkan dari dalam tubuh

atau akan diubah menjadi senyawa elektrofil dan senyawa radikal (Zakaria, 2001).

Kadar GST ditentukan dengan menggunakan metode Habig et al yaitu

dengan menggunakan substrat CDNB (1-kloro-2,4-dinitrobenzene) dan Glutation

dalam bentuk tereduksi (GSH). Analisis ini dengan menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm. Hasil pengukuran absorbansi

pada spektrofotometer ini merupakan hasil konjugasi dari GSH dan CDNB

melalui reaksi pada gambra 16 berikut:

Gambar 16 Reaksi GSH dan CDNB

Lebih lanjut Habig et al (1974) menjelaskan bahwa untuk tujuan analisis

terdapat bermacam substrat bagi glutation s-transferase yang dapat digunakan,

yaitu 1-clhoro-2,4-dinitrobenzene, 1,2-dichloro -4-nitrobenzene, p-nitrobenzyl

chloride, 4-nytropiridine-N-oxide, 1,2-epoxy-3-(p-nitrophenox) propane, 1,2-

naphtalene oxide, iodomethane, 1-menapthyl sulfat, trans-4-phenyl 3-buten-2-one,

p-nitrophenetyl bromide, dan bromosulfophthalein.


glutation S-transferase pada eritrosit kelompok perlakuan sebelum intervensi

adalah sebesar 0,083 nmol/ min/ mg protein sedangkan kelompok kontrol rata-rata

aktivitas enzim glutation S-transferase sebelum intervensi adalah sebesar 0,0825

nmol/ min/ mg protein. Setelah intervensi berlangsung selama 25 hari,

pengukuran rata-rata aktivitas GST eristrosit pada kelompok perlakuan adalah

sebesar 0,217 nmol/ mg protein sedangkan kelompok kontrol menjadi 0,110 nmol/

min/ mg protein. Ini menunjukkan bahwa terjadi peningkatan aktivitas GST

eritrosit baik pada kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol. Namun

demikian rata-rata peningkatan aktivitas GST eritrosit pada kelompok perlakuan

lebih besar (0,134 nmol/ min/ mg protein) dibandingkan kelompok kontrol yang

rata-rata peningkatannya hanya sebesar 0,03 nmol/ min/ mg protein. Hal tersebut

diperkuat dengan analisa statistik menggunakan uji t, dimana terjadi peningkatan

aktivitas GST secara nyata (p < 0,05) setelah kelompok perlakuan mengkonsumsi

minuman bubuk kakao bebas lemak selama 25 hari. Sedangkan peningkatan

aktivitas GST eritrosit yang trjadi pada kelompok kontrol tidak berbeda nyata (p >

0,05) setelah 25 hari. Data hasil penelitian disajikan dalam gambar berikut.

Gambar 17 Grafik aktivitas enzim glutation S-transferase (GST) pada eritrosit

kelompok perlakuan sebelum dan sesudah intervensi

Gambar 18 Grafik aktivitas enzim glutation S-transferase (GST) pada eritrosit kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi

Peningkatan aktivitas enzim glutation S-transferase diduga karena efek

antioksidatif dari senyawa flavonoid pada minuman bubuk kakao bebas lemak

yang dikonsumsi oleh responden selama 25 hari. Gutteridge dan Halliwell (1998)

menyebutkan bahwa flavonoid memiliki kemampuan dalam menghambat

peroksidasi lipid, ROS, menghambat kerusakan oleh haem protein atau adanya

peroksida, binding ion metal dan menghambat lipoksigenase dan enzim

cyclooxygenase. Hasil penelitian ini didukung pula oleh hasil penelitian Erniati

Rata-rata peningkatan = 0,0134 nmol/min/mg protein


00.05

0.10.15

0.20.25

0.3

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

Responden

Kada

r GS

T (n

mol

/ min

/ mg

prot

ein)


0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

K1 K2 K3 K4 K6 K7 K8

Responden

Kad

ar G

ST

(nm

ol/ m

in/ m

g pr

otei

n)



selama 25 hari terhadap 9 orang responden telah terbukti secara nyata dapat

meningkatkan kadar glutation tereduksi (GSH) pada limfosit responden.

Keberadaan enzim glutation S-tranferase dan GSH dapat melindungi sel dari

bahaya elektrofilik yang reaktif ini sebelum bereaksi dengan sisi nukleofilik dari

sel. Glutation dalam bentuk tereduksi (GSH) merupakan substrat yang penting

untuk enzim-enzim antioksidan seperti glutation S-transferase dan glutation

peroksidase dalam menguraikan berbagai macam peroksida atau lipid peroksida

(Stone 1999).

Namun demikian peningkatan aktivitas enzim gluatation s-transferase ini

tidaklah bisa semata-mata disebut sebagai akibat dari flavonoid yang terdapat

pada minuman bubuk kakao bebas lemak semata. Hal ini dikarenakan, meski

secara tidak nyata setelah 25 hari intervensi, aktivitas enzim GST pada kelompok

kontrol juga mengalami peningkatan. Peningkatan aktivitas GST yang terjadi

juga pada kelompok kontrol ini diduga karena meningkatnya asupan gizi dan

membaiknya pola makan responden selama penelitian berlangsung. Kirlin et al

(1999) menyebutkan bahwa makanan merupakan hal yang paling berperan dalam

menginduksi enzim detoksifikasi. Lebih lanjut ia menjelaskan bahwa makanan-

makanan yang dapat menginduksi enzim detoksifikasi adalah beberapa famili

sayuran seperti cruciferae (brokoli, sawi, kubis, kale, kembang kol), leuguminose

(buncis), umbelliferae (wortel, seledri), zingiberaceae (jahe), liliaceae (asparagus)

dan chenopodiceae (bayam).

Dari hasil pengukuran aktivitas enzim glutation S-transferase dapat

diketahui bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak dapat

meningkatkan aktivitas enzim ini. Peningkatan aktivitas enzim ini berhubungan

dengan aktivitas enzim sitokrom P-450, dimana telah terjadi penurunan kadar

sitokrom P-450 secara nyata dalam eritrosit responden yang mengkonsumsi

minuman bubuk kakao bebas lemak selama 25 hari, ini menunjukkan bahwa

konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak dapat menurunkannya produksi

radikal bebas dalam tubuh. Sehingga enzim glutation S-transferase yang ada

mampu mengurus intermediet yang dihasilkan, akibatnya terdapat sisa GST yang

tidak terpakai. Sisa GST yang tidak terpakai ini dapat digunakan untuk proses

detoksifikasi berikutnya. Menurut Kirlin et al ( 1999) Induksi enzim detoksifikasi

glutation S-transferase merupakan mekanisme pertahanan terhadap kanker.

Prinsipnya peningkatan enzim GST dapat mereduksi karsinogenesis melalui

penguatan pembuangan elektrofil reaktif. Lebih lanjut Donatus (2001)

menjelaskan bahwa intermediet yang bersifat elektrofilik dan reaktif dapat

membahayakan komponen seluler yang penting.

Penelitian lainnya juga telah banyak dilakukan untuk menggali potensi

flavonoid dalam meningkatkan kerja enzim glutation S-transferase, salah satunya

telah dibuktikan oleh Uhl (2002) yang menyebutkan bahwa pemberian chrysin

(dosis 5-10 μg/ ml) sebagai kemopreventif mampu menekan aktivitas enzim

sitokrom P-450 dan meningkatkan aktivitas GST pada sel hepatoma (HepG2)

manusia. Chrysin merupakan komponen biokatif golongan flavonoid yang banyak

terdapat pada buah, sayur dan mampu. Senyawa ini diduga kuat memiliki potensi

sebagai anti kanker dan tumor. Selanjutnya Patel (2005) juga telah membuktikan

bahwa konsumsi buah berry setiap hari terbukti mampu meningkatkan enzim

Glutation S-transferase responden laki-laki maupun perempuan. Pada tahun yang

sama telah dibuktikan bahwa 15 gram ekstrak teh hijau yang diseduh dalam 1 liter

air panas telah terbukti mampu meningkatkan aktivitas enzim Glutaion S-

transferase sebesar 26 % pada hati tikus yang mengkonsumsinya selama 18 hari

(El-Beshbishy, 2005).

Aktivitas enzim detoksifikasi glutation S-transferase (GST) pada plasma

Glutation s-transferase adalah famili multi gen suatu protein multi fungsi

yang mempunyai bentuk dimmer dan diyakini memegang peranan penting dan

utama dalam biosinstesis leukotrin tertentu, prostaglandin, katalis konjugasi

glutation (GSH) dengan pusat elektrofilik beragam senyawa (misalnya epoksida)

sebagai tahap pertama pembentukan asam merkapturat (Martono dan Supardjan,

2002). Enzim ini berperan penting pula dalam detoksifikasi, ditemukan dalam

fraksi sitosol. Dalam proses detoksifikasi suatu bahan obat elektrofilik dalam

tubuh ia berperan sebagai katalis pada reaksi antara glutation sebagai senyawa

nukleofil dengan senyawa-senyawa elektrofilik (Jann et al, 1995).

Analisis yang dilakukan dengan menggunakan prinsip bahwa glutation

dapat berkonjugasi dengan 1-kloro- 2,4-dinitrobenzene (CDNB) dengan adanya

katalis enzim glutation S-transferase dan menghasilkan produk yang dapat diukur

secara spektrofotometri (Habig et al, 1974). Lebih lanjut Murray et al (1999)

menjelaskan bahwa sejumlah xenobiotik elektrofilik yang berpotensi beracun

akan terkonjugasi dengan glutation nukleofilik dalam reaksi berikut:

R + GSHO R – S - G

Dimana R adalah xenobiotik elektrofilik. Jika xenobiotik yang potensial beracun

tidak terkonjugasi maka molekulnya akan berada dalam keadaan bebas yang

membentuk ikatan kovalen dengan DNA, RNA atau protein sel dengan demikian

dapat mengakibatkan kerusakan sel yang serius.

Aktivitas GST mempengaruhi tingkat toksisitas karena dengan semakin

rendahnya aktivitas GST, semakin sulit metabolit hasil reaksi fase I

dikonjugasikan dan kemungkinan besar metabolit radikal tersebut bereaksi

terlebih dahulu dengan makromolekul seperti protein, DNA, RNA sehingga

menimbulkan toksik pada tubuh (Hodgoson & Levi, 2000).

Hasil penelitian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa pengukuran

rata-rata aktivitas enzim glutation S-transferase pada plasma kelompok perlakuan

sebelum intervensi adalah sebesar 0,129 nmol/ min/ mg protein sedangkan

kelompok kontrol rata-rata aktivitas enzim glutation S-transferase sebelum

intervensi adalah sebesar 0,126 nmol/ min/ mg protein. Setelah intervensi

berlangsung selama 25 hari, pengukuran rata-rata aktivitas GST plasma pada

kelompok perlakuan adalah sebesar 0,293 nmol/ min/ mg protein sedangkan

kelompok kontrol menjadi 0,172 nmol/ min/ mg protein. Ini menunjukkan bahwa

terjadi peningkatan aktivitas GST plasma baik pada kelompok perlakuan maupun

kelompok kontrol. Namun demikian rata-rata peningkatan aktivitas GST plasma

pada kelompok perlakuan lebih besar (0,164 nmol/ min/ mg protein) dibandingkan

kelompok kontrol yang rata-rata peningkatannya hanya sebesar 0,046 nmol/ min/

mg protein. Hal tersebut diperkuat dengan analisa statistik menggunakan uji t,

dimana terjadi peningkatan aktivitas GST plasma darah secara nyata (p < 0,05)

setelah kelompok perlakuan mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak

selama 25 hari. Sedangkan peningkatan aktivitas GST plasma darah yang terjadi

pada kelompok kontrol tidak berbeda nyata (p > 0,05) setelah 25 hari. Untuk lebih

jelasnya dapat dilihat pada grafik berikut.

Gambar 19 Grafik aktivitas enzim glutation S-transferase (GST) pada plasma

kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi

Gambar 20 Grafik aktivitas enzim glutation S-transferase (GST) pada plasma

kelompok kontrol sebelum dan sesudah intervensi



00.05

0.10.15

0.2

0.250.3

0.350.4

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

Responden

Kada

r GST

(n

mol

/ min

/ mg

prot

ein)


0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

K1 K2 K3 K4 K6 K7 K8 K9

Responden

Kad

ar G

ST

(n

mol

/ min

/ mg

prot

ein)


Peningkatan aktivitas enzim glutation S-transferase ini menunjukkan

bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak selama 25 hari pada

responden memberikan efek yang positif bagi kerja enzim di fase II. Hal ini

menunjukkan bahwa GST mampu mengurus instermediet yang dihasilkan selama

proses detoksifikasi, akibatnya terdapat sisa GST yang tidak terpakai. Sisa GST

yang tidak terpakai ini dapat digunakan untuk proses detoksifikasi berikutnya.

Hodgoson dan Levi (2000) menjelaskan bahwa mekanisme konjugasi terhadap

metabolit radikal yang reaktif yang dihasilkan dari reaksi fase I merupakan reaksi

eliminasi yang cepat dan merupakan inaktivasi senyawa-senyawa yang berpotensi

toksik. Toksisitas seluler merupakan suatu keseimbangan fungsi laju pembentukan

metabolit radikal terhadap biotransformasinya sehingga akhirnya dapat

dikeluarkan dari dalam tubuh. Penurunan aktivias GST merupakan gejala dimana

telah terjadi ketidakseimbangan pembentukan metabolit radikal terhadap reaksi

eliminasinya. Hal ini disebabkan tingginya metabolit radikal yang terbentuk dan

strukturnya yang tidak mampu dikonjugasikan secara sempurna oleh GST.

Metabolit radikal bebas yang tidak terkonjugasikan tadi akhirnya dapat berikatan

dengan makromolekul seperti protein, polipeptida, RNA dan DNA yang

merupakan pemicu berbagai proses toksik seperti mutagenesis, karsinogenesis,

dan nekrosis seluler.

Hasil penelitian ini juga didukung dengan hasil penelitian Yuliatmoko


dapat secara nyata meningkatkan aktivitas antiradikal bebas pada plasma darah

responden. Radikal bebas dapat menyebabkan stres oksidatif. Stress oksidatif

merupakan keadaan ketidakseimbangan antara reaktif oxygen species (ROS) /

reaktif nitrogen species (RNS) dan antioksidan (Halliwell & Gutteridge 2001).

Jika radikal bebas berada dalam jumlah berlebihan dan jumlah antioksidan seluler

tetap atau lebih sedikit maka kelebihannya tidak bisa dinetralkan dan berakibat

pada kerusakan sel ( Langseth 1995; Palmer & Paulson 1997). Efek radikal bebas

dapat dinetralisir oleh antioksidan yang diproduksi oleh tubuh dalam jumlah yang

berimbang. Antioksidan merupakan senyawa yang dapat melindungi sistem

biologis tubuh melawan efek-efek yang potensial dari proses atau reaksi yang

dapat menyebabkan oksidasi berlebihan (Papas 1991).

Plasma adalah suatu larutan encer yang terdiri atas elektrolit, zat-zat

makanan, metabolit, protein, vitamin, elemen pelacak dan hormon. Plasma

mengandung banyak sekali ion, molekul anorganik, organik yang sedang diangkut

ke berbagai bagian tubuh atau membantu transpor zat-zat lain (Ganong 2000).

Darah menyalurkan flavonoid ke jaringan-jaringan tubuh. Apabila terdapat dalam

plasma, aglikon dapat memasuki jaringan perifer dengan difusi pasif atau

terfasilitasi. Konjugat glukoronida perlu disalurkan ke dalam jaringan perifer

karena senyawa tersebut bersifat hidrofilik dan berdifusi melewati membran

dengan lambat. Untuk dekonjugasi dalam jaringan, banyak sel memiliki aktivitas

β-Glukoronidase dalam fraksi lisosom dan lumen dalam retikulum endoplasma

(Meskin et al 2004).

Berbagai penelitian serupa juga menyebutkan bahwa beberapa tanaman

yang berpotensi sebagai antioksidan telah terbukti dapat meningkatkan kerja

enzim fase II pada proses detoksifikasi. Dalam suatu penelitian disebutkan bahwa

ekstrak tanaman widuri yang mengandung senyawa flavonoid jenis sylimarin

terbukti mampu meningkatkan aktivitas enzim fase II: glutation S-transferase dan

quinone reduktase pada liver, paru-paru dan kulit tikus percobaan dengan dosis

100-200 mg/ hari (Zao dan Agrawall 1999). (Sztanke dan Pasternak (2006) dalam

ringkasannya menyebutkan bahwa senyawa astaxanthin dan canthaxanthin

terbukti mampu meningkatkan kerja enzim fase II NAD(P)H: quinon reduktase

yang mana enzim ini sangat vital dalam proses detoksifikasi senyawa karsinogen.

Lebih lanjut dikemukakan bahwa brokoli, sawi, dan kembang kol telah terbukti

juga mampu meningkatkan kerja enzim fase II.

Namun demikian, dalam penelitian ini tidak bisa disimpulkan bahwa

peningaktan aktiviatas enzim fase II dalam hal ini glutation S-transferase semata-

mata hanya disebabkan oleh konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak yang

diberikan terhadap responden selama intervensi berlangsung. Hal tersebut

dikarenakan pada kelompok kontrol hasil penelitian juga menunjukkan adanya

peningkatan aktivitas GST pada plasma darah responden yang tidak

mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak selama intervensi yang

berlangsung 25 hari tersebut. Ini diduga karena responden mengalami perbaikan

dalam menu makan juga pola makannya dibandingakan dengan kebiasaan mereka

sebelumnya. Pada saat intervensi berlangsung, pola makan dan menu makan dari

responden menjadi perhatian penting, hal ini dilakukan untuk mendapatkan

kondisi yang seseragam mungkin sehingga bias yang besar bisa dihindari

semaksimal mungkin. Selama intervensi berlangsung, responden mendapatkan

menu makan yang terdiri dari karbohidrat, lemak, protein serta serat yang cukup.

Zakaria (2004) menyebutkan bahwa sayur, buah dan beberapa komponen bioaktif

yang terdapat pada tanaman seperti flavonoid, klorofil, antosianin, karetonoid,

terpenpoid, isothiosianat mampu menekan produksi radikal bebas dalam tubuh

sehingga mampu menekan resiko terserang penyakit degeneratif seperti kanker,

jantung koroner, stroke, diabetes dan penyakit degeneratif lainya. Seperti yang

telah dibuktikan oleh Semiz dan Sen (2007) bahwa buah semangka mentah

mampu meningkatkan aktivitas enzim GST sampai 50% pada liver, ginjal dan

paru-paru tikus, juga menurunkan aktivitas enzim sitokrom P-450. Tanaman

semangka mentah tersebut diberikan selama 16 hari dengan dosis 200 mg/ kg

berat badan setiap 4 hari sekali. Tanaman semangaka komponen bioaktif berupa

triterpen, pistein dan steroid. Selain faktor makanan, faktor lainnya yang penting

adalah pola makan, status gizi, pencemaran makanan (akibat bahan tambahan

kimia), udara, sinar matahari (UV) dan juga gaya hidup seseorang.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak setiap hari selama 25 hari

berpengaruh nyata dalam meningkatkan aktiviats enzim antioksidan katalase baik

pada eritrosit maupun plasma darah reponden. Dengan demikian dapat

disimpulkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak dapat

meningkatkan sistem pertahanan tubuh secara enzimatis dari serangan radikal

bebas.

Konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak juga dapat menurunkan

aktivitas enzim detoksifikasi yang bersifat oksidatif yaitu enzim sitokrom P-450

baik pada eritrosit maupun plasma darah reponden. Selain itu konsumsi minuman

bubuk kakao bebas lemak dapat meningkatkan aktivitas enzim detoksifikasi

glutation S-transferase pada eritrosit maupun plasma darah responden. Kedua hal

tersebut mengindikasikan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak

dapat memberikan dampak yang positif bagi kerja enzim detoksifikasi dalam

mengeluarkan senyawa asing yang toksik sehingga menekan jumlah radikal bebas

dalam tubuh.

Dengan meningkatnya sistem pertahanan tubuh secara enzimatis dan

meningkatnya kinerja enzim detoksifikasi, maka secara umum dapat dikatakan

bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak dapat berkontribusi dalam

meningkatkan kesehatan manusia.

Saran

Konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak telah terbukti mampu

meningkatkan aktivitas salah satu enzim antioksidan katalase, sehingga perlu

dilakukan penelitian lanjutan tentang pengaruhnya terhadap enzim antioksidan

yang lain seperti superoksida dismutase (SOD) dan glutation peroksidase (GPx).

Metabolisme senyawa asing dalam tubuh (detoksifikasi) melibatkan banyak enzim

dalam prosesnya, sehingga perlu adanya penelitian lanjutan tentang pengaruh

konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak terhadap kerja enzim-enzim

detoksifikasi lainnya seperti flavin containing monooksigenase, prostaglandin

synthetase cooxidase, molibdenum hidroxylase, metyl transferase, quinon

reduktase dan lain-lain. Dengan demikian benar-benar bisa dibuktikan bahwa

konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak dapat berkontribusi positif bagi

sistem pertahanan tubuh dari serangan radikal bebas yang berbahaya. Selain itu

perlu juga dilakukan penelitian lanjutan terhadap peranan enzim glutation S-

transferase dalam menangkap senyawa xenobiotik lainnya sehingga bisa

membuktikan peranan flavonoid pada minuman bubuk kakao bebas lemak dalam

system detoksifikasi.

Penelitian ini melibatkan responden perempuan dalam kondisi sehat,

sehingga perlu adanya penelitian lebih lanjut terhadap responden dengan kondisi

kesehatan dibawah normal (menderita penyakit tertentu), sehingga bisa dilihat

bagaimana pengaruh konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak terhadap

manusia dengan kondisi tubuh dalam keadaan sakit.

Mengingat konsumsi minuman bubuk kakao dapat meningkatkan sistem

pertahanan tubuh secara enzimatis dan juga berpengaruh positif terhadap sistem

detoksifikasi, maka perlu diinformasikan kepada masyarakat bahwa

mengkonsumsi minuman bubuk kakao bermanfaat bagi kesehatan.

Dafar Pustaka

Andersen OM, Markham KR. 2006. Flavonoids: chemistry, biochemistry, applications. CRC Press. New York

Amri, E. 2007. Pengaruh konsumsi minuman bubuk kakao lindak bebas lemak

terhadap sifat antioksidatif eritrosit manusia. [tesis]. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Arisudana, IG. 2003. Pengaruh bubuk cincau hijau (Cyclea barbarata L. Miers

dan Premna oblongifera Merr) [skripsi]. Fateta. Institut Pertanian Bogor. Bogor

Auroma OI. 1997. Assesment of potencial prooxidant and antioxidant actions. J

Am Oil Chem Soc 73 (12): 1617-1625 Benson, DE, Huslick KS, Sligar SG. 1996. Reduced oxygen intermediate

observed in D251 N cytochrome P-450. J Biol Chem 36: 5104-5107 Bird RP, Draper HH. 1984. Methods enzymol. CRC Press. New York Blaaubeoer, BM. 1996. Toxicology: principles and aplications. CRC Press Inc.

New York Chalid SY. 2004. Pengaruh ekstrak daun cincau hijau terhadap aktivitas enzim

antioksidan dan pertumbuhan tumor kelenjar susu mencit [tesis]. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Charpentier R, Cateora H. 1996. Turmeric; phytonutrient protection for variety of

physiological stress. Vitamin research product. Carson City, Nevada. http://www.rvp .com

Cheuvaux, Kati A., Schmitz, Harold H, Romanczyk, Leo J. 1999. Products

containing, polyphenol(s) and L-arginine to stimulate nicric oxide production. Mars, Incorporated WO/1999/045797

Cho SH, Jung-Gyo, Choi YS, Young SS, Hee CM. 1995. Lipid peroxidations and

(8)-hydroxideoxyguanosine formations in rats fed fish oil with different levels of vitamin E. J Nutr Scie Vit. 41: 61-72

Chocolate Information Center (CIC). 2001. Plyphenol explained. CIC News Cillard J, Cillard P, Cormier M. 1980. Effect of experimental factor on the

prooxidants behavior of tochoperol. J Am Oil Chem Soc 57: 255-261

Chipault JR, Mizuno GR, Hawkins JM, Lundberg WO. 1952. The antioxidant properties of natural spices. J Food Res 17:87-89.

Coscun O et al. 2004. Protective effects of quercetin, a flavonoid antioxidant, in

absolute ethanol-induced acut gastric ulcer. J Gen Med 1(3): 37-42 Donatus, IA. 2001. Toksikologi dasar. Laboratorium Farmakologi Toksikologi.

UGM. Yogyakarta Dragted LO et al. 2004. The 6-a-day study: effects of fruit and vegetables on

markers of oxidative stress and antioxidative defense in healthy non smokers. Am J Clin Nutr 79: 1060 –1072

Erniati. 2007. Efek konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak terhadap sifat

antioksidatif dan proliferativ limfosit manusia [tesis]. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor.

El-Beshbishy, HA. 2005. Hepatoprotective effect of green tea (Camellia sinensis)

extract, against tamoxifen-induced liver injury in rats. J Biochem Molec Biol 38 (05): 563-570

Fraga CG, Goretta LA, Ottaviani J, Carrasquedo F, Lotito S, Lazarus S, Schmitz

H, Keen CL. 2005. Regular consumption of flavanol rich chocolate can improve oxidant stress in young soccer players. J Clinic Dev Immun 12 (1): 11-17

Frankle EN dan Neff WE. 1983. Biochemistry. Biophys Acta 754: 264-270 Ganong WF. 2000. Buku ajar fisiologi kedokteran edisi bahasa indonesia. Editor:

M. Djauhari Widjajakusumah. Penerbit Buku Kedokteran: EGCG. Grassi D, Desideri D, Groce G, Pasqualetti P, Lippi C, Ferri C. 2006. Cocoa and

cardiovaskuler health. The sweet heart protection. Agr Food Ind Hi Tech 17 (01)

Gutteridge JMC, Halliwel B. 1996. Antioxidant in nutritions, health and disease.

Oxford University Press. New York Guengerich FP. 1991. Reactions and significance of cytochrome P-450 enzymes.

J Biol Chem 266 (16): 10019-10022 Habig WH, Pabst MJ, Jakoby WB. 1974. Glutahione S-transferase, the first

enzyme step in mercapturic acid formations. J Biol Chem 249 (22): 7130-7139

Hall C. 2001. Sources of natural antioxidants: oilseeds, nuts, cereals, legumes, animal products and microbial sources. Di dalam: Pokorny J, Yanishlieva N, Gordon M, editor. Antioxidants in food. Cambridge England: Woodhead Publishing Limited. hlm. 159-209.

Halliwell, Gutteridge. 1999. Free radical in biology and medicine. Oxford

University Press. Ed. 3. Hlm: 105-110 Hammerstone JF, Lazarus S, Mitchell. 1999. Identifications of pyrocianidins in

cocoa using HPLC. J Agr Food Chem 47: 490-496 Hammerstone JF, Lazarus SA, Schmitz HH. 2000. Procyanidin conten and

variation in some commonly consumed foods. J Nutr 130: 2086S-2092S. Hudson BJF. 1990. Food antioxidants. Elsivier Applied Sci. London Hodgoson E, Levi PE. 2000. A text book of modern toxicology. Ed. McGraw-Hill

Higher Education. Singapore. Jann, N, Commendaur, Gerald J. S, Nico PE. 1995. Enzyme and transport sistem

involved in the formation an disposition of glutathione S-conjugates. Pharmacol Rev 47 (2): 271-325

Jung UJ, Kim HJ, Lee JS, Lee KM, Park EJ, Jeong TS, Choi. 2003. Naringin

suplementation lowers plasma lipids and enhances erythrocyte antioxidant enzyme activities in hypercholesterolemic subjects. J Clinic Nutr 22(6): 561-568

Kahkonen MP, Hopia AL, Vuorela HJ. 1999. Antioxidant activity of plants

extracts containing phenolic compounds. J Agric Food Chem 47: 3954-3962 Karen JM, Andriana KC, Indu S, Mauren A, Helen M, Andrew JS. 2003. Dietary

flavanols and procyanidin oligomers from cocoa (theobroma cacao) inhibit platelet function. Am J Clin Nutr 77: 1466-73

Kehrer JP. 1993. Free radicals as mediatory of tissue injury and disease. Critic

Rev Toxic 23 (1): 21-48 Karim M, Mc Cormick K, Kappagoda CT. 2000. Effect of cocoa extracts on

endothelium-dependent relaxtions. J Nutr 130; 2105S-8S Kim JY. 2002. Effects of flavonoids isolated from scutellariae radix on

cytochrome P-450 activities in human liver microsomes. J toxic envir health 65 (5-6): 373-381

Kirlin WG, J Cai MJ, De Long, EJ Patten, DP Jones. 1999. Dietary compounds that induce cancer preventive phase 2 enzyme activates apoptosis at comparable doses in HT29 colon carcinoma cells. Am Soc Nutr Sci: 1827-1834

Klauning JE. 1998. The Role of Oxidative stress in chemical carsinogenesis.

Toxicological defense mechanism and the shape of dose response Relat Enviro Health Persp 106: 01

Kohrar SP, Rossel JB. 1990. Detections, estimations and evaluations of

antioxidants in food sistems. Di dalam Hudson JBF, editor. Food Science. Elsevier App Sci. London

Krinsky NI.1992. Mechanism of action biological antioxidant. Soc Exper Medic.

Boston Kris-Ethon, Keen. 2002. Action of carotenoids in biological systems. Annu Rev

Nutr (13) Kusumaningtyas, R. 2007. Pengaruh konsumsi minuman bubuk kakao lindak

bebas lemak terhadap profil darah manusia. [tesis]. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Krovat BC, Tracy JH, Omiecinski CJ. 2000. Finger printing of cytochrome P-450

and microsomal epoxide hydrolase. Toxicl Sci. 55: 352-360 Langseth, L. 2000. Antioxidant and their effect on health. Di dalam: Schmidl MK,

Labuza TP, Editor. Essentials of functional foods. USA: Aspen Publisher Inc. Maryland. Hal 303-317

Lautraite S, Musonda AC, Doehmer J, Edwards GO, Chipman JK. 2002.

Flavonoids inhibit genetic toxicity produced by carcinogens in cells expressing cyp1a2 and cyp1a1. J Mutagen 17 (1): 45-53

Lazarus SA, Adamsons GE, Hammerstone JF, Schmitz HN. 1999. High

performance liquid chromatography/ mass spectrometry analysis of proanthocyanidins in foods and beverages. J Agric Food Chem: 47: 3693-3701

Lechninger. 1993. Dasar-dasar biokimia terjemahan Maggy Thenawijaya.

Penerbit Airlangga. Jakarta Lee KW, Kim YJ, Lee HJ, Lee CY. 2003. Cocoa has more phenolic

phytochemical and a higher antioxidant capacity than teas and red wine. J Agric Food Chem 51: 7292-7295

Lotito SB, Actis goretta L, Renart ML. 2000. Influence of oligomers chain length on the antioxidants activity of procyanidins. Biochems Biophys Res Commun 276: 945-51

Lowry, O. H, NJ Rosebrough, Farr RJ, Randall. 1951. Protein measurement with a

the folin ohenol reagent. J Bio Chem. 193: 265-275 Lu, Frank C. 1995. Toksikologi dasar. Penerjemah: Edi N. Edisi ke-2. Penerbit

Universitas Indonesia. Jakarta Lu, FC. 1991. Basic toxicology: fundamentals, target organs and risk assesment.

Hemispher Publ Coo. Penerjemah: Edi Nugroho. UI Press. Jakarta Martono S, Supardjan. 2002. Pengaruh obat-obat antiinflamasi pada aktivitas

enzim glutation S-transferase kelas mu an pi. Laporan Penelitian Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta

Mathur S, Sridevi D, Scott M, Jialal I. 2002. Cocoa product decrease low density

lipoprotein oxidative susceptibility but do not biomarkers of inflammation human. J Nutr (132); 3663-3667

Mao T, Powell J, Van de water. 2000. Effect of pyrocianidins secretions on

endhotelium dependent relaxtions. J Med Food (3); 107-114 Mao TK, Powell JJ, Van de water J. 2000. The Effects of cocoa procyanidins on

the transcription and secretion of interlukin 1 beta in peripheral bloods mononuclear cell. Life Science 66; 1377-86

Mc Cord JM dan Fridovich 1969. The utility of SOD in studying free radical

reactions. J Biol Chem 244: 6056 Meskin MS, Bidlack WR, Davies AJ, Lewis DS, Randolph RK. 2004.

Phytochemicals (mechanism of actions). CRC Press. Washington DC Middleton, JR, Chitan K dan Theoharis CT. 2000. The effects of plant flavonoids

on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer. Pharmacol Rev 52:673-751

Miean KH, Mohammed S. 2001. Flavonoid myricetin, quercetin, kaemperol)

conten of edible tropical plants. J Agr Food Chem 49: 3106-3112 Misnawai, Selamat J, Jamilah B, Nazamid S. 2002. Activations of remaining key

enzymes in dried under fermented cocoa beans and its effect on aroma precursors formation. J Food Chem 78: 407-417

Misra, Fridovich. 1976. SOD and the oxygen enhancement of radiations lethality. Arch Biochem Biophys 176: 577

Murray Robert. K, Darly K, Granner, Peter A. Mayes, Victor WR. 1999. Biokimia

Harper. Diterjemahkan Oleh: Andry H, Alexander H Santoso. Penerbit Buku Kedokteran. EGCG

Mulder TPJ, Cort DA, Peters WHM. 1999. Variability of glutathione S-

transferase in human liver and plasma. J Clin Chem 45. 3:355-359. Murphy KJ, Kronopoulus AK, Singh I, Francis MA, Moriarty H, Pike MJ, Turner

AH, Mann NJ dan Siclair AJ. 2003. Dietary flavanols and procyanidin oligomers from cocoa (theobroma cacao) inhibit platelet function. Am J Clin Nut 77: 1466-73

Nabet BF. 1996. Zat gizi antioksidan penangkal senyawa radikal pangan dalam

sistem biologis di dalam: Zakaria FR, editor. Prosiding seminar senyawa radikal dan sistem pangan: reaksi biomolekuler, dampak terhadap kesehatan dan penangkalan. Pusat Studi Pangan dan Gizi IPB dan Kedutaan Besar Prancis Jakarta. Bogor

Nakatani. 1997. Antioxidant from spices and herbs. Di dalam: Shahidi F, editor.

Natural antioxidants: chemistry, health effects and applications. Champaign, Illinois: AOAC Press.

(NCCAM) National center for complementary and alternative medicine. 2004.

Green tea (Camellia Sinensis) extract does not alter cytochrome P450 3a4 Or 2d6 activity in healthy volunteers (komunikasi singkat). Drug Metab Dispos 32(9): 906-908

(NCCAM) National Center for Complementary and Alternative Medicine. 2005.

Lack of evidence for induction of cyp2b1, cyp3a23, and cyp1a2 gene expression by panax ginseng and panax quinquefolius extracts in adult rats and primary cultures of rat hepatocytes (komunikasi singkat). Drug Metab Dispos 33 (1): 19-22

Nugrahenny D. 2003. Pengaruh seduhan teh cincau hijau terhadap kadar sitokrom

P-450 dan aktivitas glutation s-transferase dari hati tikus. Departemen Ilmu Teknologi Pangan Institut Pertanian Bogor. Bogor

Nurahman. 1998. Pengaruh konsumsi sari jahe terhadap perlindungan limfosit dari

stres oksidatif pada mahasiswa pondok pesantren Ulil Al-Baab di Bogor. [tesis]. Program Pascasarjana IPB. Bogor

Obach RS. 2000. Inhibition of human cytochrome P450 enzymes by constituents of St. Johns wort, an herbal preparation used in the treatment of depression. J Pharm Exper Therap 294 (1): 88-95

Omura T, Sato R. 1964. The carbon monoxide binding pigment of liver

microsomes, evidence for it hemoproteins nature. J Bio Chem 239 (7): 2370-2378

Osman HR, R Nasarudid, SS Lee. 2003. Extracts of cocoa (theobroma l cacao)

leaves and their antioxidant potentials. J Food Chem (86): 41-46 Palloza P, Robbins RS, Seis H. 2000. Cantaxanthin suplement alters antioxidant

enzyme and iron concentration in liver on balb mice. American Society for Nutritional Science

Palmer HJ, Paulson KE. 1997. Reactive oxygen spesies and antioxidants in signal

transduction and gene expression. Nutr Rev 55 (10) : 353-361 Papas AM. 1999. Determinant of antioxidant in humans. Di dalam: Papas AM,

Editor. antioxidant status, diet, nutritions and health. CRC Press. USA. Hal: 21-33

Pasternak K, Hordyjewska, Borzecki A. 2005. The influence of chosen low

moleculer mass antioxidant on the activities of superoksida dismutase (SOD) and glutathione peroksidase (GPx) in rats tissue. University of Lubin. Poland

Peltola V, Mantyla E, Huhtamniemi I, Ahotupa M. 1994. Lipid peroxidation and

antioxidant enzyme activities in the rat testis after cigarette smoke inhalation or administration of polychiorinated biphenyls or polychlorinated naphthalenes. J Androl 5 (4)

Puspita-Nienaber NL, Fardiaz D, Sumardi M. 1992. Selection of natural

antioxidant from spices. Di dalam: Oei BL, Buchanan A, Fardiaz D, editor. Development of food science and technology in Southeast Asia. IPB Press, Bogor

Qin YZ, Derek D, Schramm, Heidrun B, Grooss. 2005. Influence of cocoa

flavanols and procyanidins on free radical in human erythrocite hemolysis. Clinic & Devl Imunol 12 (1): 27-34

Raucy JL, Schult ED, Wester, Arora S, Johnston, Omdahl, Carpenster S. 1997.

Human lympocyte cytochrome P450 2E1, A putative marker for alcohol mediated changes in hepatic chloroxazone activity. J Drug Met & Disp 25 (12)

Rasal VP, Shetty B, Sinnathambi A, Yeshmaina S, Ashok P. 2006. Antihyperglycaemic and antioxidant activity of brassica oleracea in streptozotocin diabetic rats. J Pharm 4 (2)

Rein D, Paglioroni TG, Person DA. 2000. Cocoa and wine polyphenol modulate

platelet activations and functions. J Nutr 130: 2120-6S Rein D, Paglioreny TG, Wun T, Pearson DA. 2000. Cocoa inhibits platelet

activations and functions. Am J Clin Nutr 72 (1); 30-35 Rice-Evans CA, Diplock AT, Symons MCR. 1991. Technique in free radical

research. Elsivier Amsterdam. London Roit LM. 1991. Essential immunology. Hongkong. Blackwell Scientific

Publications. Dan Hua Printing Cross LTD. Hlm: 78-82 Sanbongi C, Osakabe N, Natsume M, Takizawa T, Gomi S, Osawa T. 1998.

Antioxidative polyphenols isolated from theobroma cacao. J Agric Food Chem 46: 452-457

Schramm DD, Wang JF, Holt RR. 2001. Chocholate pyrocianidins decrease the

leukotrine prostacyclin ratio in human and human aortic endothelial cells. Am J Clin Nutr 73: 36-40

Schuler P. 1990. Natural antioxidants exploited commercial. Di dalam Hudson

JBF, Editor. Food Science. Elsevier App Sci. London Schmidl MK, Labuza TP. 2000. Essenstials of functional foods. Gaithesburg,

Maryland. Aspen Publisher, Inc Setyawan AF. 2006. Pengaruh minuman seduhan bubuk bunga knop terhadap

aktivitas enzim-enzim detoksifikasi pada hati tikus. Departemen Ilmu Teknologi Pangan. Institut Pertanian Bogor.

Semiz A dan Sen A. 2007. Antioxidant and chemoprotective properties of

momordica charantia l. (bitter melon) fruit extract. Afr J Biotech 6 (03): 273-277

Shahidi F, editor. 1997. Natural antioxidant. AOAC Press. Illionis Siregar THS, Riyadi S, Nuraeni L. 2007. Pembudidayaan, pengolahan dan

pemasaran cokelat. Cetakan ke-19. Jakarta: PT. Penebar Swadaya. Sozmen B, Kazaz B, Taskiran D, Aslan L, Akyol A, Sozmen EY. 1998. Plasma

antioxidant satus and nitrate levels in patients with hypertension and caronory heart disease. J Medic Scie 28: 525-531

Supari F. 1996. Radikal bebas dan fatofisiologis beberapa penyakit. Di dalam: Zakaria FR, Editor. Prosiding seminar senyawa radikal dan sistem pangan: reaksi biomolekuler, dampak terhadap kesehatan dan penangkalan. Pusat Studi Pangan dan Gizi IPB dan Kedutaan Besar Prancis Jakarta. Bogor

Sztanke M, Pasternak K. 2005. Antioxidant activities in patients after

gastrointestinal tract suegery. University in Lubin. Poland Tejasari. 2000. Efek proteksi komponen bioaktif oleorosin rimpang jahe (zingiber

officinale roscoe) terhadap fungsi limfosit secara invitro. [Disertasi]. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor

Uhl M. 2002. Effect of chrysin, a flavonoid compound, on the mutagenic activity

of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5- B] pyridine (phip) and benzo(a) pyrene (B(A)P) in bacterial and human hepatoma (Hepg2) cells. J Biomed Life Sci 77 (8): 477-484

Vinson J A, Proch J & Zubict JL. 1999. Phenol antioxidant quality and quantity of

food. J Agri Food Chem 47: 4821-4824 Weisburger JH. 2001. Chemopreventive effects of cocoa polyphenols on chronic

disease. Minirev Americ Health Found. New York Winarno. 1997. Kimia makanan. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta WIPO (World Intellectual Property Organization). 2001. WO/2001/093690: An

improved method for extracting cocoa procyanidins http://www.wipo.int. WIPO (World Intellectual Property Organization). 2001. (WO/2001/045726) The

use of procyanidins in the modulation of cytokine gene expression and protein secretion. http://www.wipo.int

Wollgast J dan Anklam E. 2000. Polyphenols in chocolate: is there a contribution

to human health? J Food Resc International 33: 449-459. Yuliatmoko, W. 2007. Efek konsumsi minuman bubuk kakao lindak bebas lemak

terhadap aktivitas antioksidan dan bioavailabilitas flavonoid plasma manusia. [Tesis]. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Zaden, Zhang Y, Young IS. 1995. The oxidative inactivation of mitochondrial

electron transport chain component. J Biol chem Zairisman SZ. 2006. Potensi imunomodulator bubuk kakao bebas lemak sebagai

produk substandar secara invitro pada sel limfosit manusia. [Skripsi]. Jurusan Ilmu dan Teknologi Pangan Gizi IPB. Bogor

Zakaria-Rungkat F, Septiana AT, Sulistiyani. 2001. Ginger (Zingiber officinale Roescoe) extracts increase human LDL resistance to oxidation and prevent cholesterol accumulation in macrophage. Abstrac presented at the Second Intl Symp on Natural Antioxidant: molecular mechanism and health affects, Beijing, China.

Zakaria FR. 1996. Synthesis of radical and electrophile compounds in and by

food compounds. In radical compounds and food system: biomolecular reaction, effects on health and prevention. Zakaria FR, Dewanti R, Yasni S, eds. CFNS, IPB, Bogor, Indonesia.

Zakaria FR, Abidin Z, Pramudya, SM, Sanjaya. 1996. Kadar malonaldehida dan

zat gizi antioksidan plasma pada populasi remaja rentan pencemaran makanan. Bul Teknol Industri Pangan 7(3):56-64

Zakaria FR. 2001. Pangan dan pencegahan kanker. J Teknologi Industri Pangan

07 (12) Zakaria FR, Nurrahman, Prangdimurti E, Tejasari. 2003. Antioxidant and

immunoenhancement activities of ginger (zingiber officinale roscoe) extracts and compounds invitro and invivo mouse and human sistem. Nutrac Food. 8(1): 96-104

Zao J dan Agrawall R. 1999. Tissue distribution of silibinin, the major active

constituent of silymarin in mice and its association with enhancement of phase II enzyme: implication in cancer chemoprevention. J Carcino 20: 2101-2108

Zhai S, Dai R, Friedman FK, Vestal RE. 1998. comparative inhibition of human

cytochromes P450 1a1 and 1a2 by flavonoids. J Drug Metab Disp 26 (10): 989-992

Zhu QY , Holt RR, Lazarus SA, Orozco TJ, Keen CL. 2002. Inhibitory effects of

cocoa flavanols and procyanidin oligomers on free radical-induced erythrocyte hemolysis. Exp Biol Med 227(5): 321-329

Zitouni K, Zadeh JN, Harry D, Kerry SM, Betteridge DJ, Cappucino FP, Earle

KA. 20005. Race specifics differences in antioxidant enzyme activity in patients with type 2 diabetes. Diabetes Care 28: 17.

L A M P I R A N

Lampiran 1

INFORMED CONCERN PERNYATAAN KESEDIAAN MENJADI RESPONDEN

PENELITIAN Saya yang bertanda tangan dibawah ini Nama : Jenis Kelamin : Tempat/Tanggal Lahir : Pekerjaan : Alamat : Telpon :

Menyatakan dalam keadaan sehat dan bersedia menjadi responden pada penelitian konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak untuk kesehatan dan bersedia mematuhi aturan yang diberitahukan. Kesediaan ini saya buat setelah mendapat penjelasan dari peneliti sebagai berikut: 1. Bersedia minum minuman bubuk kakao bebas lemak yang diberi sedikit gula

dan sedikit susu bubuk skim setiap pagi hari selama 25 hari 2. Bersedia diperiksa kesehatannya selama 2 kali yaitu sebelum dan setelah

pelaksanaan intervensi oleh petugas kesehatan yang berwenang 3. Bersedia diambil darahnya selama dua kali yaitu sebelum dan setelah

pelaksanaan intervensi oleh petugas kesehatan yang berwenang 4. Bersedia makan menu makanan yang disediakan oleh peneliti saat sarapan

pagi dan makan malam setiap hari selama satu bulan 5. Bersedia ikut diskusi tentang kebiasaan makan, kesehatan selama intervensi

berlangsung.

Semua penjelasan diatas sudah saya pahami dan mengerti sehingga saya mengerti tujuan minum minuman bubuk kakao bebas lemak untuk meningkatkan kesehatan. Dengan demikian ada kesepahaman antara responden dan peneliti tentang manfaat minum minuman bubuk kakao bebas lemak.

Demikian Surat pernyataan ini saya buat, semoga dapat dipergunakan seperlunya. Bogor, Juli 2006 Peneliti Responden, ( ) ( )

Lampiran 2

KUISIONER KESEHATAN FISIK, POLA MAKAN DAN KEBIASAAN KONSUMSI MAKANAN JAJANAN

A. Identitas Responden

1. Nama : 2. Jenis Kelamin : 3. Tempat/Tanggal lahir: 4. Alamat :

B. Keadaan sosial ekonomi keluarga

1. Pendapatan a. Orang tua : Rp.........................................../bulan b. Beasiswa : Rp.........................................../bulan c. Lain-lain : Rp.........................................../bulan

Total : Rp.........................................../bulan

2. Pengeluaran b. Makanan utama : Rp.........................................../bulan c. Jajanan : Rp.........................................../bulan d. Non Makanan : Rp.........................................../bulan

Total : Rp.........................................../bulan C. Antropometri

1. Berat badan : ...........................................Kg 2. Tinggi badan : ...........................................Cm 3. Lingkaran lengan atas : ...........................................Cm 4. Skinfoid tickness : ...........................................Mm

D. Pemeriksaan klinis

1. Keadaan umum a. Pulse rate : ............................................kali b. Respiratory rate : ……………………………kali c. Blood pressure : ……………………………mmhg d. Temperature : …………………………….Celcius

2. Mata

a. Normal b. Anemic conjunctiva c. Icteric sclera d. Conjuctivitis e. Lain-lain : ............................................

3. Telinga a. Normal b. Otitis c. Ear discharge d. Lain-lain : ..............................................

4. Mulut

a. Normal b. Angular stomatitis c. Cheilosisi d. Tonsilitis e. Pharingitis f. Gums swollen or bleeding g. Lain-lain : ………………………………

5. Gigi

a. Normal b. Carries teeth c. Lain-lain : ……………………………….

6. Leher

a. Normal b. Swolen thyroid gland c. Abnormal tissue d. Lain-lain : ………………………………..

7. Kulit

a. Normal b. Pellagrous c. Edema d. Ulcers e. Hemorrhagia f. Infections (allergic, fungal, bacterial, scabies) g. Lain-lain : ………………………………..

8. Kuku

a. Normal b. Pallor of bed c. Lain-lain : …………………………………

9. Abdominal exam

a. Normal b. Sign off acute abdomen c. Abdominal mass d. Hepatomegaly: : Grade…………………………... e. Spelenomegaly : Grade…………………………...

f. Ascites g. Flank pain h. Kidney mass i. Lain-lain : ……………………………….

10. Heart exam

a. Normal b. Murmur c. Gallop d. Congonital e. Lain-lain : ………………………………

11. Ches exam

a. Normal b. Ronchi c. Wheezing d. Slime/mucus e. Lain-lain : ……………………………….

12. CNS

a. Normal b. Anasthesia c. Abnormal gait d. Pathology reflexes e. Lain-lain : ……………………………….

13. Skeleton

a. Normal b. Deformity c. Bony Swellings d. Sign of rickets e. Lain-lain : ……………………………….

14. Other

a. …………………………………. b. …………………………………. c. …………………………………. d. ………………………………….

15. Conclusion

a. …………………………………. b. …………………………………. c. …………………………………. d. ………………………………….

E. Riwayat Kesehatan 1. Pernah sakit 1 tahun terakhir

a. Pernah b. Tidak

2. Kalau pernah

b. Jenis penyakit : ........................................ c. Kapan : ........................................ d. Berapa Lama : ........................................

3. Pengobatan yang dilakukan

b. Dokter praktek c. Rumah sakit/Puskesmas d. Mantri kesehatan e. Obat-obatan bebas f. Lain-lain : ..........................................

4. Saat ini menderita sakit

a. Ya b. Tidak

5. Kalau ya, jenis penyakit: ................................................

6. Pengobatan yang dilakukan

a. Dokter praktek b. Rumah sakit/puskesmas c. Mantri kesehatan d. Obat-obatan bebas e. Lain-lain : .............................................

F. Kebiasaan makan

1. Frekuensi makan dalam sehari a. Sekali b. Dua kali c. Tiga kali d. Empat kali

2. Kebiasaan sarapan pagi

a. Ya, setiap hari b. Kadang-kadang c. Tidak pernah

3. Bila ya atau kadang-kadang, jenisnya

a. Makanan Lengkap : ................................................... b. Makanan Kecil : ................................................... c. Minuman : ...................................................

d. Lain-lain : ...................................................

4. Kebiasaan makanan selingan a. Ya b. Kadang-kadang c. Tidak pernah

5. Jelaskan mengenai kebiasaan makan anda

Waktu makan

Jenis makanan

Asal makanan Dibuat sendiri Dibeli Diberi

Pagi Tengah hari Siang Sore Malam

G. Kebiasaan konsumsi makanan jajanan

1. Apakah anda biasa mengkonsumsi makanan jajanan a. Ya b. Tidak

2. Apabila ya, sebutkan frekuensinya

a. Lebih dari sekali sehari b. 5-7 kali seminggu c. 3-4 kali seminggu d. 1-2 kali seminggu e. 1-2 kali seminggu

3. Bagaimana pendapat anda mengenai jenis makanan jajanan yang baik ?

(bisa lebih dari satu) a. Mengenyangkan b. Bergizi c. Harganya mahal d. Rasanya enak e. Penampilan menarik f. Bersih dan aman g. Lain-lain: ......................................

4. Bagaimana pendapat anda mengenai makanan jajanan dan minuman

yang dijual dipinggir jalan, terminal, dsb? a. Tidak baik b. Baik c. Sama saja d. Tidak tahu Apakah anda membelinya?

a. Tetap membeli b. Sering c. Kadang-kadang d. Tidak pernah

5. Bagaimana pendapat anda mengenai makanan jajanan dan minuman yang

disajikan tidak tertutup a. Tidak baik b. Baik c. Sama saja d. Tidak tahu

Apakah anda membelinya? a. Tetap membeli b. Sering c. Kadang-kadang d. Tidak pernah

6. Bagaimana pendapat anda mengenai tempat jualan makanan yang dekat

dengan tempat sampah/kotor? a. Tidak baik b. Baik c. Sama saja d. Tidak tahu


7. Bagaimana pendapat anda mengenai peralatan makan dan minum yang

tidak bersih? a. Tidak baik b. Baik c. Sama saja d. Tidak tahu


8. Bagaimana pendapat anda mengenai air pencuci peralatan

makan/minum yang dipakai berkali-kali?

a. Tidak baik b. Baik c. Sama saja d. Tidak tahu

Apakah anda membelinya? a. Tetap membeli b. Sering c. Kadang-kadang d. Tidak pernah 9. Bagaimana pendapat anda mengenai lap pengering/lap tangan yang

sama sehingga kotor? a. Tidak baik b. Baik c. Sama saja d. Tidak tahu


10. Bagai mana pendapat anda mengenai makanan jajanan yang

dibungkus kertas koran/sejenisnya? a. Tidak baik b. Baik c. Sama saja d. Tidak tahu


11. Bagaimana pendapat anda mengenai makanan/minuman yang

memakai zat pewarna? a. Tidak baik b. Baik c. Sama saja d. Tidak tahu

12. Jenis-jenis makanan jajanan yang biasa dibeli

Jenis dan Nama Makanan/minuman

Frekuensi Tempat Beli

Jenis bungkus

Jumlah Harga

Makanan lengkap Nasi goreng telur Nasi rames Nasi uduk Nasi soto ayam/dg Indomie rebus Mie ayam Mie bakso Bubur ayam Bihun goreng Siomai Lontong sayur Sate ayam Kupat tahu Gado-gado Togr goreng Pecel

Lauk pauk

Dging sapi goreng Sate ayam/kambing

Ayam goreng Ati/ampela ayam Ikan kembung goreng

Ikan bakar Ayam Bakar Telur ayam rebus Telur ayam goreng

Makanan kecil/snack

Roti manis Donat Kue pia Biskuit Kue mangkok Kue nagasari Kue putu Buras Ketan urap Bubur kacang ijo

Pisang goreng Pisang molen Risoles Ubi goreng Tempe goreng Tahu Goreng Bakwan Kroket Batagor Comro Singkong goreng Perkedel kentang Pilus Kue tambang Kacang atom Rempeyek Kacang

Kerupuk Rujak Coklat manis batang

Agar-agar Buah-buahan

Jeruk manis Salak Pisang Mangga Apel Pear Duku

Minuman

Es teler Es krim Es sirup Es mambo Soft drink Es cendol Juice alpukat Juice jeruk Es doger Teh manis Teh botol/kotak Sari buah kotak

Kopi Bajigur Sekoteng Bir/minuman keras

Lain-lain: .............................. .............................. .............................. .............................. ..............................

Rokok Jamu gendong Jamu kemasan

Catatan 1. Frekuensi

a. Sekali sehari b. 5-7 kali seminggu c. 3-4 kali seminggu d. 1-2 kali seminggu e. 2 minggu sekali f. Jarang g. Tidak pernah

2. Tempat pembelian

a. Toko besar/restoran b. Pasar tradisional c. Toko kecil/kantin d. Kios/warung e. Pedang menetap f. Pedagang keliling g. Lain-lain

3. Jenis pembungkus

a. Polietilen b. Kertas lapis plastik c. Daun pisang d. Kertas bekas e. Kertas koran f. Alat makan/minum

13. Dasar pertimbangan yang digunakan dalam memilih jenis makanan jajanan tersebut (bisa lebih dari satu) a. Mengenyangkan

b. Bergizi c. Harganya murah d. Rasanya enak e. Penampilan menarik f. Bersih dan aman g. Kebiasaan h. Lain-lain:..........................................

Lampiran 3

DATA-DATA HASIL PENELITIAN

A. DATA HASIL PENGUKURAN AKTIVITAS ENZIM ANTIOKSIDAN KATALASE PADA ERITROSIT

KELOMPOK PERLAKUAN

RESPONDEN Sebelum Intervensi (U/ Mg protein)

Setelah Intervensi (U/ Mg protein)

P1 553.846 607.079 P2 521.941 565.855 P3 522.837 555.997 P4 533.592 589.156 P5 517.46 590.052 P6 520.149 581.09 P7 594.533 601.702 P8 521.045 582.882 P9 567.647 583.778

KELOMPOK KONTROL

RESPONDEN Sebelum Intervensi(U/ Mg protein)


K1 525.514 571.2322 K2 517.288 521.045 K3 544.706 547.035 K4 589.489 598.117 K6 516.374 500.433 K7 553.846 592.74 K8 594.973 596.325 K9 541.051 548.969

KURVA STANDAR H 2 O 2 PENGUKURAN KATALASE ERITROSIT

A. Sebelum Intervensi B. Setelah Intervensi

KURVA STANDAR

y = 6.7525x + 0.0274R2 = 0.9928

0

0.20.4

0.6

0.81

1.2

0 0.05 0.1 0.15 0.2

Konsentrasi

Abso

rban

si

Kurva Standar H2O2

y = 6.505x + 0.009R2 = 0.9986

0

0.20.4

0.6

0.81

1.2

0 0.05 0.1 0.15 0.2

Konsentrasi H2O2 (M)

Abs

orba

nsi

B. DATA HASIL PENGUKURAN AKTIVITAS ENZIM ANTIOKSIDAN KATALASE PADA PLASMA

KELOMPOK PERLAKUAN



P1 553.846 607.079 P2 521.941 565.855 P3 522.837 555.997 P4 533.592 589.156P5 517.46 590.052 P6 520.149 581.09 P7 594.533 601.702 P8 521.045 582.882 P9 567.647 583.778

KELOMPOK KONTROL



K1 525.514 571.2322 K2 517.288 521.045 K3 544.706 547.035 K4 589.489 598.117 K6 516.374 500.433 K7 553.846 592.74 K8 594.973 596.325 K9 541.051 548.969

KURVA STANDAR H 2 O 2 PENGUKURAN KATALASE PLASMA


KURVA STANDAR

y = 6.565x + 0.051R2 = 0.9844

0

0.20.4

0.6

0.81

1.2

0 0.05 0.1 0.15 0.2

Konsentrasi

Abs

orba

nsi

KURVA STANDAR

y = 6.695x + 0.0234R2 = 0.9949

0

0.20.4

0.6

0.81

1.2

0 0.05 0.1 0.15 0.2

Konsentrasi

Abs

orba

nsi

C. DATA HASIL PENGUKURAN KADAR SITOKROM ERITROSIT

PERLAKUAN

RESPONDEN Sebelum Intervensi(nmol/ mg protein)

Setelah Intervensi (nmol/ mg protein)

P1 5.3278 1.322 P2 4.8076 1.1384 P3 4.9016 1.2466 P4 5.4747 1.0851 P5 5.7727 1.9188 P6 5.8021 1.8766 P7 5.9564 2.4714 P8 5.5189 1.676 P9 5.2805 1.536

KONTROL



K1 5.214017846 4.229574402 K2 5.15940905 4.11398 K3 2.810513402 2.321165321 K4 5.008210296 4.262235208 K6 2.948535909 2.858659263 K7 6.149783371 4.131089509 K8 5.662763073 4.903053866 K9 5.574344656 4.934914506

KURVA STANDAR PROTEIN KADAR SITOKROM PADA ERITROSIT


KURVA STANDAR PROTEIN

y = 0.9072x + 0.0653R2 = 0.9786

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Konsentrasi (mg/ml)

Abso

rban

si


y = 0.7002x - 0.0428R2 = 0.9631

00.10.20.30.40.50.60.70.8

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Konsentrasi (mg/ml)

Abso

rban

si

D. DATA HASIL PENGUKURAN KADAR SITOKROM PADA PLASMA

PERLAKUAN



P1 2.1816 0.7505 P2 2.2061 0.6416 P3 1.9544 0.9266 P4 1.6678 0.5226 P5 1.6996 0.7928 P6 1.9188 0.7132 P7 3.1612 0.8485 P8 2.4131 1.0065 P9 1.7428 0.8496

KONTROL



K1 1.8097 1.5897 K2 1.8341 1.5136 K3 2.2248 1.7892 K4 3.9565 3.1973 K6 1.4999 1.1084 K7 1.7477 1.0583 K8 1.8811 1.3932 K9 1.8455 1.2555

KURVA STANDAR PROTEIN KADAR SITOKROM PADA PLASMA



y = 0.9906x + 0.1042R2 = 0.9913

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Konsentrasi (mg/ml)

Abso

rban

si


y = 0.9235x + 0.1027R2 = 0.9778

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Konsentrasi (mg/ml)

Abs

orba

nsi

E. DATA HASIL PENGUKURAN AKTIVITAS GLUTATION S-TRANSFERASE (GST) PADA ERITROSIT

PERLAKUAN

RESPONDEN Sebelum Intervensi(nmol/ min/ mg protein)

Setelah Intervensi (nmol/ min/ mg protein)

P1 0.095 0.239 P2 0.079 0.259 P3 0.083 0.181 P4 0.095 0.15 P5 0.076 0.179 P6 0.081 0.247 P7 0.086 0.209 P8 0.077 0.208 P9 0.079 0.281

KONTROL



K1 0.076 0.123 K2 0.071 0.115 K3 0.089 0.108 K4 0.067 0.095 K6 0.092 0.108 K7 0.095 0.114 K8 0.087 0.117 K9 0.078 0.103

KURVA STANDAR PROTEIN GST PADA ERITROSIT



y = 0.904x + 0.1246R2 = 0.9616

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Konsentrasi (mg/ml)

Abs

orba

nsi


y = 0.9588x + 0.081R2 = 0.9946

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Konsentrasi (mg/ml)

Abs

orba

nsi

F. DATA HASIL PENGUKURAN AKTIVITAS GLUTATION S-TRANSFERASE (GST) PADA PLASMA

PERLAKUAN



P1 0.1367 0.31864 P2 0.1235 0.2783 P3 0.1285 0.3435 P4 0.1273 0.2776 P5 0.1289 0.303 P6 0.1423 0.2824 P7 0.1319 0.2851 P8 0.118 0.2692 P9 0.1225 0.2794

KONTROL


Setelah Intervensi (nmol/ mg/ mg protein)

K1 0.1319 0.1983 K2 0.1369 0.2061 K3 0.1476 0.1772 K4 0.1662 0.2048 K6 0.1157 0.1781 K7 0.1421 0.2009 K8 0.1561 0.2044 K9 0.1281 0.1818

KURVA STANDAR PROTEIN GST PADA PLASMA




y = 1.0066x + 0.1496R2 = 0.9941

00.20.40.60.8

11.21.4

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Konsentrasi (mg/ml)

Abs

orba

nsi


y = 1.0959x + 0.1373R2 = 0.9871

00.20.40.60.8

11.21.4

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Konsentrasi (mg/ml)

Abs

orba

nsi

Lampiran 4

TABULASI HASIL ANALISA STATISTIK DENGAN UJI T (t-Test)

NO PARAMETER RESPONDEN UJI STATISTIK 1. Aktivitas Sitokrom Eritrosit Kontrol Tidak berbeda nyata

Perlakuan Berbeda Nyata 2. Aktivitas Sitokrom Plasma Kontrol Tidak berbeda nyata

Perlakuan Berbeda Nyata 3. Aktivitas GST Eritrosit Kontrol Tidak berbeda nyata

Perlakuan Berbeda Nyata 4. Aktivitas GST Plasma Kontrol Tidak berbeda nyata

Perlakuan Berbeda Nyata 5. Aktivitas Katalase Eritrosit Kontrol Tidak berbeda nyata

Perlakuan Berbeda Nyata 6. Aktivitas Katalase Plasma Kontrol Tidak berbeda nyata

Perlakuan Berbeda Nyata

Lampiran 5

HASIL ANALISA DATA DENGAN UJI T (t-test) KATALASE ERITROSIT KELOMPOK KONTROL Two Sample T-Test and Confidence Interval Two sample T for SEBELUM vs SESUDAH N Mean StDev SE Mean Sebelum Interven 8 989.77 3.83 1.4 Setelah Interven 8 991.76 3.01 1.1 Difference = mu (Sebelum Intervensi) - mu (Setelah Intervensi) Estimate for difference: -1.99862 95% CI for difference: (-5.69171, 1.69446) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1.16 P-Value = 0.265 DF = 14 Both use Pooled StDev = 3.4438

KATALASE ERITROSIT KELOMPOK PERLAKUAN Two Sample T-Test and Confidence Interval Two-sample T for Sebelum Intervensi_1 vs Setelah Intervensi_1 N Mean StDev SE Mean Sebelum Interven 9 999.64 6.40 2.1 Setelah Interven 9 1020.03 5.45 1.8 Difference = mu (Sebelum Intervensi_1) - mu (Setelah Intervensi_1) Estimate for difference: -20.3870 95% CI for difference: (-26.3248, -14.4492) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -7.28 P-Value = 0.000 DF = 16 Both use Pooled StDev = 5.9417

KATALASE PLASMA KONTROL Two Sample T-Test and Confidence Interval Two-sample T for Sebelum Intervensi_2 vs Setelah Intervensi_2 N Mean StDev SE Mean Sebelum Interven 8 547.9 30.4 11 Setelah Interven 8 559.5 36.5 13 Difference = mu (Sebelum Intervensi_2) - mu (Setelah Intervensi_2) Estimate for difference: -11.5819 95% CI for difference: (-47.6012, 24.4374) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0.69 P-Value = 0.502 DF = 14 Both use Pooled StDev = 33.5878

KATALASE PLASMA PERLAKUAN Two Sample T-Test and Confidence Interval Two-sample T for Sebelum Intervensi_3 vs Setelah Intervensi_3 N Mean StDev SE Mean Sebelum Interven 9 539.2 27.0 9.0 Setelah Interven 9 584.2 15.9 5.3 Difference = mu (Sebelum Intervensi_3) - mu (Setelah Intervensi_3) Estimate for difference: -44.9490 95% CI for difference: (-67.1263, -22.7717) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -4.30 P-Value = 0.001 DF = 16 Both use Pooled StDev = 22.1921 KADAR SITOKROM ERITROSIT KELOMPOK KONTROL Two Sample T-Test and Confidence Interval Two sample T for SEBELUM vs SESUDAH N Mean StDev SE Mean SEBELUM 9 4.78 1.17 0.39 SESUDAH 9 3.53 1.58 0.53 95% CI for mu SEBELUM - mu SESUDAH: ( -0.15, 2.66) T-Test mu SEBELUM = mu SESUDAH (vs not =): T= 1.91 P=0.076 DF= 14

KADAR SITOKROM ERITROSIT KELOMPOK PERLAKUAN Two Sample T-Test and Confidence Interval Two sample T for SEBELUM1 vs SESUDAH1 N Mean StDev SE Mean SEBELUM1 9 5.427 0.394 0.13 SESUDAH1 9 1.586 0.451 0.15 95% CI for mu SEBELUM1 - mu SESUDAH1: ( 3.42, 4.27) T-Test mu SEBELUM1 = mu SESUDAH1 (vs not =): T= 19.25 P=0.0000 DF= 15

KADAR SITOKROM PLASMA KELOMPOK KONTROL Two Sample T-Test and Confidence Interval Two sample T for SEBELUM2 vs SESUDAH2 N Mean StDev SE Mean SEBELUM2 9 2.183 0.767 0.26 SESUDAH2 9 1.434 0.837 0.28 95% CI for mu SEBELUM2 - mu SESUDAH2: ( -0.06, 1.56) T-Test mu SEBELUM2 = mu SESUDAH2 (vs not =): T= 1.98 P=0.066 DF= 15 KADAR SITOKROM PLASMA KELOMPOK PERLAKUAN Two Sample T-Test and Confidence Interval

Two sample T for SEBELUM3 vs SESUDAH3 N Mean StDev SE Mean SEBELUM3 9 2.105 0.470 0.16 SESUDAH3 9 0.784 0.147 0.049 95% CI for mu SEBELUM3 - mu SESUDAH3: ( 0.95, 1.693) T-Test mu SEBELUM3 = mu SESUDAH3 (vs not =): T= 8.04 P=0.0000 DF= 9

GST PLASMA KELOMPOK KONTROL Two Sample T-Test and Confidence Interval Two sample T for SEBELUM4 vs SESUDAH4 N Mean StDev SE Mean SEBELUM4 9 0.1402 0.0151 0.0050 SESUDAH4 9 0.1724 0.0657 0.022 95% CI for mu SEBELUM4 - mu SESUDAH4: ( -0.0840, 0.020) T-Test mu SEBELUM4 = mu SESUDAH4 (vs not =): T= -1.43 P=0.19 DF= 8

GST PLASMA KELOMPOK PERLAKUAN Two Sample T-Test and Confidence Interval Two sample T for SEBELUM5 vs SESUDAH5 N Mean StDev SE Mean SEBELUM5 9 0.12884 0.00742 0.0025 SESUDAH5 9 0.2930 0.0242 0.0081 95% CI for mu SEBELUM5 - mu SESUDAH5: ( -0.1833, -0.1451) T-Test mu SEBELUM5 = mu SESUDAH5 (vs not =): T= -19.45 P=0.0000 DF= 9 GST ERITROSIT KELOMPOK KONTROL Two Sample T-Test and Confidence Interval Two sample T for SEBELUM6 vs SESUDAH6 N Mean StDev SE Mean SEBELUM6 9 0.04070 0.00492 0.0016 SESUDAH6 9 0.0490 0.0188 0.0063 95% CI for mu SEBELUM6 - mu SESUDAH6: ( -0.0230, 0.0064) T-Test mu SEBELUM6 = mu SESUDAH6 (vs not =):T= -1.28 P=0.23 DF= 9 GST ERITROSIT KELOMPOK PERLAKUAN Two Sample T-Test and Confidence Interval Two sample T for SEBELUM7 vs SESUDAH7 N Mean StDev SE Mean SEBELUM7 9 0.04171 0.00351 0.0012 SESUDAH7 9 0.1084 0.0212 0.0071

95% CI for mu SEBELUM7 - mu SESUDAH7: ( -0.0833, -0.0502) T-Test mu SEBELUM7 = mu SESUDAH7 (vs not =): T= -9.30 P=0.0000 DF= 8

PENGARUH MINUMAN BUBUK KAKAO LINDAK BEBAS … · detoksifikasi dalam tubuh melibatkan kerja enzim...

Documents

Transcript of PENGARUH MINUMAN BUBUK KAKAO LINDAK BEBAS … · detoksifikasi dalam tubuh melibatkan kerja enzim...