PCRPCR 引物设计及相关软件使用引物设计及相关软件使用PCRPCR 引物设计及相关软件使用引物设计及相关软件使用

主要内容• PCR 介绍• 引物设计原理• 引物设计的优化原则• Primer Premier 5.0 介绍• 举例说明引物的设计

PCR介绍1 、什么是 PCR

2 、 PCR 的组成

3 、如何提高 PCR 成功率 （定量，对照）

引物设计原理 引物设计的目的是为了找到一对合适的

核苷酸片段，使其能有效地扩增模板 DNA 序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选 。

引物设计的原则1 、引物长度 大多数应用的最短引物长度为 18 个核

苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500 bp ，选用短的 (16 ～ 18) 的引物；若产物长 5 kb ，则用 24 个核苷酸的引

物。有人用 20 ～ 23 个核苷酸引物得到40 kb 的产物。

引物设计的原则2 、引物 GC 含量

GC 含量在 40% － 60% 之间，以 45-55％为宜。这可为有效退火提供足够热。

引物设计的原则3 、引物 Tm

引物所对应模板序列的 Tm 值最好 72℃ 左右。至少要在 55 － 80℃ 之间。

Tm=2(A+T)+4(C+G)

引物设计的原则4 、引物 3’ 端

• 引物 3’ 末端和模板的碱基完全配对 • 防止一对引物内的同源性 • 考虑末端 5 个碱基的 ΔG • 引物 3′ 端要避开密码子的第 3 位

引物设计的原则5 、引物序列与模板序列组成的相似性

可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高 。

引物设计的原则6 、最好在模板 cDNA 的保守区内设计

DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如 DNAman ）比对（ Alignment ），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

引物设计的原则7 、引物自身及引物之间不应存在互补序

列

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（ Hairpin ）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

引物设计的原则8 、碱基要随机分布

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3’ 端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（ False priming ）。

引物设计的原则9 、引物应具有特异性

引物设计完成以后，应对其进行检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

引物设计的原则10 、 ΔG 值 ΔG 值 ( 自由能 )反映了引物与模板结合

的强弱程度。一般情况下，引物的 ΔG值最好呈正弦曲线形状，即 5’ 端和中间 ΔG 值较高，而 3’ 端 ΔG 值相对较低，且不要超过 9 （ ΔG 值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。

引物设计的原则11 、引物的 5′ 端 引物的 5′ 端可以修饰，而 3′ 端不可修饰，引物 5′ 端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

引物设计的原则

12 、在 DNA 测序和 PCR 中最好用 5′ 末端稳定 ( 如 GC 含量较多 ) ，而 3′ 末端不太稳定 ( 如 AT 含量较多 ) 的引物

Primer Premier 5.0 简介主要功能 :

1 、即引物设计2 、限制性内切酶位点分析3 、 DNA 基元 (motif)查找4 、同源性分析

Primer Premier 5.0 使用介绍

Preimer Premier 启动界面

Load sequence

基本信息

Sequence nameOriginal sequence

Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or

a protein seq to a DAN seq 8 种密码子偏好

Choose a function

引物设计界面First you can design the primer

manually

Sense strand or anti-sense strand

Useful information of the primer

引物搜索选项设定引物类型

搜索模式

5’ 引物位置范围

3’ 引物位置范围

产物大小范围

引物长度

搜索结果28 对引物

引物分值100 分为满分

每对引物的信息

双击选中一对引物

引物信息回到主窗口

引物及产物信息

是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross dimer

一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有

But …

引物编辑

引物编辑Edit primer here

Analysis the edit result

Accept the edit result Return to the main

window

任务用绿色荧光蛋白 (GFP)标记蛋白 NR1

举例说明

SP

BamHI

pcDNA3.1

NR1

Plasmid 1:

Plasmid 2

GFP

SP

BamHI(GGATCC)

pcDNA3.1

NR1-1a

GFP

121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat

181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag

241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc

301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt

361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc

421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct

481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt

541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac

601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc

661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca

721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac

781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa

NR1 的编码序列 (~4000bp)

红色为信号肽 , 蓝色为 BamHI酶切位点 , 下划线标出酶切位点的阅读框

ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAA

CATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGC

ATG GACGAGCTGT ACAAGTAA

GFP 序列 (~700bp)

引物要求

• PCR 扩增 GFP

• GFP两边添加 BamHI酶切位点

• 保证 NR1 的阅读框不改变

5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’ 3’ TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5’

GFP 序列

5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’

3’ TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………CGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5’Primer1: 5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………

………..AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5’ Primer2

Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..

Primer2: 5’ TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….

Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..

Primer2: 5’ CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….

第一步：扩增 GFP 基本序列

变性 , 引物复性

第二步： GC 比值； Tm 值

Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA…………..

Primer2: 5’ CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….

Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （ GC:60%,Tm ： 64 ）Primer2: 5’ CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （ GC:57%,Tm ： 66 ）

第三步：酶切位点

Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （ GC:60%,Tm ： 64 ）

Primer2: 5’ CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （ GC:57%,Tm ： 66 ）

BamHI: ggatcc

Primer1: 5’ ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

Primer2: 5’ ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC

第四步：阅读框

atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct…..

Primer1: 5’ ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

NR1 序列：

Primer1: 5’ ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct

NR1 序列：

5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’

GFP 序列

cgc gcg gat ccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC ……………………………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG ??ggat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct

插入 GFP 后的组合序列

Primer2: 5’ ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC

Primer2: 5’ gg atc cct CTTGTACAGCTCGTCCATGCC

第五步 保护序列

Primer1: 5’ GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

Primer2: 5’ GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC