Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 1 placa - 96 72340 5 placas - 480 72341 KIT DE RASTREIO DE ANTICORPOS ANTI-HCV (VÍRUS DA HEPATITIS C) NO SORO OU PLASMA HUMANOS UTILIZANDO UMA TÉCNICA DE IMUNOENSAIO ENZIMÁTICO

883635 – 2013/09

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ÍNDICE 1. UTILIZAÇÃO PREVISTA 2. RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE 3. PRINCÍPIO DO PROCEDIMENTO 4. REAGENTES 5. AVISOS E PRECAUÇÕES 6. AMOSTRAS 7. PROCEDIMENTO 8. LIMITAÇÃO DO TESTE 9. CARATERÍSTICAS DE DESEMPENHO 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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1. UTILIZAÇÃO PREVISTA

O Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 é um imunoensaio enzimático qualitativo para a deteção da infeção pelo vírus da hepatite C (HCV) com base na deteção de anticorpos anti-HCV em soro ou plasma humanos. Este teste de rastreio para a Hepatite C pode ser usado por laboratórios de diagnóstico e por bancos de sangue.

2. RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE

O vírus da Hepatite C (HCV) é um vírus de invólucro de ARN de polaridade positiva (9,5 kb) que pertence à família dos Flaviviridae. Isolado em 1989, foram identificados seis dos principais genótipos de HCV. O HCV é reconhecido como sendo a principal causa de hepatite viral não A e não B. A infeção HCV é caracterizada por uma forma aguda e crónica que poderá dar origem a cirrose e a carcinoma hepatocelular. O rastreio de primeira linha da hepatite C utiliza um imunoensaio enzimático ELISA de terceira geração para deteção de anticorpos anti-HCV.

3. PRINCÍPIO DO PROCEDIMENTO

O Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 é baseado na utilização de uma fase sólida preparada com antigénios purificados: três proteínas recombinantes da região não estrutural (NS3 e NS4), um péptido da região estrutural (capsídeo) do vírus da hepatite C e uma fase líquida (conjugado) constituída por anticorpos IgG anti-humanos de rato associados a peroxídase. O procedimento da análise inclui os seguintes passos de reação:

1) O diluente de amostras (R6) e, em seguida, as amostras e controlos (R3 e R4) são distribuídos pelas cavidades da microplaca. Caso estejam presentes anticorpos para HCV, estes irão ligar os antigénios fixos na fase sólida.

2) Após incubação a 37 °C durante 1 hora e uma fase de lavagem, o conjugado (R7) com anticorpos IgG anti-humanos etiquetados com peroxídase é adicionado. Caso exista presença de IgG humano, tendo reagido com a fase sólida, o conjugado IgG anti-humano liga-se aos anticorpos humanos.

3) Após 30 minutos de incubação a 37 °C e eliminação do conjugado enzimático não ligado através da lavagem, a presença de complexos antigénio-anticorpo-peroxídase é revelada através da adição de substrato.

4) Após 30 minutos de incubação à temperatura de laboratório (18 - 30 °C) e uma vez que a reação tenha parado, a leitura do espetrofotómetro é tirada a 450/620-700 nm. A absorvância medida de uma amostra permite detetar a presença ou ausência de anticorpos HCV da hepatite C na amostra. A intensidade da cor é proporcional à quantidade de anticorpos HCV ligados à fase sólida.

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4. REAGENTES

4.1. Descrição

Identificação no rótulo Descrição Apresentação

Preparação 72340

Apresentação Preparação

72341

R1 MICROPLATE

Microplaca 12 tiras de 8 cavidades cada, revestidas com antigénios purificados recombinantes (NS3, NS4) e um péptido capsídeo HCV. Número ID específico = 94

1 placa Pronta a ser

utilizada

5 placas Prontas a

serem utilizadas

R2 CONCENTRATED

WASHING SOLUTION (20X)

Solução de lavagem concentrada (20 X) Tampão Tris NaCl pH 7,4 Conservante: ProClin™ 300 (0,04%)

1 frasco 70 ml

Para diluição

1 frasco 235 ml

Para diluição

R3 NEGATIVE CONTROL

Controlo negativo Tampão Tris HCI, com BSA (albumina de soro bovino) Conservante: ProClin™ 300 (0,1%)

1 frasco 1 ml

Pronto a ser utilizado

1 frasco 1 ml

Pronto a ser utilizado

R4 POSITIVE CONTROL

Controlo positivo Soro humano com anticorpos para HCV, negativo para antigénio HBs e para anticorpos anti HIV-1 e anti HIV-2 diluídos num tampão Tris HCI com BSA e fotoquimicamente desativado. Conservante: ProClin™ 300 (0,1%)

1 frasco 1,5 ml

Pronto a ser utilizado

1 frasco 3 ml

Pronto a ser utilizado

R6 SAMPLE DILUENT

Diluente de amostras Tampão de citrato; coloração púrpura Conservante: Azida de sódio (<0,1%), Cosmocil® CQ (0,025%)

1 frasco 15 ml

Pronto a ser utilizado

2 frascos 2 x 30 ml

Prontos a serem

utilizados

R7 CONJUGATE

Conjugado Anticorpos IgG anti-humanos de rato/peroxídase Coloração verde Conservante: ProClin™ 300 (0,5 %)

1 frasco 15 ml

Pronto a ser utilizado

2 frascos 2 x 30 ml

Prontos a serem

utilizados

R8 SUBSTRATE

BUFFER

Substrato Solução de ácido cítrico e acetato de sódio, pH 4,0 com H2O2 (0,015%) e dimetilsulfóxido (DMSO) 4%

1 frasco 60 ml Para

reconstituição

2 frascos 2 x 60 ml

Para reconstituição

R9 CHROMOGEN:

TMB SOLUTION (11X)

Cromogénio: Solução TMB Solução contendo 3,3’, 5,5’ tetrametilobenzeno (TMB)

1 frasco 5 ml Para

reconstituição

2 frascos 2 x 5 ml

Para reconstituição

R10 STOPPING SOLUTION

Solução de paragem Solução de ácido sulfúrico 1N

1 frasco 28 ml

Pronto a ser utilizado

3 frascos 3 x 28 ml

Prontos a serem

utilizados

4.2. Condições de conservação e manuseamento

O kit deve ser armazenado a pelo menos +2-8 °C. Cada item do kit preservado a +2-8°C pode ser usado até à data de validade indicada na embalagem (salvo indicação em contrário). Após a abertura e na ausência de contaminação, os reagentes R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 e R10 conservados a 2-8 °C podem ser utilizados até a data de validade indicada na etiqueta.

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Identificação Conservação

R1 Após a abertura do saco selado a vácuo, as tiras de microcavidades armazenadas a +2-8 °C podem ser utilizadas durante 1 mês no respetivo saco original selado novamente com cuidado.

R2 A solução de lavagem diluída pode ser armazenada a +2-30 °C durante 2 semanas. A solução de lavagem concentrada (R2) pode ser armazenada a +2-30 °C.

R8 + R9 Após a reconstituição, os reagentes armazenados num local escuro podem ser utilizados durante 6 horas à temperatura ambiente (18-30 °C).

5. AVISOS E PRECAUÇÕES Para fins de diagnóstico in vitro por um profissional de saúde.

5.1. Precauções de Saúde e Segurança • Este kit de teste apenas deve ser manuseado por pessoal qualificado, com formação em

procedimentos laboratoriais, e familiarizado com os respetivos potenciais perigos. Utilize vestuário de proteção adequado, luvas, proteção ocular/facial e manuseie de forma adequada em conformidade com as Boas Práticas Laboratoriais exigidas.

• O kit de teste contém componentes de sangue humano. O material de origem humana usado na

preparação do reagente R4 (Controlo Positivo) foi testado e considerado não reativo para o antigénio de superfície da hepatite B (HBs Ag) e anticorpos para Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-1 e HIV-2 Ab) e positivo para anticorpos anti-HCV. O R4 de controlo positivo é tornado inativo com o aquecimento. Nenhum método de teste conhecido pode oferecer total garantia da ausência de agentes infeciosos. Por conseguinte, todos os derivados de sangue humano, reagentes e amostras humanas devem ser manuseados como meios capazes de transmissão de doença infeciosa, cumprindo as Precauções Universais recomendadas para agentes patogénicos transmissíveis pelo sangue, conforme definido pelos regulamentos locais, regionais e nacionais

• Salpicos biológicos: Os salpicos de material de origem humana devem ser tratados como

potencialmente infeciosos. Os salpicos que não contenham ácido devem ser imediatamente descontaminados, incluindo a área, materiais e quaisquer superfícies ou equipamento contaminados com salpicos, com um desinfetante químico apropriado eficaz para resíduos biológicos potencialmente perigosos das amostras envolvidas (normalmente, uma diluição de 1:10 de lixívia de uso doméstico, 70-80% de etanol ou isopropanol e iodóforo como Wescodyne™ Plus a 0,5% etc.), devendo ser limpos com um pano seco. Salpicos que contenham ácido devem ser absorvidos adequadamente (limpos com um pano) ou neutralizados e a área deve ser enxaguada e limpa com um pano até ficar seca; poderá ser necessário eliminar os materiais utilizados para limpar os salpicos como resíduos biologicamente perigosos. Em seguida, a área deverá ser descontaminada com um dos desinfetantes químicos

NOTA: Não coloque soluções que contenham lixívia na autoclave!

• Elimine todas as amostras e materiais utilizados para realizar o teste como se estes contivessem um agente infecioso. Os resíduos laboratoriais, químicos ou biológicos perigosos devem ser manuseados e eliminados em conformidade com todos os regulamentos locais, regionais e nacionais.

• Para obter recomendações relativas a perigos e precauções relacionadas com alguns componentes

químicos neste kit de teste, consulte as ilustrações indicadas nos rótulos e as informações fornecidas no final das instruções de utilização. A Ficha de Dados de Segurança encontra-se disponível em www.bio-rad.com.

5.2. Precauções relacionadas com o protocolo 5.2.1. Preparação

A fiabilidade dos resultados depende da implementação correta das Boas Práticas Laboratoriais que se seguem:

• Não utilize reagentes expirados.

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• Não misture nem associe reagentes de diferentes lotes num único teste. • Antes da utilização, aguarde 30 minutos até que os reagentes estabilizem à temperatura ambiente

(18-30 °C). • O nome do teste, bem como um número de identificação específico para o teste, é indicado na

estrutura de cada microplaca. O número de identificação específico é indicado também em cada tira. Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3: Número ID específico = 94

Verifique o número de identificação específico antes da utilização. Se o número de identificação estiver em falta ou for diferente do número indicado correspondente ao ensaio a testar, a tira não deve ser utilizada.

OBSERVAÇÃO: Para a solução de lavagem (R2, identificação da etiqueta: 20X coloração verde), tampão de substrato peroxídase (R8, identificação da etiqueta: tampão TMB, coloração azul), cromogénio (R9, identificação da etiqueta: TMB 11X, coloração púrpura) e solução de paragem (R10, identificação da etiqueta: 1N coloração vermelha), é possível utilizar outros lotes para além daqueles incluídos no kit, desde que o mesmo lote seja utilizado na execução de um determinado teste. Estes reagentes podem ser utilizados com alguns dos outros produtos da nossa empresa. Contacte o nosso serviço técnico para obter informações detalhadas.

• Reconstitua cuidadosamente os reagentes, evitando qualquer contaminação. • Utilize vidros de laboratório minuciosamente lavados e enxaguados com água desionizada ou, de

preferência, material descartável. • Não deixe que a microplaca seque entre o final da operação de lavagem e a distribuição de reagente. • A reação enzimática é muito sensível a iões metálicos. Por conseguinte, não permita que qualquer

elemento metálico entre em contacto com as várias soluções de conjugado ou de substrato. • A solução de desenvolvimento (tampão de substrato + cromogénio) deve ter coloração cor-de-rosa. A

modificação desta coloração cor-de-rosa no intervalo de alguns minutos após a reconstituição indica que o reagente não pode ser utilizado e deve ser substituído. A preparação da solução de desenvolvimento pode ser realizada numa bandeja de plástico limpa, descartável e de utilização única ou num recipiente de vidro que primeiramente tenha sido pré-lavado com 1N HCl, enxaguado minuciosamente com água destilada e seco. Este reagente deve ser armazenado num local escuro.

• Nunca utilize o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução de desenvolvimento.

5.2.2. Processamento

• Não altere o procedimento de ensaio. • Não realize o teste na presença de vapores reativos (vapores ácidos, alcalinos ou aldeídicos) ou de

poeira que possam alterar a atividade enzimática do conjugado. • Utilize uma ponta de distribuição nova para cada amostra. • A lavagem da cavidade é um passo crítico neste procedimento: respeite o número de ciclos de

lavagem recomendado, certificando-se de que todas as cavidades estão completamente cheias e, em seguida, são completamente esvaziadas. Uma lavagem incorreta pode levar a um resultado incorreto.

• Siga cuidadosamente os procedimentos de lavagem descritos de modo a obter o máximo desempenho do teste. Com alguns instrumentos, poderá ser necessário otimizar o procedimento de lavagem (aumentar o número do ciclo da fase de lavagem e/ou o volume do tampão de lavagem para cada ciclo) para obter um nível aceitável de fundo DO para a amostra negativa.

• Contacte a nossa empresa para obter informações sobre adaptações e procedimentos especiais.

6. AMOSTRAS

Recolha as amostras de sangue de acordo com as práticas correntes. Os testes devem ser realizados em soro não diluído ou plasma (recolhido em EDTA, heparina de lítio, citrato de sódio ou ACD). As amostras que contêm agregados devem ser clarificadas por centrifugação antes do teste. As partículas suspensas de fibrina ou agregados podem produzir falsos resultados positivos. As amostras devem ser armazenadas a +2-8 °C se o teste for realizado no espaço de 7 dias ou podem ser congeladas a -20 °C. Não repita mais de 3 ciclos de congelamento-descongelamento. As amostras devem ser descongeladas à temperatura ambiente (18-30 °C). É recomendável homogeneizar as mesmas através de inversão antes da utilização.

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As amostras que contenham até 120 g/l de albumina, 200 mg/l de bilirrubina, amostras que contenham até 33 g/l de trioleína e amostras que contenham até 2 g/l de hemoglobina não afetam os resultados. Contudo não é recomendável o uso de amostras contaminadas hiperlipémicas ou hiper-hemolizadas. Se as amostras se destinarem a ser transportadas, devem ser acondicionadas em conformidade com os regulamentos em vigor relativamente ao transporte de agentes etiológicos e, de preferência, transportadas congeladas. Não é recomendado o aquecimento das amostras.

7. PROCEDIMENTO

7.1. Materiais necessários, mas não fornecidos

• Água destilada. • Hipoclorito de sódio (lixívia de uso doméstico) e bicarbonato de sódio. • Papel absorvente. • Fita adesiva. • Luvas descartáveis. • Óculos de segurança. • Tubos descartáveis. • Pipetas ou multi-pipetas ajustáveis ou predefinidas, automáticas ou semiautomáticas, para medir e

dispensar 50 μl, 80 μl, 100 μl, 200 μl e 1 ml. • Cilindros graduados de 10 ml, 200 ml e 1000 ml. Misturador Vortex. • Sistema de lavagem de microplacas automático, semiautomático ou manual. • Banho de água ou incubadora de microplacas equivalente, com termóstato ajustado para 37 °C ± 1

°C (*). • Recipiente para resíduos biológicos perigosos. • Leitor de microplacas equipado com filtros de 450, 490 nm e 620-700 nm (*).

(*) Contacte-nos para obter informações detalhadas sobre o equipamento recomendado pelo nosso departamento técnico.

7.2. Tipo de reagentes

7.2.1. Reagentes prontos a utilizar

Reagente 1 (R1): Microplaca Cada estrutura de apoio com 12 tiras está envolta numa bolsa de alumínio selada. Corte a bolsa utilizando uma tesoura ou um bisturi 0,5 a 1 cm acima do selo. Abra a bolsa e retire a estrutura. Coloque as tiras não utilizadas na bolsa. Feche a bolsa cuidadosamente e volte a armazená-la a +2-8 °C. Reagente 6 (R6): Amostra de diluente Homogenize invertendo antes da utilização. Reagente 7: Conjugado (R7) Homogenize invertendo antes da utilização.

7.2.2. Reagentes para reconstituir

Reagente 2 (R2): Solução de lavagem concentrada (20X) Dilua 1:20 em água destilada para obter a solução de lavagem pronta a utilizar. Prepare 800 ml para uma placa de 12 tiras. Reagente 8 (R8) + Reagente 9 (R9): Solução de desenvolvimento de enzimas Dilua 1:11 o cromogénio (R9) no Tampão de Substrato (por ex.: 1 ml de reagente R9 + 10 ml de reagente R8) visto que 10 ml são a quantidade necessária e suficiente para tratar 12 tiras. Homogenize.

7.3. Procedimento da análise

Siga rigorosamente o procedimento. Utilize soros de controlo negativos e positivos para cada teste de modo a validar a qualidade do teste. Siga as Boas Práticas Laboratoriais que se seguem: 1) Estabeleça cuidadosamente o plano de identificação e distribuição de amostras. 2) Prepare a solução de lavagem R2 diluída. (consulte § 7.2)

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3) Retire a estrutura de apoio da embalagem de proteção e o número necessário de tiras (R1). Volte a colocar as tiras não utilizadas na embalagem. Feche a embalagem e volte a colocá-la a +2-8 °C.

4) Distribua na cavidade pela seguinte ordem (distribuição de placa recomendável): • 100 μl de diluente de amostras (R6) em cada cavidade e, em seguida, • 50 μl de controlo negativo (R3) na cavidade A1, • 50 μl de controlo positivo (R4) na cavidade B1, C1, D1, • 50 μl da primeira amostra na cavidade E1, • 50 μl da segunda amostra na cavidade F1, etc.

Homogeneíze a mistura com pelo menos 3 aspirações ou com um agitador de microplacas durante 5 segundos. Se a distribuição das amostras demorar mais de 10 minutos, é recomendável distribuir os controlos negativos e positivos após as amostras a testar. Dependendo do sistema utilizado, pode ajustar a posição ou a ordem de distribuição dos controlos.

OBSERVAÇÃO: Após a distribuição das amostras, a cavidade que contém amostras (ou controlos) passa de púrpura a azul. É possível verificar a presença de amostras nas cavidades através da leitura do espetrofotómetro a 620 nm (consulte § 7.7) 5) Quando possível, cubra a placa com fita adesiva nova. 6) Incube a microplaca durante 60 minutos (± 5 min.) a 37 °C ± 1 °C. 7) Se necessário, retire a fita adesiva. Aspire o conteúdo de todas as cavidades para um recipiente

de líquido evacuado e adicione, pelo menos, 0,370 ml de solução de lavagem em cada cavidade. Aspire novamente e repita a lavagem, no mínimo, 4 vezes (5 lavagens efetuadas no total). O volume residual deve ser inferior a 10 μl (se necessário, seque as tiras virando-as ao contrário em papel absorvente). Caso possua um sistema de lavagem automático, siga o mesmo ciclo operacional.

8) Distribua rapidamente 100 μl da solução de conjugado (R7) em cada cavidade no interior da placa. O conjugado deve ser agitado antes da utilização. Cubra novamente com uma fita nova, se possível, e incube durante 30 minutos (± 5 min.) a 37 °C ± 1 °C.

OBSERVAÇÃO: O conjugado tem coloração verde. É possível verificar a presença de conjugado nas cavidades através da leitura do espectrofotómetro a 620 nm (consulte § 7.7).

9) Se necessário, retire a fita adesiva, esvazie todas as cavidades por aspiração e lave, pelo menos, 5 vezes conforme descrito acima.

10) Prepare solução de desenvolvimento de enzimas (reagente R8 + R9). 11) Distribua rapidamente 80 μl de solução de desenvolvimento de enzimas (R8 + R9) em todas as

cavidades. Deixe a reação desenvolver-se no escuro durante 30 minutos (± 5 min) à temperatura ambiente (18 - 30 °C). Não aplique fita adesiva durante esta incubação.

OBSERVAÇÃO: A distribuição da solução de desenvolvimento, com coloração cor-de-rosa, pode ser controlada visualmente (Consulte § 7.7)

12) Adicione 100 μl da solução de paragem (R10) usando a mesma sequência e a mesma razão de

distribuição usada para a solução de desenvolvimento.

OBSERVAÇÃO: A distribuição da solução de paragem incolor pode ser controlada visualmente nesta fase de manuseamento. A cor do substrato, cor-de-rosa (para amostras negativas) ou azul (para amostras positivas), desvanece das cavidades, que se tornam incolores (para amostras negativas) ou amarelas (para amostras positivas) após a adição da solução de paragem

13) Limpe cuidadosamente o fundo de cada placa. Aguarde, pelo menos, 4 minutos após a adição da

solução de paragem e, no espaço de 30 minutos após a paragem da reação, leia a densidade ótica a 450/620-700 nm utilizando um leitor de placas.

14) Verifique a conformidade entre a leitura visual e do espetrofotómetro em comparação com a placa e o plano de identificação e distribuição de amostras.

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7.4. Controlo de qualidade Utilize controlos positivos (R4) e o controlo negativo (R3) em cada execução do teste para validar o ensaio. (Consulte §7.5)

7.5. Critérios de validação do teste Este teste é validado se as condições abaixo forem respeitadas:

1) Para o controlo negativo R3: O valor de absorvância medido deve ser inferior a 60% do corte: O.D. < corte x 0,6

2) Para o controlo positivo de anticorpos R4:

0,800 ≤ Média O.D. R4 ≤ 2,700 Se um dos valores individuais R4 de controlo positivo diferir em mais de 30% do valor médio, ignore o valor e execute o cálculo novamente com os dois valores de controlo positivo restantes.

7.6. Cálculo/Interpretação dos resultados O corte é determinado com o controlo positivo R4: Calcule o valor de absorvância médio medido para o controlo positivo R4. Cálculo do valor de corte (CO):

CO = DO R4 médio X 0,4

A presença ou ausência de anticorpos anti-HCV é determinada através da comparação da absorvância registada com o valor de corte calculado para cada amostra. O rácio seguinte é calculado para cada amostra: Rácio = DO da amostra/Valor CO (Corte) As amostras com uma densidade ótica inferior ao valor de corte são consideradas negativas (rácio < 1) pelo Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3. Os resultados imediatamente abaixo do valor de corte (CO-10 % < O.D. < CO, razão entre 0,9 e 1) devem contudo, ser interpretados com cautela. É aconselhável voltar a testar em duplicado as amostras correspondentes quando os sistemas e os procedimentos laboratoriais o permitirem. As amostras com densidade ótica superior ou igual ao corte (rácio ≥ 1) são consideradas inicialmente positivas pelo Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3. Devem ser testadas novamente em duplicado antes da interpretação final. Se, após a repetição do teste, o valor do rácio de, pelo menos, um dos 2 duplicados for igual ou superior a 1, o resultado inicial é repetível e a amostra é declarada positiva com o Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3. Os valores do rácio dos 2 duplicados são inferiores a 1, o resultado inicial não é repetível e a amostra é declarada negativa. As amostras cujos testes foram repetidos duas vezes e foram declaradas negativas com o Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3, mas com um valor próximo do valor de corte (rácio entre 0,9 e 1) devem ser consideradas cuidadosamente. É aconselhável repetir o teste do paciente com outro método ou noutra amostra. Em caso de densidade ótica muito reduzida para amostras testadas (DO negativa) e quando a presença de amostras e de reagentes for controlada, os resultados podem ser interpretados como negativos.

É recomendado que confirme as amostras positivas seguindo os algoritmos e recomendações nacionais atuais.

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7.7. Verificação espetrofotométrica da pipetagem da amostra e do conjugado (opcional)

Diluente de amostras (R6) e verificação da pipetagem da amostra durante a primeira fase A presença simultânea de (R6) e da amostra (ou controlo) poderá ser verificada através de uma leitura espetrofotométrica a 620 nm. Cada cavidade com (R6) e uma amostra (ou um controlo) em simultâneo deve possuir uma densidade ótica superior a 0,800. OBSERVAÇÃO: após a adição da amostra, o (R6) passa de púrpura a azul Verificação da pipetagem do conjugado (R7) durante a segunda fase Observação: o conjugado (R7) tem coloração verde. A presença de conjugado (R7) nas cavidades pode ser controlada através de leitura automática a 620 nm. O valor OD de cada cavidade deve ser superior a 0,300 (um valor inferior a este indica normalmente uma dispensa insuficiente do conjugado). Verificação da pipetagem da solução de desenvolvimento É possível verificar a presença de solução de desenvolvimento cor-de-rosa na cavidade através de leitura automática a 490 nm. Uma cavidade com solução de desenvolvimento deve ter uma densidade ótica superior a 0,100 (uma DO inferior indica uma distribuição insuficiente da solução de desenvolvimento). Ocorre uma alteração significativa da coloração das cavidades vazias de incolor para cor-de-rosa após a adição da solução de substrato e cromogéneo preparada.

8. LIMITAÇÃO DO TESTE

Devido às diversas respostas imunológicas dos pacientes infetados pelo vírus da hepatite C (especialmente durante as seroconversões), algumas diferenças de deteção podem ser observadas entre os testes, dependendo do tipo de proteínas antigénicas usadas. Um resultado negativo durante um teste de rastreio não exclui portanto a possibilidade de exposição ou infeção pelo vírus da hepatite C. De acordo com a literatura, os portadores de HCV submetidos a tratamento de imunossupressão ou co-infetados com HIV-HCV podem ter níveis particularmente baixos de anticorpos, abaixo do limite de deteção dos testes HCV . Qualquer técnica ELISA pode produzir falsas reações positivas. É recomendável verificar a especificidade da reação de qualquer amostra que se considere um positivo repetível, de acordo com os critérios de interpretação do kit Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3, utilizando um método adequado: utilizando um teste de rastreio de anticorpos anti-HCV ELISA isoladamente ou com um teste immunoblot de deteção de anticorpos anti-HCV para provar a presença de anticorpos anti-HCV. Se necessário, utilize um teste de biologia molecular para rastrear o genoma HCV. O método colorimétrico para verificar a deposição de amostras e/ou de conjugados e/ou de solução de desenvolvimento não permite verificar a precisão dos volumes distribuídos e apenas revela a presença da amostra e/ou dos conjugados e/ou da solução de desenvolvimento. A taxa de respostas erradas com este método está intimamente relacionada com a precisão do sistema utilizado (CV de pipetagem acumulados e leituras superiores a 10% poderão reduzir significativamente a qualidade da verificação). A utilização do teste Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 não está aprovada para conjuntos de amostras ou amostras diluídas. Excecionalmente, finas partículas poderão ser vistas no diluente de amostras (R6), sendo que a presença das mesmas não altera em caso algum a qualidade do reagente.

9. CARATERÍSTICAS DE DESEMPENHO

9.1. Medição precisa

A reprodutibilidade e precisão intermédia foram determinadas utilizando amostras com diferentes concentrações de anticorpos anti-HCV. As amostras foram testadas 30 vezes durante a mesma série de testes para determinar a repetibilidade. As amostras foram também testadas duas vezes durante 20 dias a uma taxa de 2 testes por dia. As médias de rácios, os desvios padrão e os coeficientes de variação (CV) foram calculados.

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9.1.1. Repetibilidade:

Amostras N Média de rácios Desvio padrão CV%

Negativo 30 0,12 0,006 4,5

Anti-HCV fracamente positivo 30 1,29 0,059 4,6

Anti-HCV fracamente positivo 30 1,33 0,112 8,4

Anti-HCV fortemente positivo 30 3,60 0,191 5,3

Os CV obtidos nas amostras positivas são inferiores a 10%.

9.1.2. Precisão intermédia

Amostras N Média

de rácios

Intra-análise Interanálise/operador Interdia Reprodutibilid

ade total

DP CV% DP CV% DP CV% DP CV%

Negativo 120 0,13 0,009 7,3 0,011 8,5 0,005 3,9 0,015 11,8

Anti-HCV fracamente positivo 120 1,40 0,053 3,8 0,119 8,5 0* N.A 0,130 9,3

Anti-HCV fracamente positivo 120 1,48 0,082 5,6 0,120 8,1 0* N.A 0,145 9,8

Anti-HCV fortemente positivo 120 3,57 0,141 4,0 0,173 4,8 0* N.A 0,223 6,2

*O valor negativo de variação é estimado em 0.

Os CV obtidos nas amostras positivas são inferiores a 15%.

9.2. Desempenho clínico O desempenho do Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 foi determinado através de testes de amostras provenientes de dadores de sangue, pacientes hospitalizados, pacientes com infeções agudas e crónicas pelo vírus da hepatite C e de pacientes com sinais clínicos não relacionados com a infeção pelo vírus da hepatite C, todos eles aleatórios. Os estudos foram realizados em 2 bancos de sangue, num hospital e na Bio-Rad.

9.2.1. Especificidade do diagnóstico

O estudo foi realizado em amostras de soro e plasma EDTA colhidas em 2 centros de dádiva e de dadores aleatórios. Também foi realizado um estudo de especificidade em amostras provenientes de pacientes hospitalizados. Todas as amostras foram testadas com um teste anti-HCV com a marca CE.

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Tabela 1: Teste de especificidade

População Local Tipo de amostra

Número

Amostras inicialmente

reativas (IR)

Amostras reativas

repetidas (RR)

Especificidade

(%)

Intervalo de confiança 95%

Dadores de sangue

#1 soro* 2.641* 2 2 2.636/2.638

#2 soro 537 1 1 536/537

plasma 2002 4 1 2.001/2.002

#1 + #2 5.180* 7 4 99,92%

5.173/5.177 99,80 – 99,98

Pacientes hospitalizado

s #3 soro 502 0 0

100% 502/502

99,30 – 100,00

* 3 dadores considerados indeterminados com o teste de referência foram removidos dos cálculos.

9.2.2. Sensibilidade do diagnóstico

A sensibilidade de diagnóstico foi estudada em 559 amostras de pacientes infetados com o vírus da hepatite C, entre as quais 465 representavam genótipos diferentes (1, 2, 3, 4, 5, 6). Entre estas amostras, 25 vieram de pacientes testados nas 24 horas anteriores à análise.

Tabela 2: Genótipos testados

Genótipos 1 2 3 4 5 6

Total (1, 1a, 1a/b, 1b)

(2, 2a/c, 2a, 2b, 2b/3)

(3, 3a, 3b, 3c) (4, 4a, 4a/c, 4a/c/d, 4c, 4e, 4h, 4n, 4r)

(5, 5a) (6, 6a, 6a/b, 6n)

N 230 51 107 63 8 6 465

A sensibilidade do diagnóstico sobre todas as amostras testadas é de 100% (559/559) com um intervalo de confiança de 95% de [99,3-100%].

Amostras provenientes de pacientes com uma infeção aguda: A sensibilidade clínica foi também estudada em 38 painéis de seroconversão comerciais (incluindo 9 perfis de capsídeo, 10 perfis NS3 e 19 perfis múltiplos) e comparada com um teste com a marca CE utilizado como referência. Entre as 38 seroconversões, 1 painel não foi detetado com o ensaio Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3 e com o ensaio de comparação. Nos 37 painéis detetados com o Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3, 11 seroconversões foram detetadas anteriormente, 25 apresentaram uma deteção equivalente e outra apresentou uma amostra posterior.

9.3. Estudo da especificidade analítica/reatividade cruzada

283 amostras potencialmente interferentes com anticorpos contra agentes patogénicos que poderiam levar a doenças infeciosas (citomegalovírus, vírus de Epstein Barr, VZV, vírus do sarampo, vírus da rubéola, vírus da papeira, vírus do herpes, vírus da gripe, vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, HIV 1/2, HTLV 1/2, sífilis, Toxoplasma gondii, Dengue, doença de Chagas), amostras do grupo de risco (pacientes de diálise, vítimas de cirrose não hepática, mulheres grávidas, mulheres multíparas) ou amostras provenientes de pacientes com distúrbios do sistema imunitário (auto-anticorpos, fatores reumatóides, anticorpos anti-rato e mielomas) foram testadas com o teste Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3. Nenhuma amostra foi considerada positiva com o teste Monolisa™ Anti-HCV PLUS Version 3. A especificidade observada nesta população-alvo é de 100% (283/283) e foi similar à especificidade de amostras clínicas.

9.4. Efeito "hook"

A existência de um possível efeito "hook" foi estudada através do teste a 5 amostras com elevadas titulações em diferentes diluições. A equivalência de resultados observada entre amostras não diluídas e amostras diluídas indica a ausência do efeito "hook".

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