ENZIM MIKROBIALEnzim Enzim Enzim Enzim Lipase Protease Selulase Amilase

ENZIM LIPASE

Enzim hidrolase untuk ester karboksilat yang mampu menghidrolisa tri-di dan monogliserida dengan adanya interfase antara substrat tidak larut air (lipid) dan fase akueous dimana enzim berada Skema : DAG + ALB MAG +ALB Gliserol +ALB tri, di, monogliserida, ALB = asam lemak

TAG +H2O DAG +H2O MAG + H2O TAG, DAG, MAG bebas

ENZIM LIPASE

Umumnya bersifat eksoselular terinduksi Berdasarkan kinerja dibagi 3 kelompok : Memecah seluruh molekul trigliserida menjadi asam lemak dan gliserol Menghidrolisis lemak pd posisi 1 atau 3 gliserida hasilkan digliserida Spesifik pada asam lemak ikatan rangkap C9

1.

2.

3.

SIFAT FISIKO KIMIA

Sisi aktif bersifat hidrofobik Terdiri dari trio residu asam amino serin,aspartat, histidin BM 2 -120kDa Aktivitas spesifik 500-1000 unit/mg protein Lipase murni adalah glikoprotein (2-15 % karbohidrat) residu glukosida utama adalah manosa, galaktosa, silosa dan heksosamina

APLIKASIIndustri Susu Kegunaan Hidrolisis lemak susu Meningkatkan aroma, , perpanjang umur simpan Meningkatkan aroma, percepat fermentasi Meningkatkan aroma dan merubah lemak Produk Flavoring agent (mis :butyric acid) Produk roti dan kue

Roti dan kue

Bir

Produk minuman beralkohol Produk olahan daging dan ikan

Daging dan ikan

APLIKASI (lanjutan)Industri Bumbu Kimia dan obat Kegunaan Memperbaiki tekstur Produk Mayonaise, seasoning

Minyak dan Transesterifikasi lemak, digesten minyak alami Mempermudah daya cerna minyak lemak dalam pangan Hidrolisislemak dan minyak, analisis asam lemak Menghilangkan noda minyak lemak ALB, DAG, MAG, gliserol Deterjen cucian dan penggunaan alat rumah tangga

Oleokimia

Deterjen

APLIKASI (lanjutan)Industri Kedokteran Kegunaan Analisis trigliserida dalam darah Mengubah lemak Hidrolisis lemak dalam jaringan Produk Diagnostik

Kosmetik Kulit Lain-lain

Produk kosmetik Produk kulit

Dekomposisi dan Pembersih pipa, pengubahan penanganan substansi minyak limbah cair dikombinasikan dengan enzim lainnya

Sumber Lipase Mikrobial

Bakteri Staphylococcus aureus, S. hyicus, Bacillus pumilus, Pseudomonas dan Moraxella Kapang P. camemberti, Geotrichum candidum, Mucor miehei, Humicola lanuginosa, A.niger, Rhizopus arrhizus Khamir Candida antartica, C. rugosa, C. cylindicaceae

Clear zone showed lipase activity

Proses FermentasiMedia utama yang diperlukan: 1. Unsur carbon pembentukan sel dan sumber energi 2. Unsur nitrogen pembentuk protoplasma dan dinding sel 3. Lipid membentuk struktur membran sekaligus sebagai induser dalam produksi lipase Komposisi nutrien tgt jenis m.o, contoh : bakteri : 40-70%, 13-34 % asam nukleat, 10-30% lipid Kapang berfilamen : 40-50 % protein, 410% asam nukleat, 1-50% lipid

Kondisi lingkungan untuk produksi Lipase

Aerasi dan agitasi Induser fungsinya energi dan asam amino tdk terbuang percuma krn memproduksi enzim yang tdk diperlukan Ditambah lipid agar lipase diproduksi Diberikan dlm kondisi terbatas nutrient Terhambat jika banyak terdapat monodan disakarida

Kondisi Kultivasi Lipase

Bisa dilakukan dengan kultivasi media padat atau cair Kondisi yang berpengaruh :pH, suhu, lama kultivasi (berhubungan dg siklus pertumbuhan m.o penghasil lipase) fase pertumbuhan eksponensial

Bacillus pumilus capable to produce protease and lipase depends on media

Media for protease consists of (w/v) 0.04% CaCl2, 0.02% MgCl2, 1% glucose, 0.5% peptone, 0.5% NaCl, 0.3% yeast extract (pH 7.0). The production medium for lipase comprised of (w/v) 0.01% MgSO4, 0.1% KH2PO4, 1.0% tween 20, 0.2% glucose, 0.5% peptone (pH 7.0).

Effect of temperature to protease and lipase production by B. pumilus

Effect of pH to protease and lipase production by B. pumilus

Protease and lipase production by B. pumilus during log phase

Protease

Lipase

Need longer time for lipase 1st stage growth of cell using glucose and 2nd stage lipase production using tween 80

Effect of various substrates for protease production by B. pumilus

Effect of various oils for lipase production by B. pumilus

1-Gingelly oil, 2- Coconut oil, 3- Groundnut oil, 4- Olive oil, 5- Castor oil

Lipase production by repeated batch fermentation with immobilized Rhizopus arrhizus

Medium composition (%): soybean flour 4.0 (w/v), peanut oil 1.0 (v/v), MgSO4 0.1 (w/v), K2HPO4 0.5 (w/v), (NH4)2SO4 0.2 (w/v) Incubation time : 96 hours Temperature : 26.5oC, 130 rpm

Immobilized mycelium of Rhizopus arrhizusImmobilized cells on polyurethane medium for culture before immoblized soybean flour, 1% peanut oil, 0.5% K2HPO4, 0.2% (NH4)2SO4, 0.1% MgSO4, 3%

26.5 C, 130 rpm, culture time 96 h.

Diagram of experimental equipment6

5

4 1 (1) medium reservoir; (2) fermentor; 2 3 (3) broth receiver; (4) peristaltic pump; (5) air distributing implement; (6) filter.

Proses HilirCairan fermentasi filotrasi atau sentrifugasi untuk pisahkan selnya Crude enzim pengendapan dg garam dan dialisa kromatografi penukar ion evaporasi liofilisai Analisis BM : Elektroforesis SDS

Definisi

Enzim yang mengkatalisa reaksi pemecahan reaksi hidrolisis proteinAsam amino Protease

Protein

AplikasiIndustri Roti-

Perbaiki tekstur adonan mengurangi waktu pencampuran meningkatkan volume roti Clarifier

Industri Bir dan Jus buah Kulit Industri deterjen Pengolahan daging Bidang kesehatan Pasta gigi Film dan fotografi Industri Keju

-Membersihkan -Senyawa

bulu

pembersih

-

pengempukan daging

membantu pencernaan -- pengobatan pada luka bakar-

Campuran enzim Recovery komponen perak Menggumpalkan susu

Jenis-jenis protease

Aminopeptidase Karboksipeptidase Protease Serin Protease thiol Protease Asam Protease Metal

Aminopeptidase

Hidrolisis asam amino Umumnya bakteri Gram Ada korelasi antara aktivitas aminopeptidase dg perbedaan komposisi jembatan antara peptida dalam peptidoglikan BM yang dihasilkan E coli 400 kDa pH optimum 7.5-10.5, stabil thd panas, aktivitas optimum butuh ion Mg2+, Ca2+

Aminopeptidase (lanjtn)

B. subtilis hasilkan 3 aminopeptidase ekstraseluler Aktivitas opt butuh ion Mn2+ Spesifik untuk L-aspartyl naphtylamida B. licheniformis aminopeptidase dg BM 34 kDa Butuh aktivator ion Co2+

Karboksipeptidase

Dihasilkan oleh Penicillium sp dan Pseudomonas sp Penicillium sp karboksipeptidase serin Butuh ion Zn2+ atau ion Co2+ untuk aktivitasnya

Protease Serin atau subtilisinProtease serin alkalin

Diproduksi bakteri dan kapang Aktif pada pH tinggi Sensitif thd diisopropylfosfloridat (DFP) Disebut juga subtilisin : Subtilisin carlsberg B.licheniformis, B.pumilus ; diinhibisi oleh diisopropylfosflorilidat dan phenyl methyl sulfonil fluorida, BM 27 277 Da, butuh ion Ca2+, tahan EDTA,pH optimum 8-9,inaktif pH< 5 dan > 11

Protease Thiol

Dibagi 2 : - Clostripsin Clostridium histolycum, BM 50 kDa, titik isoelektrik 4.8-4.9 - Protease Streptococcal Streptococcus sp, BM 32 kDa, titik isoelektrik 8,4 * pH optimum : netral * Aktivitas menurun dg DFP

Protease Asam

Dihasilkan oleh Aspergillus, Penicillium, Mucor dan Endothia pH optimum 3.0-4.0 Tahan DFP dan EDTA tapi sensitif thd diazoketon BM 30-40kDa

Protease Metal

Dibagi atas : protease netral, protease alkali, protease mycobacter I dan H Dapat dihambat EDTA Tahan DFP

Protease Netral

pH opt 7.0 B. subtilis, B. cereus, B. megaterium, B. stearothermophilus, Thermolisin adalah protease netral dari B. stearothermophilus, BM 34 kDa, mengandung 4 atom Ca untuk stabilitas thd panas, tahan 80oC selama 1 jam,

PROSES FERMENTASI

Keberhasilan produksi enzim tergantung dari - pemilihan media - kondisi kultivasi - spesies mikroba - metode pemurnian enzim

Teknik kultivasi umum Protease -

Kultivasi terendam dg media cair Kelebihan : Komposisi dan komponen media dapat diatur dg mudah Kondisi optimum mudah diatur Penggunaan substrat efisien Aerasi dapat disesuaikan Resiko kontaminasi kecil

Kekurangan kultivasi Cair

Adanya buih Sterilisasi intensif Konsentrasi produk relatif rendah Pemanenan mahal

Persyaratan media fermentasi dalam industri enzim

Kontinyuitas bahan Mudah didapat Harga murah Substrat efisien dipergunakan

Contoh yang umum digunakan: - Limbah cair tahu, whey susu,tepung kedelai, tepung biji kapas, beras pecah dll

Skema Umum Proses Produksi Enzim MikrobialPengembangan Inokulum Biomassa

Kultur Stok

Labu Kocok

Bioreaktor Inokulum

Cairan Fermentasi

Pemisahan Sel Crude Enzim

Sterilisasi Media

Formulasi Media

Ekstraksi Produk Pemurnian Produk Penanganan Limbah Cair

Bahan Baku Media

Bioreaktor

Pengemasan produk

Proses HilirCrude enzim pengendapan dengan (NH4)2SO4 dialisis kromatografi penukar ion evaporasi liofilisai Analisis BM : Elektroforesis SDS

Protease production from rice mills wastes using solid fermentation (Paranthaman, 2009)Microorganism : Aspergillus niger in PDA slant agar Inoculum : suspension of spores of 7 days cultures of A. niger Production of protease by solid fermentation media composition : - broken rice - 50 % mineral solution (g/100ml) : NH4NO3 0.5, KH2PO4 0.2, NaCl 0.1, MgSO4 0.1 Fermentation condition : 35oC, 120 hours

Downstream

The crude enzyme was extracted using tween 80 0.1 % in amount of 100 ml per 2 grams of fermented substrates homogenized in shaker 180 rpm for 1 hour filtration clear supernatan is the crude enzyme can be used for detergent and leather industry

Alkaline Protease Production by B. polymixa and B. cereus (Maal et al. 2009)

Microorganisms were isolated from various soil samples and adapted using alkaline skim milk medium pH 9 -11 Media used was various media containing milk protein such as milk showed the best result

ENZIM SELULASE

Penting dalam konversi limbah organik berselulosa menjadi glukosa Aplikasi : * PST, makanan ternak, etanol * Campuran karbohidrase dan selulase A. niger dpt digunakan untuk pengupasan udang serta kotoran kerang Mampu memutus ikatan beta 1, 4 glikosidik dalam selulosa, selodekstrin, selobiosa, dan turunan selulosa lain

KarakteristikMerupakan kompleks enzim yang bekerja bertahap atau bersama menguraikan selulosa menjadi glukosa Kebanyakan bersifat ekstraseluler Menghidrolisis substrat yang berBM tinggi Kelebihan enzim ekstraseluler : - relatif lebih stabil, tingkat kemurnian lebih tinggi, lebih mudah proses hilirnya * Merupakan enzim induksi : hanya diproduksi jika ada selulosa atau glukan lain dg ikatan beta 1,4 seperti selobiosa

MIKROORGANISME

Kapang Trichoderma viride/resei , T.koningii, A.terreus, A.niger, P.iriensis, P.verruculosum, P.fumiculosum, Myrothecium verrucaria, Fusarium solani, Phanerochyaete chrysosporium, Pellicularia filamentosa , Eupenicillium javanicum, dll

Yang paling banyak diteliti dan diproduksi komersil

T. viridae/reesei, A. niger

Karena : - Mampu tumbuh cepat - Yield tinggi

Pernah juga digunakan kultur campuran Aspergillus sp dg T. reesei

Bakteri penghasil selulase

Pseudomonas fluorescent var sellulosa Cellumonas Bacillus sp Clostridium thermocellum yield paling baik

Teknik Kultivasi Selulase

Kapang cair

kuiltivasi padat atau

-

-

Kultivasi padat : Hasil enzim per gram selulosa lebih tinggi Waktu lebih lama

Contoh komposisi media selulase dg kapang

(NH4)2SO4 1,4 g/l; KH2PO4 2,0 g/l, Urea 0.3 g/l, CaCl2 0.3 g/l, MgSO4.7H2O 0,3 g/L,FeSO4.7H2O 0.005 g/L, MnSO4.H2O 0.0016 g/l; ZnSO4.7H2O 0.0014 g/L, CaCl2 0.002 g/L, Protease pepton 0,75 g/L, Tween 80 (surfaktan) 2.02.0 g/l, Selulosa 7,5 g/L

Sumber karbon

Selulosa murni, turunan selulosa atau selulosa alami Selulosa alami dari limbah pertanian seperti limbah penggergajian kayu, tongkol jagung, sekam padi, bagasse, dll Selulosa murni yield lebih tinggi

Faktor yang berpengaruh

Jumlah selulosa dan tingkat kemurniannya Penggunaan nitrogen organik spt pepton, yeast ekstrak Penambahan urea Penggunaan surfaktan (tween 80) meningkatkan permeabilitas membran sel terhadap enzim shg sekresi enzim menjadi cepat sekresi enzim yang cepat akan meningkatkan sintesa enzim

Faktor yang berpengaruh (lanjutan)

pH media enzim menjadi inaktif jika pH terlalu asam; pH terlalu tinggi akan menurunkan rendemen selulase Kultivasi padat pH sulit diatur. Diatur dg penambahan buffer dg pH mendekati nilai pH untuk aktivitas optimum enzim pH 5-6) Suhu kapang A. niger : 25-28oC

Proses Hilir

Pengendapan protein Kromatografi Elektroforesis

ENZIM AMILASE

1. 2. 3.

Menyerang ikatan glikosidik secara acak di bagian molekul baik pada amilosa maupun amilopektin Tiga golongan : -amilase (endoamilase) -amilase (eksoamilase) Glukoamilase

-amilase

Menyerang ikatan glikosidik di bagian dalam molekul amilosa Hasilnya : oligosakarida dan maltosa

-amilase

Menyerang ikatan glikosidik pada bagian luar substrat Hasilnya maltosa dan dekstrin

Glukoamilase

Menghasilkan glukosa

Industri Gula Cair1. Peran enzim pada ind gula cair terbesar diantara industri lainnya 2. Gula cair digunakan untuk pengolahan bahan pangan, roti dan kue serta minuman ringan, dll

Suspensi patiGelatinasi Pati (95-105 0C) -Amilase bakteri (pH 6.0-6.6, 105oC, 5 mnt atau 95oC 1-2 jam Sakarifikasi -Amilase kapang + glukoamilase pH 5.0, 55oC, 42 jam Sirup Glukosa

Maltodekstrin Sakarifikasi Glukoamilase atau Sakarifikasi Glukoamilase+ Pululanase pH 4.0-4.5, 60oC, 48-72 jam Sirup Glukosa

Amilase kapang atau -amilase pH 5.5, 55oC, 42 jam

Kolom Penukar Ion Isomerisasi Sirup Maltosa Glukosa isomerase pH 7.5-8.5, 60-65oC, 2-4 jam Sirup Fruktosa Pemurnian Sirup Fruktosa Berkadar tinggi

Produksi Sirup GlukosaPati Sagu CaCO3 Pencampuran Suspensi Pati Sagu 30% NaOH Pengaturan pH 6.2 Gelatinisasi akuades

E-amilase1,75 U/g pati

Likuifikasi (90oC)Waktu Likuifikasi 210 mnt Hasil proses likuifikasi Rendemen sirup glukosa = 63,27%. Nilai ekuivalen dekstrosa = 98,9 %

AMG 0,3 U/g pati

Sakarifikasi(60oC, pH 4,5) Waktu Sakarifikasi 48 jam Hasil Proses Sakarifikasi

Arang Aktif 2 % bk pati

Dekolorisasi 1 jam 80 oC Penyaringan Sirup Glukosa

Gambar 1. Proses Hidrolisis Pati Sagu

Mikroorganisme dan Media

Bakteri B.licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis Media fermentasi : Pati, ekstrak khamir, tripton, MgCl2, KH2PO4, NaCl, (NH4)2SO4

PROSES HILIR

Enzim kasar pengendapan dg PEG-fosfat pengendapan dg aseton sentrifugasi Gel filtrasi