Digitaalinen PCR ja sen virologiset sovellukset · •konventionaalinen PCR •reaaliaikainen PCR,...

www.helsinki.fi/yliopisto

Digitaalinen PCR ja sen virologiset sovellukset

Leena Maunula, FT, Dos.Elintarvikehygienian ja ympäristöterveyden osasto

Eläinlääketieteellinen tiedekunta,Helsingin yliopisto29.10.2019 Turku

1


• konventionaalinen PCR• reaaliaikainen PCR, qPCR• digitaalinen PCR, dPCR

PCR - polymeraasiketjureaktio

24.10.2019 2

Quan et al., MDPI. DPCR – a technology reviewSensors, 2018 18, 1271; doi:10.3390/s18041271

ELTDK/Maunula


Geenimonistus ja PCR-tuotteen visualisointi; perinteinen PCR

• Teoriassa DNA:n määrä kaksinkertaistuu jokaisella monistuskierroksella:• 20 kierrosta: 106

genomikopiota/reaktio• 30 kierrosta: 109

• Visualisointi aineella, joka tarttuu dsDNA:han: • agaroosigeeli-elektroforeesi,

EtBr-värjäys, UV-valo• tai SYBRgreen

ELTDK/Maunula


Monistuminen/amplifikaatio reaaliaikaisen PCR-reaktion aikana

24.10.2019 4


Suhteellinenfluoresenssi

Syklien määrä

ELTDK/Maunula

Kaksoisleimattu koetin - Taqman-kemia

5’ 3’

DNA

5’ 3’

DNA

5’-3’-eksonukleaasiaktiivisuus

F q

F

q

Primer (aluke) 5’3’ Probe (koetin)

Taq polymerase

-> hydrolyysi (irrottaa DNA-ketjusta nukleiinihappoja)

F= fluorofori, esim. FAMQ= quencher, vaimentaja - vaimentaa lähellä olevanfluoroforin

eksitaatio

eksitaatioemissio

eksitaatio = aktivoiminenELTDK/Maunula

qPCR - standardikäyrä

Cq-arvo

15

20

25

30

1 2 3Nukleiinihapon määrä standardissa(log10-yksikköinä)

Cq näytteessä

Nukleiinihapon määrä näytteessä

Standardi

Best-fit linear regression

ELTDK/Maunula

qPCR-yleisiä vaatimuksia standardille

• On olennaisen tärkeää, että standardin ja tutkittavan näytteen monistumistehokkuudet ovat samalla tasolla (amplification efficiency) -> muuten virheelliset nukleiinihappomäärät näytteelle

Ct

Log ng totaali RNA

Näyte

Referenssi

EsimerkkierilaisistaPCR-tehokkuuksista

ELTDK/Maunula


• qPCR-testin voi ’siirtää’ dPCR-testiksi, sillä yleensä

samat alukkeet toimivat

• myös samat kemiat toimivat

• Reaktionesteeseen lisättyä SYBRgreen I -väriä

vastaava dsDNA:han tarttuva väri (esim. EvaGreen)

• Taqman-kemiaan perustuva koetin-testi

‒ esimerkiksi FAM-leiman käyttö koettimessa

Reaaliaikaisesta digitaaliseen

24.10.2019 8

ELTDK/Maunula


• Näyte jaetaan osanäytteiksi (mikroreaktiot)• tähdätään siihen, että kussakin mikroreaktiossa on vain

muutama tai ei ollenkaan kohdesekvenssiä• kun kohdesekvenssejä on vähän, niiden konsentraatio

mikroreaktiossa on korkeampi kuin jos kaikki olisivat yhdessä isommassa reaktiotilavuudessa

• PCR-ajon jälkeen positiivisten mikroreaktioiden osuus kaikista lasketaan ja osuuden perusteella päätellään kohdesekvenssin konsentraatio Poissonintilastoanalyysillä

dPCR-testin periaate

24.10.2019 9ELTDK/Maunula


Digitaalinen PCR-testi vaiheittain

24.10.2019 10


Osittaminen Monistus Detektio

Näytteen monistumisen tehokkuuserot eivät vaikuta tuloksiin.

ELTDK/Maunula


qPCR• jokaisen näytteen

fluoresenssin kertymää mitataan joka syklissä monistusprosessin ajan

• kvantitaatiokohdesekvenssin monistumisen eksponentiaalisessa vaiheessa

dPCR• Näytteiden

(osanäytteiden) fluoresenssisignaali mitataan vasta PCR-ajon jälkeen (end point)

• positiivisten ositusten suhteesta kaikkiin osituksiin lasketaan takautuvasti kohteen alkuperäinen konsentraatio

qPCR-testin ja dPCR-testin ratkaiseva ero on kohdesekvenssien lukumäärän mittauksessa



• Poisson-jakauma kuvaa harvinaisen tapahtuman todennäköisyyttä• esimerkki tapahtumasta:

todennäköisyys huomata kirjoitusvirhe tekstissä

• l = keskimääräinen tapahtumien määrä tietyssä ajassa

• tapahtumat toisistaan riippumattomia

dPCR hyödyntää Poisson-jakaumaa

24.10.2019 12

http://zoonek2.free.fr/UNIX/48_R/07.html

ELTDK/Maunula


• Esimerkki: 5000 kohdesekvenssiä 20 000 mikroreaktiossa• Tilastollisesti

• 78% reaktioista sisältää 0 kohdesekvenssiä• 19.5% 1• 2,4% 2• 0,2% 3• 0,01% 4

• Kääntäen: Kun tiedetään positiivisten mikroreaktioiden jakauma, voidaan päätellä alkuperäinen kohdesekvenssien lukumäärä näytteessä

Poisson-jakauma ennustaa, mikä osuus mikroreaktioista sisältää tietyn määrän kohdesekvenssiä



• Poisson-tilastoanalyysi olettaa, että

• kohdesekvenssi on jakautunut tasaisesti osituksiin

• kaikkien ositusten tilavuus on sama

Poisson-jakauman oletukset

24.10.2019 14

https://fi.wikipedia.org/wiki/Poissonin_jakauma#/media/Tiedosto:Poisson_pmf.svg

ELTDK/Maunula


• Tutkittu analyytti on yleensä vain osa näytteestä, mikä asettaa ehdottoman rajan kvantitaation ulkoiselle tarkkuudelle (accuracy)• kun keskimääräinen tapahtumien määrä on matala,

kvantitaatio ei kerro ’totuutta’ millään mittaustekniikalla• sattumanvaraista eroa voidaan vähentää rinnakkaisilla

• dPCR-testin sisäistä tarkkuutta (precision) rajoittaa• näytteenotosta (otanta, sampling) johtuva

mittausepävarmuus, erityisesti vähän kohdetta sisältävissä konsentraatioissa

Ulkoinen ja sisäinen tarkkuus



• Perustutkimus, kliininen diagnostiikka, ympäristötutkimus

• Patogeenien tunnistus• Nestebiopsiat syövän monitorointiin• Elinsiirtojen hylkimisreaktiot• Non-invasiivinen prenataalitestaus• Kopiolukumuutokset (copy number variation)• Yksisoluanalyysit

Sovelluksia



• Harvinaisen tapahtuman määritys (rare eventdetection)

• Yhden geenin ekspressioanalyysi• Metylaatiomuutokset syövän biomarkkerina• NGS (uuden sukupolven sekvensointi), harvinaiset

mutaatiot, kirjastojen kalibraatio/NGS-tulosten validaatio, kokogenomiamplifikaatio

Sovelluksia, jatkuu



• Näyte 20µl reaktiossa• villityypin molekyylejä on

40 000 kpl• muuttuneita

kohdemolekyylejä on 40 eli 0,1%

• testit eivät havaitse helposti muuttuneita molekyylejä

• Kun osituksia 20 000 ja kunkin volyymi 1 nl• jos muuttuneita

kohdemolekyylejä on 40:ssä osareaktiossa

• negatiivisia osareaktioita on 19960 kpl

• kohteen abundanssi(runsaus) on 33% eli 330-kertainen herkkyyden kasvu

• testi pystyy havaitsemaan muuttuneet molekyylit

dPCR-testi soveltuu erityisen hyvin vähäisten muuttuneiden kohdemolekyylien osoitukseen isommasta joukosta



• liittyy mikroskooppisten neste- ja kaasuvirtausten hallintaan

• tilavuudet nano- ja pikolitroja, virtausnopeudet nano-ja mikrolitroja minuutissa

‒ pintajännitys, kapillaarivoimat, laminaarivirtaus

‒ erona mikroarray-systeemille, että nestettä liikutellaan sirulla annostelun jälkeen (mikroarray on staattinen)

Mikrofluidistiikka

24.10.2019Eläinlääketieteellinen tiedekunta / Henkilön nimi / Esityksen nimi 19

Erilliset mikroreaktiotVäliaikaiset kanavat Näytteen lataus

Quan et al., MDPI.; doi:10.3390/s18041271


• Droplet-pisaroiden tilavuus on piko- tai nanolitroja• Ne koostuvat nesteestä ja öljystä

• Fluorattu öljy ja fluoratut pinta-aktiiviset aineet helpottavat droplet-pisaroiden pysymistä stabiileina korkeissa lämpötiloissa ja estävät varattujen biomolekyylien sitoutumista pinnalle

Mitä droplet-pisarat ovat?



Droplet-mikrofluidistiikkaa

24.10.2019 21

öljy/pintakäsit-

telyaine

droplet-generaattori

fluoresenssi-

signaalin

mittaus - yksi

droplet

kerrallaan

dropletsQuan et al., MDPI. DPCR – a technology review

Sensors, 2018 18, 1271; doi:10.3390/s18041271

ELTDK/Maunula


ddPCR-tulos QuantaSoft-ohjelmassa

24.10.2019 22

Huggett et al., 2013, Digital MIQE Guidelines

Fluoresenssinamplitudi

Tapahtumien määrä

Frekvenssi

Amplitudi

Neg

Neg

Pos

Pos

ELTDK/Maunula


Multiplex – droplet dPCR- fluoresenssin intensiteetin eri tasoja voidaan hyödyntää

24.10.2019 23


Esimerkki 2: 1.5 x probe 1 (FAM) + 1 x probe 2 (FAM) ja1 x probe 3 (VIC) + 0.6 x probe 4 (VIC)

Esim. target 2: 2 kohdemolekyyliä/droplet

Esimerkki 1.

ELTDK/Maunula


• Fluoresenssisignaalin määrä on verrannollinen DNA-määrään• Multiplex-testi toimii fluoresenssileimattuja koettimia (probeja)

käytettäessä, useita tapoja• dPCR-testissä voidaan käyttää useita fluoroforeja (esim. 1 FAM-

leimattu ja 1 VIC-leimattu koetin samassa reaktiossa), kuten qPCR-testissä

• Tai voidaan hyödyntää värin intensiteettiä siten, että koettimet leimataan samalla fluoroforilla, mutta niitä käytetään eri konsentraatiossa (ei sovellu qPCR-testille)• voidaan myös suunnitella eri pituiset PCR-tuotteet,

fluoresenssisignaalin määrä on suhteessa tarttuvien molekyylien määrään

Multiplex-dPCR - periaatteita



• Norovirus voi levitä mm. elintarvikkeiden välityksellä• Noin 14% norovirusinfektioista liittyy elintarvikkeisiin

(Verhoef et al., 2015, EID 21;592)

• Testasimme elintarvike-, vesi- ja pintanäytteitänoroviruksen suhteen ja vertasimme qPCR ja dPCR-tuloksia (mukana tietysti käänteiskopiointi, kun on kyseessä RNA-genomin omaava virus, eli RT-qPCR ja RT-dPCR)

Alustavia kokemuksianoroviruksen nukleiinihaponosoitustestistä



Nukleiinihapon eristys ja genomidetektio

NukleiinihappoekstraktiominiMag®-laitteella

RT-qPCR, noroviruksen genoryhmillespesifiset alukkeet ja koetin

Loisy, F., R.L. Atmar, P. Guillona, P. Le Canna, M. Pommepuy, and F.S. Le Guyader. 2005. Real-timeRT-PCR for norovirus screening in shellfish. J. Virol. Methods. 123:1-7

24.10.2019 27Eläinlääketieteellinen tiedekunta / Henkilön nimi / Esityksen nimi

Näyte-RNA + RT-ddPCRreaktioseos 96-kuoppalevylle

Droplet-generaattori:-> 20000 vesi-öljy-droplet-

pisaraa jokaisesta näytteestä

RT-PCRKonventionaalinen-PCR

Droplet readerQuantSoft-ohjelmisto

Näyte-RNA tai std-laimennossarja + RT-qPCR

seoksessa

Reaaliaikainen RT-qPCR-ajoTulosten määritys std-käyrän

avulla

Standardin valmistus, yleensä plasmidista, geenikopiomäärän määritys

qPCR ddPCR

ELTDK/Maunula


• qPCR: Taqman-kemia, alukkeet ja FAM-leimattu koetin, modifioitu menetelmä ISO TC15216-2, 2013

• One step: QuantiTect probe RT-PCR kit (Rotor-Gene)

• Digital PCR: samat alukkeet ja koetin kuin yllä• Digital droplet PCR Bio-Rad system• One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes (PCR-ajo

perus-PCR-laitteella)

Norovirus: qPCR and ddPCR

28

ELTDK/Maunula

29

Norovirus genoryhmä I – positiivinenkontrolli

PCR-ajo Näyte ddPCR gc (genomi-kopiota)/ reaktio

1 G I pos. kontr. 79.2




ELTDK/Maunula

30

Norovirus GII kontrolli –laimennussarja

Näyte,laimennos

qPCR gc/ reaktio

ddPCR gc/ reaktio

GII pos. k. 723 975

1:10 94 861:40 38 31

1:80 13 8

1:160 6 4

1:320 3 7

1:640 0 0

Rinnakkaisten keskiarvo

ELTDK/Maunula


ddPCR-tuloksia

31

Neg. droplets

A. B.

ELTDK/Maunula


• ddPCR-tulokset vaikuttivat toistettavilta silloinkin, kungenomikopioiden lukumäärä oli matala.

• Norovirus genoryhmän II dPCR-testi näytti toimivan yhtähyvin kuin qPCR.

• ddPCR-workflow oli jonkin verran työläämpi ja vei myösenemmän aikaa kuin qPCR.

• Edelleen, qPCR tuntui sopivammalta, kun vaadittiin suurtaherkkyyttä kvalitatiivisessa testauksessa.

• Sen sijaan ddPCR tuntui sopivan silloin, kun vaadittiinhyvin toistettavia, kvantitatiivisia testituloksia.

Päätelmiä testauksesta

32ELTDK/Maunula


• Ei ole välttämättä yhtä herkkä kuin qPCR• Paljon erilaisia teknisiä versioita (ei avoin alusta)• Osa systeemeistä hitaampia ja/tai kalliimpia kuin

qPCR• Multiplex-testaus ei yhtä vaivatonta kuin qPCR-

testissä

dPCR-testin huonoja puolia



• Menetelmässä ei tarvita standardisuoraa/käyrää• Tarkkuus on hyvä• Absoluuttinen määritys• Harvinaisten mutanttien osoitus

• Toistettavuus hyvä sekä ajallisesti että eri laboratorioiden välillä

• Parempi sieto näytteen sisältämille PCR-inhibiittoreille

dPCR-testin hyviä puolia



• Kiitokset Tiina Iivanaiselle dPCR-työstä

Kiitos!


Digitaalinen PCR ja sen virologiset sovellukset · •konventionaalinen PCR •reaaliaikainen PCR,...

Documents

Transcript of Digitaalinen PCR ja sen virologiset sovellukset · •konventionaalinen PCR •reaaliaikainen PCR,...