NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN...

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

NGUYỄN NGỌC QUANG

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR

VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN

TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

NGUYỄN NGỌC QUANG

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR

VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN

TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 942 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. Chu Hoàng Hà

2. TS. BS. Nguyễn Phi Hùng

Hà Nội – 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng nghiên cứu,

cộng tác với các nhà khoa học khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã

được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành cũng như các hội nghị trong

nước và quốc tế với sự đồng ý và cho phép của đồng tác giả; những kết quả còn lại

trong luận án chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Ngọc Quang


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Viện Công

nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, chỉ

bảo tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án. Thầy không chỉ truyền thụ

cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm

túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực

hiện luận án là hành trang giúp tôi tự tin vững bước trên con đường khoa học sau

này.

Trong thời gian học tập và nghiên cứu, tôi xin trân trọng cảm ơn TS. BS.

Nguyễn Phi Hùng, Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K.

Thầy đã luôn hướng dẫn, động viên, dành cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong

những lúc tôi gặp khó khăn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Tạ Văn Tờ, TS. Vương Diệu Linh và các

đồng nghiệp thuộc Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K đã

tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen,

Viện Công Nghệ Sinh học đã luôn bên cạnh giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời

gian qua.

Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho bố mẹ, bạn bè đã luôn tin tưởng,

thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn trong thời gian qua, giúp

tôi hoàn thành tốt luận án này.

Nghiên cứu sinh


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 4

1.1. Ung thư phổi......................................................................................................... 4

1.1.1. Thực trạng ung thư phổi .................................................................................... 4

1.1.2. Phân loại ung thư phổi ...................................................................................... 6

1.1.3. Các giai đoạn ung thư phổi ............................................................................... 7

1.2. Ung thư biểu mô tuyến của phổi .......................................................................... 9

1.2.1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến ....................................................................... 9

1.2.2. Các phân típ mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến ................................ 11

1.3. Biến đổi gen EGFR trong ung thư phổi ............................................................. 13

1.3.1. Cấu trúc và chức năng gen EGFR ................................................................... 13

1.3.2. Đột biến gen EGFR trong ung thư phổi .......................................................... 15

1.3.3. Biểu hiện protein EGFR trong ung thư phổi ................................................... 17

1.4. Methyl hóa DNA trong ung thư phổi ................................................................. 17

1.4.1. Methyl hóa DNA ............................................................................................. 17

1.4.2. Methyl hóa các gen EGFR, BRCA1, MLH1, MGMT và RASSF1A trong

ung thư phổi ...................................................................................................... 20

1.5. Điều trị đích trong ung thư và ung thư phổi ....................................................... 29

1.5.1. Điều trị đích trong ung thư .............................................................................. 29

1.5.2. Điều trị đích trong ung thư phổi ...................................................................... 31

1.6. Phương pháp phân tích biến đổi phân tử trong ung thư phổi ............................. 33

1.6.1. Phương pháp phân tích đột biến gen trong ung thư phổi ................................ 33

1.6.2. Phương pháp phân tích methyl hóa DNA trong ung thư phổi ........................ 35

1.7. Nghiên cứu các dấu ấn phân tử trong ung thư phổi ở Việt Nam ....................... 37

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................... 39

2.1. Vật liệu ............................................................................................................... 39

2.1.1. Mẫu nghiên cứu ............................................................................................... 39

2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................... 39

2.2. Thiết bị chính ..................................................................................................... 42

2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 43

2.3.1. Tách chiết DNA tổng số và xác định nồng độ DNA ...................................... 43

2.3.2. Xử lý bisulfite với DNA tổng số ..................................................................... 44

2.3.3. Phương pháp PCR ........................................................................................... 44

2.3.4. Phương pháp điện di ....................................................................................... 47

2.3.5. Phương pháp xác đinh đột biến gen EGFR ..................................................... 47

2.3.6. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch ......................................................... 48

2.3.7. Phương pháp tạo trình tự DNA methyl bằng enzyme M.sssI ......................... 49

2.3.8. Xử lý kết quả bằng thống kê sinh học ............................................................. 50

2.4. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................................ 50

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ ...................................................................................... 51

3.1. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu ........................................................................ 51

3.2. Đột biến và biểu hiện gen EGFR ....................................................................... 52

3.2.1 Đột biến gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ...................... 52

3.2.2. Biểu hiện protein EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân .............. 56

3.3. Tình trạng methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến của

phổi ................................................................................................................... 59

3.3.1. Methyl hóa gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ................ 59

3.3.2. Methyl hóa gen BRCA1 và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân .............. 61

3.3.3. Methyl hóa gen MGMT và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ............... 63

3.3.4. Methyl hóa gen MLH1 và sự tương quan đặc điểm bệnh nhân ...................... 65

3.3.5. Methyl hóa gen RASSF1A và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân ........... 66

3.4. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa một

số gen liên quan đến ung thư tuyến của phổi ................................................... 68

3.4.1. Tương quan giữa đột biến, biểu hiện và methyl hóa gen EGFR ..................... 68

3.4.2. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa

các gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ................................................. 71

3.4.3. Tương quan về tình trạng methyl giữa các gen liên quan đến ung thư biểu

mô tuyến của phổi ............................................................................................ 74

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ...................................................................................... 76

4.1. Đặc điểm phân tử gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi..... 76

4.1.1. Đột biến vùng hoạt hóa Tyrosine Kinase gen EGFR ...................................... 76

4.1.2. Biểu hiện quá mức của protein EGFR ............................................................ 78

4.1.3. Methyl hóa vùng promoter EGFR .................................................................. 80

4.1.4. Tương quan giữa các đặc điểm phân tử gen EGFR ........................................ 81

4.2. Methyl hóa gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ở bệnh

nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi .............................................................. 83

4.2.1. Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1 .......................................................... 83

4.2.2. Methyl hóa vùng promoter gen MGMT .......................................................... 84

4.2.3. Methyl hóa vùng promoter gen MLH1 ........................................................... 86

4.2.4. Methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A ...................................................... 87

4.3. Tương quan giữa những đặc điểm phân tử gen EGFR với sự methyl hóa

BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A trong ung thư biểu mô tuyến của

phổi ................................................................................................................... 88

4.3.1. Đột biến EGFR với sự methyl hóa quá mức các gen ức chế khối u ............... 88

4.3.2. Biểu hiện EGFR với sự methyl hóa các gen ức chế khối u ............................ 90

4.3.3. Sự methyl hóa đồng thời của một số gen liên quan đến ung thư biểu mô

tuyến của phổi................................................................................................... 91

KẾT LUẬN .............................................................................................................. 94

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 95

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN

ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ ............................................................................... 96

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 97

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên đầy đủ

A260 Độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm

AAH Atipical Adenomatous Hyperplasias (Tế bào phân chia quá mức

không điển hình)

ABL Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 gene

ACS American Cancer Society (Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ)

AIS Adenocarcinoma in situ (Ung thư tại chỗ)

ALK Anaplastic Lymphoma Kinase gene

ALK-EML4,

BCR-ABL Chuyển đoạn ALK-EML4, BCR-ABL

APC Adenomatous polyposis of the colon gene

BAC Bronchioloalveolar Carcinoma (Ung thư biểu mô tiểu phế nang)

BCR Breakpoint Cluster Region gene

BRCA1 Breast cancer susceptibility gene (Gen nhạy cảm với ung thư vú)

BRAF v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B

CD74 Cluster of Differentiation 74 gene

CHFR Checkpoint With Forkhead And Ring Finger Domains

CK5/6 Cytokeratin 5/6 protein

CK7 Cytokeratin 7 protein

COBRA Combined Bisulfite Restriction Analysis (Phân tích kết hợp

Bisulfite và cắt giới hạn)

cs. Cộng sự

DAB 3, 3 –diaminobenzidine

DAPK Death‐associated protein kinase

DNA Acid deoxyribonucleic

DNMTs DNA methyltransferase (Enzyme methyl hóa DNA)

dNTP Deoxynucleotide triphosphate

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

EGFR Epidermal growth factor receptor (Yếu tố phát triển biểu mô)

ER Estrogen receptor (thụ thể estrogen)

FDA Food and Drug Administration (Hiệp hội thực phẩm và thuốc

Hoa Kỳ)

FFPE Formalin fixed paraffin embedded

FISH Fluorescence In Situ Hybridization (Lai tại chỗ huỳnh quang)

GTP Guanosine triphosphate

GDP Guanosine diphosphate

GSTP1 Glutathione S-transferase Pi 1 gene

H&E Hematoxylin & Eosin

HDACs Histone deacetylase

HRM High Resolution Melting (Độ phân giải cao nhiệt độ nóng chảy)

HPR Horseradish Peroxidase

IARC International Agency for Research on cancer (Tổ chức nghiên

cứu ung thư thế giới)

IHC Immunohistochemistry (Hóa mô miễn dịch)

MAPK Mitogen-activated protein kinase

MDR Multidrug resistance gene

MEK

(MAP2K1) Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 1

MET Mesenchymal-epithelial transition factor

MIA Minimally Invasive Adenocarcinoma

MGMT O-6-methylguanine-DNA methyltransferase gene

MLH1 MutL homolog 1 gene

MsssI CpG methyltransferase

MS-PCR Methylation Specific PCR (PCR đặc hiệu methyl)

MYC Myelocytomatosis genes

NGS Next Generation Sequencing (Giải trình tự thế hệ mới)

NSCLC Non-small cell lung cancer (Ung thư phổi không tế bào nhỏ)

PI3K Phosphoinositide 3-kinases

PTEN Phosphatase and tensin homologue

PR Progesterone Receptor (Thụ thể progesterone)

RASSF1A Ras association domain family 1A gene

RARP2 The retinoic acid receptor P gene

Ras Rat sarcoma

RB2 Retinoblastoma-like protein 2

RET Rearranged during transfection

ROS1 c-ros oncogene 1gene

SAM S-adenosylmethionine

SCLC Small cell lung cancer (Ung thư phổi tế bào nhỏ)

SDC4 Syndecan 4 gene

SLC34A2 Solute Carrier Family 34 Member 2 gene

SNP Single Nucleotide Polymorphism (Sự đa hình nucleotide)

SSCP Single-strand conformation polymorphism (đa hình cấu trúc sợi

đơn)

TAE Tris-acetate-EDTA

TBE Tris-borate-EDTA

TEMED N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine

TKIs Tyrosine Kinase Inhibitors (Các chất ức chế Tyrosine Kinase)

TIMP3 Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 3 gene

TTF-1 Transcription Termination Factor 1 (Yếu tố kết thúc phiên mã 1)

WHO World Heath Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

WNT Wingless genes

YAP Yes-associated protein

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên

thế giới 5

Hình 1.2 Số ca mắc ung thư mới tại Việt Nam năm 2018 5

Hình 1.3 Phân loại mô bệnh học trong ung thư phổi 7

Hình 1.4 Quá trình hình thành ung thư biểu mô tuyến 11

Hình 1.5 Một số phân típ phổ biến trong ung thư biểu mô tuyến của phổi 12

Hình 1.6 Đường truyền tín hiệu thông qua phân tử EGFR 14

Hình 1.7 Tần suất các dạng đột biến gen EGFR 15

Hình 1.8 Methyl hóa DNA ở tế bào bình thường và tế bào ung thư 19

Hình 1.9 Các vị trí methyl hóa trên gen EGFR 22

Hình 1.10 Cấu trúc gen BRCA1ở người 22

Hình 1.11 Chức năng ức chế khối u của BRCA1 23

Hình 1.12 Cấu trúc gen MLH1 24

Hình 1.13 Các phức hợp sửa chữa DNA của MLH1 24

Hình 1.14 Cấu trúc gen MGMT 26

Hình 1.15 Cơ chế sửa chữa DNA của MGMT 26

Hình 1.16 Cấu trúc của gen RASSF1A và các đồng phân 27

Hình 1.17 Chức năng ức chế khối u của RASSF1A 28

Hình 1.18 Điều trị đích trong ung thư phổi 32

Hình 1.19 Một số kỹ thuật phát hiện đột biến gen 35

Hình 1.20 Lịch sử phát hiện các kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA 36

Hình 2.1 Phương pháp xử lý bisulfite 44

Hình 2.2 Phương pháp RT-PCR Scorpion Arms 48

Hình 2.3 Phương pháp hóa mô miễn dịch 49

Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu 50

Hình 3.1 Kết quả phát hiện đột biến EGFR 53

Hình 3.2 Kết quả hóa mô miễn dịch protein EGFR 56

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa

gen EGFR 59


gen BRCA1 61


gen MGMT 63

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl

hóa MLH1 65


gen RASSF1A 67

Hình 4.1 Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và sự biểu hiện

EGFR 81

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Kit và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 40

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 41

Bảng 2.3 Điều kiện các phản ứng PCR sử dụng trong nghiên cứu 45

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR trong nghiên cứu 46

Bảng 3.1 Đặc điểm của bệnh nhân trong nghiên cứu 51

Bảng 3.2 Các đột biến gen EGFR được phát hiện trong nghiên cứu 52

Bảng 3.3 Tương quan giữa đột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân 54

Bảng 3.4 Tương quan giữa đột biến EGFR và tình trạng hút thuốc ở bệnh

nhân nam giới 55

Bảng 3.5 Mức độ biểu hiện protein EGFR 57

Bảng 3.6 Tương quan giữa mức độ biểu hiện protein EGFR với đặc điểm

bệnh nhân 58

Bảng 3.7 Tương quan giữa methyl hóa EGFR với đặc điểm bệnh nhân 60

Bảng 3.8 Tương quan giữa methyl hóa BRCA1 với đặc điểm bệnh nhân 62

Bảng 3.9 Tương quan giữa methyl hóa MGMT với đặc điểm bệnh nhân 64

Bảng 3.10 Tương quan giữa methyl hóa MHL1 với đặc điểm bệnh nhân 66

Bảng 3.11 Tương quan giữa methyl hóa RASSF1A với đặc điểm bệnh nhân 68

Bảng 3.12 Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và biểu hiện protein

EGFR 69

Bảng 3.13 Tỷ lệ đột biến, biểu hiện protein ở bệnh nhân methyl hóa EGFR 70

Bảng 3.14 Tương quan giữa đột biến và methyl hóa với biểu hiện EGFR 70

Bảng 3.15 Tương quan giữa đột biến EGFR với sự methyl hóa các gen

BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A 72

Bảng 3.16 Tương quan giữa biểu hiện protein EGFR với sự methyl hóa các

gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A 73

Bảng 3.17 Tương quan về tình trạng methyl các gen liên quan đến ung thư

biểu mô tuyển ở phổi 74

1

MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của luận án

Ung thư phổi là loại ung thư có tỷ lệ mắc và tử vong cao nhất trên thế giới

hiện nay. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới, năm 2018 có đến 2,1 triệu

trường hợp mắc mới và 1,8 triệu người chết do ung thu phổi. Trong khi đó, số ca

mắc mới và tử vong ở Việt Nam là 160 000 và 115 000 người. Ung thư phổi được

chia làm hai nhóm chính là ung thư phổi tế bào nhỏ chiếm 10 – 15 % và ung thư

phổi không tế bào nhỏ chiếm 85 – 90 %. Trong đó, ung thư biểu mô tuyến của phổi

là dạng phổ biến nhất, không chỉ gặp ở những người hút thuốc lá mà còn khá phổ

biến ở những người không hút thuốc, phụ nữ và những người trẻ tuổi. Ung thư phổi

nói chung và ung thư biểu mô tuyến của phổi nói riêng có tiên lượng và mức độ đáp

ứng điều trị rất thấp, chỉ 10 – 15 % bệnh nhân ung thư phổi có thể sống sót qua 5

năm. Tuy vậy hiệu quả điều trị sẽ được cải thiện rõ rệt nếu như bệnh nhân được

phát hiện ung thư sớm và sử dụng những phác đồ điều trị hiện đại. Một trong những

phương pháp điều trị mới đang được áp dụng phổ biến hiện nay là những thuốc điều

trị nhắm đích dựa trên những hiểu biết về những biến đổi di truyền của tế bào ung

thư. Ở ung thư phổi không tế bào nhỏ nói chung và ung thư biểu mô tuyến của phổi

nói riêng, phác đồ điều trị bằng thuốc nhắm đích TKIs (Tyrosine Kinase Inhibitors)

dựa trên những đột biến về gen EGFR (Epidermal growth factor receptor) đang

được sử dụng rộng rãi và mang lại những hiệu quả rõ rệt trong việc kéo dài thời

gian sống thêm và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân ung thư phổi. Bên

cạnh đó việc đánh giá sự biểu hiện của gen EGFR cũng góp phần quan trọng trong

việc đưa ra những tiên lượng tiến triển của bệnh cũng như định hướng liều lượng

thuốc cho bệnh nhân. Mặt khác, biểu hiện gen EGFR lại được điều khiển bởi mức

độ methyl hóa vùng promoter của gen này. Cùng với EGFR, methyl hóa các gen ức

chế khối u cũng được xem là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành và phát triển của

ung thư. Methyl hóa các gen ức chế khối u như: BRCA1, MGMT, MLH1,

RASSF1A…. đã được phát hiện trong nhiều loại ung thư trong đó có ung thư phổi.

Thêm vào đó, tình trạng methyl hóa một số gen ức chế khối u dẫn đến tiên lượng

xấu cho bệnh nhân và được xem là marker điển hình trong ung thư phổi. Đồng thời,

2

sự kết hợp thuốc điều trị nhắm đích TKIs với chất loại bỏ nhóm methyl đã mang lại

hiệu quả ban đầu cao hơn so với việc chỉ sử dụng TKIs trên những dòng tế bào ung

thư phổi điển hình.

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về đột biến gen EGFR trên bệnh nhân

ung thư phổi. Tuy nhiên, không có nhiều nghiên cứu tổng thể về những biến đổi

phân tử của gen EGFR và sự ảnh hưởng của hiện tượng methyl hóa các gen ức chế

khối u BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A lên những biến đổi này. Ở Việt Nam hiện

nay, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở mức độ xác định đột biến gen EGFR để đưa ra

phác đồ điều trị bằng TKIs. Vì vậy chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đột

biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl hóa một số gen liên

quan trên bệnh nhân ung thƣ biểu mô tuyến ở phổi” với mục tiêu:

1. Phân tích tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR trên bệnh nhân

ung thư biểu mô tuyển ở phổi.

2. Đánh giá được tình trạng methyl hóa một số gen bao gồm: EGFR, BRCA1,

MGMT, MLH1, RASSF1A và sự tương quan về methyl hóa giữa các gen này với đột

biến và biểu hiện protein EGFR.

Nội dung nghiên cứu

1. Sàng lọc bệnh nhân, thiết lập hồ sơ bệnh án hoàn chỉnh. Thu thập mẫu bệnh

phẩm ung thư phổi và mẫu phổi liền kề.

2. Xác định tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR. Phân tích sự liên

quan của các đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu với đột biến và biểu hiện gen EGFR.

3. Thiết lập và xây dựng điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR đặc hiệu methyl

nhằm xác định tình trạng methyl hóa vùng promoter các gen EGFR, BRCA1,

MGMT, MLH1 và RASSF1A và sự tương quan của hiện tượng này với các đặc điểm

bệnh nhân trong nghiên cứu.

4. Phân tích tương quan giữa đột biến và biểu hiện EGFR với tình trạng methyl

hóa các gen liên quan bao gồm: EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A.

3

Đóng góp mới của luận án

Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam xác định toàn diện các đặc điểm phân tử

của EGFR là đột biến, methyl hóa và biểu hiện protein. Đồng thời, đánh giá được

tình trạng methyl hóa 4 gen ức chế khối u quan trọng trong ung thư biểu mô tuyến

của phổi. Nghiên cứu có một số đóng góp mới và ý nghĩ thực tiễn như sau:

1. Mô tả tỷ lệ đột biến, mức độ biểu hiện của protein EGFR và sự methyl hóa

của một số gen liên quan đến sự phát sinh ung thư, tiến triển bệnh và đáp ứng điều

trị ung thư biểu mô tuyến ở phổi.

2. Chỉ ra được mối liên quan giữa methyl hóa gen RASSF1A với methyl hóa

các gen BRCA1 và MLH1. Sự khác nhau của methyl hóa vùng promoter gen EGFR

và BRCA1 với sự biểu hiện protein EGFR trên bề mặt tế bào ung thư biểu mô tuyến

ở phổi.

4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Ung thƣ phổi

1.1.1. Thực trạng ung thư phổi

Ung thư phổi là loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới. Theo thống kê của

Tổ chức Y tế thế giới (WHO), năm 2018 có đến 1,8 triệu người chết do ung thư

phổi trong tổng số 9,6 triệu người chết do ung thư (Hình 1.1) [35]. Đây vẫn ung thư

phổ biến nhất ở nam giới trên toàn cầu (chiếm 14,5% tổng số). Tỷ lệ mắc cao nhất

là ở Trung Âu và Đông Âu (53,3/100 000 người) và Đông Á (50,4/100 000 người).

Tỷ lệ mắc thấp nhất là ở Trung Phi và Tây Phi (2,0 và 1,7/100 000 người). Ở phụ

nữ, ung thư phổi đứng thứ ba sau ung thư vú và ung thư đại trực tràng (chiếm 8,4%

tổng số). Tỷ lệ mắc ung thư phổi ở phụ nữ thấp hơn ở nam giới và có sự khác nhau

ở các vùng địa lý khác nhau, chủ yếu phản ánh lịch sử tiếp xúc khác nhau với thuốc

lá. Do đó, tỷ lệ mắc cao nhất là ở Bắc Mỹ (33,8/100 000 người) và Bắc Âu

(23,7/100 000 người), tỷ lệ mắc tương đối cao ở khu vực Đông Á (19,2/100 000

người) và thấp nhất ở Tây Phi và Trung Phi (1,1 và 0,8/100 000 người) [35]. Hiệp

hội ung thư của Hoa Kỳ (American Cancer Society) ước tính trong năm 2017, đã có

thêm 225 500 trường hợp mới mắc ung thư phổi chiếm 13% tổng số ca ung thư

được phát hiện. Chỉ có 19% trường hợp bị phát hiện ung thư phổi có thể sống thêm

quá 5 năm. Cũng theo thống kê của Hiệp hội ung thư của Hoa Kỳ, năm 2015 có đến

155 800 người chết do căn bệnh này, chiếm 25% số trường hợp tử vong do ung thư

[102]. Số trường hợp tử vong do ung thư phổi lớn hơn tổng số trường hợp tử vong

do ba loại ung thư phổ biến khác ở Hoa Kỳ bao gồm ung thư tuyến tiền liệt, ung thư

vú và ung thư đại tràng cộng lại [102].

Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới 2018, ở Việt Nam, mỗi năm có

khoảng 160 000 trường hợp mắc mới và có tới 115 000 người tử vong do ung thư.

Việt Nam đứng ở vị trí 78/172 quốc gia, vùng lãnh thổ khảo sát với tỉ lệ tử vong

110/100 000 người (Hình 1.2). Ung thư phổi có tỉ lệ mắc đứng hàng thứ 2 ở nam

giới và đứng hàng thứ 3 ở nữ giới nhưng lại có tỷ lệ tử vong cao thứ hai ở cả nam

và nữ (sau ung thư gan). Số ca mắc mới ung thư phổi ở nam giới năm 2000 chỉ là 6

905 ca với tỉ lệ 29,3/100 000 dân, đến năm 2018 số ca mắc đã là 23 667 trường hợp

5

(14,4% tổng số ca ung thư) và tăng tỉ lệ lên 35,1/100 000 dân. Dự báo, đến năm

2020, số trường hợp mắc mới có thể lên tới 23 000 ở nam giới và hơn 34 000 ở cả

hai giới [35]. Cũng theo WHO, Việt Nam nằm ở nhóm nước có tần suất mắc ung

thư phổi cao thuộc hàng thứ hai trên thế giới, với tỉ lệ mắc ở nam giới là 25,5 –

41,5/100 000 dân và ở nữ giới là 7,3 – 13,6/100 000 dân [35].

Hình 1.1. Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên thế giới [35].

Hình 1.2. Số ca mắc mới ung thư tại Việt Nam năm 2018 [35].

6

1.1.2. Phân loại ung thư phổi

Ung thư phổi được phân loại dựa trên kết quả xét nghiệm mô bệnh học [84].

Sự phân loại này có ý nghĩa quan trọng cho việc theo dõi, điều trị và tiên lượng

bệnh. Ung thư phổi được hình thành từ khối u ác tính phát sinh từ tế bào biểu mô,

gọi là ung thư biểu mô. Ung thư biểu mô phổi được phân loại theo kích thước và

hình thái của các tế bào ác tính quan sát dưới kính hiển vi. Để phục vụ cho mục đích

điều trị, ung thư phổi được chia ra hai loại lớn: Ung thư phổi không tế bào nhỏ

(NSCLC – Non-Small Cell Lung Cancer) và ung thư phổi tế bào nhỏ (SCLC –

Small Cell Lung Cancer) (Hình 1.3) [72].

1.1.2.1. Ung thư phổi không tế bào nhỏ

Ung thư phổi không tế bào nhỏ được chia thành các nhóm nhỏ hơn, trong đó

ba phân nhóm chính là ung thư biểu mô tuyến, ung thư biểu mô tế bào vảy và ung

thư biểu mô tế bào lớn [57].

Ung thư biểu mô tuyến (AD - Adenocarcinoma) chiếm khoảng 40% trường

hợp mắc ung thư phổi và thường bắt nguồn từ mô phổi ngoại vi [57]. Ung thư biểu

mô tuyến xảy ra phổ biến ở nữ giới và những người không hút thuốc [135]. Đây

cũng là loại ung thư phổi có thời gian sống kéo dài hơn những nhóm khác [112].

Ung thư biểu mô tế bào vảy (SCC – Squamous Cell Cancer) chiếm khoảng

25 – 30% số trường hợp ung thư phổi. Chúng thường bắt đầu xuất hiện ở tế bào vẩy,

là những tế bào phẳng nằm bên trong đường hô hấp của phổi. Ung thư biểu mô tế

bào vẩy có xu hướng được tìm thấy ở phần trung tâm của phổi, gần một đường hô

hấp chính (phế quản), thường gặp ở nam giới và có liên quan mật thiết với tiền sử

hút thuốc lá nhiều hơn so với hầu hết các loại ung thư phổi khác [65].

Ung thư biểu mô tế bào lớn (LCC – Large Cell Cancer) chiếm khoảng 10 –

15% số trường hợp mắc ung thư phổi. Sở dĩ tên gọi như vậy vì tế bào ung thư có

kích thước rất lớn, với sự dư thừa tế bào chất, nhân tế bào lớn và hạch nhân dễ thấy

[84]. Ung thư biểu mô tế bào lớn có thể xuất hiện ở bất kỳ phần nào của phổi. Nó có

xu hướng phát triển và lan truyền nhanh chóng, điều này có thể làm cho việc điều trị

trở nên khó khăn hơn. Một phân nhóm của ung thư biểu mô tế bào lớn, được gọi là

ung thư biểu mô tế bào thần kinh lớn, là một loại ung thư phát triển nhanh, rất giống

với ung thư phổi tế bào nhỏ [84].

https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=M%C3%B4_b%E1%BB%87nh_h%E1%BB%8Dc&action=edit&redlink=1

https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=T%E1%BA%BF_b%C3%A0o_bi%E1%BB%83u_m%C3%B4&action=edit&redlink=1

https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Ung_th%C6%B0_bi%E1%BB%83u_m%C3%B4&action=edit&redlink=1

https://vi.wikipedia.org/wiki/K%C3%ADnh_hi%E1%BB%83n_vi

https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Ung_th%C6%B0_ph%E1%BB%95i_kh%C3%B4ng_ph%E1%BA%A3i_t%E1%BA%BF_b%C3%A0o_nh%E1%BB%8F&action=edit&redlink=1

https://vi.wikipedia.org/wiki/Ung_th%C6%B0_ph%E1%BB%95i_t%E1%BA%BF_b%C3%A0o_nh%E1%BB%8F

https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Ung_th%C6%B0_bi%E1%BB%83u_m%C3%B4_tuy%E1%BA%BFn_ph%E1%BB%95i&action=edit&redlink=1

https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Ung_th%C6%B0_bi%E1%BB%83u_m%C3%B4_ph%E1%BB%95i_t%E1%BA%BF_b%C3%A0o_v%E1%BA%A3y&action=edit&redlink=1

https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Ung_th%C6%B0_bi%E1%BB%83u_m%C3%B4_ph%E1%BB%95i_t%E1%BA%BF_b%C3%A0o_l%E1%BB%9Bn&action=edit&redlink=1



https://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%BF_b%C3%A0o_ch%E1%BA%A5t

https://vi.wikipedia.org/wiki/Nh%C3%A2n_t%E1%BA%BF_b%C3%A0o

https://vi.wikipedia.org/wiki/H%E1%BA%A1ch_nh%C3%A2n

7

Ngoài ra ung thư phổi không tế bào nhỏ còn có thêm một số phân típ khác

hiếm gặp như là carcinoid và thần kinh nội tiết [84].

Hình 1.3. Phân loại mô bệnh học trong ung thư phổi [57].

1.1.2.2. Ung thư phổi tế bào nhỏ

Đặc điểm nổi bật của ung thư phổi tế bào nhỏ là các tế bào chứa dày đặc các

hạt tiết thể dịch thần kinh đó là những túi tiết chứa hormone thần kinh nội tiết, do

đó khối u loại này có liên quan đến với hội chứng cận ung thư/nội tiết [118,

135]. Đa số trường hợp bệnh phát sinh ở đường dẫn khí lớn (phế quản chính và phế

quản thùy). Khoảng 60 – 70% trường hợp bệnh được phát hiện ở giai đoạn đã lan

rộng và không thể tiến hành xạ trị ở một phạm vi đơn lẻ [57].

1.1.3. Các giai đoạn ung thư phổi

Ung thư được phân chia theo các giai đoạn phát triển dựa vào kích thước, vị

trí của khối u nguyên phát, mức độ xâm lấn cũng như khả năng di căn. Hiện nay, hệ

thống phân loại giai đoạn ung thư phổi đang được sử dụng phổ biến nhất là hệ thống

TNM, dựa trên kích thước khối u (Tumor), số hạch lympho phát sinh (Node) và

mức độ di căn (Metastasis). Theo hệ thống phân loại này, tiến triển của ung thư

phổi có thể chia thành các giai đoạn từ 0 (STAGE 0) đến IV (STAGE IV) [3].

Giai đoạn 0 tương ứng với ung thư phổi không xâm lấn, không có hạch,

không di căn xa. Giai đoạn này, các tế bào ung thư chỉ khu trú, không hề xuất hiện

https://vi.wikipedia.org/wiki/Ung_th%C6%B0_ph%E1%BB%95i_t%E1%BA%BF_b%C3%A0o_nh%E1%BB%8F

https://vi.wikipedia.org/wiki/T%C3%BAi_ti%E1%BA%BFt

https://vi.wikipedia.org/wiki/Hormon

https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Th%E1%BA%A7n_kinh_n%E1%BB%99i_ti%E1%BA%BFt&action=edit&redlink=1

https://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Ph%E1%BA%BF_qu%E1%BA%A3n&action=edit&redlink=1

8

bất cứ một tế bào ung thư hay tế bào dị thường nào xuất hiện ngoài vùng phổi/phế

quản, hay có biểu hiện tấn công các vùng mô lành xung quanh [3].

Giai đoạn I tương ứng với ung thư phổi xâm lấn, các tế bào ung thư bắt đầu

lan tỏa và tấn công các phần mô lành, với kích thước khối u ≤ 5 cm. Ở giai đoạn

này, sự xâm lấn mới chỉ diễn ra rất ít, chủ yếu bao xung quanh phổi hoặc lá tạng

màng phổi, không xâm lấn vào phế quản thùy; chưa có hiện tượng di căn hạch. Giai

đoạn I được chia làm IA, IB tùy thuộc vào kích thước khối u [3]. Thời gian sống

thêm sau 5 năm đối với những bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn I khoảng 65%

(55 – 90,5%). Thời gian sống thêm của bệnh nhân nhóm này phụ thuộc vào kích

thước khối u khi phát hiện bệnh. Đối với bệnh nhân ở giai đoạn T1N0, tỷ lệ sống

sau 5 năm là 82%, sau 10 năm là 74%. Trong khi tỷ lệ này ở nhóm bệnh nhân T2N0

giảm xuống lần lượt là 68% và 60% [84].

Giai đoạn II được chia ra làm IIA và IIB. IIA mô tả ung thư xâm lấn dưới

dạng khối u có kích thước nhỏ hơn 5 cm, di căn hạch cạnh phế quản cùng bên

và/hoặc hạch cạnh rốn phổi, bao gồm cả xâm lấn trực tiếp vào hạch, chưa có di căn

xa. IIB mô tả ung thư xâm lấn dưới dạng khối u có kích thước có thể lớn hơn 5cm

và nhỏ hơn 7 cm, có di căn hạch cạnh phế quản cùng bên và/hoặc hạch cạnh rốn

phổi; hoặc khối u có kích thước lớn hơn 7 cm, hoặc có xâm lấn trực tiếp vào thành

ngực, cơ hoành, thần kinh hoành, màng phổi trung thất, hoặc lá thành màng tim [3].

Thời gian sống sau 5 năm của bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn II là 42%. Đặc

điểm của mô bênh học của khối u cũng có ảnh hưởng đến thời gian sống thêm.

Bệnh nhân thuộc nhóm T1 ung thư biểu mô tế bào vẩy có 75% sống sau 5 năm,

nhưng con số này chỉ là 25% ở bệnh nhân T2 ung thư biểu mô tuyến [84].

Giai đoạn III tương ứng với ung thư có di căn hạch lympho, các hạch này tập

trung thành cụm hoặc gắn lên các cấu trúc khác. Giai đoạn III được chia ra làm IIIA

và IIIB. Giai đoạn III mô tả ung thư xâm lấn chưa có di căn xa, khối u nguyên phát

có kích thước có thể lên đến 7 cm, hoặc xâm lấn vào lá tạng màng phổi, có liên

quan đến phế quản, hoặc xâm lấn vào thành ngực, cơ hoành, lá thành màng tim;

hoặc khối u có kích thước bất kỳ đã xâm nhiễm vào trung thất, lan vào tim, mạch

máu lớn, khí quản, thực quản, thân đốt sống, hoặc đã có tràn dịch màng phổi ác

tính. Giai đoạn IIIA và IIIB khác nhau ở tình trạng di căn hạch của khối u, trong đó

9

IIIB có di căn hạch trung thất đối bên, hạch rốn phổi đối bên, di căn hạch cơ bậc

thang cùng bên hoặc đối bên, hoặc hạch thượng đòn. Ngược lại, IIIA được mô tả

hoặc không có di căn hạch, hoặc hạch cạnh phế quản cùng bên và/hoặc hạch cạnh

rốn phổi, hoặc di căn hạch trung thất cùng bên và/hoặc hạch dưới carina [3]. Thời

gian sống trung bình của bệnh nhân nhóm IIIA là 12 tháng và chỉ có 9 – 15% trường

hợp có thể sống thêm 5 năm. Trong khi đó, thời gian sống trung bình của bệnh nhân

giai đoạn IIIB là 8 tháng và chỉ có dưới 5% bệnh nhân có thể sống sót sau 5 năm

[84].

Giai đoạn IV mô tả ung thư phổi xâm lấn dưới dạng di căn ra xa và hình

thành các hạch lympho ở các cơ quan khác nhau trong cơ thể. Ở giai đoạn này, có

các khối riêng biệt ở một thùy đối bên, hoặc khối u có các khối ở màng phổi, hoặc

có các tổn thương ác tính ở màng phổi [3]. Với những bệnh nhân giai đoạn IV việc

phẫu thuật loại bỏ khối u là điều gần như không thể. Thời gian sống thêm của bệnh

nhân nhóm này rất ngắn, đồng thời rất hiếm bệnh nhân có thế sống sót quá 5 năm

[84]. Tuy nhiên, trong một số trường hợp hiếm gặp, bệnh nhân có thể được phẫu

thuật thành công, làm cải thiện đáng kể chất lượng cuộc sống và thời gian sống

thêm. Thời gian sống sau 5 năm có thể lên tới 13 – 21% và thời gian sống trung

bình là 14 tháng [84].

1.2. Ung thƣ biểu mô tuyến của phổi

1.2.1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến

Ung thư biểu mô tuyến chiếm khoảng 40% số trường hợp ung thư phổi (Hình

1.3). Ung thư này thường bắt đầu ở những tế bào tiết thông thường như là tế bào tiết

chất nhầy [57, 84]. Ung thư biểu mô tuyến xảy ra ở những người đã từng hoặc đang

hút thuốc, nhưng phổ biến nhất ở những người không hút thuốc. Ngoài ra, ung thư

biểu mô tuyến ở phổi phổ biến ở nữ giới hơn nam giới và hay gặp ở những người trẻ

tuổi hơn những loại ung thư phổi khác [84].

Ung thư biểu mô tuyến của phổi thường được tìm thấy ở phần bên ngoài của

phổi. Mặc dù có xu hướng phát triển chậm hơn so với những dạng ung thư phổi

khác và khả năng phát hiện trước khi ung thư lan rộng nhưng nó lại rất khác nhau

giữa các bệnh nhân. Những bệnh nhân ung thư phổi tại chỗ (Adenocarcinoma in

situ) thường có tiên lượng tốt hơn so với những loại ung thư phổi khác [57, 84].

10

Ung thư biểu mô tuyến ngoại vi ở phổi được cho là phát sinh từ các tổn

thương tiền ung thư được gọi là tế bào ung thư tân sản (Neuoplasia) sau đó phát

triển thành các tế bào ung thư phân chia quá mức không điển hình (Atipical

Adenomatous Hyperplasias - AAH), AAH được coi là hình ảnh mô học đầu tiên

trong quá trình hình thành khối u ác tính (Hình 1.4) [41]. AAH mang những biến

đổi di tuyền và di truyền ngoại gen tương tự với những biến đổi được tìm thấy trong

ung thư tuyến của phổi kể cả đột biến KRAS, EGFR, TP53, mất đoạn dị hợp tử tại

cánh dài nhiễm sắc thể số 9 và cánh ngắn nhiễm sắc thể số 16, và biến đổi đi truyền

ngoại gen WNT [59]. Từ các AAH sẽ tiếp tục hình thành ung thư biểu mô tuyến tại

chỗ (AIS – Adenocarcinoma in situ) hay còn được gọi là ung thư biểu mô tiểu phế

nang (BAC – Bronchioloalveolar Carcinoma); lần đầu tiên tiến tới giai đoạn tiền

ung thư trước khi được gọi là ung thư biểu mô tiểu phế nang (BAC). Đây được coi

là giai đoạn không xâm lấn của những tế bào ung thư tuyến tân sản nhưng chúng thể

hiện sự tăng kích thước và hình thái tế bào không điển hình. Giai đoạn tiếp theo của

ung thư là sự hình thành xâm lấn tối thiểu (MIA – Minimally Invasive

Adenocarcinoma), được định nghĩa là một ung thư biểu mô tuyến nhỏ (kích thước

nhỏ hơn 3 cm) với thành phần chủ yếu là tổn thương lepidic và xâm lấn nhỏ hơn

5mm tại một vị trí. Sau đó khối u chuyển sang quá trình xâm lấn (Invasive

Carcinoma) mặc dù các yếu tố không xâm lấn có thể tồn tại ở các cạnh của các khối

u [59].

Di căn là giai đoạn cuối cùng trong quá trình phát triển của khối u. Ung thư

biểu mô phổi có thể di căn theo hệ bạch huyết cũng như mạch máu. Sự di căn theo

con đường mạch máu thường thấy ở các khối u ở giai đoạn thấp, thường dẫn đến

tăng tỷ lệ tái phát cũng như rút ngắn thời gian sống sót của bệnh nhân. Trong khi di

căn qua đường bạch huyết thường mất nhiều thời gian hơn cho sự hình thành khối u

di căn, di căn qua đường bạch huyết sẽ hình thành những khối u di căn xa [39]. Ung

thư biểu mô phổi có một số địa điểm ưu tiên cho di căn như: Não, xương và tuyến

thượng thận. Các cơ quan khác có di căn thường ở giai đoạn cuối của bệnh. Đối với

các loại ung thư phổi khác nhau có sự ưu tiên hình thành khối u di căn không giống

nhau, chẳng hạn như di căn gan trong ung thư biểu mô phổi tế bào nhỏ và di căn

não trong ung thư tuyến mô [39].

11

Hình 1.4. Quá trình hình thành ung thư biểu mô tuyến [59].

1.2.2. Các phân típ mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến

Khối u trong ung thư biểu mô tuyến thể hiện sự biệt hóa tuyến với một hay

nhiều dạng phát triển gồm một số dạng chính: Tổn thương lepidic, chùm nang, nhú,

vi nhú hoặc dạng đặc … (Hình 1.5) [57, 84].

Tổn thương lepidic: Đây là sự phát triển không điển hình các tế bào vuông

đơn dọc theo thành phế nang có đặc điểm: Cấu trúc phế nang vẫn được duy trì;

không có sẹo xơ trung tâm hay lan rộng; thường có dày thành phế nang; không có

hoặc ít phát triển dạng tầng; không tạo cấu trúc nhú. Nếu trên mảnh sinh thiết chỉ

thấy phát triển đơn thuần thành phần lepidic thì không loại trừ u có thành phần xâm

nhập [84].

Ung thư biểu mô tuyến nhú (Papillary Adenocarcinoma): U thường đơn độc

bao gồm cấu trúc nhú được phủ bởi tế bào kích thước lớn, không điển hình với nhân

lớn, tăng sắc, hạt nhân rõ, nhiều nhân chia (Hình 1.5A) [84].

12

Hình 1.5. Một số phân típ phổ biến trong ung thư biểu mô tuyến của phổi.

(A) ung thư biểu mô tuyến nhú (HE x 100); (B) ung thư biểu mô tuyến vi nhú (HE x

400); (C) ung thư biểu mô tuyến nhầy xâm nhập (HE x 400); (D) ung thư biểu mô

tuyến dạng chùm nang (HE x 200) [84].

Ung thư biểu mô tuyến vi nhú (Micropapillary Adenocarcinoma): Cấu trúc u

gồm các tế bào phát triển tạo các búi nhú không có trục liên kết xơ mạch. U có thể

liên tục với thành phế nang hoặc không. Tế bào u thường nhỏ, vuông đơn, nhân

không điển hình mức độ nhẹ. Thường có xâm nhập mô đệm và xâm nhập mạch. Tỷ

lệ xâm lấn và di căn cao (Hình 1.5B) [84].

Ung thư biểu mô tuyến nhầy xâm nhập (Invasive Mucinous

Adenocarcinoma): Cấu trúc u gồm các tế bào trụ có chế nhầy ở cực ngọn, nhân nhỏ

nằm ở cực đáy. Tế bào u lót dọc thành phế nang, có thể tạo cấu trúc nhú (Hình

1.5C) [84].

13

Ung thư biểu mô tuyến chùm nang (Acinar Adenocarcinoma): U có dạng

nang, túi tuyến hoặc ống với tế bào hình trụ hoặc hình khối vuông, nhân lệch đáy,

chế nhày, gợi tuyến của phế quản (Hình 1.5D) [84].

Ung thư biểu mô tuyến đặc (Solid adenocarcinoma): U không có cấu trúc

nhú, ống, nang; thay vào đó là các mảng tế bào hình đa diện nhưng có ít nhất 5 tế

bào chế nhày trên 2 vi trường có độ phóng đại lớn [84].

Ung thư biểu mô tuyến bào thai (Fetal Adenocarcinoma): Thường gặp ở độ

tuổi trẻ hơn các típ khác. U gồm các tuyến ống được lót bởi tế bào trụ không có

lông với bào tương sáng, nhân nằm ở cực đáy thường có hốc. Đôi khi u gợi hình

ảnh u nguyên bào phổi típ đơn pha (Monophasic Pulmonary Blastoma). Xảy ra do

đột biến gen β – catenin [84].

Ung thư biểu mô tuyến nhày dạng keo (Mucinous “Colloid”

Adenocarcinoma): U có đặc điểm giống với loại u cùng tên ở đường tiêu hóa. U

gồm các cấu trúc ống, tuyến kích thước không đều, mô đệm có nhiều chất nhày đặc

và quánh. Tế bào u trôi nổi trong bể chất nhày [84].

1.3. Biến đổi gen EGFR trong ung thƣ phổi

1.3.1. Cấu trúc và chức năng gen EGFR

EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) nằm trong họ thụ thể yếu tố phát

triển biểu bì bao gồm HER-1 (EGFR), HER-2, HER-3 và HER-4 trong phân lớp thụ

thể Tyrosine Kinase (Tyrosine Kinase Receptor) [12]. Protein EGFR là một

glycoprotein màng có kích thước 170 kDa với cấu trúc gồm 3 phần chính là: Phần

gắn phối tử ở ngoài màng, phần protein xuyên màng và phần bên trong tế bào chất

với vùng hoạt hóa Tyrosine Kinase được mã hóa bởi gen EGFR nằm trên cánh ngắn

của nhiễm sắc thể 7 (7p12) gồm 28 exon. EGFR chứa một số yếu tố lặp lại, bao

gồm SINE và LINE, và một vùng giàu (TGG/A) trong intron 15, và 2 vùng lặp lại

CA trong intron 27, đặc biệt exon 1 rất giàu trình tự GC [49,114]. EGFR có vai trò

quan trọng trong quá trình nhân lên, chết theo chương trình, di động, xâm nhập, sửa

chữa và tương tác giữa tế bào với tế bào. Khi phân tử EGFR kết hợp với phối tử

chúng sẽ thực hiện quá trình nhị trùng hợp (homo/heterodimeration) và hoạt hóa

phân tử EGFR qua đó kích hoạt hai con đường truyền tín hiệu chính của tế bào là

con đường qua PI3K/AKT/m-TOR và RAS/RAF1/MAP2K1/MAPK1 làm cho tế

14

bào tăng phân chia, tăng khả năng sống sót và chống lại quá trình chết theo chương

trình [96].

Hình 1.6. Đường truyền tín hiệu thông qua phân tử EGFR [96].

Con đường MAPK RAS-RAF-MEK-ERK có thể là con đường quan trọng

nhất liên quan đến phản ứng sinh học của EGFR, trong đó có gen RAS và RAF là

các tác nhân tiền gây ung thư (Hình 1.6). Mục tiêu chính trong liệu pháp điều trị

ung thư là MEK. MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) tương tác với hơn 100

cơ chất để khởi đầu một loạt các phản ứng sinh lý và bệnh lý, bao gồm tăng trưởng,

biệt hóa, di cư và ức chế chết theo chương trình (Apoptosis) [96]. Hệ thống dẫn

truyền tín hiệu PI3K-AKT-mTOR kiểm soát sự trao đổi chất, tăng sinh, kích thước

tế bào, sự sống còn và tính di động của tế bào. Trong ung thư, con đường này

thường được kích hoạt ở trạng thái tăng hoạt động do tạo ra đột biến đối với các

thành viên tham gia vào con đường, chẳng hạn như EGFR, PI3K, AKT; ngược lại

con đường này có thể giảm biểu hiện của gen ức chế khối u PTEN, từ đó ức chế

hoạt động của PI3K. Con đường PI3K-AKT-mTOR cũng rối loạn trong bệnh tiểu

đường, tự kỷ và lão hóa [22].

15

1.3.2. Đột biến gen EGFR trong ung thư phổi

Đột biến hoạt hóa các gen gây ung thư được xem như một điểm nhạy trong

ung thư. Khi gen gây ung thư nhạy cảm với các chất ức chế, đặc tính tăng sinh của

tế bào u bị loại bỏ, đặc biệt có thể gây chết tế bào [149]. Liệu pháp điều trị kháng

EGFR trong ung thư phổi được sử dụng trước khi có những hiểu biết về các đột

biến gen EGFR hoạt hóa. Cụ thể, Gefitinib, khi được sử dụng trong các trường hợp

quần thể không được sàng lọc, có tỷ lệ đáp ứng 10 – 20%. Erlotinib liên quan đến

việc cải thiện thời gian sống thêm của bệnh nhân, đặc biệt hiệu quả điều trị rõ rệt

đối với trường hợp ung thư biểu mô tuyến mang đột biến xảy ra với tỷ lệ cao ở bệnh

nhân nữ giới, không hút thuốc và chủng tộc Châu Á [70].

Hình 1.7. Tần suất các dạng đột biến gen EGFR [127].

Đến nay, đã phát hiện được khoảng 40 đột biến khác nhau của gen EGFR

nằm rải rác trên 4 exon từ 18 – 21 thuộc vùng kinase domain (Hình 1.7) [127]. Đột

biến dẫn đến sự tự động hoạt hóa phân tử EGFR mà không cần đến sự có mặt của

phối tử. Kết quả của quá trình này làm cho tế bào ung thư tăng cường sự phân chia,

16

khả năng sống sót, tăng khả năng di căn, xâm lấn và chống lại sự chết theo chương

trình [88, 127]. Hầu hết các đột biến thường gặp là đột biến điểm và đột biến mất

đoạn dẫn đến sai lệch khung đọc mở, trong đó đột biến mất đoạn ở exon 19 và đột

biến thay thế L858R ở exon 21 chiếm khoảng 90% tổng số các trường hợp bị đột

biến [88, 127]. Ba đột biến điểm thường gặp là G791C, L858R và L861Q; ba đột

biến mất đoạn chính là Del E746 – A750, Del L747 – T751inS và Del L747 –

T753inS [85]. Tỷ lệ đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của

phổi tương đối khác nhau ở các nghiên cứu. Những nghiên cứu được thực hiện ở

những bệnh nhân phương tây có tỷ lệ đột biến khá thấp 10 – 15% [8]. Trong khi

những nghiên cứu được công bố ở người châu Á có tỷ lệ đột biến 30 – 60% [105].

Đột biến gen EGFR thường gặp ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi là nữ

giới và không hút thuốc [8, 105].

Những hiểu biết về sinh học phân tử, nguyên nhân và cơ chế phát triển của

ung thư nói chung và ung thư phổi nói riêng đã góp phần quan trọng trong việc xây

dựng những phác đồ điều trị mới có hiệu quả hơn rất nhiều so với những phương

pháp điều trị truyền thống trước đây cả về khả năng lui bệnh và chất lượng cuộc

sống của bệnh nhân ung thư [55]. Tyrosine Kinase Inhibitors (TKIs) là những chất

ức chế sự hoạt hóa phân tử EGFR được phát triển dựa trên những hiểu biết về đột

biến gen trong ung thư phổi [55, 139]. TKIs gắn vào vị trí bám ATP của phân tử

EGFR làm cho phân tử này không thể hoạt hóa và làm cho những con đường truyền

tín hiệu qua EGFR không hoạt động. Sự bất hoạt phân tử EGFR làm cho tế bào mất

khả năng phân chia, giảm khả năng sống sót và đi vào con đường chết theo chương

trình [68]. Trong những đột biến gen EGFR đã biết hầu hết những đột biến có sự

đáp ứng tốt với TKIs thế hệ thứ nhất và thế hệ thứ hai trong đó đột biến chiếm tỷ lệ

lớn nhất là mất đoạn ở exon 19 và thay thế L858R ở exon 21 được nghiên cứu và

thử nghiệm nhiều nhất. Có nhiều công trình nghiên cứu đã công bố về hiệu quả sử

dụng của TKIs đối với bệnh nhân ung thư phổi [55, 68, 139]. Những nghiên cứu

này đã chỉ ra được sự cải thiện đáng kể về tỷ lệ đáp ứng điều trị, thời gian tái phát u

và thời gian sống thêm ở những bệnh nhân mang đột biến này được sử dụng TKIs

so với bệnh nhân không sử dụng thuốc và bệnh nhân không mang đột biến [55, 68].

17

1.3.3. Biểu hiện protein EGFR trong ung thư phổi

Biểu hiện protein có liên quan mật thiết đến sự methyl hóa và khuếch đại gen

EGFR [80, 95]. Methyl hóa làm giảm sự biểu hiện protein trong khi khuếch đại gen

lại tăng cường mức độ biểu hiện [95, 122]. Mức độ biểu hiện protein được chia

thành các cấp độ khác nhau từ 0 đến 3+ tùy thuộc vào cường độ và tỷ lệ phần trăm

tế bào có sự biểu hiện protein EGFR trên bề mặt[80]. Phương pháp xác định mức độ

biểu hiện của EGFR trên bề mặt tế bào phổ biến nhất hiện nay là hóa mô miễn dịch,

sử dụng những kháng thể kháng EGFR đặc hiệu kết hợp với hệ enzyme – cơ chất

tạo mầu đặc trưng có thể quan sát bằng kính hiển vi quang học [80]. Khoảng 60 –

80% trường hợp ung thư biểu mô tuyến của phổi có sự biểu hiện protein EGFR,

trong đó sự biểu hiện quá mức EGFR chiếm khoảng 35 – 50% [80, 122]. Sự biểu

hiện EGFR cũng phụ thuộc vào giai đoạn tiến triển của bệnh. Có đến 50% trường

hợp bệnh nhân ở giai đoạn III có sự biểu hiện quá mức EGFR trong khi đó tỷ lệ này

ở giai đoạn I và II lần lượt là 20% và 25%. Sự biểu hiện quá mức EGFR cũng đi

kèm với tiên lượng xấu cho bệnh nhân, thể hiện ở việc tăng nguy cơ xâm lấn hoặc

di căn; trong khi sự ức chế biểu hiện EGFR dẫn đến giảm sự phân chia tế bào ung

thư, sự di cư, hình thành mạch máu và quá trình apoptosis trong các khối u thể rắn

[122, 150]. Biểu hiện EGFR trong tế bào ung thư được kiểm soát chặt chẽ, tuy

nhiên cơ chế kiểm soát chưa được nghiên cứu đầy đủ. Điều hòa di truyền ngoại gen

là cơ chế sinh học mà gen được biểu hiện hay bị kìm hãm thông qua quá trình

methyl hóa DNA, biến đổi Histone và miRNA, trong đó phổ biến và tập trung nhiều

hơn cả là methyl hóa DNA. Nghiên cứu về trạng thái methyl hóa vùng promoter

liên quan đến biểu hiện protein EGFR tạo điều kiện cho sự phát triển các dấu ấn

sinh học hữu ích trong thử nghiệm lâm sàng [150].

1.4. Methyl hóa DNA trong ung thƣ phổi

1.4.1. Methyl hóa DNA

Methyl hóa DNA là hiện tượng gắn thêm gốc methyl (CH3) vào vị trí 5’ C

của nucleotide. Ở một số trường hợp, Adenine bị methyl hóa phổ biến đóng vai trò

trong cơ chế bảo vệ đối với vi khuẩn [134]. Trong khi đó ở động vật có vú, methyl

hóa DNA xảy ra ở Cytosine đứng trước Guanine trong phức CpG tạo thành 5 –

methylcytosine (5mC) [81]. Trong hệ gen ở người, đảo CpG là vùng giàu phức

18

CpG, có kích thước từ 0,5 – 5,0 kb và thường tìm thấy trong vùng promoter của các

gen. Khi đảo CpG bị methyl hóa, các gen không được phiên mã. Methyl hóa xảy ra

tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen chiếm ưu thế so với các vị trí khác, bởi

vậy khi đánh giá tình trạng methyl hóa DNA thường xem xét tại vùng chứa đảo

CpG (Hình 1.8) [54]. Ngoài ra, methyl hóa DNA có vai trò nhất định đối với các tế

bào ở trạng thái bình thường như in dấu gen, duy trì trạng thái dị nhiễm sắc, duy trì

trạng thái bất hoạt của 1 nhiễm sắc thể X ở con cái động vật có vú [128]. Ở tế bào

bình thường, các Cytosine trong phức CpG không bị methyl hóa trong quá trình

phát triển và biệt hóa mô; tuy nhiên các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen có

thể bị methyl hóa dẫn đến trạng thái ức chế phiên mã của gen. Methyl hóa DNA

được hình thành trong quá trình biệt hóa tế bào, làm tế bào mất một phần hoặc mất

hoàn toàn khả năng phân chia. Methyl hóa DNA có tính đặc hiệu đối với các mô

trong cơ thể, và vai trò của hiện tượng này ở các tế bào khác nhau là không giống

nhau. Ở tế bào bình thường, promoter mang các đảo CpG không bị methyl hóa có

chức năng duy trì cấu trúc nhiễm sắc thực, đây là cấu trúc hoạt hóa phiên mã cho

phép gen được biểu hiện. Tuy nhiên, trong quá trình phát sinh ung thư, CpG vùng

promoter nhiều gen bị methyl hóa gây ức chế biểu hiện gen do thay đổi cấu trúc

nhiễm sắc thực thành cấu trúc dị nhiễm sắc. Enzyme DNA methyltransferase 1

(DNMT1) và DNA methyltransferase 3a, 3b (DNMT3a, DNMT3b) thực hiện quá

trình methyl hóa DNA [117]. DNMT1 duy trì nhóm methyl cho sợi DNA sau khi tái

bản; do đó duy trì trạng thái methyl hóa cho thế hệ sau [43]. DNMT1 tương tác với

một số protein như HDACs và HMTs tạo phức liên kết với CpG bị methyl hóa, từ

đó hình thành hệ thống phức tạp điều hòa sự sắp xếp lại chất nhiễm sắc và mức độ

biểu hiện gen. Nhóm DNMT3 gồm enzyme DNMT3a, DNMT3b và DNMT3L.

DNMT3a và 3b là các enzyme methyl hóa DNA ở các vị trí mới (denovo

methylation). DNMT3b và DNMT1 duy trì sự methyl hóa quá mức gen ức chế khối

u p16INK4a ở dòng tế bào ung thư đại trực tràng [115]. Khi hoạt tính của hai

enzyme bị ức chế, mức độ methyl hóa gen này giảm tới hơn 95% [115]. Trong khi

đó, DNMT3L có chức năng methyl hóa DNA trên các gen in dấu (imprinting genes)

[53].

19

Methyl hóa DNA được chia thành 2 loại: Methyl hóa dưới mức và methyl

hóa quá mức. Methyl hóa DNA dưới mức trong ung thư thường xảy ra tại các trình

tự lặp lại, yếu tố vận động Alu hay LINE1, vùng DNA vệ tinh α gần tâm động. Kết

quả là thúc đẩy sự vận động của các yếu tố di truyền, tăng khả năng sắp xếp lại hệ

gen và phát sinh khối u. Ví dụ như methyl hóa dưới mức promoter của yếu tố vận

động L1 xuất hiện ở nhiều loại ung thư như thận, bàng quang, đại trực tràng [18].

Bên cạnh các trình tự lặp lại và yếu tố vận động, các nghiên cứu gần đây chỉ ra

methyl hóa dưới mức còn xảy ra ở các gen đơn bản trong các loại ung thư. Shao và

cs. (2011) phát hiện 8 gen bị methyl hóa dưới mức, bao gồm các gen AQP1,

CECR1, C1QR1, CTAG2, P53AIP1, TDRD12, BEX1 và DYNLT3 trong ung thư

biểu mô tuyến nước bọt, trong khi đó Gupta A. và cs. (2003) chỉ ra có sự methyl

hóa dưới mức gen synuclein γ trong ung thư vú và ung thư buồng trứng [45,124].

Bên cạnh đó, methyl hóa dưới mức có vai trò trong phát sinh ung thư bằng cách

hoạt hóa các gen gây ung thư như cMYC và H-RAS [33].

Hình 1.8. Methyl hóa DNA ở tế bào bình thường và tế bào ung thư [43].

Methyl hóa quá mức vùng promoter là cơ chế phổ biến gây bất hoạt các gen

ức chế khối u, xuất hiện ở nhiều loại ung thư thể rắn. Chẳng hạn, nhiều gen bị bất

hoạt do methyl hóa quá mức trong ung thư vú như các gen tham gia mã hóa thụ thể

steroid ER, PR; gen mã hóa protein liên kết tế bào E-cadherin; gen có chức năng

20

sửa chữa DNA BRCA1, TIMP-3 [29, 111]. Trong khi đó, methyl hóa quá mức các

gen p15, p21, ER, SDC4, MDR liên quan tới các dạng ung thư máu [75]. Bên cạnh

các gen như RASSF1A và p16 thường bị methyl hóa trong nhiều loại ung thư, một

số gen chỉ methyl hóa đặc hiệu trong một loại ung thư, ví dụ như gen GSTP1 bị

methyl hóa quá mức trên 90% ở ung thư tuyến tiền liệt [91]. Hơn nữa, mức độ

methyl hóa của mỗi gen trong từng loại ung thư cũng khác nhau. Ví dụ như gen

RASSF1A ít bị methyl hóa trong ung thư đại tràng nhưng bị methyl hóa cao ở ung

thư vú, ung thư tuyến tiền liệt [29, 91, 111].

1.4.2. Methyl hóa các gen EGFR, BRCA1, MLH1, MGMT và RASSF1A trong

ung thư phổi

Ung thư phổi là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Di truyền

ngoại gen được xem như một dấu ấn phân tử trong giai đoạn sớm hình thành ung

thư, hỗ trợ chẩn đoán, tiên lượng và định hướng điều trị. Methyl hóa DNA, biến đổi

Histone và miRNA là 3 lĩnh vực của di truyền ngoại gen, trong đó methyl hóa DNA

phổ biến và được tập trung nghiên cứu [61]. Hiện nay, hầu hết các dấu chuẩn ngoại

gen trong ung thư phổi được phát triển và ứng dụng ngày càng rộng rãi trong lâm

sàng.

Methyl hóa dưới mức hay quá mức tại các vùng chứa đảo CpG được chứng

minh liên quan đến ung thư phổi. Đặc biệt, methyl hóa quá mức vùng CpG thường

xảy ra ở giai đoạn sớm của quá trình phát sinh ung thư [61]. Nhiều gen được methyl

hóa quá mức trong ung thư phổi bao gồm p16, PAK3, NISCH, KIF1A, OGDHL,

BRMS1, FHIT, CTSZ, CCNA1, NRCAM, LOX, MGMT, DOK1, SOX15, TCF21,

DAPK, RAR, RASSF1, CYGB, MSX1, BNC1, CTSZ và CDKN2A [104,110]. Tần

suất methyl hóa của các gen có sự biến đổi rộng, một số gen như p16 hay MGMT,

tỷ lệ methyl hóa có thể lên đến 100% ở các trường hợp chẩn đoán ung thư phổi tế

bào nhỏ trước 3 năm. Một số gen ức chế khối u bị methyl hóa quá mức có vai trò

trong các quá trình tế bào khác nhau, chẳng hạn như điều chỉnh chu kỳ tế bào (p16),

sửa chữa DNA (MGMT), apoptosis (DAPK, caspase 8, ARF, FAS, TRAILR1,

RASSF1A, NORE1A và G0S2) [104, 109]. Protein p16 thúc đẩy quá trình chuyển

pha G1 sang pha S không biểu hiện do methyl hóa promoter chiếm 70% trong ung

thư phổi. Điểm đặc biệt là methyl hóa quá mức p16 thường xảy ra ở các tế bào biểu

21

mô của người hút thuốc cũng như các dạng tổn thương, và tần suất methyl hóa tăng

lên cùng với sự tiến triển ung thư. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng sự thay đổi

trong quá trình methyl hóa quá mức Cytosine có giá trị chẩn đoán và tiên lượng

trong ung thư phổi, trong một số trường hợp có thể sử dụng để dự đoán đáp ứng

điều trị. Zhang và cs. (2011) đánh giá methyl hóa 20 gen ức chế khối u trên 78 mẫu

UTPKTBN và 50 mẫu đối chứng cho thấy một bộ 5 gen (APC, RASSF1A, CHD13,

KLK10 và DLEC1) bị methyl hóa cao hơn đáng kể ở bệnh nhân ung thư phổi với độ

nhạy 83,64% và độ đặc hiệu 74%, gợi ý về panel chẩn đoán đối với bệnh nhân

UTPKTBN Trung Quốc [157]. Nghiên cứu tương tự trên 64 bệnh nhân UTPKTBN,

bệnh nhân có ít nhất 4 gen bị methyl hóa đồng thời trong hệ thống 15 gen nghiên

cứu (APC, CHD13, KLK13, DLEC1, RASSF1A, EFEMP1, SFRP1, RAR,

p16INK4A, RUNX3, Hmlh1, DAPK, BRCA1, p14ARF) có tỷ lệ có tỷ lệ sống sót sau

2 năm kém hơn trường hợp bệnh nhân bị methyl hóa dưới 4 gen (13,8 tháng so với

17,8 tháng). Salazar và cs. khẳng định quá trình methyl hóa gen có thể hữu ích trong

việc dự đoán đáp ứng điều trị, cụ thể bệnh nhân có gen CHFR không bị methyl hóa

đáp ứng với thuốc ức chế TKIs tốt hơn so với trường hợp CHFR bị methyl [119].

Bên cạnh methyl hóa quá mức, methyl hóa dưới mức cũng có vai trò nhất định

trong ung thư phổi. Chẳng hạn, các gen H19, IGF2 và MEST bị mất in dấu do

methyl hóa dưới mức được phát hiện ở các tế bào ung thư phổi, làm mất kiểm soát

quá trình tăng trưởng tế bào.

1.4.2.1. Methyl hóa gen EGFR

Bên cạnh những nghiên cứu về đột biến gen, những nghiên cứu về sự methyl

hóa gen EGFR cũng đang nhận được rất nhiều sự quan tâm. Methyl hóa gen EGFR

được tập trung nghiên cứu ở vùng promoter nằm trong khoảng –300 đến –100 tại

đầu 5’ không dịch mã [120]. Sự methyl hóa gen EGFR đã được nghiên cứu trên một

số ung thư như ung thư đại trực tràng, ung thư vú và ung thư đầu và cổ dạng tế bào

vẩy và ung thư phổi [95, 120]. Tế bào phổi bình thường không xảy ra hiện tượng

methyl hóa EGFR, hiện tượng này chỉ xảy ra đối với những tế bào ung thư [95].

Một nghiên cứu trên 54 mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân ung thư phổi không tế bào

nhỏ tại Hoa Kỳ cho thấy 11% trường hợp có vùng promoter của gen EGFR bị

methyl hóa [95]. Tuy nhiên, một số công bố tương tự ở bệnh nhân người Trung

22

Quốc lại cho thấy sự methyl hóa EGFR xảy ra khá phổ biến với tỷ lệ 30 - 40% [77,

106].

Hình 1.9. Các vị trí methyl hóa trên gen EGFR

1.4.2.2. Methyl hóa gen BRCA1

BRCA1 ( Breast cancer – associated gene 1) là một gen ức chế khối u chủ

yếu liên quan đến ung thư vú và ung thư buồng trứng được xác định và tách dòng

lần đầu năm 1994 bởi Miki và cs. [93]. Gen BRCA1chứa 24 exon với dài khoảng

100kb nằm trên cánh dài của NST17 (17q21) và mã hóa cho protein BRCA1 có

chức năng trong sửa chữa DNA và apotosis của tế bào (Hình 1.10) [93].

Hình 1.10. Cấu trúc gen BRCA1 ở người [97].

Trong tế bào bình thường, BRCA1 mã hóa cho một phosphoprotein đóng vai

trò quan trọng trong việc duy trì sự ổn định di truyền, đồng thời nó cũng hoạt động

như một gen ức chế khối u. BRCA1 tham gia điều khiển sự biểu hiện p53, GADD45

đồng thời có vai trò trong quá trình sửa chữa hiện tượng gãy DNA sợi đôi [66].

BRCA1 còn tương tác trực tiếp với phức hợp sửa đổi NST SWI/SNF, với các nhân

tố điều hòa quá trình acetyl hóa hoặc khử acetyl hóa histone, cũng như với các

DNA helicase bao gồm BLM và BACH1 để tham gia vào quá trình điều hòa phiên

mã [133] (Hình 1.11).

Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1 được tìm thấy chủ yếu trong ung thư

vú và ung thư buồng trứng. Hiện tượng methyl hóa BRCA1 xảy ra chủ yếu tại đảo

CpG chứa 30 vị trí CpG, nằm từ vị trí –567 đến +44 (Hình 1.10). Các nghiên cứu

23

chỉ ra rằng đảo CpG này vai trò quan trọng trong điều hòa phiên mã và không bị

methyl hóa ở các tế bào bình thường nhưng lại có nhiều biến đổi và trạng thái

methyl trong các tế bào ung thư [116]. Sự methyl hóa BRCA1 trong ung thư vú

được nghiên cứu khá rộng rãi trên thế giới, kết quả cho thấy có sự khác nhau về

mức độ methyl gen này xảy ra với tỷ lệ cao hơn ở người châu Á so với ở các nước

phương tây và châu Úc [155]. Ở Việt Nam, tỷ lệ methyl hóa gen BRCA1 xảy ra ở

58,2% bệnh nhân ung thư vú 18,6% bệnh nhân ung thư buồng trứng [142, 143].

Hình1.11. Chức năng ức chế khối u của BRCA1[125]

Đã có một số nghiên cứu về hiện tương methyl hóa vùng promoter gen

BRCA1 trên ung thư phổi không tế bào nhỏ. Nghiên cứu đầu tiên được tiến hành tại

Hòa Kỳ năm 2004 với 158 bệnh nhân, kết quả cho thấy chỉ có 4% trường hợp được

phát hiện có sự methyl hóa gen này [89]. Những nghiên cứu sau đó trên bệnh nhân

người Đài Loan và Trung Quốc cho thấy hiện tượng methyl hóa BRCA1 xảy ra khá

phổ biến ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bảo nhỏ ở bệnh nhân Châu Á với tỷ lệ

30% và 27% [40, 73]. Không những vậy, methyl hóa quá mức BRCA1 trong ung

thư phổi cho thấy sự tiên lượng xấu cho bệnh nhân [40].

1.4.2.3. Methyl hóa gen MLH1

Gen MLH1 (human mutL homolog 1) nằm ở vị trí 3p22.2 trên nhiễm sắc thể

số 3 bao gồm 19 exon với kích thước khoảng 57 kb. Protein in MLH1 chứa 756

acid amin với khối lượng phân tử là 84,6 kDa (Hình 1.12) [24]. MLH1 là một trong

24

sáu thành phần trong phức hợp sửa chữa bắt cặp sai trên DNA bao gồm: MSH2,

MLH1, PMS2, MSH3, MSH6 và MPS1. Đối với những bắt cặp sai ở một hoặc một

vài nucleotide MLH1 sẽ kết hợp với PMS2/1, MSH2 và MSH6 để loại bỏ trình tự

bắt cặp sai trên một sợi DNA sau đó sợi DNA mới được tổng hợp dựa trên sợi DNA

bổ sung còn lại. Ngược lại đối với những bắt cặp sai của nhiều nucleotide, MLH1 sẽ

kết hợp với PMS2/1, MSH2 và MSH3 để tạo thành phức hợp sữa chữa (Hình1.13)

[90].

Hình1.12. Cấu trúc gen MLH1 [24].

Hình1.13. Các phức hợp sửa chữa DNA của MLH1 [90].

Đột biến tế bào mầm gen MLH1 có liên quan đến hội chứng Lynch trong ung

thư đại trực tràng với tần suất khoảng 37% [154]. Ngoài ra methyl hóa vùng

25

promoter gen MHL1 cũng được phát hiện khá phổ biến trong ung thư đại tràng với

tỷ lệ khoảng 18% [78]. Không những vậy, đột biến tế bào mầm MLH1 và methyl

hóa quá mức MLH1 được phát hiện đồng thời ở những bệnh nhân ung thư đại trực

tràng. Ngoài ra, methyl hóa quá mức MLH1 được quan sát ở một số ung thư khác

như: Ung thư phổi và ung thư dạ dày [123].

Methyl hóa MLH1 trong ung thư phổi được nghiên cứu khá phổ biến, với tỷ

lệ nằm trong khoảng từ 0 – 58% [23]. Một nghiên cứu trên 72 người Châu Âu vào

năm 2006 không phát hiện sự methyl hóa MLH1 trên bất kỳ bệnh nhân nào [137].

Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác trên bệnh nhân ung thư phổi tại Trung Quốc lại

cho thấy tỷ lệ methyl khá cao của gen MLH1, đạt 35 – 56% [123, 148]. Ngoài ra,

Seng T.J. và cs. (2008) so sánh tỷ lệ sống sót của bệnh nhân bị methyl hóa và không

methyl hóa MLH1 cho thấy những bệnh nhân mang gen MLH1 bị methyl hóa có

tiên lượng xấu và có thời gian sống sót thấp hơn nhóm không methyl hóa [110].

1.4.2.4. Methyl hóa gen MGMT

MGMT (O6-methylguanine DNA methyltransferase) là một protein duy nhất

có khả năng sửa chữa DNA có gắn các chất gây ung thư và tự bất hoạt. Trình tự gen

MGMT được nhân bản lần đầu tiên vào năm 1988. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể

10 ở vị trí 10q26, bao gồm 5 exon và 4 intron và kéo dài hơn 300 kb (Hình 1.14).

Protein MGMT có chiều dài 207 axit amin và được bảo tồn thông qua quá trình tiến

hóa [126, 127]. MGMT tham gia vào nhiều con đường sửa chữa sai hỏng DNA

trong tế bào, thông qua việc loại bỏ các nhóm Alkyl gắn vào Guanine. Trong trường

hợp không có sự có mặt của MGMT, O6-meG chưa được chỉnh sửa có thể kết hợp

với Cytosine hoặc Thymine dẫn đến lỗi bắt cặp sai O6-meG/T (Hình 1.15). Thiếu

hụt MGMT do sự methyl hóa quá mức thường được quan sát thấy trong ung thư

biểu mô đại trực tràng, u thần kinh đệm, ung thư phổi không tế bào nhỏ, u lympho

và ung thư biểu mô cổ và đầu. Trong ung thư đại trực tràng, sự bất hoạt MGMT là

một sự kiện sớm liên quan đến phát sinh đột biến. Hiện tượng methyl hóa promoter

MGMT được phát hiện ở khoảng 45% bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm

(GBM-Glioblastoma), liên quan đến việc tăng độ nhạy cảm với TMZ và kéo dài

thời gian sống thêm của bệnh nhân [28].

26

Hình1.14. Cấu trúc gen MGMT [30].

Methyl hóa vùng promoter MGMT đã được quan sát trong ung thư phổi, tuy

nhiên tình trạng methyl hóa MGMT cho thấy sự khác nhau giữa các báo cáo (8 –

50%) [113]. Một nghiên cứu trên bệnh nhân Hàn Quốc cho thấy tỷ lệ methyl

MGMT là 17% [69]. Trong khi đó, kết quả phân tích trên bệnh nhân người Trung

Quốc có tỷ lệ methyl hóa gen này cao hơn khá nhiều 30 – 50% [83, 151]. Đồng

thời, methyl hóa MGMT ở những bệnh nhân ung thư phổi giai đoạn I-III và những

bệnh nhân trẻ tuổi cho thấy tiên lượng xấu trong quá trình tiến triển của ung thư

phổi [14].

Hình 1.15. Cơ chế sửa chữa DNA của MGMT [100].

27

1.4.2.5. Methyl hóa gen RASSF1A

RASSF1A (Ras association domain-containing protein 1A) là một trong 8

đồng phân của gen RASSF1 bao gồm RASSF1A, RASSF1B, RASSF1C, RASSF1D,

RASSF1E, RASSF1F, RASSF1G, RASSF1H. RASSF1 nằm ở vị trí 3p21.3 trên

nhiễm sắc thế số 3 và có kích thước khoảng 11 kb bao gồm 8 exon [87]. RASSF1A

bao gồm các exon 1α, 2αβ, 3, 4, 5, 6 mã hóa cho chuỗi polypeptide ngắn với 340

axit amin có trọng lượng phân tử là 38,8 kDa (Hình 1.16) [87] (Hình 1.16).

Hình 1.16. Cấu trúc của gen RASSF1A và các đồng phân [87].

RASSF1A là một gen ức chế khối u tham gia vào con đường điều hòa sự phát

triển và chết theo chương trình của tế bào (Hình 1.16) [87]. RASSF1A tham gia

tổng hợp thoi vô sắc và có thể gây kìm hãm chu kì tế bào bằng cách tác động đến

protein Rb (Retinoblastoma protein). RASSF1A ức chế quá trình tích lũy cyclin D1

điều khiển sự phosphoryl hóa Rb và kiểm soát chương trình chết tự nhiên của tế bào

từ pha G1. Nhờ vậy RASSF1A có thể ức chế chu kỳ tế bào ở điểm chuyển đổi G1/S

[87]. Ngoài ra, RASSF1A có thể kết hợp với serine/threonine kinase MST1

(mammalian sterile twenty - like protein) để điều khiển Ras theo con đường chết

theo chương trình [2]. RASSF1A còn được chứng minh có khả năng ức chế sự xâm

lấn và di căn của những dòng tế bào ung thư phổi thông qua sự ức chế protein YAP

(Yes-associated protein) [26].

28

Methyl hóa quá mức gen RASSF1A xảy ra chủ yếu ở đảo CpG – A gồm 48 vị

trí CpG nằm ở vùng promoter và exon 1 [87]. Hiện tượng methyl hóa RASSF1A

được phát hiện ở rất nhiều ung thư khác nhau như: U nguyên bào thần kinh, ung thư

biểu mô tuyến giáp, ung thư gan, tụy, tuyến thượng thận … và đặc biệt phổ biến ở

ung thư đường tiêu hóa [87]. Tuy nhiên, mức độ methyl hóa gen RASSF1A không

cho thấy sự tương đồng trong các dạng ung thư khác nhau của đường tiêu hóa. Tỷ lệ

methyl hóa gen này trong ung thư biểu mô tế bào gan là 78% trong khi ở u nguyên

bào gan chỉ có 34,6% trường hợp. Tương tự, tỷ lệ methyl hóa RASSF1A trong các

dạng ung thư đường tiêu hòa khác lần lượt là: Ung thư biểu mô tế bào vảy thực

quản 50%, ung thư tuyến tụy tuyến tụy 54%, u nội tiết tụy 75%, ung thư biểu mô

đại trực tràng 35,6% và dạ dày 31% [87].

Hình 1.17. Chức năng ức chế khối u của RASSF1A [25].

Methyl hóa RASSF1A đã được nghiên cứu khá rộng rãi và trở thành dấu

chuẩn trong chẩn đoán và điều trị ung thư phổi. Tỷ lệ methyl hóa RASSF1A trong

các nghiên cứu khác nhau từ 20 – 80% [146]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra methyl

hóa RASSF1A có tiên lượng xấu đối với bệnh nhân ung thư phổi. Những bệnh nhân

mang gen RASSF1A bị methyl hóa có thời gian sống thêm cũng như thời gian sống

không bệnh ngắn hơn so với bệnh nhân không methyl hóa RASSF1A [21,74]. Ngoài

ra, methyl hóa RASSF1A có liên quan đến tiền sử hút thuốc của bệnh nhân. Năm

2011, Yanagawa N. và cs. tiến hành phân tích 62 bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến

của phổi, kết quả cho thấy tỷ lệ methyl hóa RASSF1A ở nhóm không hút thuốc là

29

34,6% trong khi tỷ lệ này ở nhóm hút thuốc là 61,9% [153]. Nghiên cứu của Lee

S.M. và cs. (2011) cũng cho kết quả tương tự [74]. Vì vậy, hút thuốc lá có thể là

nguyên nhân gây nên sự methyl hóa RASSF1A ở những bệnh nhân ung thư phổi.

1.5. Điều trị đích trong ung thƣ và ung thƣ phổi

1.5.1. Điều trị đích trong ung thư

Ung thư thể rắn ở người gây ra bởi nhiều nguyên nhân bao gồm các thay đổi

di truyền và di truyền ngoại gen. Trong các phương pháp điều trị ung thư, hóa trị

truyền thống đã được chấp thuận từ 60 năm trước. Các thuốc hóa trị nhắm vào các

tế bào ung thư có đặc điểm phân chia rất nhanh, tuy nhiên, những loại thuốc này

cũng nhắm vào một số tế bào bình thường, chẳng hạn như tế bào biểu mô ruột. Với

mục đích chỉ nhắm tới các tế bào, liệu pháp điều trị đích đã được phát triển nhằm

ngăn chặn sự phát triển và di căn của ung thư. Thay vì điều trị trên toàn bộ hệ gen,

liệu pháp điều trị đích tập trung vào những thay đổi phân tử cụ thể giúp mang lại lợi

ích trong điều trị cho nhiều loại ung thư như phổi, đại trực tràng, vú, ung thư hạch

và bệnh bạch cầu [7]. Từ năm 2000, cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ

(FDA) đã phê duyệt hơn 15 liệu pháp điều trị đích trong ung thư. Liệu pháp điều trị

đích được chia thành 3 loại chính: 1) Kháng thể đơn dòng, 2) Chất ức chế phân tử

nhỏ và 3) Độc tố miễn dịch. Mỗi liệu pháp điều trị có ưu và khuyết điểm riêng dựa

trên việc xác định những thay đổi phân tử đặc hiệu ở các tế bào ung thư, do vậy

điều trị hiệu quả hơn và ít gây hại cho mô và tế bào bình thường hơn các phác đồ

điều trị hiện nay.

Những thay đổi bất thường trong hoạt tính kinase là con đường chủ yếu làm

các tế bào bình thường chuyển dạng sang ung thư. Các chất ức chế phân tử nhỏ

cạnh tranh vị trí liên kết của Tyrosine Kinase dẫn tới bất hoạt hoặc kích hoạt ATP.

Các chất này nhắm đến các protein không được kiểm soát hoặc tăng biểu hiện trong

quá trình tiến triển ung thư như BCR-ABL, Akt hay mTOR. Khi các phân tử này

liên kết với đích đặc hiệu, chúng sẽ bất hoạt vùng Tyrosine Kinase, từ đó ngăn chặn

con đường tín hiệu tiếp theo. Các thuốc thuộc dòng này đặc biệt có hiệu quả đối với

bệnh nhân được điều trị kết hợp với phương pháp hóa trị. Hiện nay, hơn 20 đích

kinase khác nhau đã được phát triển trong các thử nghiệm lâm sàng [42].

30

Một trong những cách điều trị đích là tạo ra các kháng thể đơn dòng chống

lại protein đích có vai trò trong quá trình hình thành khối u. Các nhà khoa học đã

phát triển các kháng thể đơn dòng nhắm tới một loạt các protein liên quan đến nhiều

loại ung thư. Ba cơ chế chính phá hủy tế bào ung thư bao gồm: Phá vỡ chức năng

của protein và tín hiệu theo sau; gây độc tính độc lập với kháng thể và độc tính độc

lập với bổ thể [7]. Bên cạnh các phương pháp truyền thống, kháng thể đơn dòng

ngày càng được sử dụng phổ biến trong điều trị ung thư. Liệu pháp này sử dụng rất

nhiều kháng thể được tạo ra bên ngoài cơ thể hơn là những kháng thể do hệ miễn

dịch của bệnh nhân sản xuất ra. Các kháng thể đơn dòng đầu tiên được tạo ra trong

phòng thí nghiệm bằng cách dung hợp tế bào ung thư của chuột (Myeloma) với tế

bào B của chuột hình thành dạng tế bào lai. Tất cả các kháng thể đơn dòng ban đầu

có nguồn gốc từ chuột, tuy nhiên để đảm bảo an toàn và có hiệu quả điều trị cao hơn

trong điều trị ung thư, các kháng thể đơn dòng hiện nay đều có nguồn gốc từ người.

Trong thập kỷ qua, nhiều kháng thể đơn dòng đã được FDA chấp thuận để điều trị

một loạt các bệnh ung thư [7].

Độc tố miễn dịch là một loại thuốc mới bao gồm các yếu tố sinh trưởng và

kháng thể đơn dòng bị biến đổi [1]. Ban đầu, độc tố miễn dịch được tạo ra bằng

cách gắn một độc tố với một protein thông qua liên kết hóa học. Tuy nhiên, hiện

nay với công nghệ DNA tái tổ hợp có thể hình thành các protein dung hợp có độc tố

là vùng bổ sung trên kháng thể hoặc yếu tố sinh trưởng. Độc tố miễn dịch sau khi

gắn với protein bề mặt của tế bào sẽ xâm nhập vào bên trong tế bào, dẫn đến hoạt

động chết theo chương trình của tế bào đích, chẳng hạn như các độc tố bạch hầu

(DT), protein kháng virus (PAP), ngoại độc tố A từ pseudomonas (PE), ricin và

saporin [1].

Giải trình tự thế hệ mới phát hiện ra hơn 50% ung thư ở người mang các đột

biến ảnh hưởng đến trình tự DNA, cấu trúc nhiễm sắc thể. Bên cạnh các thay đổi

liên quan đến trình tự gen, các tế bào u có sự biến đổi di truyền ngoại gen nhằm trốn

thoát hệ thống miễn dịch của cơ thể. Do vậy, nghiên cứu và phát triển các loại thuốc

với mục tiêu là những biến đổi di truyền và di truyền ngoại gen ngày càng được đặc

biệt quan tâm, bao gồm các thuốc liên quan đến đột biến gen, methyl hóa DNA và

biến đổi Histone, đã được thử nghiệm và chấp thuận bởi FDA [62]. Liệu pháp di

31

truyền ngoại gen (chất ức chế DNMT, HDAC) đảo ngược những thay đổi acetyl hóa

Histone và methyl hóa DNA ở bệnh nhân ung thư. Chất ức chế DNMT và HDAC

có tác dụng bổ trợ, có thể tái kích hoạt lại các gen ức chế khối u. Vì vậy, chức năng

bình thường của tế bào được phục hồi [71].

1.5.2. Điều trị đích trong ung thư phổi

Những hiểu biết về sinh học phân tử, nguyên nhân và cơ chế phát triển của

ung thư nói chung và ung thư phổi nói riêng đã góp phần quan trọng trong việc xây

dựng những phác đồ điều trị mới có hiệu quả hơn rất nhiều so với những phương

pháp điều trị truyền thống trước đây cả về khả năng lui bệnh và chất lượng cuộc

sống của bệnh nhân ung thư [55]. EGFR và các đường truyền tín hiệu của nó đóng

vai trò quan trọng trong quá trình sinh ung thư. Hai nhóm chính của liệu pháp đích

EGFR đã được phát triển, nhóm đầu tiên là các kháng thể đơn dòng chống lại vùng

ngoại bào của EGFR, với thiết kế nhằm ức chế phần gắn phối tử hoặc có vai trò

trung gian giảm mức độ biểu hiện [51]. Lớp thứ hai bao gồm các chất ức chế

Tyrosine Kinase (TKIs), ngăn chặn truyền tín hiệu (Hình 1.18) [17]. TKIs là những

chất ức chế sự hoạt hóa phân tử EGFR được phát triển dựa trên những hiểu biết về

đột biến gen trong ung thư phổi [55, 139]. TKIs gắn vào vị trí bám ATP của phân tử

EGFR làm cho phân tử này không thể hoạt hóa và làm cho những con đường truyền

tín hiệu qua EGFR không hoạt động. Sự bất hoạt phân tử EGFR làm cho tế bào mất

khả năng phân chia, giảm khả năng sống sót và đi vào con đường chết theo chương

trình [68]. Trong những đột biến gen EGFR đã biết hầu hết những đột biến có sự

đáp ứng tốt với TKIs (trừ đột biến thay thế T790M, S768I, đột biến thêm đoạn ở

exon 20) trong đó đột biến mất đoạn ở exon 19 và thay thế L858R ở exon 21 của

gen EGFR được nghiên cứu và thử nghiệm nhiều nhất. Có nhiều công trình nghiên

cứu đã công bố về hiệu quả sự dụng của TKIs đối với bệnh nhân ung thư phổi [55,

68, 139]. Những nghiên cứu này đã chỉ ra được sự cải thiện đáng kể về tỷ lệ đáp

ứng điều trị, thời gian tái phát u và thời gian sống thêm ở những bệnh nhân mang

đột biến này được sử dụng TKIs so với bệnh nhân không sử dụng thuốc và bệnh

nhân không mang đột biến [55, 68].

Hiện nay, FDA đã chấp thuận các kháng thể đơn dòng EGFR bao gồm

Cetuximab (Erbitux) và Panitumumab (Vectibix); các chất ức chế TKIs như

32

Erlotinib (Tarceva), Gefitinib (Iressa) và Lapatinib (Tykerb). Trong đó, Gefitinib và

Erlotinib được cấp phép trong điều trị ung thư phổi [94]. Gefitinib là thế hệ thuốc

đích đầu tiên được sử dụng cho các trường hợp ung thư phổi không tế bào nhỏ di

căn có mang đột biến mất đoạn ở exon 19 và đột biến thay thế L858R ở exon 21

gen EGFR, hai đột biến này chiếm khoảng 90% đột biến EGFR kích hoạt đã biết

[131]. Tuy nhiên, các khối u dương tính với đột biến EGFR có thể kháng với chất

ức chế EGFR, do đó sàng lọc các dấu ấn sinh học có khả năng dự đoán tính nhạy

cảm với liệu pháp đích EGFR được đặc biệt quan tâm. Phản ứng với liệu pháp

kháng EGFR có thể bị biến đổi bởi đột biến EGFR dạng soma, khuếch đại gen

EGFR, tăng các thể gắn EGFR tự do, và đột biến trong các protein của con đường

truyền tín hiệu EGFR, bao gồm ERBB2, K-RAS, B-RAF, PI3KCA, PTEN và BIM

[9]. Chẳng hạn, biểu hiện quá mức protein EGFR được chứng minh là không tương

quan trong đáp ứng với các chất ức chế EGFR [16].

Hình 1.18. Điều trị đích trong ung thư phổi [138].

33

Ngoài thử thách trong phát triển các dấu ấn sinh học nhằm dự đoán phản ứng

nhạy hoặc kháng thuốc khi điều trị liệu pháp kháng EGFR, một thách thức hiện nay

là thời gian đáp ứng thường bị hạn chế và nhiều khối u luôn phát triển kháng thuốc

[9]. Các đột biến EGFR thứ cấp có thể xảy ra sau khi điều trị TKIs, ví dụ đột biến

T790M là dạng kháng thuốc phổ biến nhất đối với TKIs [158]. TKIs thế hệ thứ ba

đang được phát triển để nhắm tới T790M, bao gồm Brigatinib, HM61713,

Osimertinib và Rociletinib. Ngoài đột biến T790M, các đột biến thứ cấp trong con

đường truyền tín hiệu EGFR như đột biến KRAS, PI3K cũng ảnh hưởng đến hiệu

quả của liệu pháp đích EGFR. Ức chế EGFR chủ yếu giữ chu kỳ tế bào ở G1, ngăn

cản quá trình tổng hợp DNA, tăng sinh tế bào. Thông thường, các TKIs được sử

dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với hóa trị hoặc xạ trị liều cao [131].

1.6. Phƣơng pháp phân tích biến đổi phân tử trong ung thƣ phổi

1.6.1. Phương pháp phân tích đột biến gen trong ung thư phổi

Sinh học phân tử cung cấp các thông tin chi tiết về đặc tính di truyền ở

người, phát triển và ngày càng hoàn thiện phân tích dựa trên DNA/RNA nhằm kiểm

soát bệnh lý ở người. Trong ung thư, phát hiện đột biến gen gặp một vài hạn chế.

Thứ nhất, tế bào bình thường (tế bào lành) không mang những biến đổi trên gen; vì

vậy phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm cần đảm bảo độ chính xác để toàn bộ bệnh

phẩm đều là các tế bào ác tính, không lẫn tế bào lành. Thứ hai, không phải tất cả các

tế bào ác tính đều mang đột biến gen. Với những hạn chế này, phương pháp phát

hiện đột biến gen phải có độ nhạy cao để phát hiện được các đột biến ngay cả khi nó

xuất hiện ở mức thấp trong mẫu bệnh phẩm. Nhiều cách thức tiếp cận khác nhau

được sử dụng trong xác định các đột biến gen đã biết, mỗi phương pháp đều có

những ưu điểm và nhược điểm khác biệt, thông thường bắt đầu với phản ứng chuỗi

trùng hợp (PCR) (Hình1.19) [86]. Vào những năm 1980, Mullis giới thiệu một

phương pháp khuếch đại đoạn DNA thành một số lượng lớn chỉ trong vài giờ; được

gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR), là một thành tựu tiêu biểu trong sinh học

phân tử [98]. Một vài dạng PCR được ứng dụng phổ biến hiện nay như PCR phiên

mã ngược (Reverse transcriptase PCR), Multiplex PCR, Nested PCR, Scorpion-arm

RT-PCR (ARMS-PCR), Real time PCR...[94].

Giải trình tự gen trực tiếp (Sanger sequencing) là kỹ thuật mang tính kinh tế,

dễ triển khai nhất nhưng độ nhạy thấp nhất (có thể phát hiện đột biến khi lượng tế

bào mang đột biến phải lớn hơn 20% tổng số tế bào). Để đảm bảo lượng tế bào ác

tính, kỹ thuật này yêu cầu sự trợ giúp từ các nhà giải phẫu bệnh với mục đích

34

khoanh vùng khu vực bệnh phẩm có tế bào ác tính trước khi tiến hành tách DNA để

phát hiện đột biến [37].

Realtime PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển

thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Realtime PCR có độ nhạy khá cao, có

thể phát hiện được đột biến khi tế bào ác tính mang đột biến ở mức trên 1% tổng số

tế bào. Trong các phương pháp Realtime PCR, SYBR green được sử dụng đầu tiên

với ưu điểm đơn giản, dễ thao tác, chỉ liên kết với mạch kép DNA [5]. Tuy nhiên,

SYBR green có nhược điểm quan trọng đó là tín hiệu huỳnh quang phát ra không

cao và có thể ức chế phản ứng PCR. Do đó, Realtime sử dụng SYBR green làm chất

phát huỳnh quang không thể ứng dụng trong Multiplex realtime PCR, realtime PCR

phát hiện các SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Để khắc phục nhược điểm

này, hệ màu HRM (High Resolution Melting dye) đã được phát triển và thay thế.

Ưu điểm vượt trội của hệ màu HRM là khả năng phân biệt được sự khác biệt với 1

nucleotide do hệ màu HRM không ức chế PCR và cường độ phát huỳnh quang của

một phân tử màu HRM khi chèn vào mạch đôi DNA có thể tăng 250 lần so với khi

tự do trong dung dịch. Với realtime PCR sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang,

tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu xác định SNP hay định genotype có thể sử dụng

Taqman probe hoặc probe lai (FRET) (Hình 1.19) [63].

Kỹ thuật lai DNA tại chỗ (In stitu Hybridiration) cho phép xác định vị trí của

trình tự DNA đặc biệt trên nhiễm sắc thể. Thí nghiệm lai tại chỗ lần điều tiên được

tiến hành vào năm 1969 với các đầu dò là các DNA gắn phóng xạ, sau đó đầu dò

huỳnh quang ra đời và nhanh chóng thay thế các đoạn DNA phóng xạ. Cho đến nay

kỹ thuật lại tại chỗ huỳnh quang đã được cải thiện rất nhiều về độ nhạy và độ đặc

hiệu. Ngoài lai tại chỗ huỳnh quang, lai tại chỗ sử dụng enzyme cũng được ra đời

nhằm cải thiện nhược điểm của đầu do huỳnh quang với thời gian tồn tại của tín

nhiệu ngắn và có thể sử dụng kính hiển vi quang học thay vì kính hiển vi huỳnh

quang (Hình 1.19) [36]. Vi dãy DNA được sử dụng để phát hiện nhiều đột biến.

Trong công nghệ này, các đích DNA khác nhau ở dạng mạch đơn sẽ được cố định

lên một bề mặt rắn (chip). Mặt khác, DNA mẫu hoặc cDNA được gắn huỳnh quang

được lai với chip. Sau đó sử dụng một hệ thống laser, tín hiệu huỳnh quang được

35

kiểm tra; các trình tự và số lượng trình tự quan tâm trong mẫu nghiên cứu được xác

định [36].

Hình 1.19. Một số kỹ thuật phát hiện đột biến gen [36].

Bên cạnh những đột biến đã được nghiên cứu, với những đột biến mới,

phương pháp đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) cho phép sàng lọc đơn giản và hiệu

quả các đột biến như thay thế nucleotide, mất đoạn ngắn, thêm đoạn hoặc đảo đoạn

có kích thước nhỏ. Nguyên tắc của kỹ thuật đó là 2 mạch DNA trong đó 1 mạch

mang đột biến và mạch còn lại bình thường sẽ có độ di động khác nhau trong quá

trình điện di [64]. Khoảng 80 – 90% đột biến điểm tiềm năng có thể được phát hiện

bởi kỹ thuật SSCP. Trong những năm gần đây, công nghệ mới cho giải trình tự

DNA với quy mô lớn được gọi là giải trình tự thế hệ tiếp mới (NGS). Ưu điểm nổi

trội của kỹ thuật này cho phép định tính và định lượng toàn hệ gen trong thời gian

vài ngày [121].

1.6.2. Phương pháp phân tích methyl hóa DNA trong ung thư phổi

Hiện nay, ba phương pháp được sử dụng để phân tích methyl hóa DNA trên

toàn bộ hệ gen hoặc từng gen đặc hiệu. Thứ nhất là phương pháp kết tủa miễn dịch

sử dụng kháng thể đặc hiệu nhận biết trình tự methyl hóa. Thứ hai là sử dụng các

enzyme giới hạn nhạy cảm với trình tự methyl hóa/không methyl hóa, dẫn đến cắt

hoặc không cắt các trình tự này. Cuối cùng là các kỹ thuật dựa trên DNA đã xử lý

bisulfite, trong đó Cytosine không bị methyl sau quá trình xử lý biến đổi thành

36

Uracil và Cytosine bị methyl được giữ nguyên sau quá trình này (Hình 1.20) [129].

Với đặc điểm phòng thí nghiệm ở các nước đang phát triển như Việt Nam, phát

triển các kỹ thuật phân tích định tính và định lượng methyl hóa từng gen đặc hiệu

đối với từng loại ung thư được đặc biệt quan tâm.

Hình 1.20. Lịch sử phát hiện các kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA [52].

PCR đặc hiệu methyl (Methyl specific PCR, MS-PCR) là kỹ thuật đơn giản,

độ nhạy cao, cho phép phát hiện 1 alen methyl hóa trên 1000 alen không methyl hóa

với nguyên tắc DNA xử lý bisulfite được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR sử

dụng các cặp mồi đặc hiệu thiết kế trên vùng giàu CpG, cho phép khuếch đại trình

tự DNA methyl hóa hoặc DNA không methyl hóa [129, 156]. Như vậy, MS-PCR

cho phép đánh giá trình tự quan tâm là đồng hợp methyl hóa hay không methyl hóa

(chỉ thu được sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho DNA meythyl hay không

methyl hóa), và dị hợp methyl hóa (thu được đồng thời cả sản phẩm khuếch đại với

cặp mồi methyl hóa và không methyl hóa). Tuy nhiên, nhược điểm của phương

pháp này đó là không đánh giá được mức độ methyl hóa vùng trình tự nằm giữa các

vị trí thiết kế mồi đặc hiệu [156]. Để khắc phục điểm yếu này, các kỹ thuật định

lượng methyl hóa DNA dựa trên biến đổi bisulfite được phát triển và hoàn thiện.

Giải trình tự bisulfite (Bisulfite sequencing) là tiêu chuẩn vàng cho phép đánh giá

methyl hóa ở từng vị trí CpG trong sản phẩm khuếch đại từ khuôn DNA đã xử lý

bisulfite, nhưng không phù hợp khi tiến hành phân tích trên số lượng mẫu nghiên

cứu lớn [38].

37

Bên cạnh đó, phương pháp COBRA (Combined bisulfite restriction analysis)

có thể định lượng các Cytosine bị methyl hóa/không methyl hóa trong trình tự nhận

biết của enzyme giới hạn. DNA sau khi xử lý bisulfite dẫn đến thay đổi nucleotide

(C thành U) có thể làm xuất hiện hoặc mất đi vị trí nhận biết của enzyme giới hạn

[152]. Phương pháp định lượng qMS – PCR đánh giá methyl hóa trên sản phẩm

PCR dựa trên 2 nguyên lý khác nhau. Đầu tiên, định lượng qua SYBR green cho

phép phát hiện tín hiệu huỳnh quang sau mỗi chu kỳ khuếch đại do SYBR green

liên kết với mạch kép DNA [141]. Với mục đích giảm kết quả dương tính giả,

nguyên lý sử dụng đầu dò Taqman và các mồi đặc hiệu cho DNA methyl hóa và

DNA không methyl hóa được phát triển và ngày càng hoàn thiện [10]. Vì vậy, qMS

– PCR thường được ứng dụng thường quy để phân tích methyl hóa DNA trên nhiều

bệnh nhân và đánh giá đồng thời nhiều trình tự gen quan tâm.

1.7. Nghiên cứu các dấu ấn phân tử trong ung thƣ phổi ở Việt Nam

Hiện nay, ung thư phổi là loại ung thư phổ biến và có tỷ lệ tử vong cao nhất

ở Việt Nam, trong đó 80 - 90% là dạng không tế bào nhỏ (UTPKTBN) [60]. Thụ

thể yếu tố phát triển biểu mô EGFR trở thành đích nhắm cho liệu pháp điều trị đích

đối với nhóm bệnh nhân UTPKTBN có đột biến gen EGFR đáp ứng tốt với thuốc

ức chế Tyrosine Kinase (TKIs) của EGFR như Erlotinib hay Gefitinib [107]. Nhằm

định hướng công tác điều trị đích bằng Erlotinib và Gefitinib, nghiên cứu mô tả tỷ

lệ đột biến gen EGFR trên bệnh nhân UTPKTBN tại Việt Nam ngày càng phổ biến.

Cụ thể, Vu H. A. và cs. (2016) phân tích 332 mẫu bệnh phẩm UTPKTBN bằng kỹ

thuật giải trình tự tự động nhận thấy 40,7% các mẫu có đột biến gen EGFR [145].

Bên cạnh đó, nghiên cứu đột biến gen EGFR trên 120 mẫu UTPKTBN giai đoạn

muộn, Nguyễn Minh Hà và cs. (2013) sử dụng kỹ thuật realtime PCR Scorpion

ARMS phát hiện 25/70 (35,7%) mẫu phân tích có hiện tượng này [47]. Sử dụng kỹ

thuật lai DNA, Mai Trọng Khoa và cs. (2016) nhận thấy 204/511 (40,1%) mẫu

UTPKTBN có đột biến ở gen EGFR [67]. Ngoài ra, đã có một số luận án tiến sỹ

nghiên cứu về đặc điểm đột biến và đáp ứng với TKIs ở bệnh nhân ung thư phổi tại

Việt Nam như luận án của Nguyễn Minh Hà (2014) và Lê Thu Hà (2017) [46, 48].

Bên cạnh các đột biến gây ung thư, các nguyên nhân ngoại cảnh chính dẫn

đến sự hình thành và phát triển ung thư gồm có ô nhiễm môi trường sống (khói

38

thuốc lá, chất thải, hóa chất và nguồn phóng xạ công nghiệp...), nguồn thực phẩm

không an toàn (bị nhiễm các chất gây ung thư), các tác nhân gây bệnh truyền

nhiễm.... Những nghiên cứu cuối thập kỷ 20 cho thấy những tác nhân ngoại cảnh

nêu trên đều có khả năng gây ra các biến đổi di truyền ngoại gen [32]. Nói cách

khác hầu hết các loại ung thư, trong đó có ung thư biểu mô tuyến của phổi đều ít

nhiều gây ra do rối loạn kiểm soát của di truyền ngoại gen. Tuy nhiên, những báo

cáo phân tích methyl hóa DNA trong ung thư phổi cũng như phân tích đồng thời đột

biến gen EGFR và hiện tượng methyl hóa DNA chưa được triển khai rộng rãi tại

Việt Nam. Methyl hóa các gen liên quan ung thư được nghiên cứu rải rác trong một

số dạng ung thư như methyl hóa gen BRCA1, ER, RASSF1A, APC trong ung thư vú

và ung thư buồng trứng; gen GSTP1, RASSF1A trong ung thư tuyến tiền liệt [27,

142, 143]. Chỉ có một nghiên cứu về hiện tượng methyl hóa của MiR34 trên bệnh

nhân ung thư phổi của Vo T.T.L. và cs (2018) [144]. Methyl hóa và khuếch đại gen

EGFR có liên quan mật thiết đến sự biểu hiện và biểu hiện quá mức của gen EGFR.

Methyl hóa làm giảm biểu hiện protein trong khi khuếch đại gen lại tăng cường

mức độ biểu hiện [95]. Tại Việt Nam, việc nghiên cứu biểu hiện một số dấu ấn miễn

dịch bằng hóa mô miễn dịch trong ung thư phổi nói chung và UTPKTBN nói riêng

chưa được nghiên cứu rộng rãi. Các dấu ấn được sử dụng hiện nay chủ yếu tập

trung vào p63, TTF–1, CK5/6, CK7 và Napsin A [19]. Đặc biệt, những nghiên cứu

và đánh giá mối tương quan giữa các biến đổi phân tử EGFR bao gồm đột biến gen,

methyl hóa DNA và biểu hiện quá mức protein tương ứng cùng với thay đổi methyl

hóa trên các gen ức chế khối u phổ biến như MGMT, MLH1, BRCA1,

RASSF1A…trong ung thư phổi hoàn toàn chưa được triển khai, là một lĩnh vực

nghiên cứu mới ở Việt Nam. Bởi vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đột

biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl hóa một số gen liên

quan trên bệnh nhân ung thƣ biểu mô tuyến ở phổi”

39

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu

2.1.1. Mẫu nghiên cứu

Một trăm ba mươi chín (139) mẫu bệnh phẩm đúc paraffin từ bệnh nhân ung

thư biểu mô tuyến của phổi được Trung tâm Giải phẫu bệnh và Sinh học phân tử,

Bệnh viện K cung cấp trong thời gian từ năm 2015 đến 2018. Mẫu được lựa chọn

dựa trên tiêu chuẩn: Bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến có nguồn gốc từ phổi được

chẩn đoán bằng mô bệnh học dựa trên phương pháp nhuộm H&E (Hematoxiline và

Eosine) và chẩn đoán loại trừ là khối u di căn từ cơ quan khác đến bằng nhuộm hóa

mô miễn dịch. Năm mẫu mô phổi lành được thu thập từ vùng mô cách khối u 5 – 7

cm. Đặc điểm về mô bênh học của từng mẫu bệnh phẩm được xác định và phân loại

bởi các chuyên gia giải phẫu bệnh tại Trung tâm Giải phẫu bệnh và Sinh học phân

tử, Bệnh viện K. Thông tin lâm sàng của bệnh nhân được tiến hành thu thập tại các

khoa lâm sàng, Bệnh viện K. Thông tin lâm sàng và chẩn đoán giải phẫu bệnh của

bệnh nhân tham gia nghiên cứu được trình bày trong Phụ lục 1.

Mẫu máu của người khỏe mạnh được cung cấp bởi Khoa huyết học – vi sinh,

Bệnh viện K. DNA từ mẫu máu người khỏe mạnh được sử dụng làm đối chứng

dương cho trình tự EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A không bị methyl

hóa và trình tự EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A methyl hóa sau khi

được xử lý với enzyme M.sssI.

2.1.2. Hóa chất

Hóa chất và bộ kit sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1.

Trình tự các cặp mồi cho phản ứng PCR được trình bày trong bảng 2.2. Các hóa

chất và bộ kit đều đạt tiêu chuẩn dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử.

40

Bảng 2.1. Kit và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên kit, hóa chất Hãng sản xuất Cat No

1 Kit tách chiết DNA tổng số từ mẫu

mô và mẫu máu

- QIAmp DNA FFPE Tissue kit

- Reliaprep TM Blood gDNA

Miniprep

Qiagen

Promega

157015287

A5081

2 Kit phát hiện đột biến gen EGFR

bằng công nghệ Scorpion-arm RT-

PCR

- Therascreen EGFR RGQ PCR kit

Qiagen

874111

3 Kit xử lý bisulfite

- Epitect Bisulfite kit

Qiagen

1570022598

4 Kit giải trình tự DNA trên máy ABI

3130

- Bigdye Termiator v3.1 Sequencing

kit

Applied Bio-System

1603386

5 Kit nhuộm hóa mô miễn dịch

- Ultra View Universal DAB

Detection Kit

Roche

Y26202

6 Hỗn hợp PCR master mix

- HotstarTaq DNA Polymerase

Qiagen

203203

7 Các hóa chất chính

- Xylen

- Cồn tuyệt đối

- Agarose

- Bisacrylamide

- Kháng thể kháng EGFR

(CONFIRM anti-EGFR -5B7)

- Tris Acetate – EDTA Buffer

- Tris- Borate – EDTA Buffer

- Nuclease Free Water

- DNA 100Bp Ladder

- Ethidium Bromide

- Gelred

-TEMED

Merk

Sigma

Roche

Sigma

Roche

Sigma

Sigma

Apex

…

SHBG7326V

11315400

M 1533

Y21127

SLBM5034V

SLBN7008V

150713

41

Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Gen Tên mồi Trình tự nucleotide (5’-3’) Kích thƣớc (bp)

β-globin

U01317.1

Globin F caa ctt cat cca cgt tca cc 268

[99] Globin R gaa gag cca agg aca ggt ac

EGFR

NC_000007.14

EGFR UnF ggt tgg gtt tgt aag ttt gt 150

[79] EGFR UnR ata aac aac aat aac ccc ca

EGFR Me F1 ttt atg cgt cgt ttt att ttc gtc 495

(Tự thiết kế) EGFR MeR1 cgg tcg ttt cgg agg gtc gta tcg

EGFR MeF2 tgt ttt tcg cgt ttc ggt tcg cgc Vòng 2: 158

[120] EGFR MeR2 cgt cta aac gac gac gcc gcc g

MGMT

NC_000010.11 MGMT meF1 gta tgg gtt cga ttc ggt cgg gc

Vòng 1: 249

(Tự thiết kế)

MGMT meF2 ttt cga cgt tcg tag gtt ttc gc Vòng 2: 81

MGMT meR gca ctc ttc cga aaa cga aac g [83]

MGMT unF1 gta tgt gtt gat ttg gtt ggg tg Vòng 1: 249

(Tự thiết kế)

MGMT unF2 ttt gtg ttt tga tgt ttg tag gt Vòng 2: 93

MGMT unR ggg tgg ttt tat att tga tgg tg (Tự thiết kế)

MLH1

NC_000003.12 MLH1 meF1 gcg tta agt att ttt ttc gtt ttg c

Vòng 1: 417

(Tự thiết kế)

MLH1 meF2 cga att aat agg aag agc gga ta Vòng 2: 301

MLH1 meR tac cac gaa cga cat ttt aac g (Tự thiết kế)

MLH1 unF1 gtg tta agt att ttt ttg ttt tgt Vòng 1: 417

(Tự thiết kế)

MLH1 unF2 tga att aat agg aag agt gga tag t Vòng 2: 303

MLH1 unR cct acc aca aac aac att tta aca (Tự thiết kế)

42

Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu (tiếp)

Gen Tên mồi Trình tự nucleotide (5’-3’) Kích thƣớc (bp)

BRCA1

NC_000017.11 BRCA1 meF tgg tgg taa cgg aaa agc gc

Vòng 1: 75

[31]

BRCA1 meR1 aaa tct caa cga act cac gcc g Vòng 2: 70

BRCA1 meR2 tac acg aac tca cgc cgc gca atc g (Tự thiết kế)

BRCA1 unF ttg gtt ttt gtg gta atg gaa aag tgt Vòng 1: 86

[31]

BRCA1 unR1 caa aaa atc tca aca aac tca cac ca Vòng 2: 77

BRCA1 unR2 tca aca aac tca cac cac aca atc ca [31]

RASSF1A

NC_000003.12

RASSF1A MeF ggt ttt gcg aga gcg cgt tta 170

[142] RASSF1A MeR acg cta aca aac gcg aac cga

RASSF1A UnF1 ggg gtt ttg tga gag tgt gtt tag Vòng 1: 175

[82]

Vòng 2: 135

[142]

RASSF1A UnF2 gag agt gtg ttt agt ttt gtt t

RASSF1A UnR taa aca cta aca aac aca aac caa ac

2.2. Thiết bị chính

Nghiên cứu sử dụng hệ thống thiết bị chuyên dụng cho sinh học phân tử tại

Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen – Viện công nghệ sinh học và Trung

tâm Giải phẫu bệnh và Sinh học phân tử - Bệnh viện K bao gồm:

- Máy cắt mẫu đúc paraffin Microm HP 325 (Themo Scientific, 9001140)

- Máy PCR: Veriti 96 – Well Thermal Cycler (Applied Bio-system 2990211069,

California 94404, USA)

- Hệ thống điện di ngang: ELITE 300 PLUS (Wealtee Corp., NV 89431, USA)

- Hệ thống điện di đứng: ELITE 300 PLUS (Wealtee Corp., NV 89431, USA)

- Máy li tâm: MIKRO 220R (Hettich Zentrifugen, Germany)

- Máy đo nồng độ DNA: Spectrophotometer (BioDrop 80-3006-51)

- Tủ ấm: INB 200 (Memmert E210-0681 Germany)

43

- Tủ an toàn sinh học cấp 2: LABGARD Class II Biological Safety Cabinet

(NUAIRE 142561020811, MN 55447, USA)

- Tủ thao tác PCR: Clean Bench (JEPO TECH S010211, Korea)

- Máy chụp ảnh gel: UVCI-01-312 (Major Science 110223061, CA 95070, USA)

- Hệ thống RT-PCR Rotor-Gene Q MDx (Qiagen Hilden, Germany)

- Hệ thống giải trình tự gen: 3130 Genetic Analyzer, (Hitachi High-Technologies

Corporation, Tokyo, Japan)

- Hệ thống nhuộm hóa mô miễn dịch: Benchmark XT, (Vetana Mecical System,

Inc, 1910 E. Innavation Park Drive, Tucson, AZ 85755, USA)

- Bể ổn nhiệt: JSRC-13 (JS Research Inc. Korea)

- Máy sấy lam: MEDAX GmbH & Co. KG (D-24536 Neumunster Germany)

- Hệ thống nhuộm Hematoxilin và Eosin: Medite (Germany)

- Kính hiển vi quang học: Olympus (Philippines)

- Các thiết bị chuyên dụng khác.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp mô tả cắt ngang, thông

tin bệnh nhân và mẫu bệnh phẩm sử dụng trong nghiên cứu được sự cho phép của

Bệnh viện K.

2.3.1. Tách chiết DNA tổng số và xác định nồng độ DNA

+ DNA tách từ mẫu đúc: Mảnh bệnh phẩm và mẫu phổi lành đúc trong

paraffin được cắt lát với độ dày 5 – 20 µm. Mỗi mẫu gồm 5 – 10 lát tùy vào độ lớn

của mẫu được cho vào các ống eppendort 1,5ml. DNA từ mẫu đúc paraffin được

tiến hành tách chiết bằng bộ kit QIAmp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, UK) theo

hướng dẫn cụ thể của hãng sản xuất. DNA sau khi tách chiết được bảo quản trong

dung dịch đệm TE ở – 20 oC.

+ DNA tách từ mẫu máu: 1 ml máu người khỏe mạnh được sử dụng để tách

DNA với bộ kit ReliaprepTM

Blood gDNA Miniprep kit (Promega) theo hướng dẫn

của nhà sản xuất. DNA sau khi tách chiết được hòa tan trong 200 µl dung dịch EB

và bảo quản ở – 20 oC.

+ Xác định nồng độ DNA: DNA sau khi tách chiết được xác định bằng máy

đo quang phổ Spectrophotometer (BioDrop – USA) dựa trên sự hấp thụ ánh sáng tử

44

ngoại với bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine, độ hấp thụ tỷ lệ

thuận với nồng độ DNA. Hàm lượng DNA được xác định bằng công thức: [DNA]

(µg) = A260 x 50 x X. Trong đó A260 là độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm; X là số lần

pha loãng.

2.3.2. Xử lý bisulfite với DNA tổng số

Quá trình xử lý bisulfite là một chuỗi phản ứng hóa học của sodium bisulfite

(HSO3-) xảy ra trên sợi đơn của DNA ở nhiệt độ cao và pH thấp bao gồm 3 bước

chính: (1) Phản ứng Sulfo hóa tại vị trị C số 5 của Cytosine; (2) Loại bỏ nhóm amin

và (3) Loại sulfo của nhóm alkali. Kết quả của quá trình xử lý bisulfite sẽ biến

nucleotide Cytosine thành Uracil. Khi Cytosine bị gắn gốc methyl ở vị trí Carbon số

5 thì quá trình xử lý bifulfite bị ngăn cản ngay từ bước 1. Vì vậy, quá trình xử lý

bisulfite chỉ biến đổi các Cytosine không bị methyl hóa thành Uracil, trong khi vẫn

giữ nguyên các Cytosine bị methyl hóa. Những mẫu sử dụng trong nghiên cứu được

xử ly bisulfite bằng kit Epitect Bisulfite kit (48) (Qiagen – UK) theo hướng dẫn của

nhà sản xuất.

Hình 2.1: Phương pháp xử lý bisulfite [50].

2.3.3. Phương pháp PCR

Phản ứng PCR nhằm mục đích khuếch đại các trình tự DNA quan tâm. Phản

ứng PCR trong nghiên cứu được thực hiện để khuếch đại những trình tự DNA sau:

+ Khuếch đại gen đơn bản β-globin (268 bp) nhằm đánh giá chất lượng DNA

sau tách chiết và hiệu quả của quá trình xử lý bisulfite. Thành phần và điều kiện

phản ứng được trình bày trong Bảng 2.3 và Bảng 2.4.

45

Bảng 2.3. Điều kiện các phản ứng PCR sử dụng trong nghiên cứu

Phản ứng

PCR Mồi vòng 1

Nhiệt độ, thời

gian gắn mồi

vòng 1

Mồi vòng 2

Nhiệt độ, thời

gian gắn mồi

vòng 2

TT EGFR

không methyl

EGFR

UnF – UnR 58

oC, 30 giây

TT BRCA1

không methyl

BRCA1

UnF – UnR1 55

oC, 40 giây

BRCA1

UnF – UnR2 62

oC, 20 giây

TT MGMT

không methyl

MGMT

UnF1 – UnR 55

oC, 30 giây

MGMT

UnF2 – UnR 58

oC, 30 giây

TT MLH1

không methyl

MLH1

UnF1 – UnR 55

oC, 30 giây

MLH1

UnF2 – UnR 58

oC, 20 giây

TT RASSF1A

không methyl

RASSF1A

UnF1 – UnR 58

oC, 20 giây

RASSF1A

UnF2 – UnR 62

oC, 20 giây

TT EGFR

methyl

EGFR

MeF1 – MeR1 55

oC, 30 giây

EGFR

MeF2 – MeR2

TT BRCA1

methyl

BRCA1

MeF – MeR1 55

oC, 40 giây

BRCA1

MeF – MeR2 62

oC, 40 giây

TT MGMT

methyl

MGMT

MeF1 – MeR 55

oC, 40 giây

MGMT

MeF2 – MeR 58

oC, 30 giây

TT MLH1

methyl

MLH1

MeF1 – MeR 55

oC, 30 giây

MLH1

MeF2 – MeR 58

oC, 30 giây

TT RASSF1A

methyl

RASSF1A

MeF – MeR 64

oC, 50 giây

TT β-globin Glubin

F-R 65

oC, 10 giây

+ Trình tự promoter EGFR methyl hóa sử dụng phản ứng Nested-PCR với

cặp mồi vòng một và vòng hai lần lượt là EGFR MeF1– EGFR MeR1 và EGFR

MeF2 – EGFR MeR2. Trình tự Promoter EGFR không methyl với cặp mồi MS –

46

PCR đặc hiệu EGFR UnF – EGFR UnR. Thành phần và điều kiện phản ứng được

trình bày trong Bảng 2.3 và Bảng 2.4.

+ Trình tự promoter BRCA1 methyl hóa sử dụng phản ứng Nested-PCR với

cặp mồi vòng một và vòng hai lần lượt là BRCA1 MeF – BRCA1 MeR1 và BRCA1

MeF – BRCA1 MeR2. Trình tự promoter BRCA1 không methyl với cặp mồi MS –

PCR đặc hiệu của phản ứng Nested: BRCA1 UnF – BRCA1 UnR1 và BRCA1 UnF

– BRCA1 UnR2. Thành phần và điều kiện phản ứng được trình bày trong Bảng 2.3

và Bảng 2.4.

+ Trình tự promoter MGMT methyl hóa sử dụng phản ứng Nested-PCR với

cặp mồi vòng một và vòng hai lần lượt là MGMT MeF1 – MGMT MeR và MGMT

MeF2 – MGMT MeR. Trình tự promoter MGMT không methyl với cặp mồi MS –

PCR đặc hiệu của phản ứng Nested: MGMT UnF1 – MGMT UnR và MGMT UnF2

– MGMT UnR. Thành phần và điều kiện phản ứng được trình bày trong Bảng 2.3

và Bảng 2.4.

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR trong nghiên cứu

Hóa chất Thể tích (µl)

H2O 13,0

Đệm 10X (20 mM Mg2+

) 2,0

dNTPs (2 mM) 1,0

Mồi xuôi - F (10 µM) 1,0

Mồi ngược - R (10 µM) 1,0

Taq DNA polymerase (1 U/µl) 1,0

DNA khuôn 1,0

Tổng thể tích 20,0

+ Trình tự promoter MLH1 methyl hóa sử dụng phản ứng Nested-PCR với

cặp mồi vòng một và vòng hai lần lượt là MLH1 MeF1 – MLH1 MeR và MLH1

MeF2 – MLH1 MeR. Trình tự promoter MLH1 không methyl với cặp mồi MS –

PCR đặc hiệu của phản ứng Nested: MLH1 UnF1 – MLH1 UnR và MLH1 UnF2 –

MLH1 UnR. Thành phần và điều kiện phản ứng được trình bày trong Bảng 2.3 và

Bảng 2.4.

47

+ Trình tự promoter RASSF1A methyl hóa sử dụng phản ứng MS – PCR với

cặp mồi đặc hiệu RASSF1A MeF – RASSF1A MeR. Trình tự promoter RASSF1A

không methyl với cặp mồi MS – PCR đặc hiệu của phản ứng Nested: RASSF1A

UnF1 – RASSF1A UnR và RASSF1A UnF2 – RASSF1A UnR. Thành phần và điều

kiện phản ứng được trình bày trong Bảng 2.3 và Bảng 2.4.

2.3.4. Phương pháp điện di

Phương pháp điện di được sử dụng để xác định sự có mặt của DNA đồng

thời phân biệt sự khác nhau về kích thước giữa những đoạn DNA quan tâm. Điện di

trên gel Agarose 1% được sử dụng để kiểm tra DNA tổng số sau tách chiết từ máu

người khỏe mạnh và sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn gen đơn bản β-globin với

dung dịch đệm TAE 1X (40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA). Trong khi

điện di Polyacryramide 10% được dùng để kiểm tra kết quả khuếch đại vùng

promoter gen EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A methyl và không methyl

với dung dịch đệm TBE 1X (89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA).

2.3.5. Phương pháp xác định đột biến gen EGFR

Đột biến gen EGFR được xác định bằng kỹ thuật RT-PCR Scorpion - Arms

sử dụng kit Therascreen EGFR RGQ PCR kit (Qiagen – UK). Bộ kit có khả năng

phát hiện 29 đột biến khác nhau trải dài trên 4 exon (18 – 21) của gen EGFR với độ

nhạy, độ đặc hiệu là 99% và ngưỡng phát hiện là 1% (phụ lục 4). Các mồi của

Scorpion Arms bao gồm hai thành phần là mồi PCR liên kết cộng hóa trị với phức

hợp đầu dò ở đầu 5’. Đầu dò chứa một trình tự DNA tự bổ sung với một đầu gắn

Reporter (chất báo cáo) và một đầu gắn Quencher (chất khử). Mồi Scorpion Arms

có đầu 5’ bị biến đổi và được gắn với một Blocker (khóa – ngăn chặn phản ứng

PCR) (Hình 2.2). Trong trường hợp không có trình tự DNA đích chất khử gần như

hấp thụ huỳnh quang phát ra từ chất báo cáo. Trong phản ứng PCR của Scorpion,

với sự có mặt của trình tự đích, chất báo cáo và chất khử chất tách ra dẫn đến sự gia

tăng của tín hiệu huỳnh quang phát ra. Sự phát huỳnh quang có thể được phát hiện

và đo trong ống phản ứng. Quy trình xác định đột biến EGFR được tiến hành tuân

theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất. Kết quả đột biến gen được phân tích dựa

trên phần mềm chuyên dụng cho hệ thống RT-PCR Rotor-gene Q24 là Rotor-Gene

Q Siries Software.

48

Hình 2.2. Phương pháp RT-PCR Scorpion Arms [6].

2.3.6. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch

Sự biểu hiện của protein EGFR được xác định thông qua phương pháp

nhuộm hóa mô miễn dịch sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng EGFR (CONFIRM

anti-EGFR – 5B7) trên hệ thống tự động Benchmark XT (Vetana Mecical System,

Tucson, AZ 85755, USA) và bộ kit phát hiện Ultra View Universal DAB Detection

Kit (Roche - Gemany). Trong phương pháp hóa mô miễn dịch phát hiện sự biểu

hiện của EGFR trên bề mặt tế bào, protein được coi như một kháng nguyên bề bặt

và được gắn được hiệu với kháng thể thứ nhất CONFIRM anti – EGFR – 5B7. Sau

đó phức hệ kháng nguyên – kháng thể tiếp tục được gắn với kháng thể thứ 2 hai là

kháng thể kháng với kháng thể thứ nhất. Phần chuỗi nặng của kháng thể thứ hai

được gắn với enzyme peroxidase (HPR – horseradish peroxidase). Cuối cùng cơ

chất DAB (3, 3 – diaminobenzidine) trong bộ kit phát hiện được đưa vào phức hệ

kháng nguyên – kháng thể. Enzyme peroxidase gắn với kháng thể thứ hai sẽ phân

hủy DAB để tạo ra kết tủa có màu nâu và có thể quan sát được bằng kính hiển vi

quang học (Hình 2.3). Kết quả biểu hiện protein EGFR được đánh giá gián tiếp

thông qua số lượng tế bào bắt màu cũng như cường độ bắt màu DAB của màng tế

49

bào. Sự biểu hiện EGFR được đánh giá thông qua 4 cấp độ: Không có sự biểu hiện

protein (0); biểu hiện yếu (1+); biểu hiện vừa (2+); biểu hiện mạnh (3+) với trên

10% tế bào có sự biểu hiện protein trên bề mặt. Trong đó mức độ 0 và 1+ được coi

là âm tính, mức độ 2+ và 3+ được coi là dương tính đối với sự biểu hiện protein.

Hình 2.3. Phương pháp hóa mô miễn dịch [140].

2.3.7. Phương pháp tạo trình tự DNA methyl bằng enzyme M.sssI

CpG methyltransferase (M.sssI) là một trong những công cụ cơ bản được sử

dụng trong nghiên cứu di truyền ngoại gen. M.sssI methyl hóa toàn bộ các

nucleotide Cytosine ở vị trí Carbon số 5 trong phức hệ CpG không bị methyl hóa

hoặc đã bị methyl hóa một phần. M.sssI (Thermo Scientific) được đặc chế cho thời

gian phản ứng nhanh mà không ảnh hưởng đến hiệu quả của phản ứng. Enzyme

hoàn thành sửa đổi tất cả các CpGs trong 15 phút ở 37 °C. Ngoài ra, enzyme đã

được chuẩn hóa để sử dụng với DNA hệ gen (genomic DNA) là cơ chất cho nguyên

cứu di truyền ngoại gen. M.SssI đóng gói kèm bộ đệm phản ứng 10X được tối ưu

hóa và 50X S-adenosylmethionine (SAM) là đồng yếu tố (co-factor). Sản phẩm

DNA sau khi xử lý với enzyme được sử dụng như mẫu đối chứng dương cho phản

ứng xử lý bisulfite với phức hệ CpG bị methyl hóa.

50

2.3.8. Xử lý kết quả bằng thống kê sinh học

Tỷ lệ đột biến gen, sự biểu hiện protein EGFR, tình trạng methyl hóa EGFR,

BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A cũng như sự tương quan giữa các hiện tượng

này với các đặc điểu bệnh nhân và giữa các hiện tượng này với nhau được thực hiện

dựa trên phầm mềm thống kê SPSS 16.0. Kiểm định Chi – Square được sử dụng để

phân tích sự tương quan giữa hai yếu tố bất kỳ trong nghiên cứu, trong khi đó kiểm

định Fisher’s được sử dụng cho những biến số có số lượng mẫu nhỏ hơn 5.

2.4. Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.4. Sơ đồ nghiên cứu

51

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ

3.1. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trên 139 bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của

phổi được chẩn đoán và điều trị tại Bệnh Viện K từ tháng 6 năm 2015 đến tháng 6

năm 2018. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân trong nghiên cứu

được trình bày trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Đặc điểm của bệnh nhân trong nghiên cứu

Đặc điểm Số lƣợng Tỷ lệ (%) Đặc điểm Số lƣợng Tỷ lệ (%)

Tổng số 139 100 Tổng số 139 100

Tuổi Típ mô bệnh học

≤57,4 67 48,2 Chùm nang 79 56,8

>57,4 72 51,8 Tuyến nhú 22 15,8

Giới tính Tuyến vi nhú 3 2,2

Nam 94 67,6 Tuyến đặc 34 24,5

Nữ 45 33,4 Típ hỗn hợp 1 0,7

Hút thuốc Tình trạng U

Có 79 56,8 Nguyên phát 104 74,8

Không 60 43,2 Di căn 35 25,2

Giai đoạn

I & II 12 8,6

III & IV 127 91,4

Độ tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân là 57,4 tuổi, trong đó có 94 (67,6%)

bệnh nhân là nam giới và 45 (32,4%) bệnh nhân là nữ giới. Tiền sử hút thuốc được

ghi nhận ở 79 bệnh nhân trong đó phần lớn là nam giới với 76/79 trường hợp,

ngược lại trong 45 bệnh nhân nữ chỉ có 3 bệnh nhân đã từng hút thuốc lá. Kết quả

giải phẫu bệnh phân típ mô bệnh học cho thấy những bệnh nhân trong nghiên cứu

nằm trong 3 phân típ chủ yếu là tuyến chùm nang (Acinar adenocarcinoma), tuyến

nhú (Papilary adenocarcinoma) và tuyến đặc (Solid adenocarcinoma) với tỷ lệ lần

lượt là 56,8; 15,8 và 24,5%. Trong 139 mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến, 104

mẫu thu được từ khối u nguyên phát và 35 mẫu từ khối u di căn. Hầu hết bệnh nhân

52

ung thư biểu mô tuyến của phổi trong nghiên cứu nằm trong giai đoạn muộn

(127/139 trường hợp ở giai đoạn III và IV) và chỉ có 12 trường hợp phát hiện ở giai

đoạn sớm (giai đoạn I và II).

3.2. Đột biến và biểu hiện gen EGFR

3.2.1 Đột biến gen EGFR và sự tương quan với các đặc điểm bệnh nhân

3.2.1.1. Đột biến gen EGFR

Kết quả phân tích đột biến EGFR của 139 bệnh nhân ung thư phổi biểu mô

tuyến trong nghiên cứu sử dụng bộ kit Therascreen EGFR RGO PCR (Qiagen, UK)

phát hiện đột biến trên 4 exon từ 18-21 được trình bày trong Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Các đột biến gen EGFR được phát hiện trong nghiên cứu

STT Đột biến Số lƣợng Tỷ lệ %

Tổng số 49 100

1 Del 21 42,9

2 L858R 16 32,7

3 T790M 2 4,1

4 L861Q 1 2,0

5 G719X 1 2,0

6 INS 1 2,0

7 S768I 1 2,0

8 G719X + S768I 2 4,1

9 G719X + L861Q 1 2,0

10 Del + L858R 1 2,0

11 Del + T790M 1 2,0

12 L858R + G719X 1 2,0

Hình 3.1 minh hoạ kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật RT-PCR

Scorpion Arms, trong đó (A), (B) là đối chứng dương và đối chứng âm cho các đột

biến được cung cấp bởi nhà sản xuất, (C), (D) là hình minh họa cho các đột biến lần

lượt là: Mất đoạn ở exon 19 và thay thế L858R (thay thế Leucine bằng Arginine ở

53

vị trí axit amin thứ 858) tại exon 21. Ngoài đối chứng dương và âm được cung cấp

bởi nhà sản xuất, trong mỗi một phản ứng RT-PCR đều sử dụng một nội chứng là

một đoạn trình tự nằm trên exon 2 của gen EGFR. Vì vậy, kết quả RT-PCR chỉ

được chấp nhận khi có xuất hiện tín hiệu huỳnh quang ở các ống đối chứng dương,

nội chứng và không có tín hiệu ở đối chứng âm.

Hình 3.1. Kết quả phát hiện đột biến EGFR.

(A): Đối chứng dương, (B):Đối chứng âm, (C): Đột biến mất đoạn exon 19,

(D): Đột biến thay thế L858R exon 21.

Đột biến EGFR được phát hiện ở 35,3% (49/139) bệnh nhân, với 12 dạng đột

biến khác nhau. Đột biến mất đoạn ở exon 19 và đột biến L858R chiếm 85,5% với

tỷ lệ lần lượt là 42,9% và 32,7% (Bảng 3.2). Đột biến kháng TKIs thế hệ thứ nhất

và thứ hai T790M (thay thế Threonine bằng Methionine tại vị trí axit amin 790)

trên exon 20 xuất hiện ở 3/139 (4,1%) bệnh nhân trong nghiên cứu (Hình 3.1). Bên

cạnh đó, 6 trường hợp phát hiện 2 đột biến xảy ra đồng thời. Đột biến thay thế

G719X (bao gồm: G719A thay thế Glycine bằng Alanine; G719C thay thế Glycine

bằng Cysteine và G719S thay thế Glycine bằng Serine tại axit amin 719) thường

xảy ra đồng thời với những đột biến khác (4/5 trường hợp) như S768I (thay thế

Serine bằng Isoleucine tại axit amin 768), L861Q (thay thế Leucine bằng Glutamine

tại axit amin 861), L858R và mất đoạn ở exon 19.

54

3.2.1.2. Tương quan giữa đột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân

Sự tương quan của đột biến EGFR với các yếu liên quan bao gồm: Tuổi, giới

tính, tình trạng hút thuốc, phân típ mô bệnh học, tình trạng khối u và giai đoạn bệnh

được trình bày trong Bảng 3.3.

Bảng 3.3. Tương quan giữa đột biến gen EGFR với các đặc điểm bệnh nhân

ĐỘT BIẾN GEN EGFR

Số lƣợng

(%)

Đột biến

(%)

Kiểu dại

(%)

Giá trị

p

ĐẶC ĐIỂM 139 (100) 49 (35,3) 90 (64,75)

Tuổi (57,4 ±10,67)

≤57,4 67 (48,2) 30 (44,8) 37 (55,2) 0,023

>57,4 72 (51,8) 19 (26,4) 53 (73,6)

Giới tính

Nam 94 (67,6) 23 (24,5) 71 (75,5)

Nữ 45 (33,4) 26 (57,8) 19 (42,2) <0,001

Tình trạng hút thuốc

Hút thuốc 79 (56,8) 20 (25,3) 59 (74,7)

Không hút thuốc 60 (43,2) 29 (48,3) 31 (51,7) 0,005

Phân típ mô bệnh học

Tuyến chùm nang 79 (56,8) 32 (40,5) 47 (59,5) 0,065

Tuyến nhú 22 (15,8) 7 (31,8) 15 (68,2) 0,714

Tuyến vi nhú 3 (2,2) 2 (66,7) 1 (33,3) 0,190

Tuyến đặc 34 (24,5) 7 (20,6) 27 (79,4) 0,040

Típ hỗn hợp 1 (0,7) 1 (100) 0 (0,0)

Tình trạng U

Nguyên phát 104 (74,8) 36 (34,6) 68 (63,4) 0,787

Di căn 35 (25,2) 13 (37,1) 22 (62,9)

Giai đoạn

I & II 12 (8,6) 6 (50,0) 6 (50,0) 0,263

III & IV 127 (91,4) 43 (33,9) 84 (67,1)

55

Độ tuổi trung bình trong nghiên cứu là 57,4, trong đó 67 trường hợp dưới

57,4 tuổi và 72 trường hợp trên 57,4 tuổi. Đột biến EGFR ở nhóm bệnh nhân thấp

hơn tuổi trung bình là 44,8% (30/67) và ở nhóm cao hơn tuổi trung bình là 26,4%

(19/72). Tần suất đột biến EGFR giữa hai nhóm tuổi có khác biệt có ý nghĩa, với

p<0,05 (Bảng 3.3). Kết quả cho thấy đột biến EGFR có xu hướng xảy ra ở những

bệnh nhân trẻ tuổi mắc ung thư phổi dạng biểu mô tuyến.

Kết quả phân tích số liệu ở Bảng 3.3 cho thấy, tỷ lệ đột biến EGFR ở bệnh

nhân nữ giới là 57,8% (26/45). Trong khi đó ở nhóm bệnh nhân là nam giới, tỷ lệ

này là 24,5% (23/94). Như vậy, đột biến EGFR xảy ra phổ biến hơn ở bệnh nhân nữ

giới so với nam giới với p<0,05.

Bảng 3.4. Tương quan giữa đột biến EGFR và tình trạng hút thuốc ở bệnh nhân

nam giới

ĐỘT BIẾN EGFR

HÚT THUỐC

Đột biến

(%)

Kiểu dại

(%)

Tổng số

Giá trị

p

Không 9

(45,0)

11

(55,0) 20

0,016

Có 14

(18,9)

60

(81,1) 74

Trong 139 bệnh nhân của nghiên cứu, 79 trường hợp có tiền sử hút thuốc lá

và 60 trường hợp chưa từng sử dụng thuốc lá. Tiền sử hút thuốc lá của bệnh nhân và

hiện tượng đột biến gen EGFR có mối liên quan ngược với p<0,05. Cụ thể, ở bệnh

nhân có hoặc đã từng hút thuốc, tỷ lệ đột biến EGFR là 23,3% (20/79), trong khi tỷ

lệ này ở bệnh nhân không sử dụng thuốc lá là 48,3% (29/60) (Bảng 3.3). Do số

lượng bệnh nhân có tiền sử hút thuốc ở nữ giới có 3 trường hợp nên nghiên cứu chỉ

phân tích sự tương quan giữa tỷ lệ đột biến EGFR và tiền sử hút thuốc ở nhóm bệnh

nhân nam giới. Tỷ lệ hút thuốc và không hút thuốc ở nam giới lần lượt là 78,7%

(74/94) và 21,3%. Ngược lại, tỷ lệ đột biến EGFR ở hai nhóm này là 18,9% (14/60)

và 45,0% (9/20) (Bảng 3.4). Phân tích mối tương quan giữa tiền sử hút thuốc lá và

đột biến gen EGFR ở bệnh nhân nam giới cho thấy đột biến gen xảy ra ở những

bệnh nhân chưa từng hút thuốc cao hơn những bệnh nhân hút thuốc với p<0,05.

56

Ba phân típ mô bệnh học chính trong nghiên cứu là tuyến chùm nang; tuyến

nhú và típ tuyến đặc, tỷ lệ đột biến tính riêng cho từng phân típ lần lượt là 40,5%

(32/79), 31,8% (7/22) và 20,6% (7/34). Phân tích mối tương quan giữa đột biến

EGFR với các típ mô bệnh học, kết quả cho thấy ở những bệnh nhân ung thư biểu

mô tuyến dạng típ đặc có tỷ lệ đột biến EGFR thấp hơn những típ mô bệnh học khác

với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (Bảng 3.3).

Tần suất đột biến EGFR ở những khối u nguyên phát và khối u di căn lần

lượt là 34,6% (36/104) và 37,1% (13/35). Đột biến ở những khối u di căn có xu

hướng cao hơn ở khối u nguyên phát, tuy nhiên sự sai khác là ngẫu nhiên, không có

ý nghĩa với p>0,05 (Bảng 3.3). Đồng thời, kết quả phân tích cũng không cho thấy

có sự khác biệt trong tỷ lệ đột biến gen EGFR giữa nhóm bệnh nhân giai đoạn muộn

và giai đoạn sớm (33,9% so với 50,0%), với p>0,05 (Bảng 3.3).

3.2.2. Biểu hiện protein EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân

3.2.2.1. Biểu hiện protein EGFR

Hình 3.2. Kết quả hóa mô miễn dịch protein EGFR.

A: Kết quả nhuộm H&E, B: Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch, (0): Không biểu

hiện, (1+): Biểu hiện yếu, (2+): Biểu hiện trung bình, (3+): Biểu hiện mạnh.

Sự biểu hiện protetin EGFR được đánh giá bằng phương pháp hóa mô miễn

dịch (HMMD). Cường độ biểu hiện của EGFR trên bề mặt tế bào được chia thành 4

mức độ từ 0 đến 3+, trong đó: Không có sự biểu hiện (0), biểu hiện yếu (1+), biểu

hiện trung bình (2+), biểu hiện mạnh (3+). Kết quả phân tích trên 139 mẫu bệnh

phẩm cho thấy, 32 mẫu bệnh phẩm không biểu hiện protein EGFR, mức độ biểu

57

hiện tăng dần từ 1+ đến 3+ được xác định trên các mẫu bệnh phẩm lần lượt là 25; 6

và 20 trường hợp. Dựa trên kết quả phân tích mức độ biểu hiện của protein trong xét

nghiệm hóa mô miễn dịch, những trường hợp cho kết quả HMMD 0 và 1+ được cho

âm tính, những trường hợp có kết quả HMMD là 2+ và 3+ được cho là dương tính

với protein EGFR. Như vậy, nghiên cứu thu được 57 (41,0%) mẫu bệnh phẩm âm

tính và 82 (59,0%) mẫu dương tính với sự biểu hiện protein EGFR (Bảng 3.4 và

phụ lục 7).

Bảng 3.5. Mức biểu hiện protein EGFR

BIỂU HIỆN PROTEIN EGFR

Cƣờng độ 0 1+ 2+ 3+ Tổng số

Số lƣợng

(%)

32

(23,0)

25

(18,0)

62

(44,6)

20

(13,4)

139

(100)

Cƣờng độ

Âm tính

(%)

Dương tính

(%)

Số lƣợng

(%)

57

(41,0)

82

(59,0)

139

(100)

3.2.2.2. Tương quan giữa biểu hiện protein EGFR với đặc điểm bệnh nhân

Sự tương quan giữa biểu hiện protein EGFR với các yếu liên quan bao gồm:

Tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc, phân típ mô bệnh học, trình trạng khối u và giai

đoạn bệnh được trình bày trong Bảng 3.6.

Phân tích mối liên quan giữa biểu hiện EGFR với nhóm tuổi, kết quả cho

thấy ở những bệnh nhân trên độ tuổi trung bình (57,4) có sự biểu hiện protein

EGFR cao hơn so với nhóm bệnh nhân độ tuổi thấp (61,1% so với 56,7%). Tuy

nhiên, sự khác biệt là ngẫu nhiên (p>0,05). Ở nhóm protein EGFR dương tính cho

thấy phần lớn mẫu bệnh phẩm biểu hiện ở mức độ trung bình ở cả hai nhóm tuổi với

tỷ lệ lần lượt là 79,0% (30/38) và 72,7% (23/44) (Bảng 3.6).

Nghiên cứu cũng chỉ ra không có sự khác biệt về sự biểu hiện EGFR giữa

nhóm bệnh nhân là nam giới và nữ giới. Bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi

là nam giới có tỷ lệ biểu hiện protein EGFR là 62,8% và ở nữ giới là 51,1%. Tuy

nhiên, tần suất biểu hiện quá mức protein EGFR (3+) ở bệnh nhân nam giới và nữ

giới có sự khác biệt với tỷ lệ lần lượt là 30,5% và 8,0%, sự sai khác có ý nghĩa

58

thống kê với p<0,05. Như vậy, ở nam giới có mức độ biểu hiện EGFR quá mức cao

hơn ở bệnh nhân nữ giới (Bảng 3.6).

Bảng 3.6. Tương quan giữa mức độ biểu hiện EGFR với đặc điểm bệnh nhân

BIỂU HIỆN PROTEIN EGFR

Số lƣợng 0 + 1+ 2+ 3+ Âm tính Dƣơng tính Giá trị p

ĐẶC ĐIỂM 139 (100) 32 25 62 20 57 (41,0) 82 (59,0)

Tuổi (57,4 ±10,67)

≤57,4 67 (48,2) 16 13 30 8 29 (43,3) 38 (56,7) 0,599

>57,4 72 (51,8) 16 12 32 12 28 (38,9) 44 (61,1)

Giới tính

Nam 94 (67,6) 20 15 41 18 35 (37,2) 59 (62,8) 0,191

Nữ 45 (33,4) 12 10 21 2 22 (48,9) 23 (51,1)


Hút thuốc 79 (56,8) 17 14 35 13 31 (39,2) 48 (60,8) 0,627

Không hút thuốc 60 (43,2) 15 11 27 7 26 (43,3) 34 (56,7)


Tuyến chùm nang 79 (56,8) 13 14 38 14 27 (34,2) 52 (65,8) 0,060

Tuyến nhú 22 (15,8) 4 5 11 2 9 (40,9) 13 (51,1) 0,992

Tuyến vi nhú 3 (2,2) 2 0 1 0 2 (66,7) 1 (33,3) 0,361

Tuyến đặc 34 (24,5) 12 6 12 4 18 (52,9) 16 (47,1) 0,104

Típ hỗn hợp 1 (0,7) 1 0 0 0 1 (100) 0 (0,0) 0,229

Tình trạng U

Nguyên phát 104 (74,8) 23 16 50 14 39 (37,5) 64 (72,50) 0,203

Di căn 35 (25,2) 9 9 12 6 18 (50,0) 18 (50,0)

Giai đoạn

I & II 12 (8,6) 2 2 5 3 4 (33,3) 8 (66,7) 0,572

III & IV 127 (91,4) 30 23 57 17 53 (33,8) 74 (66,2)

Nghiên cứu không cho thấy có sự ảnh hưởng của thói quen hút thuốc, sự

khác nhau trong các phân típ mô bệnh học, cũng như giai đoạn bệnh đến sự biểu

hiện của protein EGFR trên bề mặt tế bào (Bảng 3.6). Tỷ lệ biểu hiện và biểu hiện

quá mức protein EGFR ở khối u nguyên phát là 72,5% và 21,9% và ở khối u di căn

59

là 50,0% và 33,3%. Như vậy, khối u nguyên phát có xu hướng biểu hiện EGFR với

cường độ trung bình, ngược lại ở những khối u di căn có xu hướng biểu hiện quá

mức protein này. Tuy nhiên, với sự khác biệt về mức độ biểu hiện quá mức EGFR

không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Bảng 3.6).

3.3. Tình trạng methyl hóa một số gen liên quan đến ung thƣ biểu mô tuyến

của phổi

3.3.1. Methyl hóa gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân

3.3.1.1. Methyl hóa gen EGFR

Trạng thái methyl hóa vùng promoter gen EGFR được xác định thông qua kỹ

thuật PCR đặc hiệu methyl hóa (MS-PCR). Sau đó sản phẩm PCR được kiểm tra

bằng điện di trên gel polyacrilamide 10% (Hình 3.3).

Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen EGFR.

B: mẫu máu người khỏe mạnh, B+: Mẫu máu được xử lý với enzyme M.sssI,

N1-N2: Mẫu phổi lành tính, S1-S12: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến

của phổi, L: Thang chuẩn DNA 100bp (Fermentas), M: Sản phẩm EGFR methyl

hóa (158 bp), U: Sản phẩm EGFR không methyl hóa (150 bp), NTC: Đối chứng âm.

Kết quả điện di cho thấy sản phẩm EGFR methyl hóa và EGFR không

methyl hóa có kích thước là 150 bp và 158 bp. Hiện tượng methyl EGFR có thể xảy

ra ba trường hợp: (1) Mẫu không methyl khi đó MS-PCR chỉ khuếch đại trình tự

EGFR không methyl hóa; (2) Mẫu methyl hoàn toàn khi MS-PCR chỉ khuếch đại

trình tự EGFR methyl hóa và (3) Mẫu methyl hóa không hoàn toàn khi MS – PCR

khuếch đại đồng thời trình tự EGFR methyl hóa và trình tự EGFR không methyl

hóa. Trong nghiên cứu, mẫu được sử dụng là mẫu bệnh phẩm mổ hoặc sinh thiết vì

60

vậy ngoài DNA được tách chiết từ tế bào ung thư sẽ có cả DNA từ những tế bào

lành không mang gen EGFR methyl hóa. Dẫn đến kết quả điện di sản phẩm MS-

PCR luôn xuất hiện băng EGFR không methyl hóa.

Bảng 3.7. Tương quan giữa methyl EGFR với đặc điểm bệnh nhân

METHY HÓA EGFR

Số lƣợng

(%)

Methyl

(%)

Không Methyl

(%)

Giá trị

p

ĐẶC ĐIỂM 139 (100) 33 (23,7) 106 (76,3)

Tuổi (57,4 ±10,67)

≤57,4 67 (48,2) 15 (22,4) 52 (77,6) 0,718

>57,4 72 (51,8) 18 (25,0) 54 (75,0)

Giới tính

Nam 94 (67,6) 22 (23,4) 72 (76,6) 0,893

Nữ 45 (33,4) 11 (23,9) 34 (76,1)


Hút thuốc 79 (56,8) 20 (25,3) 59 (74,7) 0,616

Không hút thuốc 60 (43,2) 13 (21,7) 47 (78,2)


Tuyến chùm nang 79 (56,8) 16 (20,3) 63 (79,7) 0,267

Tuyến nhú 22 (15,8) 5 (22,7) 17 (77,3) 0,903

Tuyến vi nhú 3 (2,2) 2 (66,7) 1 (33,3) 0,077

Tuyến đặc 34 (24,5) 10 (29,4) 24 (70,6) 0,371

Típ hỗn hợp 1 (0,7) 0 (0,0) 1 (100,0) 0,575

Tình trạng U

Nguyên phát 104 (74,8) 24 (23,1) 80 (76,9) 0,751

Di căn 35 (25,2) 9 (25,7) 26 (74,3)

Giai đoạn

I & II 12 (8,6) 1 (8,3) 11 (91,7) 0,189

III & IV 127 (91,4) 32 (25,2) 95 (74,8)

Phân tích 139 mẫu bệnh phẩm kết quả cho thấy 23,7% (33/139) trường hợp

có vùng promoter gen EGFR bị methyl hóa và 76,5% (106/139) không có sự

61

methyl. Để khẳng định kết quả của quá trình xử lý bisulfite và tính đặc hiệu của

phản ứng MS-PCR khuếch đại trình tự promoter EGFR, sản phẩm MS-PCR được

tiến hành giải trình tự trực tiếp với cặp mồi tương ứng cho trình tự EGFR bị methyl

và không methyl hóa. Kết quả giải trình tự được trình bày trong Phụ lục 5.

3.3.1.2. Tương quan giữa methyl hóa gen EGFR với các đặc điểm bệnh nhân

Sự tương quan giữa methyl hóa gen EGFR với các yếu tố liên quan bao gồm:

Tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc, phân típ mô bệnh học, trình trạng khối u và giai

đoạn bệnh được trình bày trong Bảng 3.7. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt

về tình trạng methyl hóa vùng promoter gen EGFR ở các nhóm bệnh nhân ung thư

biểu mô tuyển của phổi khác nhau về những đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng

trong nghiên cứu với p>0,05 (Bảng 3.7).

3.3.2. Methyl hóa gen BRCA1 và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân

3.3.2.1. Methyl hóa BRCA1

Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen BRCA1.

B: mẫu máu người khỏe mạnh, B+: Mẫu máu được xử lý với enzyme M.sssI, N1 –

N2: Mẫu phổi lành tính, S1 – S12: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến của

phổi, L: Thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas), M: Sản phẩm BRCA1 methyl (70

bp), U: Sản phẩm BRCA1 không methyl (77 bp), NTC: Đối chứng âm.

Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1 được đánh giá dựa trên kết quả điện

di polyacrimamide 10% sản phẩm MS-PCR với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại trình

tự BRCA1 bị methyl và BRCA1 không bị methyl. Kích thước sản phẩm MS-PCR

lần lượt là 70 bp (BRCA1 bị methyl ) và 77 bp (BRCA1 không bị methyl) (Hình 3.4)

62

Kết quả phân tích tình trạng methyl hóa gen BRCA1 trên 139 bệnh nhân cho thấy 41

(29,5 %) mẫu bệnh phẩm mang gen BRCA1 bị methyl hóa và 98 (70,5%) mẫu bệnh

phẩm không xảy ra hiện tượng methyl hóa BRCA1.

3.3.2.2. Tương quan giữa methyl hóa BRCA1 với đặc điểm bệnh nhân

Bảng 3.8. Tương quan giữa methyl hóa BRCA1 với đặc điểm bệnh nhân

METHYL HÓA BRCA1

Số lƣợng

(%)

Methyl

(%)

Không meyhly

(%)

Giá trị

p

ĐẶC ĐIỂM 139 (100) 41 (29,5) 98 (70,5)

Tuổi (57,4 ±10,67)

≤57,4 67 (48,2) 18 (26,9) 49 (73,1) 0,512

>57,4 72 (51,8) 23 (31,9) 49 (68,1)

Giới tính

Nam 94 (67,6) 31 (33,0) 63 (67,0) 0,193

Nữ 45 (33,4) 10 (22,2) 35 (77,8)


Hút thuốc 79 (56,8) 26 (32,9) 53 (67,1) 0,311

Không hút thuốc 60 (43,2) 15 (25,0) 45 (75,0)


Tuyến chùm nang 79 (56,8) 21 (26,6) 58 (73,4) 0,387

Tuyến nhú 22 (15,8) 7 (31,8) 15 (68,2) 0,795

Tuyến vi nhú 3 (2,2) 1 (33,3) 2 (66,7) 0,883

Tuyến đặc 34 (24,5) 11 (3,4) 23 (67,6) 0,674

Típ hỗn hợp 1 (0,7) 1 (100,0) 0 (0,0) 0,121

Tình trạng U

Nguyên phát 104 (74,8) 30 (28,9) 74 (71,1) 0,772

Di căn 35 (25,2) 11 (31,4) 24 (68,6)

Giai đoạn

I & II 12 (8,6) 3 (25,0) 9 (75,0) 0,721

III & IV 127 (91,4) 38 (29,9) 89 (70,1)

63

Sự tương quan giữa tình trạng methyl BRCA1 với các yếu tố liên quan được

trình bày trong Bảng 3.8. Kết quả cho thấy methyl hóa vùng promoter gen BRCA1

không có sự khác biệt giữa với các yếu tố: Độ tuổi, giới tình, tình trạng hút thuốc,

phân típ mô bệnh học, đặc điểm khối u và giai đoạn bệnh vói p>0,05.

3.3.3. Methyl hóa gen MGMT và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân

3.3.3.1. Methyl hóa MGMT

Kết quả xác định tình trạng methyl hóa MGMT được đánh giá thông qua

phương pháp điên di sản phẩm MS – PCR với cặp mồi đặc hiệu trên gel

polyacrilamide 10% được minh họa trong Hình 3.5. Sản phẩm MS – PCR đặc hiệu

cho MGMT methyl hóa có kích thước 81 bp và MGMT không methyl hóa có kích

thước 93 bp. Tần suất methyl hóa vùng promoter gen MGMT trên 139 mẫu bệnh

phẩm trong nghiên cứu là 33,1% (46/139) (Bảng 3.9).

Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen MGMT.

B: Mẫu máu người khỏe mạnh, B+: Mẫu máu được xử lý với enzyme M.sssI, N1 –


phổi, L: Thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas), M: Sản phẩm MGMT methyl (81

bp), U: Sản phẩm MGMT không methyl (93 bp), NTC: Đối chứng âm.

3.3.2.2. Tương quan giữa methyl hóa gen MGMT với đặc điểm bệnh nhân

Sự tương quan giữa trình trạng methyl MGMT với các yếu tố liên quan được

trình bày trong Bảng 3.9. Kết quả cho thấy không có sự ảnh hưởng của các đặc

điểm như: Tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc, đặc điểm mô bệnh học và giai đoạn

bệnh đến sự methyl MGMT (p>0,05) (Bảng 3.9). Sự khác biệt duy nhất giữa tình

trạng methyl hóa MGMT với các đặc điểm của bệnh nhân trong nghiên cứu được

tìm thấy đó là đặc điểm khối u nghiên cứu. Trong 104 mẫu bệnh phẩm thu được từ

64

những khối u nguyên phát chỉ có 28,2% (29/104) trường hợp có sự methyl MGMT.

Ngược lại, tỷ lệ methyl gen MGMT ở nhóm mẫu thu thập từ 35 khối u di căn là

47,2% (17/35). Như vậy, tại những khối u di căn của bệnh nhân ung thư biểu mô

tuyến của phổi, hiện tượng methyl hóa MGMT xảy ra phổ biến hơn so với tại những

khối u nguyên phát (p<0,05) (Bảng 3.9).

Bảng 3.9. Tương quan giữa methyl hóa MGMT với đặc điểm bệnh nhân

METHYL HÓA MGMT

Số lƣợng

(%)

Methyl

(%)

Không methyl

(%)

Giá trị

p

ĐẶC ĐIỂM 139 (100) 46 (33,1) 93 (66,9)

Tuổi (57,4 ±10,67)

≤57,4 67 (48,2) 17 (25,4) 50 (74,6) 0,062

>57,4 72 (51,8) 29 (40,3) 43 (59,7)

Giới tính

Nam 94 (67,6) 32 (34,0) 62 (66,0) 0,731

Nữ 45 (33,4) 14 (31,1) 31 (68,9)


Hút thuốc 79 (56,8) 29 (36,7) 50 (63,3) 0,299

Không hút thuốc 60 (43,2) 17 (28,3) 43 (71,7)


Tuyến chùm nang 79 (56,8) 26 (32,9) 53 (67,1) 0,958

Tuyến nhú 22 (15,8) 6 (27,3) 16 (72,7) 0,527

Tuyến vi nhú 3 (2,2) 2 (66,7) 1 (33,3) 0,212

Tuyến đặc 34 (24,5) 12 (35,3) 22 (64,7) 0,754

Típ hỗn hợp 1 (0,7) 0 (0,0) 1 (100,0) 0,480

Tình trạng U

Nguyên phát 104 (74,8) 29 (28,2) 75 (72,8) 0,024

Di căn 35 (25,2) 17 (47,2) 18 (52,8)

Giai đoạn

I & II 12 (8,6) 3 (25,0) 9 (75,0) 0,533

III & IV 127 (91,4) 43 (33,9) 84 (66,1)

65

3.3.4. Methyl hóa gen MLH1 và sự tương quan đặc điểm bệnh nhân

3.3.4.1. Methyl hóa MLH1

Sự methyl hóa vùng promoter gen MLH1 được đánh dựa trên kết quả điện di

polyacrimamide 10% sản phẩm MS-PCR với cặp mồi đặc hiệu cho DNA bị methyl

và không bị methyl. Kích thước sản phẩm MS-PCR khuếch đại trình tự MLH1

methyl hóa là 301 bp và trình tự MLH1 không methyl hóa là 303 bp (Hình 3.6) Kết

quả phân tích tình trạng methyl hóa MLH1 trên 139 bệnh nhân cho thấy có 28

(20,1%) mẫu bệnh phẩm mang gen MLH1 bị methyl và 111 (79,9%) mẫu bệnh

phẩm không xảy ra hiện tượng này.

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa MLH1.

B: Mẫu máu người khỏe mạnh, B+: Mẫu máu được xử lý với enzyme M.sssI, N1–


phổi, L: Thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas), M: Sản phẩm MLH1 methyl (303

bp), U: Sản phẩm MLH1 không methyl (301 bp), NTC: Đối chứng âm.

3.3.4.2. Tương quan giữa methyl hóa gen MLH1 với đặc điểm bệnh nhân

Sự tương quan giữa tình trạng methyl hóa vùng promoter gen MLH1 với các

đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu được trình bày trong Bảng 3.10. Tuy nhiên, không

cho thấy sự khác biệt về tình trạng methyl MLH1 giữa các nhóm bệnh nhân khác

nhau về những đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng với giá trị p>00,5 (Bảng 3.10).

66

Bảng 3.10. Tương quan giữa methyl hóa MHL1 với đặc điểm bệnh nhân

METHYL HÓA MLH1

Số lƣợng

(%)

Methyl

(%)

Không methyl

(%)

Giá trị

p

ĐẶC ĐIỂM 139 (100) 28 (20,1) 111 (79,9)

Tuổi (57,4 ±10,67)

≤57,4 67 (48,2) 12 (17,9) 55 (82,1) 0,527

>57,4 72 (51,8) 16 (22,2) 56 (77,8)

Giới tính

Nam 94 (67,6) 18 (19,2) 76 (80,8) 0,673

Nữ 45 (33,4) 10 (22,2) 35 (77,8)


Hút thuốc 79 (56,8) 16 (20,3) 63 (79,7) 0,971

Không hút thuốc 60 (43,2) 12 (20,0) 48 (80,0)


Tuyến chùm nang 79 (56,8) 15 (19,0) 64 (81,0) 0,697

Tuyến nhú 22 (15,8) 5 (22,7) 17 (77,3) 0,742

Tuyến vi nhú 3 (2,2) 1 (33,3) 2 (66,7) 0,476

Tuyến đặc 34 (24,5) 7 (20,6) 27 (79,4) 0,941

Típ hỗn hợp 1 (0,7) 0 (0,0) 1 (100,0) 0,614

Tình trạng U

Nguyên phát 104 (74,8) 19 (18,3) 85 (81,7) 0,341

Di căn 35 (25,2) 9 (25,7) 26 (74,3)

Giai đoạn

I & II 12 (8,6) 2 (16,7) 10 (83,3) 0,753

III & IV 127 (91,4) 26 (20,5) 101 (79,5)

3.3.5. Methyl hóa gen RASSF1A và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân

3.3.5.1. Methyl hóa gen RASSF1A

Tỷ lệ bệnh nhân mang gen RASSF1A có vùng promoter bị methyl hóa trong

nghiên cứu là 29,5% (41/139). Sự methyl hóa RASSF1A được đánh giá thông qua

kết quả điện di trên gel Polyacrimadide 10%. Phản ứng MS-PCR sử dụng cặp mồi

67

đặc hiệu khuếch đại trình tự RASSF1A methyl hóa có kích thước 175 bp và trình tự

RASSF1A không methyl hóa có kích thước 137 bp (Hình 3.7).

Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen RASSF1A.

B: Mẫu máu người khỏe mạnh, B+: Mẫu máu được xử lý với enzyme M.sssI, N1-

N2: Mẫu phổi lành tính, S1-S12: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến của

phổi, L: thang chuẩn DNA 100bp (Fermentas), M: Sản phẩm RASSSF1A methyl

(175 bp), U: Sản phẩm RASSF1A không methyl (137 bp), NTC: Đối chứng âm.

3.3.4.2. Tương quan giữa methyl hóa RASSF1A với các đặc điểm bệnh nhân

Sự tương quan giữa trình trạng methyl hóa RASSF1A với các yếu tố liên

quan được trình bày trong Bảng 3.11. Kết quả cho thấy không có sự ảnh hưởng của

các đặc điểm như: Tuổi, giới tính, đặc điểm mô bệnh học và giai đoạn bệnh đến sự

methyl RASSF1A. Ngược lại, tình trạng methyl RASSF1A ở bệnh nhân hút thuốc và

những khối u di căn cao hơn có ý nghĩa thống kê so với những bệnh nhân không hút

thuốc và tại những khối u nguyên phát. Ở nhóm bệnh nhân khác nhau về tiền sử hút

thuốc là, tỷ lệ methyl hóa RASSF1A ở nhóm hút thuốc lá lên đến 36,7%, trong khi ở

nhóm không hút thuốc chỉ 20,0% trường hợp được phát hiện có gen RASSF1A

methyl (p<0,05). (Bảng 3.11). Bên cạnh đó, nghiên cứu chỉ ra có sự khác nhau về

tình trạng methyl hóa RASSF1A và tình trạng khối u của bệnh nhân. Phân tích trên

hai nhóm u nguyên phát và di căn cho thấy, tỷ lệ methyl hóa RASSF1A tại khối u di

căn cao hơn so với khối u nguyên phát (42,9% so với 25,0% với p<0,05). Như vậy,

sự methyl RASSF1A sẽ tăng lên cùng với mức độ di căn của khối u trong ung thư

biểu mô tuyến của phổi (Bảng 3.11)

68

Bảng 3.11. Tương quan giữa methyl hóa RASSF1A với đặc điểm bệnh nhân

METHYL HÓA RASSF1A

Số lƣợng

(%)

Methyl

(%)

Không methyl

(%)

Giá trị

p

ĐẶC ĐIỂM 139 (100) 41 (29,5) 98 (70,5)

Tuổi (57,4 ±10,67)

≤57,4 67 (48,2) 20 (29,9) 47 (70,1) 0,93

>57,4 72 (51,8) 21 (29,2) 51 (70,8)

Giới tính

Nam 94 (67,6) 29 (30,9) 65 (69,1) 0,613

Nữ 45 (33,4) 12 (26,7) 33 (73,3)


Hút thuốc 79 (56,8) 29 (36,7) 50 (63,3) 0,032

Không hút thuốc 60 (43,2) 12 (20,0) 48 (80,0)


Tuyến chùm nang 79 (56,8) 22 (27,9) 57 (72,1) 0,625

Tuyến nhú 22 (15,8) 7 (31,8) 15 (68,2) 0,795

Tuyến vi nhú 3 (2,2) 1 (33,3) 2 (66,7) 0,883

Tuyến đặc 34 (24,5) 11 (32,4) 23 (67,6) 0,674

Típ hỗn hợp 1 (0,7) 0 (0,0) 1 (100,0) 0,521

Tình trạng U

Nguyên phát 104 (74,8) 26 (25,0) 78 (75,0) 0,045

Di căn 35 (25,2) 15 (42,9) 20 (57,1)

Giai đoạn

I & II 12 (8,6) 4 (33,3) 8 (66,7) 0,760

III & IV 127 (91,4) 37 (29,1) 90 (70,9)

3.4. Tƣơng quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa

một số gen liên quan đến ung thƣ tuyến của phổi

3.4.1. Tương quan giữa đột biến, biểu hiện và methyl hóa gen EGFR

Sự tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa vùng promoter và biểu hiện

protein EGFR trên bề mặt tế bào ung thư biểu mô tuyến của phổi được trình bày

trong Bảng 3.12.

69

Bảng 3.12. Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và biểu hiện protein EGFR

Methyl EGFR

Đột biến EGFR

M U p + - p

33 106

49 90

Biểu hiện EGFR

- 21 36 0,002 20 37 0,973

+ 12 70

29 53

Đột biến EGFR

+ 15 34 0,160

- 18 72

Kết quả phân tích cho thấy không có mối tương quan giữa đột biến gen với

sự methyl vùng promoter và sự biểu hiện của protein EGFR. Ở nhóm bệnh nhân

mang đột biến EGFR, 30,6% (15/49) trường hợp xảy ra hiện tượng methyl hóa

EGFR và 59,2% (29/49) có biểu hiện protein EGFR. Trong khi đó ở nhóm không

mang đột biến, 20,0% (18/90) có gen EGFR bị methyl hóa và 58,9% (53/90) biểu

hiện protein bề mặt. Tuy nhiên, sự khác biệt trên không có ý nghĩ thống kê (p>0,05)

(Bảng 3.12). Ngược lại, nghiên cứu chỉ ra có sự tương quan chặt chẽ giữa sự methyl

hóa vùng promoter EGFR và biểu hiện của protein EGFR. Ở nhóm bệnh nhân mang

gen EGFR bị methyl hóa, chỉ có 36,4% (12/33) trường hợp có sự biểu hiện của

protein, trong khi tỷ lệ biểu hiện protein ở nhóm không methyl là 66,0% (p<0,05).

Như vậy, methyl hóa vùng promoter gen EGFR có vai trò ức chế sự hình thành

protein của gen này trong tế bào ung thư biểu mô tuyến của phổi (Bảng 3.12).

Mối tương quan giữa ba đặc điểm phân tử của gen EGFR bao gồm đột biến,

biểu hiện và methyl hóa được tiến hành phân tích cụ thể hơn ở những trường hợp

bệnh nhân có gen EGFR methyl hóa. Trong 33 trường hợp methyl EGFR có 18

(54,5%) bệnh nhân không có đột biến gen và 15 (45,5%) bệnh nhân có mang gen

EGFR đột biến. Kết quả phân tích cũng cho thấy 21 (63,6 %) trường hợp bệnh nhân

có gen EGFR âm tính với kết quả IHC phát hiện sự có mặt của EGFR trên bề mặt tế

bào. Trong đó 12/21 mẫu hoàn toàn không có sự biểu hiện protein và 9/21mẫu có sự

biểu hiện EGFR ở mức độ thấp. Ngược lại, trong số 33 trường hợp phân tích, có 12

mẫu chứa gen EGFR methyl nhưng lại có sự biểu hiện protein do gen này mã hóa,

trong đó có 2 cho kết quả IHC là 3+ (Bảng 3.13).

70

Bảng 3.13. Tỷ lệ đột biến và biểu hiện protein ở bệnh nhân methyl hóa EGFR

ĐỘT BIẾN EGFR BIỂU HIỆN PROTEIN EGFR

Kiểu dại

(%)

Đột biến

(%)

(0)

(%)

(1+)

(%)

(2+)

(%)

3(+)

(%)

18

(54,5)

15

(45,5)

12

(36,3)

9

(27,3)

10

(30,3)

2

(6,1)

Âm tính Dương tính

21 (63,6) 12 (36,4)

Bảng 3.14. Tương quan giữ đột biến và methyl với biểu hiện EGFR

Biến số Số lƣợng

Biểu hiện EGFR Giá trị

p Âm tính Dƣơng tính

4 biến số 0,223

Không biến đổi 72 24 (33,3) 48 (66,7)

Đột biến 49 20 (40,8) 29 (59,2) 0,973

Methyl 33 21 (63,6) 12 (36,4) 0,002

Cả hai 15 8 (53,3) (46,7) 0,308

3 biến số 0,319

Không biến đổi 72 24 (33,3) 48 (66,7)

Đột biến hoặc methyl 67 33 (49,3) 34 (50,7) 0,227

Cả hai 15 8 (53,3) 7 (46,7) 0,308

Ảnh hưởng của đột biến và methyl hóa vùng promoter đến mức độ biểu hiện

của EGFR được trình bày trong bảng 3.14. Trong đó mức độ biểu hiện EGFR được

tiến hành phân tích đồng thời với hai biến đổi khác là đột biến và methyl theo hai

nhóm biến số: Nhóm 1: Đột biến và metyhl được phân tích độc lập; nhóm hai đột

biến và metyhl được coi như một biến đổi chung (Bảng 1.14). Kết quả một lần nữa

71

khẳng định mức đột biểu hiện của protein EGFR có sự tương quan với methyl vùng

promoter mà không bị ảnh hưởng bởi đột biến tại vùng Tyrosine Kinase.

3.4.2. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa các

gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A

3.4.2.1. Tương quan giữa đột biến gen EGFR với sự methyl hóa các gen BRCA1,

MGMT, MLH1 và RASSF1A

Sự tương quan giữa đột biến gen EGFR với methyl hóa lần lượt các gen ức

chế khối u và methyl hóa đồng thời các gen được thể hiện trong Bảng 3.14. Kết quả

phân tích mối liên hệ giữa đột biến gen EGFR và methyl hóa BRCA1 cho thấy mối

tương quan ngược giữa hai hiện tượng. Trong 49 mẫu phát hiện đột biến EGFR chỉ

có 9 mẫu (18,4%) xảy ra hiện tượng methyl hóa BRCA1 và 40 mẫu (81,6%) không

có sự methyl hóa BRCA1. Đồng thời, trong 41 mẫu có methyl hóa BRCA1, 32

trường hợp (78,1%) không mang đột biến và 9 trường hợp (21,1%) đột biến EGFR

(p<0,05) (Bảng 3.14).

Hiện tượng tương tự cũng được phát hiện khi phân tích sự tương quan giữa

đột biến EGFR với tình trạng methyl hóa MGMT và RASSF1A. Ở gen MGMT, trong

49 trường hợp phát hiện đột biến EGFR, 11 mẫu có gen MGMT bị methyl hóa và

không phát hiện methyl hóa ở 38 mẫu còn lại. Ngược lại, với 46 mẫu bị methyl hóa

MGMT, 35 mẫu không phát hiện đột biến EGFR. Đối với methyl hóa RASSF1A và

đột biến EGFR, chỉ có 7/139 trường hợp xảy ra đồng thời hai hiện tượng trên, trong

khi đó 42 trường hợp có đột biến EGFR, không có methyl RASSF1A và 34 trường

hợp xảy ra hiện tượng ngược lại (p<0,05) (Bảng 3.14).

Tuy nhiên, không có sự tương quan giữa đột biến EGFR với sự methyl

MLH1 với p>0,05. Hiện tượng đột biến EGFR và methyl hóa MLH1 xảy ra đồng

thời ở 8 bệnh nhân, 41 bệnh nhân mang đột biến EGFR nhưng không methyl hóa

MLH1 và 20 bệnh nhân có sự biến đổi theo chiều ngược lại. Như vậy, đột biến

EGFR và methyl hóa gen MLH1 là hai hiện tượng xảy ra song song và không có

mối tương quan với nhau.

Thêm vào đó, nghiên cứu cũng chỉ ra sự tương quan giữa đột biến EGFR với

sự methyl hóa đồng thời của các gen ức chế khối u. 90 mẫu bệnh phẩm có sự

methyl hóa của ít nhất một trong 4 gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A. 41

72

trường hợp methyl hóa 2 trong 4 gen, 17 trường hợp methyl hóa 3 trong 4 gen và 5

trường hợp methyl hóa cả 4 gen đồng thời. Kết quả đánh giá mối tương quan cho

thấy, đột biến EGFR có mối liên quan ngược với sự methyl hóa đồng thời của các

gen ức chế khối u trong nghiên cứu với giá trị p lần lượt là 0,041; 0,001; 0,004 và

0,106. Riêng yếu tố methyl hóa đồng thời cả 4 gen, chỉ có 5 trường hợp vì vậy kết

quả thống kê có thể không chính xác (Bảng 3.15).

Bảng 3.15. Tương quan giữa đột biến EGFR với sự methyl hóa các gen BRCA1,


ĐỘT BIẾN EGFR

Số lƣợng Đột biến Kiểu dại Giá trị

METHYL 139 49 90 p

BRCA1 M 41 9 32 0,034

U 98 40 58

MGMT M 46 11 35 0,049

U 93 38 55

MLH1 M 28 8 20 0,408

U 111 41 70

RASSF1A M 41 7 34 0,004

U 98 42 56

1 trong 4 M 90 26 64 0,041

U 49 23 26

2 trong 4 M 41 6 35 0,001

U 98 43 55

3 trong 4 M 17 1 16 0,004

U 122 48 74

4 trong 4 M 5 0 5 0,106

U 134 49 85

3.4.2.2. Tương quan giữa biểu hiện protein EGFR với sự methyl hóa BRCA1,


Tương quan giữa mức độ biểu hiện protein EGFR và sự methyl hóa độc lập

cũng như sự methyl hóa đồng thời của 4 gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1

và RASSF1A được trình bày trong Bảng 3.16.

73

Bảng 3.16. Tương quan giữa biểu hiện protein EGFR với sự methyl hóa các gen

BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A

BIỂU HIỆN EGFR

Số lƣợng Âm tính Dƣơng tính Giá trị

METHYL 139 57 82 p

BRCA1 M 41 23 18 0,019

U 98 34 64

MGMT M 46 21 25 0,434

U 93 36 57

MLH1 M 28 14 14 0,279

U 111 43 68

RASSF1A M 41 19 22 0,408

U 98 38 60

1 trong 4 M 90 43 47 0,031

U 49 14 35

2 trong 4 M 41 21 20 0,131

U 98 36 62

3 trong 4 M 17 10 7 0,123

U 122 47 75

4 trong 4 M 5 3 2 0,401

U 134 54 80

Kết quả cho thấy có sự tương quan giữa mức độ biểu hiện của protein EGFR

và methyl hóa gen BRCA1. Trong số 57 trường hợp protein EGFR âm tính, tỷ lệ

methyl hóa BRCA1 lần lượt là 40,4% (23/57), ngược lại tỷ lệ này trong nhóm biểu

hiện EGFR chỉ có 22,0%. Điều đó cho thấy mức độ biểu hiện thấp của protein

EGFR ở những bệnh nhân có tương quan với methyl hóa gen BRCA1, với p=0,019

(Bảng 3.16). Kết quả phân tích tương quan giữa biểu hiện EGFR với sự methyl hóa

của 3 gen còn lại cho thấy xu hướng giảm biểu hiện protein này ở những trường hợp

gen ức chế khối u bị methyl hóa. Tuy nhiên, những sự khác biệt trên không có ý

nghĩa thống kê với p lần lượt là 0,434; 0,279 và 0,408 (Bảng 3.16).

74

Để phân tích sâu hơn ảnh hưởng của methyl hóa 4 gen BRCA1, MGMT,

MLH1 và RASSF1A đến sự biểu hiện của EGFR, chúng tôi tiến hành phân tích mối

tương quan giữa sự methyl hóa ít nhất một gen và methyl hóa đồng thời của 2, 3 và

4 gen với sự biểu hiện EGFR. Trong 139 mẫu nghiên cứu có 90 trường hợp có

methyl hóa ít nhất 1 trong 4 gen. Tỷ lệ biểu hiện EGFR ở nhóm bệnh nhân methyl

một trong 4 gen nghiên cứu là 52,2%, trong khi tỷ lệ này ở nhóm không methyl hóa

cả 4 gen là 71,4%. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p=0,031) (Bảng 3.16).

Tuy nhiên, kết quả đánh giá ảnh hưởng của methyl hóa đồng thời của 2, 3 và 4 gen

không cho thấy sự tương quan với biểu hiện EGFR mặc dù ở nhóm các gen bị

methyl hóa luôn có tỷ lệ biểu hiện protein thấp hơn (p= 0,131; 0,123 và 0,401)

(Bảng 3.16).

3.4.3. Tương quan về tình trạng methyl giữa các gen liên quan đến ung thư biểu

mô tuyến của phổi

Sự tương quan giữa methyl hóa EGFR với sự methyl hóa của 4 gen ức chế

khối u trong nghiên cứu được trình bày trong Bảng 3.17. Kết quả cho thấy không có

sự tương quan giữa sự methyl hóa EGFR và 4 gen trong nghiên cứu là BRCA1,

MGMT, MLH1 và RASSF1A với giá trị p lần lượt là 0,378; 0,096 và 0,907 (Bảng

3.17)

Bảng 3.17. Tương quan về tình trạng methyl các gen liên quan đến ung thư biểu mô

tuyển ở phổi

EGFR MLH1 RASSF1A MGMT

M U p M U p M U p M U p

BRCA1

M 11 30 0,580 10 31 0,419 21 20 0,001 15 26 0,571

U 22 76

18 80 20 78

31 67

MGMT

M 13 33 0,378 13 33 0,093 17 29 0,175

U 20 73

15 78 24 69

RASSF1

M 10 31 0,907 17 24 0,001

U 23 75

11 87

MLH1 M 10 18 0,096

U 23 88

75

Sự tương quan về tình trạng methyl hóa của 4 gen ức chế khối u trong nghiên

cứu được trình bày trong Bảng 3.17. Kết quả cho thấy có mối liên quan chặt chẽ

giữa sự methyl hóa RASSF1A với sự methyl hóa của MLH1 và BRCA1 (p<0,05). Tỷ

lệ methyl hóa đồng thời của hai gen RASSF1A – MLH1 và RASSF1A – BRCA1 lần

lượt là 17 trường hợp (41,5% đối với RASSF1A và 60,7% đối với MLH1) và 21

trường hợp (51,2% đối với cả hai gen RASSF1A – BRCA1), trong khi đó sự methyl

hóa của một trong hai gen RASSF1A – MLH1 và RASSF1A – BRCA1 lần lượt là 24

– 11 (58,5% đối với RASSF1A và 39,3% đối với MLH1), và 20 – 20 (48,8% đối với

cả hai gen RASSF1A – BRCA1). Như vậy sự methyl gen RASSF1A có xu hướng xảy

ra đồng thời với methyl hóa gen MLH1 và BRCA1 (Bảng 3.17).

Tuy cùng có sự liên quan đối với methyl gen RASSF1A, nhưng methyl hóa

gen MLH1 và BRCA1 lại xảy ra độc lập. Có 10 trường hợp (35,7% đối với MLH1

và 24,4% đối với BRCA1) xảy ra sự methyl đồng thời của 2 gen, trong khi số trường

hợp methyl riêng của MLH1 và BRAC1 lần lượt là 18 và 31 (tương ứng với 64,2%

và 75,6%) (Bảng 3.17).

Trong 4 gen ức chế khối u được nghiên cứu, methyl hóa gen MGMT không

có sự tương quan với 3 gen còn lại. Tỷ lệ methyl hóa của các gen còn lại xảy ra

đồng thời với gen MGMT lần lượt là 28,3 % (13/46 với MLH1); 32,6% (15/4) với

BRCA1 và 37,0% (17/46) với RASSF1A (Bảng 3.17).

76

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN

4.1. Đặc điểm phân tử gen EGFR ở bệnh nhân ung thƣ biểu mô tuyến của phổi

4.1.1. Đột biến vùng hoạt hoạt Tyrosine Kinase gen EGFR

EGFR có vai trò quan trọng trong sự phát triển của tế bào biểu mô tuyến của

phổi, có vai trò điều khiển quá trình nhân lên, chết theo chương trình, di động, xâm

nhập, sửa chữa và tương tác giữa tế bào với tế bào. Khi phân tử EGFR được hoạt

hóa bằng phối tử sẽ kích hoạt hai con đường truyền tín hiệu chính của tế bào là con

đường qua PI3KCA/AKT/m-TOR và RAS/RAF1/MAP2K1/MAPK1, làm cho tế

bào tăng phân chia, tăng khả năng sống sót và chống lại quá trình chết theo chương

trình [96]. Tại những tế bào ung thư, đột biến gen EGFR dẫn đến sự tự động hoạt

hóa protein mà không cần đến sự có mặt của ligand làm cho tế bào ung thư tăng

sinh không kiểm soát [96]. Hiện nay, EGFR được xem là đích điều trị có vai trò

quan trọng nhất trong ung thư phổi cho những bệnh nhân ở giai đoạn muộn và cho

thấy hiệu quả rõ rệt về thời gian sống thêm cũng như chất lượng cuộc sống của bệnh

nhân [4, 13]. Vì vậy, xác định đột biến EGFR cho bệnh nhân ung thư phổi là cơ sở

để đưa ra phác đồ điều trị tối ưu cho bệnh nhân. Khi tiến hành phân tích đột biến

EGFR trên 139 bệnh nhân trong nghiên cứu chúng tôi nhận thấy 35,3% trường hợp

dương tính. Tỷ lệ đột biến trong nghiên cứu này tương tự với những công bố trước

đây tại một số nước Châu Á như Nhật Bản 32,0%, Hàn Quốc 36,4% [105]. Tại Việt

Nam, tần suất đột biến EGFR trong nghiên cứu tại Bệnh viện ung bướu ở TP Hồ

Chí Minh là 40,7% và Bệnh viện Bạch Mai là 40,1% [67, 145]. Tỷ lệ này thấp hơn

so với tại một số quốc gia khác trong khu vực như Thái Lan 57,4% và Đài Loan là

55,0% [105]. Tuy nhiên, so với các nước Châu Mỹ và Châu Âu thì tỷ lệ đột biến

trong nghiên cứu cao hơn, đột biến EGFR chỉ xảy ở ra 10 – 15% bệnh nhân các

nước phương tây [8, 127]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi một lần nữa khẳng

định tỷ lệ đột biến EGFR có sự khác nhau giữa các chủng tộc và vùng địa lý.

Đột biến mất đoạn ở exon 19 (Del 19) và thay thế axit amin L858R tại exon

21 chiếm tỷ lệ 85,5%. Đây cũng là hai đột biến phổ biến nhất được tìm thấy trong

những nghiên cứu khác cả ở người Châu Á và người phương tây với tỷ lệ đột biến

khoảng 90% [105, 130]. Del 19 và L858R là hai đột biến nhạy với các thuốc điều trị

77

nhắm đích TKIs đang được sử dụng phổ biến trong ung thư phổi trên thế giới cũng

như tại Việt Nam. Đột biến kháng TKIs thế hệ thứ nhất và thế hệ thứ hai T790M

nguyên phát xuất hiện ở 3 (4,1%) trường hợp bệnh nhân nghiên cứu. Tỷ lệ thấp của

đột biến kháng thuốc T790M có thể được giải thích bởi toàn bộ bệnh nhân trong

nghiên cứu chưa trải qua bất kỳ liệu pháp điều trị nào kể cả xạ trị, hóa chất hay điều

trị bằng TKIs. Bên cạnh đó, 6 mẫu bệnh phẩm phát hiện 2 đột biến xảy ra đồng thời.

Đột biến thay thế G719X thường xảy ra đồng thời với những đột biến khác (4/5

trường hợp). Kết quả nghiên cứu của Shi Y. và cs (2015) cũng cho thấy đột biến

thay thế G791X thường xảy ra đồng thời với các đột biến khác như L861Q và S768I

[130]. Đột biến EGFR là dấu chuẩn quan trọng trong điều trị bệnh nhân ung thư

phổi bằng TKIs. Những bệnh nhân mang đột biến nhạy thuốc có thời gian sống

thêm và thời gian sống không bệnh cao hơn rõ rệt, thêm vào đó chất lượng cuộc

sống của bệnh nhân sử dụng TKIs cũng được cải thiện hơn nhiều so với những bệnh

nhân điều trị theo phương pháp bao vây truyền thống [4, 13]. Vì vậy, việc xác định

chính xác đột biến EGFR có ý nghĩa quan trọng trong việc tiên lượng cũng như lựa

chọn phác đồ điều trị cho bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ nói chung và

ung thư phổi dạng tuyến nói riêng.

Các báo cáo công bố cho thấy đột biến EGFR có xu hướng xảy ra nhiều hơn

ở những người trẻ tuổi, nữ giới và không hút thuốc lá [92]. Midha A. và cs (2015)

tổng hợp và phân tích 139 nghiên cứu về đột biến EGFR trên khắp thế giới cho thấy

tuy có khác nhau về tỷ lệ đột biến giữa các nhóm người, các vùng địa lý nhưng tỷ lệ

đột biến EGFR luôn cao hơn ở phụ nữ và những người không hút thuốc lá. Nghiên

cứu của chúng tôi cũng cho kết quả tương tự với những nghiên cứu đã công bố

trước đây trên cả bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ nói chung, dạng biểu

mô tuyến nói riêng. Cụ thể, tỷ lệ đột biến EGFR ở những nhóm bệnh nhân trẻ tuổi,

phụ nữ, không hút thuốc lá lần lượt là: 44,7; 57,8 và 48,3% so với nhóm lớn tuổi,

nam giới và hút thuốc lá là 26,4; 24,5 và 25,3% với p<0,05 (Bảng 3.3). Từ đó có

thể giả thuyết ung thư biểu mô tuyến của phổi được hình thành bởi hai hướng: Ung

thư hình thành do hệ quả của quá trình hút thuốc lá kéo dài với đối tượng mắc chủ

yếu là nam giới lớn tuổi; hoặc ung thư hình thành do kết quả của đột biến gen

EGFR xảy ra nhiều ở những người trẻ tuổi, không hút thuốc và phụ nữ.

78

Báo cáo của Midha A. và cs (2015) cũng chỉ ra không có sự khác biệt ở

những bệnh nhân có giai đoạn bệnh khác nhau hay tại khối u nguyên phát hoặc di

căn [92]. Kết quả chúng tôi thu được hoàn toàn phù hợp với những nghiên cứu đã

công bố trước đây. Một điểm mới trong nghiên cứu của chúng tôi đó là tiến hành

phân tích đột biến EGFR trên những phân típ khác nhau của ung thư biểu mô tuyến

ở phổi và nhận thấy tỷ lệ đột biến không đồng nhất giữa các phân típ. Phân típ biểu

mô tuyến đặc có tỷ lệ đột biến thấp hơn có ý nghĩa với các phân típ khác trong

nghiên cứu. Cụ thể trong ba phân típ có số bệnh nhân lớn trong nghiên cứu, tỷ lệ đột

biến gen của phân típ tuyến chùm nang và tuyến nhú lần lượt là 40,5 và 33,3%

trong khi tỷ lệ này ở nhóm bệnh nhân típ đặc chỉ có 20,6% (p<0,05) (Bảng 3.3).

Tuy nhiên, một số phân típ có số lượng tương đối ít, chúng tôi sẽ tiến hành mở rộng

nghiên cứu để có kết luận chính xác hơn về sự khác biệt trong tỷ lệ đột biến EGFR

giữa các phân típ. Ngoài ra, tỷ lệ đột biến EGFR không có sự khác biệt giữa các giai

đoạn bệnh khác nhau, cũng như tình trạng khối u nguyên phát hay di căn. Điều đó

thêm một lần nữa khẳng định đột biến EGFR xảy ra trong quá trình phát sinh của

ung thư; không hình thành trong quá trình tiến triển và di căn của bệnh.

Như vậy, đột biến EGFR xảy ra với tần suất khá cao ở bệnh nhân ung thư

phổi dạng tuyến tại Bệnh viện K. Đột biến thường gặp ở những bệnh nhân trẻ tuổi,

là phụ nữ và không hút thuốc. Phân típ biểu mô tuyến đặc có tỷ lệ đột biến thấp hơn

những nhân típ khác.

4.1.2. Biểu hiện quá mức của protein EGFR

Sự biểu hiện protein EGFR có ý nghĩa quan trọng trong việc đánh giá tiên

lượng cho bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi [11, 80]. Mức độ biểu hiện

EGFR trong các nghiên cứu có độ tương đồng khá lớn, năm 2005, Cappuzzo F. và

cs. cho thấy có 60,2% (59/98) bệnh nhân biểu hiện EGFR; đến năm 2010, một

nghiên cứu trên bệnh nhân Châu Á cho thấy 68,4% bệnh nhân có sự biểu hiện

protein này [11, 80] và trong nghiên cứu này là 59,0% (82/139). Cappuzzo F. và cs.

(2005) đưa ra sự tương quan giữa mức độ đáp ứng với TKIs, thời gian sống thêm

của bệnh nhân với mức độ biểu hiện EGFR. Bệnh nhân có kết quả dương tính với

protein EGFR đáp ứng tốt hơn so với những bệnh nhân có kết quả hóa mô miễn

dịch EGFR âm tính. Cụ thể, tỷ lệ đáp ứng ở nhóm dương tính với protein EGFR là

79

21% so với 5,0% ở nhóm âm tính. Ngoài ra, thời gian sống thêm ở nhóm có biểu

hiện EGFR cũng cao hơn ở nhóm không biểu hiện (5,2 tháng so với 2,3 tháng) khi

điều trị hóa chất kết hợp với Gefitinib [11]. Nghiên cứu của Hirsch F.R. và cs.

(2008) trên 102 bệnh nhân cũng cho kết quả tương tự [55]. Như vậy, sự biểu hiện

EGFR có thể được xem là dấu chuẩn trong việc tiên đoán mức độ đáp ứng với TKIs

ở nhóm bệnh nhân mang đột biến EGFR nhạy thuốc trong ung thư phổi nói chung

và ung thư phổi dạng biểu mô tuyến nói riêng.

Tuy nhiên, sự biểu hiện protein EGFR không thể hiện mối tương quan với

một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân. Những kết quả phân tích

tương tự cũng thu được trong các nghiên cứu của Cappuzzo F. và cs. (2005) và

Liang Z. (2010) [11, 80]. Hai tác giả thực hiện nghiên cứu trên hai nhóm bệnh nhân

Châu Âu và Châu Á với nhiều đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng khác nhau. Các

phân tích đều không nhận thấy mối tương quan giữa các đặc điểm này với sự biểu

hiện của EGFR. Biểu hiện EGFR không đặc trưng cho tế bào ung thư biểu mô

tuyến, protein này có mặt cả trên những mô lành tính. Sự biểu hiện EGFR không có

sự khác biệt giữa các nhóm bệnh nhân khác nhau về các đặc điểm lâm sàng và cận

lâm sàng. Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi cũng không nhận thấy sự khác biệt

và mức độ biểu hiện của protein này giữa những nhóm bệnh nhân khác nhau về các

đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng như: Tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc, phân

típ mô bệnh học, đặc điểm khối u và giai đoạn bệnh với giá trị p>0,05 (Bảng 3.6).

Kết quả từ nghiên cứu cho thấy mức độ biểu hiện cao của EGFR chứng tỏ vai trò

trung tâm của EGFR trong điều khiển hoạt động của tế bào biểu mô tuyến kể cả ở

mẫu mô lành tính và mô ung thư. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận

thấy mức độ biểu hiện quá mức của EGFR (3+) ở bệnh nhân nam giới cao hơn ở nữ

giới tỷ lệ lần lượt là 30,5 và 8,0% sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p<0,05. Mặc

dù vậy, cơ chế của hiện tượng này vẫn chưa được làm sáng tỏ. Thêm vào đó, ở

những khối u di căn, mức độ biểu hiện EGFR có xu hướng tăng mạnh so với tại

những khối u nguyên phát. Tỷ lệ biểu hiện và biểu hiện quá mức protein EGFR ở

khối u nguyên phát là 72,5 và 21,9% và ở khối u di căn là 50,0 và 33,3%. Khối u

nguyên phát có xu hướng biểu hiện EGFR với cường độ trung bình, ngược lại ở

những khối u di căn có xu hướng biểu hiện quá mức protein này. (Bảng 3.6). Sự

80

biểu hiện quá mức thụ thể của các yếu tố tăng trưởng ngoại bào dẫn đến sự tăng

trưởng và phát triển mạnh của những tế bào ung thư từ đó dẫn đến đẩy nhanh tốc độ

tiến triển ung thư. Như vậy, mức độ ác tính cao ở những khối u di căn có thể là kết

quả của sự biểu hiện quá mức protein EGFR.

4.1.3. Methyl hóa quá mức vùng promoter EGFR

Mặc dù nghiên cứu đột biến EGFR đã trở nên phổ biến đối với bệnh nhân

ung thư phổi nói chung và ung thư phổi dạng biểu mô tuyến nói riêng. Tuy nhiên,

không có nhiều công bố về sự methyl hóa EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi. Li J.

Và cs. (2015) và Pan Z.Y. và cs. (2015) phân tích sự methyl hóa EGFR trên hai

nhóm bệnh nhân ung thư phổi tại Trung Quốc, kết quả cho thấy tỷ lệ methyl hóa

EGFR lần lượt là 36,8 và 35,7% [77, 106], cao hơn so với kết quả thu được trong

nghiên cứu này (23,7%). Như vậy, methyl hóa EGFR xảy ra khá phổ biến trên bệnh

nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ nói chung và ung thư dạng biểu mô tuyến nói

riêng. Một số nghiên cứu nhằm đánh giá vai trò của methyl hóa EGFR đã được thực

hiện, năm 2012, Li X. Và cs. đã chỉ ra methyl hóa EGFR góp phần làm giảm quá

trình chết theo chương trình của tế bào ung thư phổi, đồng thời việc loại bỏ sự

methyl hóa kết hợp với sử dụng TKIs có tác dụng thúc đẩy quá trình chết theo

chương trình của những tế bào này [79]. Điều này gợi ý rằng methyl hóa EGFR có

thể trở thành một dấu chuẩn trong đánh giá đáp ứng và tiên lượng cho bệnh nhân

ung thư phổi đặc biệt là những bệnh nhân điều trị bằng TKIs.

Chúng tôi không nhận thấy có sự tương quan giữa methyl hóa EGFR với các

đặc điểm như: Tuổi, giới tính, trình trạng hút thuốc, các phân típ mô bệnh học, giai

đoạn bệnh và tình trạng khối u (Bảng 3.7). Các nghiên cứu trước đây của Li J và cs.

(2015) và Pan Z.Y. và cs. (2015) cũng chỉ ra những điểm tương đồng về sự tương

quan giữa tình trạng methyl hóa vùng promoter gen EGFR với các đặc điểm của

bệnh nhân nghiên cứu [77, 106]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Li J. và cs. (2015)

, tác giả nhận thấy ở bệnh nhân giai đoạn III có tỷ lệ methyl hóa EGFR thấp hơn so

với giai đoạn I và II [77]. Trong nghiên cứu này, 127/139 bệnh nhân ở giai đoạn III

và IV, chỉ có 12 bệnh nhân nằm trong giai đoạn I và II. Nhưng chúng tôi lại nhận

thấy methyl EGFR có xu hướng tăng lên ở nhóm bệnh nhân giai đoạn muộn (8,3%

ở giai đoạn I và II so với 25,2% so với giai đoạn III và IV) (Bảng 37). Mặc dù vậy,

81

số lượng bệnh nhân giai đoạn sớm trong nghiên cứu này còn ít, do đó chúng tôi sẽ

tiếp tục mở rộng phạm vi nghiên cứu để có thể đưa ra những đánh giá chính xác

hơn. Phân tích mối tương quan giữa methyl hóa EGFR với các đặc điểm bệnh nhân

nghiên cứu cho thấy hiện tượng này xảy ra ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của

phổi theo một cách ngẫu nhiên, không bị chi phối bởi các đặc điểm lâm sàng và cận

lâm sàng của bệnh nhân.

4.1.4. Tương quan giữa các đặc điểm phân tử gen EGFR

Đột biến gen EGFR dẫn đến những biến đổi về trình tự axit amin cũng như

hoạt tính của protein qua đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của

tế bào. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của protein lại bị điều khiển bởi nhiều con

đường trong tế bào trong đó có hiện tượng methyl hóa vùng promoter của gen. Vì

vậy, nghiên cứu mối tương quan của ba hiện tượng đột biến, methyl hóa và biểu

hiện protein sẽ góp phần làm sáng tỏ cơ chế hình thành và phát triển của ung thư.

Hình 4.1. Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và sự biểu hiện EGFR.

Những nghiên cứu về mối tương quan giữa đột biến gen và methyl hóa cũng

như biểu hiện EGFR cho những kết quả rất khác nhau. Cappuzzo F. và cs. (2005)

không nhận thấy có liên hệ giữa sự biểu hiện EGFR với đột biến EGFR, nhưng lại

82

cho thấy mối tương quan giữa biểu hiện với mức độ khuếch đại gen [11]. Ngược lại,

Liang Z. và cs. (2010) lại chỉ ra mức độ biểu hiện EGFR cao ở những bệnh nhân

mang đột biến gen này [80]. Thêm vào đó, Ohsaki và cs. (2000) đã chỉ ra methyl

hóa thường xuất hiện với tần suất cao hơn ở bệnh nhân mang đột biến EGFR nhưng

Liang Z. và cs. (2010) lại cho thấy không có sự liên quan giữa hai hiện tượng này

trên một nhóm bệnh nhân nghiên cứu khác [80, 103]. Trong nghiên cứu này, chúng

tôi không nhận thấy có sự tương quan giữa đột biến gen với hiện tượng methyl hóa

EGFR cũng như mức độ biểu hiện của protein EGFR trên bề mặt tế bào. Cụ thể, ở

nhóm bệnh nhân mang đột biến, tỷ lệ methyl hóa vùng promoter và biểu hiện quá

mức protein EGFR lần lượt là: 30,6 (15/49) và 59,2% (29/49). Trong khi đó, tỷ lệ

này ở nhóm bệnh nhân không mang đột biến là 20,0 (18/90) và 58,9% (53/90)

(Bảng 3.12). Như vậy, sự tương quan giữa đột biến với methyl hóa và biểu hiện của

EGFR có thể không đồng nhất theo các nghiên cứu, do sự khác biệt về chủng tộc,

lứa tuổi, giới tính cũng như giai đoạn bệnh.

Ngược lại, không chỉ được chứng minh ở mức độ protein, ức chế biểu hiện

EGFR thông qua methyl hóa còn được chứng minh thông qua mRNA. Nghiên cứu

của Liang Z. và cs. (2010) đã chỉ ra sự khác biệt ở mức độ biểu hiện mRNA giữa

nhóm bệnh nhân methyl và không methyl hóa EGFR [80]. Trong nghiên cứu này,

chúng tôi nhận thấy methyl hóa quá mức vùng promoter EGFR có vai trò quan

trọng trong ức chế biểu hiện của protein do gen này mã hóa. Cụ thể, chỉ có 36,4%

(12/33) trường hợp methyl hóa EGFR có biểu hiện protein, ngược lại 66,0%

(70/106) mẫu bệnh phẩm cho thấy sự biểu hiện quá mức EGFR ở nhóm bệnh nhân

không methyl hóa gen này (Bảng 3.12). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với

p<0,05. Như vậy, trong số 33 trường hợp có xảy ra hiện tượng methyl hóa vùng

promoter gen EGFR vẫn có 12 trường hợp có sự biểu hiện protein mặc dù ở mức độ

trung bình (10/12 mẫu có kết quả IHC 2+). Kết quả này có thể được giải thích do

tình trạng methyl hóa EGFR có thể chỉ xảy ra trên một alen (methyl hóa không hoàn

toàn). Do vậy, trong một số trường hợp gen EGFR vẫn được phiên mã tạo ra các

phân tử mRNA từ đó dịch mã ra các protein tương ứng (Hình 4.1). Ngược lại,

46/106 trường hợp bệnh nhân có gen EGFR không bị methyl hóa nhưng không có

sự biểu hiện của protein tương ứng. Như vậy có thể thấy, sự biểu hiện của gen

83

EGFR không chỉ được điều khiển bằng con đường methyl hóa DNA mà còn bị chi

phối bởi những cơ chế khác.

Mặt khác, mức độ biểu hiện protein có thể được sử dụng trong đánh giá đáp

ứng cũng như tiên tượng điều trị ung thư [11]. Thêm vào đó, Li và cs. (2013) đã chỉ

ra sự tăng mức độ biểu hiện của EGFR cũng như chết theo chương trình ở những

dòng tế bào có EGFR methyl hóa được nuôi cấy trong môi trường có sử dụng chất

loại bỏ nhóm methyl 5-aza-CdR và bổ sung TKIs [79]. Do đó kiểm soát mức độ

biểu hiện của EGFR thông qua quá trình methyl hóa cũng kết hợp với các thuốc

điều trị đích TKIs có thể là một hướng mới trong nghiên cứu cũng như trong điều trị

ung thư phổi.

4.2. Methyl hóa gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ở bệnh

nhân ung thƣ biểu mô tuyến của phổi

4.2.1. Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1

BRCA1 đóng vai trò quan trọng trong duy trì sự ổn định của tế bào, sửa chữa

DNA, điều khiển các điểm kiểm tra trong chu kỳ tế bào và điều hòa các yếu tố

phiên mã như là P53 và c-Myc [113]. Thêm vào đó, BRCA1 còn tham gia vào điều

khiển quá trình hình thành mạch trong khối u. Methyl hóa BRCA1 được nghiên cứu

chủ yếu trong ung thư vú và ít được chú ý trong ung thư phổi. Tuy nhiên, tình trạng

methyl hóa BRCA1 cao bất thường cũng có thể được xem là một con đường hình

thành khối u bên cạnh những con đường đã biết thông qua đột biến EGFR hoặc

KRAS [73]. Tỷ lệ methyl hóa BRCA1 ở bệnh nhân ung thư phổi dạng biểu mô tuyến

trong nghiên cứu này là 29,5%, trong khi ở các nghiên cứu trước đây nằm trong

khoảng 4 – 54% [40, 73, 89, 147]. Nghiên cứu đầu tiên công bố về methyl hóa

BRCA1 trong ung thư phổi được thực hiện trên 158 bệnh nhân tại Hoa Kỳ cho thấy

chỉ 4% bệnh nhân được phát hiện có hiện tượng này [89]. Hai nghiên cứu khác trên

98 và 50 bệnh nhân ung thư phổi người Trung Quốc cho thấy tỷ lệ methyl BRCA1

là 30% và 54% [40, 73]. Cũng giống như tỷ lệ đột biến gen và methyl các gen khác,

sự khác biệt về chủng tộc có thể dẫn đến sự khác biệt về tình trạng methyl BRCA1

trong ung thư phổi. Ở những bệnh nhân Châu Á, sự methyl hóa BRCA1 có xu

hướng xảy ra phổ biến hơn so với những bệnh nhân người phương tây.

84

Trong nghiên cứu này, chúng tôi không nhận thấy có sự tương quan giữa

methyl hóa BRCA1 với các đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân. Các

nghiên cứu trước đây, tuy không nghiên cứu đầy đủ các đặc điểm lâm sàng và cận

lâm sàng như trong nghiên cứu này nhưng phần lớn cũng đều chỉ ra không có sự

tương quan giữa các đặc điểm này với sự methyl hóa BRCA1 [73, 89, 147]. Báo cáo

của Gao W. và cs. (2016) cho thấy sự methyl hóa BRCA1 có xu thế tăng cao hơn ở

những bệnh nhân giai đoạn II và III so với bệnh nhân ở giai đoạn I; ở những bệnh

nhân có sự di căn hạch lympho so với bệnh nhân không di căn hạch [40]. Từ sự

khác nhau về tình trạng methyl hóa BRCA1 giữa các nhóm bệnh nhân khác nhau về

giai đoạn và tình trạng di căn hạch lympho có thể nhận thấy quá trình methyl hóa

BRCA1 xảy ra song song với quá trình tiến triển bệnh, bệnh càng tiến triển mức độ

methyl hóa càng cao. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng nhận thấy có tự tăng

lên về tình trạng methyl hóa BRCA1 với tiến triển giai đoạn bệnh tuy nhiên sự sai

khác mang tính ngẫu nhiên, không có ý nghĩa (29,9% ở giai đoạn muộn so với

25,0% ở giai đoạn sớm) (Bảng 3.8). Điểm khác biệt giữa nghiên cứu của chúng tôi

so với nghiên cứu của Gao W. và cs. (2016) là giai đoạn của bệnh nhân nghiên cứu.

Gao W. và cs. (2016) chỉ ra sự methyl hóa ở tần suất thấp đối với nhóm bệnh nhân

giai đoạn I (5/18) và có xu hướng tăng lên theo giai đoạn bệnh [40]. Tuy nhiên,

trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ thu thập được một số lượng rất ít bệnh nhân ở

giai đoạn sớm (12/139), mặc dù vậy chúng tôi cũng có nhận thấy sự tăng lên về tình

trạng methyl hóa BRCA1 cùng với sự tiến triển của bệnh tuy sự khác biệt không cho

thấy ý nghĩa thống kê (Bảng 3.8). Với vai trò điều khiển nhiều quá trình quan trọng

trong tế bào, sự methyl hóa BRCA1 dẫn đến sự thiếu hụt protein này trong việc

tham gia điều khiển chu kỳ tế bào và sửa chữa DNA. Vì vậy, methyl hóa BRCA1

cũng có thể được xem là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự hình thành, phát

triển của ung thư biểu mô tuyến ở phổi và cần được nghiên trên một cách chi tiết.

4.2.2. Methyl hóa vùng promoter gen MGMT

MGMT là gen ức chế khối u, protein do gen mã hóa tham gia vào quá trình

sửa chữa DNA bằng cách loại bỏ các gốc methyl đặc hiệu và các nhóm alkyl khác

tại vị trí O6 của Guanine [108]. Methyl hóa MGMT được tiến hành nghiên cứu

trong nhiều ung thư trong đó có ung thư phổi [23]. Tỷ lệ methyl MGMT trong các

85

nghiên cứu khác nhau thay đổi từ 8 – 50% [23]. Kỹ thuật được sử dụng chủ yếu

trong các nghiên cứu methyl hóa gen MGMT là MS – PCR, ngoài ra Feng Q. và cs.

(2008) sử dụng kỹ thuật MethyLight chỉ thu được 8% trường hợp bệnh nhân nguyên

cứu có methyl hóa MGMT [34]. Một nghiên cứu trên bệnh nhân Hàn Quốc cho thấy

tỷ lệ methyl MGMT là 17% [69]. Những kết quả thu được thấp hơn khá nhiều so với

những nghiên cứu trên người Trung Quốc với tỷ lệ là 30 – 50% [83, 151]. Tỷ lệ

methyl MGMT ở bệnh nhân người Việt Nam trong nghiên cứu là 33,1%, tương

đương với ở người Trung Quốc và cao hơn ở Hàn Quốc và các nước phương tây.

Methyl hóa MGMT dẫn đễn sự ức chế biểu hiện và mất chức năng sửa chữa DNA

trong tế bào từ đó làm tăng nguy cơ hình thành các đột biến. Thêm vào đó, mức độ

methyl hóa cao MGMT được chứng minh có tương quan với đột biến p53 [151].

Như vậy, có thể khẳng định vai trò quan trọng của MGMT trong hình thành và phát

triển của ung thư phổi.

Kết quả phân tích mối tương quan cho thấy methyl hóa MGMT không bị chi

phối bởi các đặc điểm của bệnh nhân trong nhiên cứu ngoại trừ đặc điểm khối u.

Các báo cáo trên bệnh nhân Hàn Quốc và Trung Quốc cũng cho kết quả tương tự.

Nghiên cứu sự methyl hóa của một số gen ức chế khối u bao gồm p16; RARP2;

DAPK; MGMT; GSTP1, Kim và cs. (2005) đã chỉ ra mức độ methyl hóa khác nhau

của RARP2 và GSTP1 ở những bệnh nhân giai đoạn sớm so với giai đoạn muộn.

Tuy nhiên, tác giả không cho thấy sự khác biệt trong mức độ methyl MGMT đối với

giai đoạn bệnh [69]. Kết quả tương tự cũng được thể hiện trong nghiên cứu của Liu

Y. và cs. (2006) trên 122 bệnh nhân [83]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận

thấy sự methyl hóa MGMT tăng lêm ở những khối u di căn so với khối u nguyên

phát. Trong 104 mẫu bệnh phẩm thu được từ những khối u nguyên phát chỉ có

28,2% (29/104) trường hợp có sự methyl MGMT, ngược lại, tỷ lệ ở những khối u di

căn là là 47,2 % (17/35) với p<0,05 (Bảng 3.9). Tuy cơ chế thúc đẩy sự methyl hóa

MGMT ở những tế bào di căn trong ung thư phổi chưa được làm sáng tỏ nhưng có

thể thấy methyl hóa MGMT có thể góp phần đẩy nhanh quá trình di căn của khối u.

Từ đó tăng tiến triển của bệnh, đồng thời sự methyl hóa MGMT cũng có thể được

xem là một trong những dấu chuẩn hỗ trợ tiên lượng và điều trị ung thư phổi.

86

4.2.3. Methyl hóa vùng promoter gen MLH1

Protein MLH1 là một thành phần của hệ thống sửa chữa bắt cặp sai trong quá

trình sao chép hoặc tái tổ hợp DNA. Sự mất chức năng sửa chữa của hệ thống bắt

cặp sai thường hình thành do sự thiếu hụt của MLH1 [58]. Vì vậy, methyl hóa

MLH1 trong ung thư phổi được nghiên cứu khá phổ biến, tuy nhiên tỷ lệ methyl hóa

rất khác nhau ở các nghiên cứu. Tỷ lệ methyl hóa MLH1 đã được công bố trong các

báo cáo trước đây nằm trong khoảng từ 0 – 58% [23]. Tang M. và cs. (2006) tiến

hành phân tích methyl hóa trên 72 bệnh nhân người Tây Ban Nha nhưng không phát

hiện sự methyl hóa MLH1 trên bất kỳ bệnh nhân nào [137]. Một số tác giả khác lại

công bố tỷ lệ methyl hóa khá cao khi thực hiện trên những nhóm bệnh nhân khác, ví

dụ như theo nghiên cứu của Seng T.J. và cs. (2008); Wang Y.C. và cs. (2003) tỷ lệ

methyl hóa MLH1 lần lượt là 35% và 56% [123, 148]. Ngoài ra, Seng T.J. và cs.

(2008) so sánh tỷ lệ sống sót của bệnh nhân bị methyl hóa và không methyl hóa

MLH1, cho thấy những bệnh nhân mang gen MLH1 bị methyl hóa có tiên lượng xấu

và có thời gian sống sót thấp hơn nhóm không methyl hóa [123]. Như vậy, với tần

suất phát hiện khoảng 20% ở người Việt Nam (Bảng 3.10) và 30 – 50% ở những

quốc gia Châu Á khác, hiện tượng methyl hóa gen MLH1 và ảnh hưởng của hiện

tượng này đến thời gian sống thêm của bệnh nhân, có thể coi methyl hóa MLH1 là

một trong những dấu chuẩn trong đánh giá tiên tượng cho bệnh nhân ung thư phổi

cùng với những dấu chuẩn khác.

Nhiều phân tích trên các nhóm bệnh nhân khác nhau đã cho thấy không có

mối tương quan giữa methyl hóa MLH1 với các đặc điểm của bệnh nhân nghiên cứu

như: Tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc lá. Các báo cáo thường không đi sâu vào

các phân típ khác nhau trong ung thư biểu mô tuyến mà chỉ tập trung phân tích trên

bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến nói chung [123, 148] . Tuy nhiên, tình trạng

methyl hóa MLH1 ở các giai đoạn bệnh khác nhau không có sự tương đồng giữa các

nghiên cứu. Trong công bố của Seng T.J. và cs. (2008), tác giả nhận thấy tỷ lệ

methyl hóa MLH1 ở bệnh nhân giai đoạn II cao hơn rất nhiều so với ở giai đoạn I

(40/86 so với 46/153) [123]. Ngược lại, Wang Y.C. và cs. (2003) chỉ ra sự khác biệt

về mức độ methyl hóa MLH1 ở nhóm bệnh nhân giai đoạn muộn so với bệnh nhân

giai đoạn sớm (giai đoạn III và IV so với giai đoạn I và II) là hoàn toàn ngẫu nhiên

87

[148]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng không nhận thấy sự khác nhau về tình

trạng methyl hóa MLH1 ở các giai đoạn bệnh khác nhau (bệnh nhân trong nghiên

cứu chủ yếu ở giai đoạn muộn, 16,7% ở giai đoạn sớm và 20,5% ở giai đoạn muộn)

cũng như ở vị trí khối u (nguyên phát hay di căn, 18,3% so với 25,7%). Với chức

năng sửa chữa bắt cặp sai trong quá trình sao chép DNA của MLH1, có thể đưa ra

giả thuyết quá trình methyl hóa MLH1 xảy ra chủ yếu trong giai đoạn xâm lấn của

khối u khi khối u chuyển từ giai đoạn I sang giai đoạn II. Đây cũng là giai đoạn

chức năng sửa chữa bắt cặp sai của DNA của tế bào bị suy giảm và phát sinh thêm

những đột biến mới trước khi bước vào giai đoạn di căn.

4.2.4. Methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A

RASSF1A tham gia vào điều khiển nhiều quá trình quan trọng trong tế bào

trong đó có điều khiển chu kỳ tế bào cũng như quá trình chết theo chương trình.

Methyl hóa RASSF1A có vai trò quyết định dẫn đến ức chế biểu hiện protein này. Vì

vậy, methyl hóa RASSF1A đã được nghiên cứu khá rộng rãi và trở thành dấu chuẩn

trong chẩn đoán và điều trị ung thư phổi. Tỷ lệ methyl hóa RASSF1A trong các

nghiên cứu khác nhau từ 20 – 80% [146], đối với bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến

ở phổi tại Bệnh viện K trong nghiên cứu này có tỷ lệ methyl hóa là 29,5%. Một số

nghiên cứu trước đây đã chỉ ra methyl hóa RASSF1A có tiên lượng xấu đối với bệnh

nhân ung thư phổi. Những bệnh nhân mang gen RASSF1A bị methyl hóa có thời

gian sống thêm cũng như thời gian sống không bệnh ngắn hơn so với bệnh nhân

không methyl hóa RASSF1A [21, 74]. de Fraipont F. và cs. (2012) nghiên cứu trên

202 bệnh nhân thấy có 44 (21,8%) trường hợp có methyl hóa RASSF1A [21]. Sau đó

tác giả tiếp tục theo dõi thời gian sống thêm và thời gian sống thêm không bệnh của

hai nhóm bệnh nhân sau khi điều trị bằng hóa chất. Kết quả chỉ ra thời gian sống

thêm không có bệnh cũng như thời gian sống thêm toàn bộ của nhóm mehthyl hóa

RASSF1A thấp hơn so với nhóm không methyl hóa (16,7 so với 61,2 tháng và 32,9

so với 84 tháng). Như vậy, việc xác định tình trạng methyl hóa RASSF1A được xem

như một trong những yếu tố tiên lượng cho bệnh nhân ung thư phổi.

Methyl hóa RASSF1A có liên quan đến tiền sử hút thuốc của bệnh nhân, mối

tương quan giữa methyl hóa RASSF1A và tiền sử hút thuốc cũng đã được khẳng

định trong một số nghiên trước đây. Năm 2011, Yanagawa N. và cs. phân tích 62

88

bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi, kết quả cho thấy tỷ lệ methyl hóa

RASSF1A ở nhóm không hút thuốc là 34,6% trong khi tỷ lệ này ở nhóm hút thuốc là

61,9% [153]. Nghiên cứu của Lee S.M. và cs. (2011) cũng cho kết quả tương tự

[74]. Kết quả thu được trong nghiên cứu của chúng tôi về sự tương quan giữa

methyl hóa RASSF1A và tiền sự hút thuốc của bệnh nhân hoàn toàn tương đồng với

những công bố trước đây. Cụ thể, tỷ lệ methyl RASSF1A ở những bệnh nhân hút

thuốc và không hút thuốc trong nghiên cứu lần lượt là 36,7 và 20,0% với p<0,05

(Bảng 3.11). Vì vậy, hút thuốc lá có thể là nguyên nhân gây nên sự methyl hóa

RASSF1A ở những bệnh nhân ung thư phổi. Bên cạnh sự phát sinh đột biến EGFR,

methyl hóa RASSF1A có thể là một cơ chế quan trọng trong quá trình hình thành và

phát triển của ung thư phổi.

Trước đó, RASSF1A còn được chứng minh có khả năng ức chế sự xâm lấn

và di căn của những dòng tế bào ung thư phổi thông qua sự ức chế protein YAP

(Yes-associated protein) [26]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, tình trạng methyl

hóa RASSF1A tại những khối u di căn cao hơn tại những khối u nguyên phát. Điều

đó chứng tỏ, methyl hóa RASSF1A không chỉ tham gia vào quá trình hình thành

khối u mà còn có vai trò quan trọng trong sự di căn của khối u trong ung thư phổi.

Vì vậy, việc xác định tình trạng methyl hóa RASSF1A đang dần trở nên cần thiết

cho bệnh nhân, góp phần hỗ trợ chẩn đoán cũng như là tiên lượng bệnh.

4.3. Tƣơng quan giữa những đặc điểm phân tử gen EGFR với sự methyl hóa

BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A trong ung thƣ biểu mô tuyến của phổi

4.3.1. Đột biến EGFR với sự methyl hóa vùng promoter các gen ức chế khối u

Đột biến gen và methyl DNA hóa là hai con đường chính dẫn đến sự hình

thành và phát triển của ung thư. Sự tác động qua lại của hai con đường này đã được

phát hiện trong nhiều loại ung thư [15, 136]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến

hành phân tích tác động qua lại giữa đột biến gen EGFR với sự methyl hóa quá mức

của một số gen ức chế khối u điển hình trong ung thư phổi. Kết quả cho thấy đột

biến EGFR và methyl hóa các gen ức chế khối u có xu hướng xảy ra ngược chiều và

loại trừ lẫn nhau. Cụ thể, đột biến EGFR có tương quan ngược với sự methyl hóa

của BRCA1, MGMT và RASSF1A (Bảng 3.15). Mối tương quan ngược giữa đột biến

EGFR với methyl hóa RASSF1A đã được nhắc đến trong một số nghiên cứu trước

89

đây. Yanagawa N. và cs. (2011), Hoque M.O. và cs. (2010) đã chỉ ra mối liên hệ

ngược giữa methyl hóa RASSF1A và tiền sử hút thuốc của bệnh nhân với đột biến

EGFR [56, 153]. Nghiên cứu này một lần nữa khẳng định lại sự loại trừ lẫn nhau

của hai hiện tượng này. Đồng thời với kết quả phân tích ở trên, đột biến EGFR xảy

ra ở những người không hút thuốc lá, ngược lại methyl hóa RASSF1A thường gặp ở

những người hút thuốc. Kết quả thu được đưa ra giả thuyết về sự hình thành ung thư

biểu mô tuyến ở phổi có thể xảy ra ra theo hai con đường khác nhau. Ở những

người không hút thuốc, ung thư biểu mô tuyến có thể được hình thành do đột biến

gen EGFR. Đối với những người hút thuốc, ung thư được hình thành thông qua con

đường methyl hóa RASSF1A.

Bên cạnh đó, trong nghiên cứu chúng tôi cũng đã chỉ ra những mối tương

quan ngược giữa đột biến EGFR với methyl hóa BRCA1 và MGMT. BRCA1 có vai

trò quan trọng trong sự hình thành và tiến triển của ung thư vú, methyl hóa MGMT

được xem như là một dấu ấn quan trọng trong chẩn đoán và điều trị u não [20,101].

Nghiên cứu methyl hóa BRCA1 và MGMT ít được chú ý trong ung thư phổi. Tuy

nhiên, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy methyl hóa BRCA1 và methyl hóa

MGMT xảy ra phổ biến trong ung thư phổi, chủ yếu ở những bệnh nhân không

mang đột biến gen EGFR. Như vậy, không chỉ có methyl hóa RASSF1A được xem

một trong những con đường hình thành ung thư biểu mô tuyến của phổi, sự methyl

hóa BRCA1 và MGMT cũng có thể là một bước quan trọng trong quá trình hình

thành và phát triển khối u ở trong trường hợp không mang đột biến gen EGFR. Giả

thuyết này được tiếp tục củng cố bằng kết quả phân tích mối tương quan methyl hóa

đồng thời của 4 gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A với đột biến EGFR.

Tương quan ngược của đột biến EGFR với methyl hóa ngẫu nhiên của 1 gen riêng

lẻ, của đồng thời 2, 3 hay 4 gen cho thấy cái nhìn rõ ràng hơn về những biến đổi di

truyền và di truyền ngoại gen trong ung thư biểu mô tuyến của phổi; đồng thời chỉ

ra hai con đường dẫn đến sự hình thành và phát triển của ung thư đó là con đường

thông qua đột biến gen và con đường thông qua sự methyl hóa các gen ức chế khối

u. Như vậy, có thể nhận thấy vai trò quan trọng của hiện tượng methyl hóa các gen

ức chế khối u trong ung thư biểu mô tuyến của phổi và có thể xem methyl hóa là

một đích cho điều trị ung thư cần được nghiên cứu và thử nghiệm.

90

4.3.2. Biểu hiện EGFR với sự methyl hóa vùng promoter các gen ức chế khối u

Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy biểu hiện EGFR tăng lên ở những

trường hợp bệnh nhân không mang gen BRCA1 bị methyl hóa. Cụ thể, 18/41

(43,9%) trường hợp có kết quả IHC EGFR dương tính và có gen BRCA1 methyl,

trong khi đó 64/98 (62,7%) trường hợp bệnh nhân có IHC EGFR dương tính và gen

BRCA1 không methyl. Điều đó cho thấy mức độ biểu hiện thấp của protein EGFR

có tương quan với methyl hóa gen BRCA1, với p=0,019 (Bảng 3.16). Tuy cơ chế về

sự tương quan giữa methyl hóa BRCA1 và biểu hiện protein EGFR vẫn chưa được

làm sáng tỏ nhưng có thể thấy methyl hóa BRCA1 tham gia ức chế biểu hiện EGFR.

Mặc dù vậy, không có nhiều báo cáo trên ung thư phổi được tiến hành nhằm làm rõ

cơ chế của hiện tượng này. Sự tương quan giữa methyl hóa BRCA1 và biểu hiện

EGFR đã được nghiên cứu ở ung thư buồng trứng, nhưng cho kết quả ngược lại. Li

D. và cs. (2013) cho rằng methyl hóa BRCA1 có thể thúc đẩy biểu hiện EGFR ở

những dòng tế bào ung thư buồng trứng [76]. Điều này có thể góp phần lý giải vai

trò điều khiển các quá trình trong tế bào của các gen khác nhau ở các loại ung thư

khác nhau.

Methyl hóa ngẫu nhiên của 1 trong 4 gen cũng cho thấy sự tương quan

nghịch giữa methyl hóa các gen ức chế khối u và biểu hiện EGFR. Khi phân tích

mối tương quan này cùng với giai đoạn bệnh và tình trạng khối u sẽ thấy rõ hơn ảnh

hưởng của methyl hóa gen ức chế khối u trong nghiên cứu. Các nghiên cứu của Gao

W. và cs. (2016), Wang Y.C. và cs. (2003) và Lee S.M. và cs. (2011) cho thấy mức

độ methyl hóa BRCA1, MLH1 và RASSF1A cao hơn ở những bệnh nhân giai đoạn

muộn [40, 74, 148], trong khi đó Li J. và cs. (2015) chỉ ra sự giảm biểu hiện EGFR

theo tiến triển của bệnh [77]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy tại khối u

di căn có sự methyl hóa MGMT, và RASSF1A cao hơn so với những khối u nguyên

phát (Bảng 3.7, 3.8, 3.9 và 3.10); đồng thời biểu hiện quá mức protein EGFR (3+)

tại khối di căn cao hơn so với khối u nguyên phát (Bảng 3.6). Từ đó có thể lý giải

mức độ ác tính của khối u di căn được bắt nguồn từ hai nguyên nhân chính: (1) Ức

chế methyl hóa các gen tham gia vào quá trình ức chế khối u, dẫn đến thiết hụt các

protein có chức năng kìm hãm sự hình thành và phát triển ung thư; (2) Biểu hiện

quá mức của protein EGFR có vai trò quan trọng trong thúc đẩy phát triển và phân

chia tế bào ung thư.

91

4.3.3. Sự methyl hóa đồng thời của một số gen liên quan đến ung thư biểu mô

tuyến của phổi

Methyl hóa EGFR dẫn đến hạn chế biểu hiện protein do gen này mã hóa

đồng thời có thể được xem là một cơ chế tự vệ của cơ thể nhằm hạn chế sự phát

triển của các tế bào ung thư [11, 80]. Trong khi đó, methyl hóa các gen ức chế khối

u lại thúc đẩy quá trình phát triển của ung thư. Tuy nhiên, kết quả phân tích mối

tương quan cho thấy methyl hóa EGFR xảy ra độc lập và không chịu sự chi phối bởi

methyl hóa của 4 gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A. Tình

trạng methyl hóa các gen ức chế khối u trong các công bố trước đây trên ung thư

phổi dẫn đến tiên lượng xấu cho bệnh nhân và có tương quan ngược với đột biến

EGFR, nhưng hoàn toàn độc lập với methyl hóa EGFR [40, 123, 153]. Thêm vào

đó, quá trình chết theo chương trình của những dòng tế bào ung thư phổi mang gen

EGFR bị methyl hóa tăng lên khi được nuôi cấy trong môi trường có chứa chất loại

bỏ nhóm methyl [79]. Từ đó có thể giả thuyết methyl hóa các gen ức chế khối u

BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A và methyl hóa EGFR là hai quá trình độc lập

trong ung thư biểu mô tuyến của phổi. Methyl hóa các gen ức chế khối u góp phần

tăng cường sự phát triển và dẫn đến tiên lượng xấu cho bệnh nhân. Ngược lại,

methyl hóa EGFR có vai trò hạn chế sự phát triển của khối u trong ung thư phổi.

Những biến đổi di truyền và di truyền ngoại gen của các gen ức chế khối u

và gen gây ung thư có thể là cơ chế quan trọng trong quá trình hình thành và tiến

triển nhiều loại ung thư trong đó có ung thư phổi. Sự hiểu biết về mức độ methyl

hóa bất thường tại khối u góp phần làm sáng tỏ các sự kiện xảy ra trong ung thư

đồng thời đưa ra những định hướng điều trị hiệu quả. Trong nghiên cứu này, chúng

tôi phân tích hiện tượng methyl hóa trên 4 gen ức chế khối u bao gồm BRCA1,

MGMT, MLH1 và RASSF1A. Trong đó, BRCA1, MGMT, MLH1 tham gia vào quá

trình sửa chữa những sai hỏng của DNA và gen RASSF1A tham gia vào điều khiển

quá trình chết theo chương trình của tế bào. BRCA1 tham gia vào quá trình sữa

chữa những sai hỏng lớn của DNA bằng việc sử dụng trình tự tương đồng trong cặp

nhiễm sắc thể [113]. MGMT tham gia vào quá trình sửa chữa những sai hỏng trong

trình tự DNA bằng cách loại bỏ các gốc methyl đặc hiệu và các nhóm alkyl khác tại

vị trí O6 của Guanine [108]. Trong khi đó, MLH1 là thành phần quan trọng trong

92

phức hợp sửa chữa những trường hợp bắt cặp sai trong quá trình sao chép DNA

[58]. RASSF1A là một thành viên trong họ gen RAS có liên quan đến các con đường

truyền tín hiệu quan trọng của tế bào như PI3K/AKT/m-TOR, Ras/RAF/MEK/ERK

và con đường Hippo [44]. Các tín hiệu thông qua RASSF1A có thể tạo ra những

đáp ứng khác nhau của tế bào như sự phân chia, biệt hóa và chết theo chương trình

của tế bào. Ngoài ra, RASSF1A còn có chức năng như một phân tử ức chế khối u

thông qua việc kiểm soát chu kỳ tế bào ở giai đoạn G1-S [132]. Có nhiều báo cáo

nghiên cứu sự methyl đồng thời nhiều gen trong ung thư phổi [132, 153]. Tuy

nhiên, lại có rất ít nghiên cứu nói về mối tương quan về tình trạng methyl hóa các

gen ức chế khối u. Kết quả phân tích trong nghiên cứu này cho thấy sự tương quan

mật thiết giữa tình trạng methyl hóa MLH1 và RASSF1A, với tỷ lệ methyl hóa đồng

thời của hai gen lần lượt là 60,7 và 41,5% (Bảng 3.17). Trong nghiên cứu của Seng

T.J và cs. (2008), tác giả cũng đã chỉ ra mối tương quan thuận giữa methyl hóa

RASSF1A và methyl hóa MLH1 và cho thấy bệnh nhân có methyl hóa riêng lẻ hoặc

đồng thời của RASSF1A, MLH1 có thời gian sống sót ngắn hơn so với những bệnh

nhân không methyl hóa [123]. Điều đó cho thấy các gen ức chế khối u không hoạt

động độc lập mà có sự liên quan đến những gen ức chế khối u khác.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện thêm sự tương quan giữa methyl

hóa RASSF1A và methyl hóa BRCA1 với tỷ lệ methyl đồng thời của hai gen là

51,2% (Bảng 3.17). Theo Gao W. và cs. (2016), methyl hóa RASSF1A và methyl

hóa BRCA1 đều có tiên lượng xấu hơn so với những trường hợp không methyl hóa.

Tuy nhiên, tác giả lại không phân tích mối tương quan giữa về tình trạng methyl

hóa của RASSF1A và BRCA1 [40]. Từ những kết quả nghiên cứu trên có thể nhận

thấy tác động cộng gộp của methyl hóa các gen ức chế khối u. Methyl hóa các gen

ức chế khối u càng nhiều, mức độ ác tính của khối u và tiên lượng xấu cho bệnh

nhân càng tăng lên.

Từ những kết quả thu được trong luận án cho thấy những biến đổi phân tử

của gen EGFR bao gồm đột biến, biểu hiện và methyl hóa vùng promoter cùng với

sự methyl hóa các gen ức chế khối u có tác động qua lại lẫn nhau trong sự hình

thành và phát triển của ung thư phổi dạng biểu mô tuyến. Trong đó, (1) Đột biến

gen EGFR có xu hướng loại trừ với hiện tượng methyl hóa các gen ức chế khối u

93

trong nghiên cứu; (2) Biểu hiện quá mức EGFR (3+) và methyl hóa quá mức các

gen ức chế khôi u có xu hướng tăng lên cùng với tiến triển ung thư; (3) Methyl hóa

EGFR xảy ra một các độc lâp với methyl hóa các gen ức chế khối u trong nghiên

cứu; (4) Sự methyl hóa các gen ức chế khối u có xu hướng xảy ra đồng thời trong

ung thư biểu mô tuyến của phổi.

94

KẾT LUẬN

Từ những kết quả nghiên cứu trong luận án chúng tôi xin đưa ra một số

kết luận như sau:

1. Tỷ lệ đột biến EGFR và biểu hiện quá mức protein EGFR trong 139

bệnh nhân nghiên cứu là 35,3 và 59,0%. Tần suất đột biến EGFR cao hơn ở những

người trẻ tuổi, phụ nữ và không hút thuốc lá. Ở bệnh nhân nam giới có sự biểu hiện

quá mức EGFR cao hơn bệnh nhân nữ giới.

2. Tỷ lệ methyl hóa các gen liên quan đến ung thư phổi bao gồm: EGFR,

BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A lần lượt là: 23,7; 29,5; 33,1; 20,1 và 29,5%.

Methyl hóa MGMT và RASSF1A có tỷ lệ cao hơn ở khối u di căn; Tình trạng methyl

hóa RASSF1A cao hơn ở những người không hút thuốc và xảy ra đồng thời với sự

methyl hóa BRCA1 và MLH1. Đột biến gen EGFR có tương quan ngược với sự

methyl hóa của BRCA1, MGMT và RASSF1A. Biểu hiện protein EGFR tương quan

ngược với methyl hóa BRCA1.

95

KIẾN NGHỊ

Nhóm nghiên cứu cũng xin đưa ra một số kiến nghị để nghiên cứu được

hoàn thiện trong thời gian tới:

1. Sự methyl hóa các gen ức chế khối u xảy ra khá phổ biến ở bệnh nhân

ung thư phổi dạng biểu mô tuyến. Nghiên cứu và thiết lập hệ panel methyl hóa các

gen liên quan ung thư dạng biểu mô tuyến ở phổi, có vai trò đối với tiên lượng cũng

như sự đáp ứng với các phác đồ điều trị ung thư.

2. Tiến hành xác định thêm một số đột biến trong con đường tuyền tín

hiệu thông qua protein EGFR để thấy rõ mối tương quan giữa đột biến gen và

methyl hóa DNA xảy ra bên trong tế bào ung thư biểu mô tuyến của phổi.

96

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ

1. Nguyễn Ngọc Quang, Vương Diệu Linh, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Phi Hùng

(2016), “Nghiên cứu tần suất và một số yếu tố liên quan đến đột biến gen EGFR

trên bệnh nhân Carcinoma tuyến của phổi tại Bệnh viện K”, Tạp chí Ung thư học

Việt Nam, số 2, 258-266. ISSN: 1859 - 400.

2. Nguyễn Ngọc Quang, Vương Diệu Linh, Tạ Văn Tờ, Nguyễn Trung Nam,

Nguyễn Phi Hùng, Chu Hoàng Hà (2018), “Nghiên cứu hiện tượng methyl hóa

vùng promoter của ba gen sửa chữa DNA MLH1, MGMT và BRCA1 trong ung thư

biểu mô tuyến của phổi”, Báo cao khoa học hội nghị khoa học công nghệ sinh học

toàn quốc 2018.

3. Quang Ngoc Nguyen, Linh Dieu Vuong, Van-Long Truong, To Van Ta, Nam

Trung Nguyen, Hung Phi Nguyen, Ha Hoang Chu (2019), “Genetic and epigenetic

alterations of the EGFR and mutually independentassociation with BRCA1, MGMT,

and RASSF1A methylations in Vietnamese lung adenocarcinomas”, Pathology -

Research and Practice, 215, 885–892.

97

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. C. Alewine, R. Hassan, I. Pastan, Advances in anticancer immunotoxin therapy,

Oncologist, 2015, 20, 176-185.

2. K.S. Amin, P.P. Banerjee, The cellular functions of RASSF1A and its inactivation

in prostate cancer, J Carcinog, 2012, 11, 1477-3163.

3. M.B. Amin, S. Edge, F. Greene, D.R. Byrd, R.K. Brookland, et al. (2017) AJCC

Cancer Staging Manual. Springer International Publishing.

4. A. Antonicelli, S. Cafarotti, A. Indini, A. Galli, A. Russo, et al., EGFR-Targeted

Therapy for Non-Small Cell Lung Cancer: Focus on EGFR Oncogenic

Mutation, Int J Med Sci, 2013, 10, 320–330.

5. M. Arya, I.S. Shergill, M. Williamson, L. Gommersall, N. Arya, et al., Basic

principles of realtime quantitative PCR, Expert Rev Mol Diagn 2005, 5, 209-

219.

6. J.A. Bates, E.J. Taylor, Scorpion ARMS primers for SNP real-time PCR detection

and quantification of Pyrenophora teres, Mol Plant Pathol, 2001, 2, 275-280.

7. T.A. Baudino, Targeted Cancer Therapy: The Next Generation of Cancer

Treatment, Curr Drug Discov Technol, 2015, 12, 3-20.

8. D.W. Bell, T.J. Lynch, S.M. Haserlat, P.L. Harris, R.A. Okimoto, et al.,

Epidermal growth factor receptor mutations and gene amplification in non-

small-cell lung cancer: molecular analysis of the IDEAL/INTACT gefitinib

trials, J Clin Oncol, 2005, 23, 8081-8092.

9. A. Bertotti, E. Papp, S. Jones, V. Adleff, V. Anagnostou, et al., The genomic

landscape of response to EGFR blockade in colorectal cancer, Nature, 2015,

526, 263–267.

10. I.L. Candiloro, T. Mikeska, A. Dobrovic, Closed-tube PCR methods for locus-

specific DNA methylation analysis, Methods Mol Biol, 2011, 791, 55-71.

11. F. Cappuzzo, F.R. Hirsch, G.L. Ceresoli, A. Sidoni, C. Doglioni, et al.,

Epidermal Growth Factor Receptor Gene and Protein and Gefitinib

Sensitivity in Non–Small-Cell Lung Cancer, Journal of the National Cancer

Institute, 2005, 97, 643–655.

12. G. Carpenter, Receptors for epidermal growth factor and other polypeptide

mitogens, Ann Rev Biochem 1987, 56, 881–914.

13. B.A. Chan, B.G. Hughes, Targeted therapy for non-small cell lung cancer:

current standards and the promise of the future, Transl Lung Cancer Res

2015, 4, 36–54.

14. C. Chen, H. Hua, C. Han, Y. Cheng, Y. Cheng, et al., Prognosis value of

MGMT promoter methylation for patients with lung cancer: a meta-analysis,

International journal of clinical and experimental pathology, 2015, 8, 11560-

11564.

15. Y. Chen, V. Gotea, G. Margolin, L. Elnitski, Significant associations between

driver gene mutations and DNA methylation alterations across many cancer

types, PLoS computational biology, 2017, 13, e1005840-e1005840.

98

16. K.Y. Chung, J. Shia, N.E. Kemeny, M. Shah, G.K. Schwartz, et al., Cetuximab

shows activity in colorectal cancer patients with tumors that do not express

the epidermal growth factor receptor by immunohistochemistry, J Clin

Oncol, 2005, 23, 1803-1810.

17. F. Ciardiello, G. Tortora, S.F. Magrassi, A. Lanzara, EGFR Antagonists in

Cancer Treatment, N Engl J Med, 2008, 358, 1160–1174.

18. J. Costello, C. Plass, Methylation matters, J Med Genet, 2001, 38, 285-303.

19. Phạm Nguyên Cường, Lê Đình Roanh, Nguyễn Văn Hưng, Trần Thị Ngọc

Phương, Nghiên cứu sự bộc lộ các dấu ấn miễn dịch p63, CK5/6, Ttf-1 và

Napsin-A trong chẩn đoán ung thư biểu mô phổi không tế bào nhỏ, Tạp chí

Y dược học, 2016, 173-178.

20. Q.G. D’Alessandris, N. Montano, L.M. Larocca, G. Maira, R. Palliniand,

Prognostic Impact of MGMT Promoter Methylation in Glioblastoma -

ASystematic Review, J Cancer Sci Ther 2014, 6, 136-141

21. F. de Fraipont, G. Levallet, C. Creveuil, E. Bergot, M. Beau-Faller, et al., An

apoptosis methylation prognostic signature for early lung cancer in the

IFCT-0002 trial, Clin Cancer Res, 2012, 18, 2976-2986.

22. C.C. Dibble, L.C. Cantley, Regulation of mTORC1 by PI3K signaling, Trends

Cell Biol, 2015, 25, 545–555.

23. H. Do, N.C. Wong, C. Murone, T. John, B. Solomon, et al., A critical re-

assessment of DNA repair gene promoter methylation in non-small cell lung

carcinoma, Sci Rep, 2014, 26, 4186.

24. E. Domingo, S.J. Schwartz (2005) MLH1 (human mutL homolog 1) Atlas

Genet Cytogenet Oncol Haematol. pp. 120-122.

25. H. Donninger, M.D. Vos, G.J. Clark, The RASSF1A tumor suppressor, Journal

of Cell Science, 2007, 120, 3163.

26. F. Dubois, M. Keller, O. Calvayrac, F. Soncin, L. Hoa, et al., RASSF1A

Suppresses the Invasion and Metastatic Potential of Human Non-Small Cell

Lung Cancer Cells by Inhibiting YAP Activation through the GEF-H1/RhoB

Pathway, Cancer Res 2016, 76, 1627-1640.

27. T.Q.M. Duong, H.T. Trinh, Methylation analysis of the Adenomatous polyposis

coli (APC) gene promoter in breast cancer patients, VNU, Journal of

Science, Natural Sciences and Technology 01, 2011.

28. H. Erasimus, M. Gobin, S. Niclou, E. Van Dyck, DNA repair mechanisms and

their clinical impact in glioblastoma, Mutat Res Rev Mutat Res, 2016, 769,

19-35.

29. M. Esteller, P.G. Corn, S.B. Baylin, J.G. Herman, A gene hypermethylation

profile of human cancer, Cancer Research, 2001, 61, 3225-3229.

30. M. Esteller, J.G. Herman, Generating mutations but providing chemosensitivity:

the role of O6-methylguanine DNA methyltransferase in human cancer,

Oncogene, 2004, 23, 1-8.

99

31. M. Esteller, J.M. Silva, G. Dominguez, F. Bonilla, X. Matias-Guiu, et al.,

Promoter hypermethylation and BRCA1 inactivation in sporadic breast and

ovarian tumors, J Natl Cancer Inst, 2000, 92, 564-569.

32. A.P. Feinberg, Phenotypic plasticity and the epigenetics of human disease,

Nature, 2007, 447, 433-440.

33. A.P. Feinberg, B. Vogelstein, Hypomethylation distinguishes genes of some

human cancers from their normal counterparts, Nature, 1983, 301, 89.

34. Q. Feng, S.E. Hawes, J.E. Stern, L. Wiens, H. Lu, et al., DNA methylation in

tumor and matched normal tissues from non-small cell lung cancer patients,

Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2008, 17, 645-654.

35. Forman D., F. Bray (2013) GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and

Mortality Worldwide. Lyon, France: International Agency for Research on

Cancer.

36. F. Forozan, R. Karhu, J. Kononen, A. Kallioniemi, O.P. Kallioniemi, Genome

screening by comparative genomic hybridization, Trends Genet 1997, 13,

405-409.

37. L.T. Franca, E. Carrilho, T.B. Kist, A review of DNA sequencing techniques, Q

Rev Biophys, 2002, 35, 169-200.

38. M. Frommer, L.E. McDonald, D.S. Millar, C.M. Collis, F. Watt, et al., A

genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-

methylcytosine residues in individual DNA strands, Proc Natl Acad Sci U S

A, 1992, 89, 1827-1831.

39. S. Gabor, H. Renner, H. Popper, U. Anegg, O. Sankin, et al., Invasion of blood

vessels as significant prognostic factor in radically resected T1-3N0M0 non-

small-cell lung cancer, Eur J Cardiothorac Surg, 2004, 25, 439-442.

40. W. Gao, Z. Zhou, Y. Liu, D. Liu, Q. Feng, et al., Prognostic significance of

BRCA1 and RASSF1A promoter hypermethylation in non-small cell lung

cancer patients, Int J Clin Exp Pathol, 2016, 9, 8544-8549.

41. A.F. Gazdar, J.D. Minna, Deregulated EGFR signaling during lung cancer

progression: mutations, amplicons, and autocrine loops, Cancer Prev Res,

2008, 1, 156-160.

42. D.E. Gerber, Targeted therapies: a new generation of cancer treatments, Am

Fam Physician 2008, 77, 311-319.

43. V. Grandjean, Inheritance of an Epigenetic Mark: The CpG DNA

Methyltransferase 1 Is Required for De Novo Establishment of a Complex

Pattern of Non-CpG Methylation, 2007, 2.

44. A.M. Grawenda, E. O'Neill, Clinical utility of RASSF1A methylation in human

malignancies, Br J Cancer 2015, 113, 372–381.

45. A. Gupta, A.K. Godwin, L. Vanderveer, A. Liu, Hypomethylation of the

Synuclein γ gene CpG island promoters its aberrant expression in breast

carcinoma and ovarian carcinoma, Cancer Research, 2003, 63, 664-673.

46. Lê Thu Hà (2017) Đánh giá hiệu quả thuốc erlotinib trong điều trị ung thư phổi

biểu mô tuyến giai đoạn muộn. Luận án tiến sĩ.

100

47. Nguyễn Minh Hà, Xác định đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi

không tế bào nhỏ, Y Học TP Hồ Chí Minh, 2013, 17, 34-37.

48. Nguyễn Minh Hà (2014) Xác định đột biến gen EGFR và gen KRAS quyết định

tính đáp ứng thuốc trong điều trị bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ. Luận

án tiến sĩ.

49. J. Haley, N. Whittle, P. Bennett, D. Kinchington, A. Ullrich, et al., The human

EGF receptor gene: structure of the 110 kb locus and identification of

sequences regulating its transcription, Oncogene Res 1987, 1, 375-396.

50. M. Hanner, F.F. Moebius, A. Flandorfer, H.G. Knaus, J. Striessnig, et al.,

Purification, molecular cloning, and expression of the mammalian sigma1-

binding site, Proceedings of the National Academy of Sciences, 1996, 93,

8072.

51. A. Harandi, A.S. Zaidi, A.M. Stocker, D.A. Laber, Clinical efficacy and toxicit

of anti-EGFR therapy in common cancers, J Oncol 2009, 1-15.

52. A. Harrison, A. Parle-McDermott, DNA methylation: a timeline of methods and

applications, Front Genet, 2011, 2.

53. K. Hata, M. Okano, H. Lei, E. Li, Dnmt3L cooperates with the Dnmt3 family of

de novo DNA methyltransferases to establish maternal imprints in mice,

Development, 2002, 129, 1983-1993.

54. H.G. Hernandez, M.Y. Tse, S.C. Pang, H. Arboleda, D.A. Forero, Optimizing

methodologies for PCR-based DNA methylation analysis, Biotechniques,

2013, 55, 181-197.

55. F.R. Hirsch, R.S. Herbst, C. Olsen, K. Chansky, J. Crowley, et al., Increased

EGFR gene copy number detected by fluorescent in situ hybridization

predicts outcome in non-small-cell lung cancer patients treated with

cetuximab and chemotherapy, J Clin Oncol, 2008, 26, 3351-3357.

56. M.O. Hoque, M. Brait, E. Rosenbaum, M.L. Poeta, P. Pal, et al., Genetic and

epigenetic analysis of erbB signaling pathway genes in lung cancer, J Thorac

Oncol, 2010, 5, 1887–1893.

57. L. Horn, C.M. Lovly, D.H. Johnson (2015) Harrison's Principles of Internal

Medicine: McGraw-Hill.

58. P. Hsieh, K. Yamane, DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer,

and ageing, Mech Ageing Dev 2008, 129, 391–407.

59. E. Izumchenko, X. Chang, M. Brait, E. Fertig, L.T. Kagohara, et al., Targeted

sequencing reveals clonal genetic changes in the progression of early lung

neoplasms and paired circulating DNA, Nat Commun, 2015, 6.

60. A. Jemal, F. Bray, M.M. Center, J. Ferlay, E. Ward, et al., Global cancer

statistics, CA Cancer J Clin, 2011, 61, 69-90.

61. P.A. Jones, S.B. Baylin, The fundamental role of epigenetic events in cancer,

Nat Rev Genet, 2002, 3, 415-428.

62. P.A. Jones, J.J. Issa, S. Baylin, Targeting the cancer epigenome for therapy,

Nature Reviews Genetics, 2016, 17, 630–641.

101

63. P. Jothikumar, V. Hill, J. Narayanan, Design of FRET-TaqMan probes for

multiplex real-time PCR using an internal positive control, Biotechniques,

2009, 46, 519-524.

64. V.K. Kakavas, P. Plageras, T.A. Vlachos, A. Papaioannou, V.A. Noulas, PCR

SSCP:A method for the molecular analysis of genetic diseases, Mol

Biotechnol, 2008, 38, 155-163.

65. S.A. Kenfield, E.K. Wei, M.J. Stampfer, B.A. Rosner, G.A. Colditz,

Comparison of aspects of smoking among the four histological types of lung

cancer, Tob Control, 2008, 17, 198-204.

66. R.D. Kennedy, J.E. Quinn, P.B. Mullan, P.G. Johnston, D.P. Harkin, The role of

BRCA1 in the cellular response to chemotherapy, J Natl Cancer Inst, 2004,

96, 1659-1668.

67. Mai Trọng Khoa, Trần Đình Hà, Phạm Cẩm Phương, Nguyễn Tiến Lung,

Nguyễn Tuấn Anh, Nguyễn Thuận Lợi, Nguyễn Văn Kình, Nguyễn Quốc

Tuấn, Nguyễn Huy Bình, Ngô Thị Thu Hiền, Xác định đột biến gen EGFR

trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại bệnh viện Bạch Mai, Tạp

chí ung thư học Việt Nam, 2016, 2, 235-242.

68. E.S. Kim, V. Hirsh, T. Mok, M.A. Socinski, R. Gervais, et al., Gefitinib versus

docetaxel in previously treated non-small-cell lung cancer (INTEREST): a

randomised phase III trial, Lancet, 2008, 372, 1809-1818.

69. Y.T. Kim, S.J. Park, S.H. Lee, H.J. Kang, S. Hahn, et al., Prognostic

implication of aberrant promoter hypermethylation of CpG islands in

adenocarcinoma of the lung, The Journal of Thoracic and Cardiovascular

Surgery, 2005, 130, 1371-1378.

70. M.G. Kris, R.B. Natale, R.S. Herbst, T.J. Lynch, D. Prager, et al., Efficacy of

gefitinib, an inhibitor of the epidermal growth factor receptor tyrosine

kinase, in symptomatic patients with non-small cell lung cancer: a

randomized trial, Jama, 2003, 290, 2149-2158.

71. L.S. Kristensen, H.M. Nielsen, L.L. Hansen, Epigenetics and cancer treatment,

Eur J Pharmacol, 2009, 625, 131-142.

72. V. Kumar, A.K. Abbas, J.C. Aster (2013) Robbins Basic Pathology: Elsevier

Saunders.

73. M.N. Lee, R.C. Tseng, H.S. Hsu, J.Y. Chen, C. Tzao, et al., Epigenetic

inactivation of the chromosomal stability control genes BRCA1, BRCA2, and

XRCC5 in non-small cell lung cancer, Clin Cancer Res, 2007, 13, 832-838.

74. S.M. Lee, W.K. Lee, D.S. Kim, J.Y. Park, Quantitative promoter

hypermethylation analysis of RASSF1A in lung cancer: comparison with

methylation-specific PCR technique and clinical significance, Mol Med Rep,

2012, 5, 239-244.

75. G. Leone, L. Teofili, M.T. Voso, M. Lubbert, DNA methylation and

demethylating drugs in myelodysplastic syndromes and secondary leukemias,

Haematologica, 2002, 87, 1324-1341.

102

76. D. Li, F. Bi, J. Cao, C. Cao, C. Li, et al., Effect of BRCA1 on epidermal growth

factor receptor in ovarian cancer, Journal of experimental & clinical cancer

research : CR, 2013, 32, 102-102.

77. J. Li, X.F. Jia, J. Liu, J.J. Liu, H.B. Zhao, Relationship of EGFR DNA

methylation with the severity of non-small cell lung cancer, Genet Mol Res,

2015, 14, 11915-11923.

78. X. Li, Y. Wang, Z. Zhang, X. Yao, J. Ge, et al., Correlation of MLH1 and

MGMT methylation levels between peripheral blood leukocytes and

colorectal tissue DNA samples in colorectal cancer patients, Oncol Lett,

2013, 6, 1370-1376.

79. X. Li, J. Wu, H. Cao, R. Ma, J. Wu, et al., Blockade of DNA methylation

enhances the therapeutic effect of gefitinib in non-small cell lung cancer

cells, Oncology Reports, 2013, 29, 1975-1982.

80. Z. Liang, J. Zhang, X. Zeng, J. Gao, S. Wu, et al., Relationship between EGFR

expression, copy number and mutation in lung adenocarcinomas, BMC

Cancer, 2010, 10, 1471-2407.

81. Vương Diệu Linh, Nguyễn Phi Hùng, Tạ Văn Tờ, Nguyễn Thanh Hòa, Ngô Thị

Hà, Võ Thị Thương Lan, Nghiên cứu hiện tượng methyl hóa trên gen BRCA1

ở bệnh nhân ung thư vú và ung thư buồng trứng tại bệnh viện K, Tạp chí ung

thư học Việt Nam, 2011, 3, 476-481.

82. L. Liu, J.H. Yoon, R. Dammann, G.P. Pfeifer, Frequent hypermethylation of the

RASSF1A gene in prostate cancer, Oncogene, 2002, 21, 6835-6840.

83. Y. Liu, Q. Lan, J.M. Siegfried, J.D. Luketich, P. Keohavong, Aberrant promoter

methylation of p16 and MGMT genes in lung tumors from smoking and

never-smoking lung cancer patients, Neoplasia, 2006, 8, 46-51.

84. C. Lu, A. Onn, A.A. Vaporciyan, J.Y. Chang, B.S. Glisson, et al. (2010)

Chapter 78: Cancer of the Lung: Holland-Frei Cancer Medicine, People's

Medical Publishing House.

85. T.J. Lynch, D.W. Bell, R. Sordella, S. Gurubhagavatula, R.A. Okimoto, et al.,

Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying

responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib, N Engl J Med,

2004, 350, 2129-2139.

86. N. Mahdieh, B. Rabbani, An overview of mutation detection methods in genetic

disorders, Iran J Pediatr, 2013, 23, 375-388.

87. G. Malpeli, G. Innamorati, I. Decimo, M. Bencivenga, A. Nwabo Kamdje, et al.,

Methylation Dynamics of RASSF1A and Its Impact on Cancer, Cancers,

2019, 11, 959.

88. A. Marchetti, C. Martella, L. Felicioni, F. Barassi, S. Salvatore, et al., EGFR

mutations in non-small-cell lung cancer: analysis of a large series of cases

and development of a rapid and sensitive method for diagnostic screening

with potential implications on pharmacologic treatment, J Clin Oncol, 2005,

23, 857-865.

103

89. C.J. Marsit, M. Liu, H.H. Nelson, M. Posner, M. Suzuki, et al., Inactivation of

the Fanconi anemia/BRCA pathway in lung and oral cancers: implications

for treatment and survival, Oncogene, 2004, 23, 1000-1004.

90. S.A. Martin, C.J. Lord, A. Ashworth, Therapeutic targeting of the DNA

mismatch repair pathway, Clin Cancer Res, 2010, 16, 5107-5113.

91. I. Meiers, J.H. Shanks, D.G. Bostwick, Glutathione S-transferase pi (GSTP1)

hypermethylation in prostate cancer: review 2007, Pathology, 2007, 39, 299-

304.

92. A. Midha, S. Dearden, R. McCormack, EGFR mutation incidence in non-small-

cell lung cancer of adenocarcinoma histology: a systematic review and

global map by ethnicity (mutMapII), Am J Cancer Res, 2015, 5, 2892–2911.

93. Y. Miki, J. Swensen, D. Shattuck-Eidens, P.A. Futreal, K. Harshman, et al., A

strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene

BRCA1, Science, 1994, 266, 66.

94. H. Modjtahedi, S. Essapen, Epidermal growth factor receptor inhibitors in

cancer treatment: Advances, challenges and opportunities, Anticancer Drugs

2009, 20, 851–855.

95. A.J. Montero, C.M. Diaz-Montero, L. Mao, E.M. Youssef, M. Estecio, et al.,

Epigenetic inactivation of EGFR by CpG island hypermethylation in cancer,

Cancer Biol Ther, 2006, 5, 1494-1501.

96. D.K. Morrison, MAP Kinase Pathways. Cold Spring Harb, Perspect Biol, 2012,

4, a011254.

97. C.R. Mueller, C.D. Roskelley, Regulation of BRCA1 expression and its

relationship to sporadic breast cancer, Breast Cancer Res, 2003, 5, 45-52.

98. K.B. Mullis, F.A. Faloona, Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-

catalyzed chain reaction, Methods Enzymol, 1987, 155, 335-350.

99. M. Nakayama, C.J. Bennett, J.L. Hicks, J.I. Epstein, E.A. Platz, et al.,

Hypermethylation of the human glutathione S-transferase-pi gene (GSTP1)

CpG island is present in a subset of proliferative inflammatory atrophy

lesions but not in normal or hyperplastic epithelium of the prostate: a

detailed study using laser-capture microdissection, Am J Pathol, 2003, 163,

923-933.

100. S.L. Nay, T.R. O'coner. (2013) Chapter 5: Direct Repair in Mammalian Cells,

IntechOpen Limitted.

101. R.D. Nindrea, W.A. Harahap, T. Aryandono, L. Lazuardi, Association of

BRCA1 Promoter Methylation with Breast Cancer in Asia: A Meta- Analysis,

Asian Pac J Cancer Prev, 2018, 19, 885–889.

102. A.M. Noone, N. Howlader, M. Krapcho, D. Miller, A. Brest, et al., SEER

Cancer Statistics Review (CSR) 1975-2015, National Cancer Institute, 2017.

103. Y. Ohsaki, S. Tanno, Y. Fujita, E. Toyoshima, S. Fujiuchi, et al., Epidermal

growth factor receptor expression correlates with poor prognosis in non-

small cell lung cancer patients with p53 overexpression, Oncol Rep, 2000, 7,

603-607.

104

104. G.A. Otterson, S.N. Khleif, W. Chen, A.B. Coxon, F.J. Kaye, CDKN2 gene

silencing in lung cancer by DNA hypermethylation and kinetics of p16INK4

protein induction by 5-aza 2'deoxycytidine, Oncogene, 1995, 11, 1211-1216.

105. Pan-Chyr, S. Yuankal, J. Sankar, C. M., T.K. Mai, Molecular epidemiological

prospective study of EGFR mutations from Asian patients with advanced

lung adenocarcinoma, J Cin Oncol, 2012, 846-858.

106. Z.Y. Pan, Z.S. Jiang, H.Q. Ouyang, Study of the methylation patterns of the

EGFR gene promoter in non-small cell lung cancer, Genetics and Molecular

Research, 2015, 14, 9813-9820.

107. W. Pao, V.A. Miller, Epidermal growth factor receptor mutations, small-

molecule kinase inhibitors, and non-small-cell lung cancer: current

knowledge and future directions, J Clin Oncol, 2005, 23, 2556-2568.

108. A.E. Pegg, Q. Fang, N.A. Loktionova, Human variants of O6-alkylguanine-

DNA alkyltransferase, DNA Repair (Amst), 2007, 6, 1071–1078.

109. M.A. Pereira, L. Tao, Y. Liu, L. Li, V.E. Steele, et al., Modulation by

budesonide of DNA methylation and mRNA expression in mouse lung

tumors, Int J Cancer, 2007, 120, 1150-1153.

110. G.P. Pfeifer, M.F. Denissenko, M. Olivier, N. Tretyakova, S.S. Hecht, et al.,

Tobacco smoke carcinogens, DNA damage and p53 mutations in smoking-

associated cancers, Oncogene, 2002, 21, 7435-7451.

111. A.V. Probst, E. Dunleavy, G. Almouzni, Epigenetic inheritance during the cell

cycle, Nat Rev Mol Cell Biol, 2009, 10, 192-206.

112. D.J. Raz, B. He, R. Rosell, D.M. Jablons, Bronchioloalveolar carcinoma: a

review, Clinical Lung Cancer, 2006, 7, 313–322.

113. N. Reguart, A.F. Cardona, E. Carrasco, P. Gomez, M. Taron, et al., BRCA1: A

New Genomic Marker for Non–Small-Cell Lung Cancer, Clinical Lung

Cancer, 2008, 9, 331-339.

114. J.L. Reiter, D.W. Threadgill, G.D. Eley, K.E. Strunk, A.J. Danielsen, et al.,

Comparative genomic sequence analysis and isolation of human and mouse

alternative EGFR transcripts encoding truncated receptor isoforms,

Genomics, 2001, 71, 1-20.

115. I. Rhee, K.E. Bachman, B.H. Park, K.W. Jair, R.W. Yen, et al., DNMT1 and

DNMT3b cooperate to silence genes in human cancer cells, Nature, 2002,

416, 552-556.

116. J.C. Rice, H. Ozcelik, P. Maxeiner, I. Andrulis, B.W. Futscher, Methylation of

the BRCA1 promoter is associated with decreased BRCA1 mRNA levels in

clinical breast cancer specimens, Carcinogenesis, 2000, 21, 1761-1765.

117. K.D. Robertson, DNA methylation, methyltransferases, and cancer, Oncogene,

2001, 20, 3139-3155.

118. G. Rosti, G. Bevilacqua, P. Bidoli, L. Portalone, A. Santo, et al., Small cell

lung cancer, Ann Oncol, 2006, 17.

119. F. Salazar, M.A. Molina, M. Sanchez-Ronco, T. Moran, J.L. Ramirez, et al.,

First-line therapy and methylation status of CHFR in serum influence

105

outcome to chemotherapy versus EGFR tyrosine kinase inhibitors as second-

line therapy in stage IV non-small-cell lung cancer patients, Lung Cancer,

2011, 72, 84-91.

120. M. Scartozzi, I. Bearzi, A. Mandolesi, R. Giampieri, L. Faloppi, et al.,

Epidermal growth factor receptor (EGFR) gene promoter methylation and

cetuximab treatment in colorectal cancer patients, British Journal of Cancer,

2011, 104, 1786 – 1790.

121. S.C. Schuster, Next-generation sequencing transforms today's biology, Nat

Methods 2008, 5, 16-18.

122. G. Selvaggi, S. Novello, V. Torri, E. Leonardo, P. De Giuli, et al., Epidermal

growth factor receptor overexpression correlates with a poor prognosis in

completely resected non-small-cell lung cancer, Ann Oncol, 2004, 15, 28-32.

123. T.J. Seng, N. Currey, W.A. Cooper, C.S. Lee, C. Chan, et al., DLEC1 and

MLH1 promoter methylation are associated with poor prognosis in non-

small cell lung carcinoma,Br J Cancer, 2008, 99, 375-382.

124. C. Shao, W. Sun, M. Tan, C.A. Glazer, S. Bhan, et al., Integrated, genome-

wide screening for hypomethylated oncogenes in salivary gland adenoid

cystic carcinoma, Clinical Cancer Research, 2011, 17, 4320-4330.

125. B. Sharma, R. Preet Kaur, S. Raut, A. Munshi, BRCA1 mutation spectrum,

functions, and therapeutic strategies: The story so far, Curr Probl Cancer,

2018, 42, 189-207.

126. S. Sharma, F. Salehi, B.W. Scheithauer, F. Rotondo, L.V. Syro, et al., Role of

MGMT in tumor development, progression, diagnosis, treatment and

prognosis, Anticancer Res, 2009, 29, 3759-3768.

127. S.V. Sharma, D.W. Bell, J. Settleman, D.A. Haber, Epidermal growth factor

receptor mutations in lung cancer, Nat Rev Cancer, 2007, 7, 169-181.

128. A.J. Sharp, E. Stathaki, E. Migliavacca, M. Brahmachary, S.B. Montgomery,

et al., DNA methylation profiles of human active and inactive X

chromosomes, Genome Res, 2011, 21, 1592-1600.

129. L. Shen, R.A. Waterland, Methods of DNA methylation analysis, Curr Opin

Clin Nutr Metab Care, 2007, 10, 576-581.

130. Y. Shi, J. Li, S. Zhang, M. Wang, S. Yang, et al., Molecular Epidemiology of

EGFR Mutations in Asian Patients with Advanced Non-Small-Cell Lung

Cancer of Adenocarcinoma Histology – Mainland China Subset Analysis of

the PIONEER study, PLoS One, 2015, 10, e0143515.

131. T. Shukuya, T. Takahashi, R. Kaira, A. Ono, Y. Nakamura, et al., Efficacy of

gefitinib for non-adenocarcinoma non-small-cell lung cancer patients

harboring epidermal growth factor receptor mutations: A pooled analysis of

published reports, Cancer Sci, 2011, 102, 1032–1037.

132. M.S. Song, S.J. Song, N.G. Ayad, J.S. Chang, J.H. Lee, et al., The tumour

suppressor RASSF1A regulates mitosis by inhibiting the APC-Cdc20

complex, Nat Cell Biol 2004, 6, 129-137.

106

133. L.M. Starita, J.D. Parvin, The multiple nuclear functions of BRCA1:

transcription, ubiquitination and DNA repair, Curr Opin Cell Biol, 2003, 15,

345-350.

134. T. Strachan, A. and Read (2004) Human Molecular Genetics; edition, editor:

Garland Science.

135. J. Subramanian, R. Govindan, Lung cancer in never smokers: a review,

American Society of Clinical Oncology 2007, 25, 561–570.

136. H. Takeshima, T. Ushijima, Accumulation of genetic and epigenetic

alterations in normal cells and cancer risk, npj Precision Oncology, 2019, 3,

1-7.

137. M. Tang, J. Torres-Lanzas, F. Lopez-Rios, M. Esteller, M. Sanchez-Cespedes,

Wnt signaling promoter hypermethylation distinguishes lung primary

adenocarcinomas from colorectal metastasis to the lung, International

Journal of Cancer, 2006, 119, 2603-2606.

138. A.S. Tsao, G.V. Scagliotti, P.A. Bunn Jr., D.P. Carbone, G.W. Warren, et al.,

Scientific Advances in Lung Cancer Journal of Thoracic Oncology, 2015, 11,

613-638.

139. M.S. Tsao, A. Sakurada, J.C. Cutz, C.Q. Zhu, S. Kamel-Reid, et al., Erlotinib

in lung cancer - molecular and clinical predictors of outcome, N Engl J Med,

2005, 353, 133-144.

140. M. Uhlen, P. Oksvold, L. Fagerberg, E. Lundberg, K. Jonasson, et al. (2010)

Towards a knowledge-based Human Protein Atlas. Nature Biotechnology.

pp. 1248-1250.

141. V.H. van der Velden, A. Hochhaus, G. Cazzaniga, T. Szczepanski, J. Gabert, et

al., Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by

real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects,

Leukemia, 2003, 17, 1013-1034.

142. L.T. Vo, T.B. Thuan, D.M. Thu, N.Q. Uyen, N.T. Ha, et al., Methylation

profile of BRCA1, RASSF1A and ER in Vietnamese women with ovarian

cancer, Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14, 7713-7718.

143. T.T. Vo, B.T. Ta, V.T. Ta, D.L. Vuong, Q.U. Nguyen, Promoter methylation

profile of GSTP1 and RASSF1A in prostate cancerand benign hyperplasia in

Vietnamese men, Turk J Med Sci, 2016, 46, 228-235.

144. T.T.L. Vo, S. Ho, T. Vu, T. Nguyen, P. Nguyen, et al., Methylation profiles of

MIR34 gene family in Vietnamese patients suffering from breast and lung

cancers, Molecular Medicine Reports, 2018, 18.

145. H.A. Vu, P.T. Xinh, H.T. Ha, N.T. Hanh, N.D. Bach, et al., Spectrum of EGFR

gene mutations in Vietnamese patients with non-small cell lung cancer, Asia

Pac J Clin Oncol, 2016, 12, 86-90.

146. J. Wang, B. Wang, X. Chen, J. Bi, The prognostic value of RASSF1A promoter

hypermethylation in non-small cell lung carcinoma: a systematic review and

meta-analysis, Carcinogenesis, 2011, 32, 411-416.

107

147. Y. Wang, D. Zhang, W. Zheng, J. Luo, Y. Bai, et al., Multiple gene

methylation of nonsmall cell lung cancers evaluated with 3‐dimensional

microarray, Cancer, 2008, 112, 1325-1336.

148. Y.C. Wang, Y.P. Lu, R.C. Tseng, R.K. Lin, J.W. Chang, et al., Inactivation of

hMLH1 and hMSH2 by promoter methylation in primary non-small cell lung

tumors and matched sputum samples, J Clin Invest, 2003, 111, 887-895.

149. I.B. Weinstein, A.K. Joe, Mechanisms of disease: Oncogene addiction--a

rationale for molecular targeting in cancer therapy, Nat Clin Pract Oncol,

2006, 3, 448-457.

150. X. Weng, H. Zhang, J. Ye, M. Kan, F. Liu, et al., Hypermethylated Epidermal

growth factor receptor (EGFR) promoter is associated with gastric cancer,

Sci Rep, 2015, 5.

151. J.Y. Wu, J. Wang, J.C. Lai, Y.W. Cheng, K.T. Yeh, et al., Association of O6-

methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) promoter methylation with

p53 mutation occurrence in non-small cell lung cancer with different

histology, gender, and smoking status, Ann Surg Oncol 2008, 15, 3272-3277.

152. Z. Xiong, P.W. Laird, COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation

assay, Nucleic Acids Res, 1997, 25, 2532-2534.

153. N. Yanagawa, G. Tamura, H. Oizumi, M. Endoh, M. Sadahiro, et al., Inverse

correlation between EGFR mutation and FHIT, RASSF1A and RUNX3

methylation in lung adenocarcinoma: relation with smoking status,

Anticancer Res, 2011, 31, 1211-1214.

154. T. Yokoyama, K. Takehara, N. Sugimoto, K. Kaneko, E. Fujimoto, et al.,

Lynch syndrome-associated endometrial carcinoma with MLH1 germline

mutation and MLH1 promoter hypermethylation: a case report and literature

review, BMC Cancer, 2018, 18, 018-4489.

155. L. Zhang, X. Long, Association of BRCA1 promoter methylation with sporadic

breast cancers: Evidence from 40 studies, Scientific reports, 2015, 5, 17869-

17869.

156. Y. Zhang, V. Bailey, C.M. Puleo, H. Easwaran, E. Griffiths, et al., DNA

methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array, Lab Chip, 2009, 9,

1059-1064.

157. Y. Zhang, R. Wang, H. Song, G. Huang, J. Yi, et al., Methylation of multiple

genes as a candidate biomarker in non-small cell lung cancer, Cancer Lett,

2011, 303, 21-28.

158. Z. Zhang, A.L. Stiegler, T.J. Boggon, S. Kobayashi, B. Halmos, EGFR-

mutated lung cancer: A paradigm of molecular oncology, Oncotarget, 2010,

1, 497–514.

PHỤ LỤC 1:

Bảng 1.1. Danh sách bệnh nhân ung trong nghiên cứu

STT Số GPB Ký hiệu Họ và tên Giới

tính Tuổi

Kết quả

chẩn đoán

1 22724 S1 Nguyễn Thị B. Nữ 43 K Phế quản

2 30706 S2 Vũ Văn K. Nam 64 Hạch di căn AC

3 38917 S3 Nguyễn Xuân Đ. Nam 57 K Phế quản

4 34221 S4 Đinh Thị D. Nữ 37 K Phế quản

5 52455 S5 Nguyễn Văn B. Nam 55 K Phổi

6 38814 S6 Lê Văn T. Nam 59 Hạch di căn AC

7 36505 S7 Phạm Văn C. Nam 53 Hạch di căn AC

8 38663 S8 Nguyễn Thị T. Nữ 71 K Phế quản

9 62635 S9 Đỗ Văn B. Nam 68 K Phế quản

10 24617 S10 Nguyễn Xuân B. Nam 61 K Phế quản

11 3634 S11 Lâm Thiên T. Nữ 56 Hạch di căn AC

12 17030 S12 Phạm Thị D. Nữ 59 Hạch di căn AC

13 30270 S13 Cao Thị H. Nữ 53 Hạch di căn AC

14 7821 S14 Hà Thị H. Nữ 60 K Phổi

15 445 S15 Phùng Ngọc C. Nam 61 K Phổi

16 36391 S16 Phùng Quyết T. Nam 66 Hạch di căn AC

17 33066 S17 Nguyễn Văn T. Nam 67 Hạch di căn AC

18 36868 S18 Vũ Thị T. Nữ 61 Hạch di căn AC

19 31542 S19 Trịnh Thị C. Nam 64 Hạch di căn AC

20 29023 S20 Nguyễn Thị Xuân T. NAm 46 K Phế quản

21 27189 S21 Nguyễn Kim H. Nữ 60 Hạch di căn AC

22 38698 S22 Mai Thế T. Nam 50 K Phế quản

23 37451 S23 Nguyễn Văn T. Nam 40 K Phế quản

24 64484 S24 Nguyễn Thị Đ. Nữ 56 K Phổi

25 61609 S25 Đỗ Tất M. Nam 67 K Phổi

26 43883 S26 Nguyễn Duy D. Nam 33 K Phổi

27 58838 S27 Lê Thăng L. Nam 65 K Phổi

28 34385 S28 Ngô Thị N. Nữ 47 K Phế quản

29 17026 S29 Nguyễn Công L. Nữ 38 K Phổi

30 30550 S30 Đặng Văn S. Nữ 55 K Phổi

31 72498 S31 Trịnh Văn B. Nam 53 K Phế quản

32 32540 S32 Phạm G. nam 59 K Phổi

33 39886 S33 Nguyễn Đình S. Nam 60 K Phế quản

34 64146 S34 Nguyễn Hữu T. Nam 80 K Phế quản

35 40828 S35 Phạm Văn P. Nam 44 K Phổi

36 39305 S36 Tống Quốc Đ. Nam 62 K Phổi

37 32926 S37 Nguyễn Ngọc D. Nam 53 K Phổi

38 41294 S38 Bùi Cao T. Nam 69 Hạch di căn AC

39 64249 S39 Đỗ Đức B. Nam 65 Hạch di căn AC

40 R1097 S40 Lê Thanh H. Nam 51 K Phổi

41 63959 S41 Hà Huy Đ. Nam 78 K Phổi

42 61036 S42 Trần Tiến Đ. Nam 27 K Phế quản

43 41240 S43 Nguyễn Thị Hồng T. nữ 49 K Phổi

44 29311 S44 Nguyễn Văn C. Nam 59 K Phế quản

45 5999 S45 Trần Thị T. Nữ 54 Hạch di căn AC

46 33351 S46 Trần Văn T. nam 52 K Phổi

47 3163 S47 Hoàng Văn T. Nam 53 K Phế quản

48 63005 S48 Đàm Ngọc S. Nam 41 Hạch di căn AC

49 32040 S49 Trần Văn Đ. nam 50 K Phổi

50 41730 S50 Nguyễn Thị G. Nữ 77 K Phổi

51 1525 S51 Lê Anh Đ. Nam 64 K Phổi

52 57820 S52 Nguyễn Thị T. Nữ 53 K Phổi

53 47854 S53 Trần Mỹ S. Nam 54 K Phế quản

54 33244 S54 Vũ Văn C. Nam 66 K Phế quản

55 DA394 S55 Đỗ Tất T. Nam 57 K Phế quản

56 42712 S56 Lê Thị Y. Nữ 58 Hạch di căn AC

57 39816 S57 Lê Hồng N. Nam 72 K Phế quản

58 40539 S58 Nguyễn Văn T. Nam 69 Hạch di căn AC

59 32335 S59 Trần Quy D. Nam 56 K Phế quản

60 62660 S60 Nguyễn Tuấn K. Nam 55 Hạch di căn AC

61 33892 S61 Đồng Như H. Nam 56 K Phế quản

62 5821 S62 Đào Thị T. Nữ 49 K Phổi

63 42536 S63 Nguyễn Thị Đ. Nữ 54 Hạch di căn AC

64 5290 S64 Đồng Xuân C. Nam 69 K Phổi

65 22624 S65 Phạm Thị T. Nữ 56 K Phổi

66 44004 S66 Nguyễn Văn B. Nam 75 K Phế quản

67 42705 S67 Hoàng Thị L. Nữ 65 K Phế quản

68 32862 S68 Nguyễn Đức L. Nam 58 K Phế quản

69 42850 S69 Trần Văn N. Nam 62 K Phổi

70 90391 S70 Nguyễn Thị O. Nữ 70 K Phổi

71 57965 S71 Nguyễn Văn Q. Nam 57 K Phế quản

72 66349 S72 Vũ Thế M. Nam 71 K Phổi

73 44507 S73 Tô Văn Đ. Nam 53 K Phế quản

74 14090 S74 Lê Kim T. Nam 53 K Phế quản

75 M828 S75 Lê Quang N. Nam 69 K Phế quản

76 33960 S76 Trần Mạnh H. Nam 53 Hạch di căn AC

77 10808 S77 Phạm Quang T. Nam 56 K Phế quản

78 42516 S78 Đậu Thị Huyền T. Nữ 25 Hạch di căn AC

79 38272 S79 Hoàng Văn M. Nam 66 K Phổi

80 44006 S80 Kiều Văn Đ. Nam 66 K Phế quản

81 45150 S81 Trần Vũ H. Nam 70 K Phế quản

82 44748 S82 Trịnh Phú Đ. Nam 53 K Phế quản

83 39062 S83 Nguyễn Huy L. Nam 61 K Phế quản

84 93133 S84 Hoàng Văn K. Nam 42 K Phổi

85 44874 S85 Nguyễn Thị T. Nữ 59 K Phế quản

86 49313 S86 Nguyễn Thị L. Nữ 40 K Phế quản

87 45407 S87 Phạm Thị Thu G. Nữ 31 Hạch di căn AC

88 10087 S88 Tô Đình M. Nam 67 K Phổi

89 89195 S89 Trần Thị V. Nữ 50 K Phế quản

90 45282 S90 Đỗ Văn C. Nam 64 Hạch di căn AC

91 43942 S91 Lê Thị C. Nữ 48 K Phổi

92 52957 S92 Lê Trung T. Nam 60 K Phổi

93 10793 S93 Trần Văn H. Nam 62 K Phổi

94 12395 S94 Đỗ Văn T. Nam 25 K Phổi

95 12905 S95 Phan Duy T. Nam 30 K Phế quản

96 41967 S96 Nguyễn Văn T. Nam 70 K Phổi

97 52178 S97 Nguyễn Thanh T. Nam 66 K Phế quản

98 44771 S98 Phan Thị Đ. Nữ 65 Hạch di căn AC

99 44144 S99 Nguyễn Đình T. Nam 47 K Phế quản

100 46210 S100 Nguyễn Hữu K. Nam 70 K Phế quản

101 46628 S101 Nguyễn Thị G. Nữ 57 Hạch di căn AC

102 45998 S102 Đào Hoa D. Nam 68 Hạch di căn AC

103 47046 S103 Vũ Thị N. Nữ 69 Hạch di căn AC

104 38325 S104 Lê Đức Đ. Nam 49 Hạch di căn AC

105 43861 S105 Nguyễn Văn H. nam 51 K Phế quản

106 94807 S106 Bùi Thị Minh H. Nữ 47 K Phế quản

107 46146 S107 Đặng Như H. Nam 63 K Phế quản

108 57240 S108 Hà Thị H. Nữ 58 K Phế quản

109 68116 S109 Ngô Thị M. Nữ 69 K Phổi

110 32619 S110 Quách Thị Q. Nữ 61 K Phổi

111 94607 S111 Nguyễn Văn V. Nam 62 Hạch di căn AC

112 47562 S112 Trần Văn H. nam 63 Hạch di căn AC

113 45312 S113 Đỗ Văn Đ. Nam 59 K Phổi

114 62319 S114 Triệu Thị H. Nữ 40 Hạch di căn AC

115 95421 S115 Hoàng Văn Y. Nam 33 K Phế quản

116 59222 S116 Nguyễn Đình M. Nam 68 Hạch di căn AC

117 45392 S117 Trần Trọng P. Nam 69 K Phế quản

118 52412 S118 Nguyễn Văn H. nam 64 K Phổi

119 67142 S119 Nguyễn Quốc S. nam 66 K Phế quản

120 37039 S120 Nguyễn Ngọc M. Nam 69 K Phế quản

121 99551 S121 Nguyễn Văn Đ. Nam 54 K Phế quản

122 56484 S122 Hồ Mạnh T. nam 63 K Phổi

123 99696 S123 Nguyễn Thị C. Nữ 41 Hạch di căn AC

124 56128 S124 Phạm Thị Phương H. Nữ 51 Hạch di căn AC

125 56309 S125 Vũ Đức Q. Nam 72 K Phổi

126 55923 S126 Đặng Thị H. Nữ 65 K Phế quản

127 59068 S127 Lê Quang T. Nam 57 K Phế quản

128 30471 S128 Đặng Thu H. Nữ 57 K Phế quản


130 43860 S130 Vũ Đình T. Nam 51 K Phế quản

131 59993 S131 Nguyễn Thị V. Nữ 70 K Phế quản

132 41418 S132 Đào Đình Đ. nam 69 K Phổi

133 45528 S133 Hoàng Đình B. Nam 56 K Phế quản

134 59050 S134 Phạm Văn N. nam 61 K Phế quản

135 43573 S135 Phạm Văn H. Nam 52 K Phế quản

136 62996 S136 Nguyễn Văn P. Nam 62 K Phổi

137 39885 S137 Trần Tiến D. nam 60 K Phổi


139 49473 S139 Nguyễn Thị T. Nữ 50 Hạch di căn AC

140 38917-2 S140 Nguyễn Xuân Đ. Nam 57 Mẫu liền kề

141 34221-2 S141 Đinh Thị D. Nữ 37 Mẫu liền kề

142 38698-2 S142 Mai Thế T. Nam 50 Mẫu liền kề

143 32540-2 S143 Phạm G. Nam 59 Mẫu liền kề

144 39816-2 S144 Lê Hồng N. Nam 72 Mẫu liền kề

145 Máu S145 Nguyễn Thị T Nữ 25

Khám SK

tổng quát

Hà Nội, ngày 09 tháng 1 năm 2020

Xác nhận của TT GPB - SHPT

Bệnh viện K

Bảng 1.2. Đặc điểm bệnh nhân trong nghiên cứu

STT Số GPB Ký hiệu Phân type

mô bệnh học

Tình trạng

khối u Giai Đoạn

Tình trạng

hút thuốc

1 22724 S1 Acinar Nguyên phát 4 Không

2 30706 S2 Acinar Di căn 4 Có

3 38917 S3 Papilary Nguyên phát 2B Có

4 34221 S4 Papilary Nguyên phát 2B Không

5 52455 S5 Acinar Nguyên phát 3A Không

6 38814 S6 Papilary Di căn 4 Có


8 38663 S8 Acinar Nguyên phát 3B Không

9 62635 S9 Acinar Nguyên phát 4 Có

10 24617 S10 Acinar Nguyên phát 3B Có


12 17030 S12 Acinar Di căn 4 Không

13 30270 S13 Solid Di căn 4 Không


15 445 S15 Papilary Nguyên phát 3B Có






21 27189 S21 Papilary Di căn 4 Không


23 37451 S23 Papilary Nguyên phát 3A Có

24 64484 S24 Papilary Nguyên phát 4 Không

25 61609 S25 Solid Nguyên phát 4 Có

26 43883 S26 Acinar Nguyên phát 3A Có








34 64146 S34 Papilary Nguyên phát 3A Không





39 64249 S39 Solid Di căn 4 Có

40 R1097 S40 Acinar Nguyên phát 4 Có




44 29311 S44 Solid Nguyên phát 3B Không




48 63005 S48 Micro-Papillary Di căn 4 Có




52 57820 S52 Micro-Papillary Nguyên phát 3A Không



55 DA394 S55 Acinar Nguyên phát 2B Có

56 42712 S56 Acinar & Papillary Di căn 4 Không





61 33892 S61 Papilary Nguyên phát 4 Có





66 44004 S66 Solid Nguyên phát 3A Có


68 32862 S68 Solid Nguyên phát 3A Không







75 M828 S75 Papilary Nguyên phát 3A Có









84 93133 S84 Solid Nguyên phát 2B Có

















101 46628 S101 Acinar Di căn 4 có




105 43861 S105 Solid Nguyên phát 3A Có




109 68116 S109 Solid Nguyên phát 4 Không















124 56128 S124 Papilary Di căn 4 Không

125 56309 S125 Solid Nguyên phát 3A có











136 62996 S136 Micro-Papillary Nguyên phát 4 Có




PHỤ LỤC 2: Kết quả nồng độ DNA, đột biến, methyl hóa và biểu hiện EGFR

STT Số

GPB

Ký

hiệu

Nồng độ

DNA (ng/µl)

Đột biến

EGFR

Methyl hóa

EGFR

Biểu hiện

EGFR

1 22724 S1 190,5 Wildtype - Âm tính

2 30706 S2 262,4 Wildtype - 2+

3 38917 S3 220,4 L858R + 2+

4 34221 S4 196,8 Wildtype - 2+

5 52455 S5 107,6 Wildtype - 2+

6 38814 S6 238,9 Del - 3+

7 36505 S7 90,59 Wildtype - 3+

8 38663 S8 175,2 L858R + Âm tính

9 62635 S9 141,0 Wildtype - 3+

10 24617 S10 137,4 Wildtype - 2+

11 3634 S11 101,8 Wildtype - 2+


13 30270 S13 271,9 T790 - 1+

14 7821 S14 186,8 G719X, L861Q + Âm tính

15 445 S15 265,3 Wildtype + Âm tính

16 36391 S16 306,4 Wildtype - 2+

17 33066 S17 212,7 Wildtype - 3+

18 36868 S18 318,5 Wildtype + 1+

19 31542 S19 304,3 L858R + 2+


21 27189 S21 273,3 T790M+Del - 1+

22 38698 S22 211,8 S768I - Âm tính

23 37451 S23 90,76 Wildtype - 2+

24 64484 S24 106,3 Wildtype - 2+


26 43883 S26 140,1 L858R - 2+

27 58838 S27 216,0 Wildtype - 2+

28 34385 S28 167,4 G719X - 1+

29 17026 S29 127,0 Wildtype - 3+

30 30550 S30 350,9 Wildtype - 2+

31 72498 S31 128,8 Del - 3+

32 32540 S32 205,8 Wildtype - 2+

33 39886 S33 25,59 Del - 3+

34 64146 S34 196,0 Wildtype + 2+

35 40828 S35 25,46 Del - 2+

36 39305 S36 34,44 Del - 2+

37 32926 S37 147,0 G719X, S768I - 1+

38 41294 S38 386 Wildtype - 3+

39 64249 S39 194,1 Wildtype - 3+

40 R1097 S40 105,1 L858R - 2+

41 63959 S41 206,0 Wildtype - 2+


43 41240 S43 108,2 L858R - 2+

44 29311 S44 163,3 Wildtype - 2+

45 5999 S45 174,3 Wildtype + 1+

46 33351 S46 170,1 Wildtype - 1+

47 3163 S47 53,89 G719X, L858R - 2+


49 32040 S49 25,90 Del + 1+

50 41730 S50 180,0 L858R - 3+

51 1525 S51 301,7 Wildtype - 2+

52 57820 S52 237,8 Del + 2+

53 47854 S53 242,2 Wildtype - 2+

54 33244 S54 241,4 L858R - 2+

55 DA394 S55 62,38 G719X, S768I - 3+

56 42712 S56 229,0 Del - Âm tính

57 39816 S57 158,9 Wildtype - 1+

58 40539 S58 202,8 Wildtype - 3+

59 32335 S59 138,9 Wildtype - 2+

60 62660 S60 285,8 Wildtype - 2+

61 33892 S61 196,9 Wildtype + 1+

62 5821 S62 145,7 Wildtype - 1+

63 42536 S63 120,4 L858R - 2+

64 5290 S64 164,9 Wildtype - 1+

65 22624 S65 112,4 L858R - Âm tính

66 44004 S66 23,48 Wildtype + 1+

67 42705 S67 79,31 Wildtype - 1+


69 42850 S69 875,7 Wildtype - 1+

70 90391 S70 103,2 Wildtype - 2+


72 66349 S72 457,6 Wildtype + 1+

73 44507 S73 39,37 Wildtype - 2+


75 M828 S75 134,3 Wildtype - 2+

76 33960 S76 389,4 Wildtype - 1+

77 10808 S77 420,2 Wildtype - 1+

78 42516 S78 181,3 Wildtype - 1+

79 38272 S79 127,4 Wildtype - 2+

80 44006 S80 68,11 Wildtype - 3+

81 45150 S81 187,8 Wildtype - 2+

82 44748 S82 161,1 Del, L858R + 3+

83 39062 S83 94,72 L858R + Âm tính

84 93133 S84 124,8 L861Q - 3+


86 49313 S86 34,43 Wildtype - 2+

87 45407 S87 142,0 Wildtype + 1+

88 10087 S88 264,1 Wildtype - 2+

89 89195 S89 177,5 L858R - 2+

90 45282 S90 284,6 Wildtype - 1+

91 43942 S91 50,66 Del + 2+

92 52957 S92 235,1 Wildtype + 2+

93 10793 S93 157,0 Wildtype - 2+

94 12395 S94 961,0 Wildtype - 2+

95 12905 S95 1172,5 Del - 3+


97 52178 S97 273,9 Wildtype - 1+

98 44771 S98 22,74 Del - 2+

99 44144 S99 72,25 Del + 1+

100 46210 S100 408,3 Wildtype + 3+

101 46628 S101 183,9 Del - 2+


103 47046 S103 124,0 Del + 2+

104 38325 S104 346,5 Ins - Âm tính

105 43861 S105 72,75 Wildtype - 2+

106 94807 S106 92,14 L858R - 2+


108 57240 S108 224,8 Del - 2+

109 68116 S109 293,8 Wildtype - 2+

110 32619 S110 43,62 L858R - 2+

111 94607 S111 257,8 Del + 1+


113 45312 S113 188,9 Wildtype + 2+

114 62319 S114 189,6 Wildtype - 2+

115 95421 S115 132,2 Wildtype - 2+

116 59222 S116 807,3 Wildtype - 2+

117 45392 S117 96,04 Wildtype - 3+


119 67142 S119 102,1 Wildtype - 2+

120 37039 S120 114,2 Wildtype - 2+

121 99551 S121 411,4 Wildtype - 2+

122 56484 S122 324,3 Wildtype + 2+


124 56128 S124 306,4 L858R + Âm tính

125 56309 S125 176,3 Wildtype - 2+

126 55923 S126 152,0 Del - 1+

127 59068 S127 58,18 Wildtype - 3+

128 30471 S128 380,5 T790M + Âm tính

129 43248 S129 184,8 L858R - Âm tính

130 43860 S130 39,06 Wildtype - 2+

131 59993 S131 32,76 L858R + 2+



134 59050 S134 117,5 Wildtype - 2+


136 62996 S136 195,8 Del - Âm tính

137 39885 S137 264,8 Wildtype - 3+

138 22053 S138 125,6 Del - 2+

139 49473 S139 208,5 Del - Âm tính

PHỤ LỤC 3: Kết quả methyl hóa gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A

STT Số GPB Ký

hiệu

Methyl hóa

gen BRCA1

Methyl hóa

gen MGMT

Methyl hóa

gen MLH1

Methyl hóa

gen RASSF1A

1 22724 S1 - - - -

2 30706 S2 - - - +

3 38917 S3 - - - -

4 34221 S4 - - - -

5 52455 S5 - + - -

6 38814 S6 - + - +

7 36505 S7 - + - +

8 38663 S8 + - - -

9 62635 S9 - - - -

10 24617 S10 - - - -

11 3634 S11 - - + +

12 17030 S12 - - - +

13 30270 S13 - + - -

14 7821 S14 - - - -

15 445 S15 + + + +

16 36391 S16 - + + +

17 33066 S17 - - + +

18 36868 S18 + + + +

19 31542 S19 - + - -

20 29023 S20 - + + -

21 27189 S21 - + - -

22 38698 S22 - - + -

23 37451 S23 - - - -

24 64484 S24 - - - -

25 61609 S25 - - - -

26 43883 S26 - - - -

27 58838 S27 - - - -

28 34385 S28 + - + +

29 17026 S29 + - - -

30 30550 S30 - - - -

31 72498 S31 + - - -

32 32540 S32 + - - -

33 39886 S33 - - - -

34 64146 S34 - - - -

35 40828 S35 + - - +

36 39305 S36 - - - -

37 32926 S37 - - - -

38 41294 S38 - + - -

39 64249 S39 - + - -

40 R1097 S40 - - - -

41 63959 S41 + - - +

42 61036 S42 + + - -

43 41240 S43 - - - +

44 29311 S44 - + - -

45 5999 S45 - + - +

46 33351 S46 + + - -

47 3163 S47 + - - -

48 63005 S48 + + - +

49 32040 S49 - - - -

50 41730 S50 - - - -

51 1525 S51 + - - +

52 57820 S52 - + + -

53 47854 S53 + - - -

54 33244 S54 + - - -

55 DA394 S55 - - - -

56 42712 S56 + - - -

57 39816 S57 + - - +

58 40539 S58 + - - +

59 32335 S59 - + - +

60 62660 S60 + - + +

61 33892 S61 + - + +

62 5821 S62 - - + -

63 42536 S63 - - - -

64 5290 S64 - - - +

65 22624 S65 + - - +

66 44004 S66 + - - -

67 42705 S67 - + - -

68 32862 S68 + + - -

69 42850 S69 + + + +

70 90391 S70 + + + +

71 57965 S71 - - - +

72 66349 S72 - - + +

73 44507 S73 + + - +

74 14090 S74 - + + +

75 M828 S75 - - - -

76 33960 S76 + - - -

77 10808 S77 + + - +

78 42516 S78 - - - -

79 38272 S79 + - - +

80 44006 S80 + + - -

81 45150 S81 + + + +

82 44748 S82 - - - -

83 39062 S83 - + - -

84 93133 S84 - - - -

85 44874 S85 - - - -

86 49313 S86 - - - -

87 45407 S87 + - - +

88 10087 S88 - + - -

89 89195 S89 - - - -

90 45282 S90 + - + -

91 43942 S91 - - + +

92 52957 S92 - - + -

93 10793 S93 - + + +

94 12395 S94 - - - -

95 12905 S95 - - - -

96 41967 S96 - + - -

97 52178 S97 + - - +

98 44771 S98 - + - -

99 44144 S99 - - - -

100 46210 S100 - - - -

101 46628 S101 - + - -

102 45998 S102 - + + +

103 47046 S103 - + + -

104 38325 S104 - - + -

105 43861 S105 - - - -

106 94807 S106 - - + -

107 46146 S107 - - + -

108 57240 S108 - - + +

109 68116 S109 - - - -

110 32619 S110 - - - -

111 94607 S111 - - - -

112 47562 S112 + - - -

113 45312 S113 - + - -

114 62319 S114 - + - -

115 95421 S115 - - - +

116 59222 S116 - - - -

117 45392 S117 - - - -

118 52412 S118 - + - -

119 67142 S119 - - - -

120 37039 S120 + - - -

121 99551 S121 - + - -

122 56484 S122 + + + -

123 99696 S123 + + - +

124 56128 S124 + - - -

125 56309 S125 - + - -

126 55923 S126 - + - -

127 59068 S127 - - - -

128 30471 S128 - - - -

129 43248 S129 - - - -

130 43860 S130 - - - -

131 59993 S131 - + - -

132 41418 S132 + + - -

133 45528 S133 - - - +

134 59050 S134 - - - -

135 43573 S135 - - - -

136 62996 S136 - - - -

137 39885 S137 - - - -

138 22053 S138 - - - -

139 49473 S139 - - - -

140 38917-2 S140 - - - -

141 34221-2 S141 - - - -

142 38698-2 S142 - - - -

143 32540-2 S143 - - - -

144 39816-2 S144 - - - -

145 Máu S145 - - - -

PHỤ LỤC 4:

29 đột biến có thể đƣợc phát hiện bằng bộ kit Therascreen EGFR RGQ PCR

Đột biến Exon Vị trí thay đổi COSMIC ID

T790M 20 2369C>T 6240

L858R 21 2573T>G 6224

L861Q 21 2582T>A 6213

S768I 20 2303G>T 6241

G719A 18 2156G>C 6239

G719S 18 2155G>A 6252

G719C 18 2155G>T 6253

Thêm đoạn

20

2307_2308ins9 12376

2319_2320insCAC 12377

2310_2311insGGT 12378

Mất đoạn

19

2237_2255>T (complex) 12384

2236_2250del15 6225

2238_2255del18 6220

2238_2248>GC (complex) 12422

2238_2252>GCA (complex) 12419

2239_2247del9 6218

2239_2253del15 6254

2239_2256del18 6255

2239_2248TTAAGAGAAG>C (complex) 12382

2239_2258>CA (complex) 12387

2240_2251del12 6210

2240_2257del18 12370

2240_2254del15 12369

2239_2251>C (complex) 12383

PHỤ LỤC 5: Kết quả giải trình tự

Phụ lục 5.1: Trình tự promoter gen EGFR methyl hóa

Hình 5.1. Trình tự vùng promoter gen EGFR methyl

Phụ lục 5.2. Trình tự promoter gen EGFR không methyl hóa

Hình 5.2. Trình tự vùng promoter gen EGFR không methyl

PHỤ LỤC 6: Một số kết quả điện di sản phẩm MS-PCR

Phụ lục 6.1: Một số kết quả điện di sản phẩm MS-PCR gen EGFR

Hình 6.1. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen EGFR.

S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến của phổi, L: Thang chuẩn DNA

100bp (Fermentas), M: Sản phẩm EGFR methyl hóa (158 bp), U: Sản phẩm EGFR

không methyl hóa (150 bp), NTC: Đối chứng âm,

Phụ lục 6.2: Một số kết quả điện di sản phẩm MS-PCR gen BRCA1

Hình 6.2. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen BRCA1.

S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến của phổi, L: Thang chuẩn DNA 100

bp (Fermentas), M: Sản phẩm BRCA1 methyl (70 bp), U: Sản phẩm BRCA1 không

methyl (77 bp), NTC: Đối chứng âm,

Phụ lục 6.3: Một số kết quả điện di sản phẩm MS-PCR gen MGMT

Hình 6.3. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen MGMT.


bp (Fermentas), M: Sản phẩm MGMT methyl (81 bp), U: Sản phẩm MGMT không


Phụ lục 6.4: Một số kết quả điện di sản phẩm MS-PCR gen MLH1

Hình 6.4. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa MLH1.


bp (Fermentas), M: Sản phẩm MLH1 methyl (303 bp), U: Sản phẩm MLH1 không


Phụ lục 6.5: Một số kết quả điện di sản phẩm MS-PCR gen RASSF1A

Hình 6.5. Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa gen RASSF1A,

S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến của phổi, L: thang chuẩn DNA

100bp (Fermentas), M: Sản phẩm RASSSF1A methyl (175 bp), U: Sản phẩm

RASSF1A không methyl (137 bp), NTC: Đối chứng âm

PHỤ LỤC 7: Kết quả hóa mô miễn dịch

S8 S12 S14

S13 S18 S21

S1 S2 S3

S6 S7 S29

S42 S48 S56

S37 S45 S46

S51 S52 S53

S39 S55 S58

Hình 7.1. Kết quả hóa mô miễn dịch,

S: Các mẫu bệnh phẩm ung thư biểu mô tuyến của phổi độ phóng đại 200X

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN...

Documents

Transcript of NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN...