PCR 引物设计及软件使用技巧
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PCR 引物设计及软件使用技巧
←3’
5’
Sense primer
Antisense primer
→
王深浩
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引物设计是 PCR 技术中至关重要的一环
使用不合适的 PCR 引物容易导致实验失败:
a. 非特异性扩增
b. 扩增产物量较少
c. 无扩增产物
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2. 引物设计的原则
1. 引物与模板的序列要紧密互补
2. 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构
3. 引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应 ( 即错配 )
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引物设计时考虑的因素引物长度 碱基分布的均衡性Tm值引物二级结构引物3’端引物5’端引物的内部稳定性引物的保守性与特异性
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常用的是 18-27bp ,太短则特异性降低容易引起错配,太长则结合能量过高,不易结合。
1. 引物长度引物的长度一般为 15-30 bp
2. 引物 GC 含量在 40%~60% 间,上下游引物 GC 含量差异不要太大
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a. 引物 3’ 端的末位使用碱基 A 引物 3’ 端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较
大的影响,末位碱基为 A 的错配效率明显高于其他 3 个碱基
3. 引物的 3’ 端
b. 引物 3’ 端不要出现 3 个以上的连续相同碱基,如 GGG 或 CCC ,也会使错误引发机率增加
c. 引物的延伸从 3’ 端开始,因此 3’ 端的几个碱基与模板 DNA 均需严格配对,不能进行任何修饰,否则不能进行有效的延伸,甚至导致 PCR 扩增完全失败。
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5. PCR 反应的 Tm 值(退火温度) . 一般在 55 ~ 70 ℃ 之间。
(这个温度不同软件的计算差异很大,有时需要实验人员摸索条件)
4. 引物 5’ 端 引物 5’ 端可以有与模板 DNA 不配对碱基,在 5’ 端
引入一段非模板依赖性序列,如增加酶切位点等
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6. 引物中尽量避免发夹结构和引物二聚体的出现。
发夹结构:发夹结构:55’’-- ACATGAGGTACCAGCCCCATGT ACATGAGGTACCAGCCCCATGT --33’’
55’’-- ACATGAGGTACACATGAGGTAC……
||||| ||||||| ||
33’’-- TGTACCCCGACTGTACCCCGAC……
引物二聚体结构:引物二聚体结构:上游:上游:TACCGAACTCAGGGAACAGCTACCGAACTCAGGGAACAGC
|| ||| ||| ||| ||| ||| |
下游:下游: GACTCCATTGCCTAGCCTGGGACTCCATTGCCTAGCCTGG
Hairpin
Dimer
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7. 防止引物错误引发( False priming )
primer1 primer1
primer2 primer2
目的区域
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Primer Premier 5.0 的特点•人工操作,精度高•对于复杂结构引物设计可以结合试验条件 对引物做出取舍•总能设计出引物
•效率低,不适合大规模设计引物
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Primer Premier 3.0 ( on line )的特点
•操作简单,方便•无需考虑太多的因素•设计的引物可信度较高
•不能对于复杂结构引物设计可以结合试验条件对引物做出取舍
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