MONOLISA® Total Anti HAV PLUS 2 platničky - 192 testov 72481 SÚPRAVA NA DETEKCIU A KVANTIFIKÁCIU CELKOVÝCH PROTILÁTOK PROTI HAV V SÉRE/PLAZME ENZÝMOVOU IMUNOANALÝZOU

Kontrola kvality výrobcu

Všetky vyrábané a distribuované reagencie podliehajú úplnému systému kontroly kvality počínajúc príjmom vstupných surovín až po konečný expedovaný výrobok. Každá šarža podlieha kontrole kvality a je dodaná na trh iba ak spĺňa schvaľovacie kritériá. Naša spoločnosť uchováva záznamy o výrobe a kontrole každej šarže.

sophieLOGO BIO-RAD

3

OBSAH

1. POUŽITIE

2. PRINCÍP TESTU

3. ZLOŽENIE SÚPRAVY (KITU)

4. POTREBNÝ MATERIÁL, KTORÝ NIE JE SÚČASŤOU DODÁVKY

5. ZDRAVOTNÉ A BEZPEČNOSTNÉ POKYNY

6. UPOZORNENIA

7. VZORKY

8. ROZPÚŠŤANIE REAGENCIÍ – VALIDITA – UCHOVÁVANIE

9. POSTUP ANALÝZY: KVALITATÍVNE A KVANTITATÍVNE METÓDY

10. ÚPRAVY SYSTÉMU

11. VÝPOČET A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV: KVALITATÍVNA METÓDA

12. VÝPOČET A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV: KVANTITATÍVNA METÓDA

13. SPEKTROFOTOMETRICKÉ OVERENIE PIPETOVANIA VZORKY A REAGENCIÍ (VOLITEĽNÉ)

14. PARAMETRE TESTU

15. LIMITY TESTU

16. POUŽITÁ LITERATÚRA

4

1 - POUŽITIE MONOLISA® Total Anti-HAV PLUS je kit (súprava) enzýmovej imunoanalýzy na detekciu a kvantifikáciu celkových anti-HAV protilátok v ľudskom sére alebo v plazme. Tento kit je možné použiť ako pomôcku pri diagnostike opakovanej a súčasnej infekcie vírusom hepatitídy A (HAV). Súpravu možno tiež použiť na stanovenie imunitného stavu pred vakcináciou a ku vyhodnoteniu stupňa ochrany po vakcinácii proti HAV. Po anti-HAV vakcinácii je možné anti-HAV protilátky detegovať zhruba po 2 týždňoch a obvykle po dobu niekoľkých rokov. Stanovenie hladín anti-HAV bolo štandardizované použitím štandardu WHO Anti-Hepatitis A Immunoglobulin 2nd International Standard, 1998. Pripravenosť sa vyjadruje v medzinárodných milijednotkách na mililiter (mIU/ml). Koncentrácia 20 mIU/ml je obvykle považovaná za prahovú, ktorá zaručuje pacientovi imunitu proti HAV infekcii. Hodnota 20 mIU/ml štandardnej priemernej absorbancie (uvádzaná v medzinárodnej norme World Health Organization Anti-Hepatitis A Immunoglobulin 2nd International Standard, 1998) sa používa ako hodnota cut-off (medzná hodnota). 2- PRINCÍP TESTU

Táto analýza je inhibičná enzýmová imunoanalýza založená na použití mikroplatničiek pokrytých monoklonálnou protilátkou proti HAV, antigénu a vzorky, a tiež enzýmového indikátora obsahujúceho chrenovú, peroxidázou značenú myšaciu monoklonálnu protilátku proti HAV.

1. Počas prvej inkubácie sa vzorky (alebo kontroly) a HAV antigén inkubujú spoločne 1 hodinu pri teplote 37 °C. Ak sú vo vzorke prítomné protilátky proti HAV, tieto protilátky vytvárajú komplex s činidlom HAV antigénu a bránia tak naviazaniu antigénu s protilátkami na tuhú fázu (mikroplatnička).

2. Na konci prvej inkubácie premývanie odstráni nenaviazanú vzorku, nenaviazaný HAV antigén a rozpustné HAV/anti-HAV komplexy.

3. Enzýmový indikátor, obsahujúci chrenovú, peroxidázou značenú myšiu monoklonálnu protilátku proti HAV, sa pridá do každej jamky a inkubuje jednu hodinu pri teplote 37 °C. Množstvo enzýmového indikátora, ktorý sa viaže na tuhú fázu prostredníctvom HAV antigénu a nasledujúca enzýmová aktivita, sú nepriamo úmerné anti-HAV protilátkam prítomným vo vzorke alebo kontrole.

4. Prebytočný enzýmový indikátor sa odstráni premytím a do každej jamky sa pridá TMB chromogén/substrátový roztok.

5. Po 30 minútach inkubácie pri izbovej teplote sa reakcia zastaví a urobí sa spektrofotometrické odčítanie pri 450/620-700 nm.

Nameraná absorbancia u jednej vzorky umožní stanovenie prítomnosti alebo kvantifikáciu celkového počtu anti-HAV protilátok v testovanej vzorke.

5

3 - ZLOŽENIE SÚPRAVY

Označenie Zloženie reagencií Balenie

R1 Mikroplatnička 12 x 8 stripov s jamkami potiahnutými monoklonálnými anti-HAV protilátkami 2 platničky

R2 Koncentrovaný premývací roztok (20 x)

Tris NaCl pufor, pH 7,4 Konzervačné činidlo: ProClin™ 300 (0,04%)

1 fľaštička (235ml)

R3 Negatívna kontrola Ľudské sérum, negatívne na anti-HAV protilátky, na HBs antigén, na anti-HCV protilátky a na anti-HIV 1-2 protilátky. Konzervačné činidlo: Azid sodný (< 0,1 %)

1 fľaštička (1,5 ml)

R4

Pozitívny štandard 20 mIU/ml Ľudské sérum, pozitívne na anti-HAV protilátky a negatívne na HBs antigén, na anti-HCV protilátky a na anti-HIV 1-2 protilátky, nariedené v zmesi ľudského séra negatívneho na anti-HAV protilátky. Konzervačné činidlo: Azid sodný (< 0,1 %)

1 fľaštička (3,0 ml)

R5

Pozitívna kontrola 80 mIU/ml Ľudské sérum, pozitívne na anti-HAV protilátky a negatívne na HBs antigén, na anti-HCV protilátky a na anti-HIV 1-2 protilátky, nariedené v zmesi ľudského séra negatívneho na anti-HAV protilátky. Konzervačné činidlo: Azid sodný (< 0,1 %)

1 fľaštička (1,0 ml)

R6 Vírusový antigén Tris pufor obsahujúci bielkovinu, HAV vírus a indikačné farbivo vzorky Konzervačné činidlo: ProClin™ 300 (0,1 %)

1 fľaštička (28 ml)

R7 Konjugát Tris pufor obsahujúci bielkovinu, anti-HAV konjugát potiahnutý peroxidázou a indikačné farbivo vzorky. Konzervačné činidlo: ProClin™ 300 (0,1 %)

1 fľaštička (26ml)

R8 Substrátový pufor peroxidázy Roztok kyseliny sírovej a octanu sodného, pH 4,0, obsahujúci H2O2 (0,015 %) a DMSO (4 %)

1 fľaštička (60 ml)

R9 Chromogén Farebný roztok obsahujúci tetrametylbenzidín (TMB) 1 fľaštička

(5 ml)

R10 Zastavovací roztok 1N roztok kyseliny sírovej 1 fľaštička

(28 ml)

4 - POTREBNÝ MATERIÁL, KTORÝ NIE JE SÚČASŤOU DODÁVKY • Destilovaná alebo deionizovaná voda. • Chlórnan sodný (bielidlo) a bikarbonát sodný. • Pijavý (filtračný) papier. • Jednorázové rukavice. • Ochranné okuliare. • Jednorázové skúmavky. • Automatické alebo poloautomatické, nastaviteľné alebo prednastavené pipety na objem 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl and

1 ml.

6

• Odmerné valce objemom 10 ml, 200 ml a 1000 ml. • Vortexové miešadlo. • Automatický*, poloautomatický* alebo manuálny čistič (premývačka) mikroplatní. • Vodný kúpeľ alebo suchý inkubátor* termostaticky nastaviteľný na teplotu 37 °C ± 1 °C. • Kontajner na kontaminovaný odpad. • Čítač mikroplatní* (vybavený 490, 620, 450/620 až 700 nm filtrami).

(*) Podrobnosti ohľadom ďalších informácií o potrebnom vybavení vám poskytne naše technické oddelenie.

5 - ZDRAVOTNÉ A BEZPEČNOSTNÉ POKYNY Všetky činidlá obsiahnuté v súprave sú určené na diagnostické použitie „in vitro“.

• Názov testu, ako aj špecifické identifikačné číslo testu sú uvedené na obale každej mikrotitračnej platničky. Toto špecifické identifikačné číslo je taktiež uvedené na každom stripe.

MONOLISA® Total Anti-HAV PLUS : Špecifické identifikačné číslo = 59. Pred každým použitím si overte špecifické identifikačné číslo. Ak toto číslo chýba, alebo sa líši od hore uvedeného čísla, strip nesmiete použiť.

• Pri manipulácii s činidlami a vzorkami používajte jednorázové ochranné rukavice, po manipulácii s nimi si starostlivo umývajte ruky.

• Nepipetujte ústami. • Ľudský zdrojový materiál použitý pri príprave negatívnej kontroly (R3), pozitívnej kontroly (R5) a pozitívneho

štandardu 20 mIU/ml (R4) bol otestovaný a zistilo sa, že je nereaktívny na povrchový antigén proti hepatitíde B (HBsAg), protilátky proti vírusu hepatitídy C (HCV) a protilátky proti vírusom ľudskej imunodeficiencie (HIV-1 a HIV-2 Ab). Pretože nie je známa žiadna metóda, ponúkajúca záruku neprítomnosti zdrojov infekcie, s činidlami aj so vzorkami pacientov narábajte opatrne tak, ako keby boli schopné prenášať nákazlivé choroby.

• Všetok materiál, ktorý prišiel do priameho kontaktu so vzorkami a reagenciami ľudského pôvodu, ako aj premývacie roztoky, je potrebné považovať za infekčné materiály.

• Zabráňte rozliatiu vzoriek či roztokov obsahujúcich vzorky. • Rozliatu kvapalinu je potrebné opláchnuť 10% roztokom oxidovadla (odfarbovacieho činidla). Ak je

kontaminovaný roztok kyselina, rozliatu kvapalinu najprv neutralizujte bikarbonátom sodným, vyčistite v bielidle a vysušte pijavým (filtračným) papierom. Materiál použitý na čistenie je potrebné zlikvidovať v nádobe na kontaminovaný odpad.

• Vzorky a činidlá ľudského pôvodu, vrátane kontaminovaných materiálov a produktov sa musia po dekontaminácii zlikvidovať: − buď ponorením na 30 minút do odfarbovacieho činidla s konečnou koncentráciou 5% chlórnanu sodného

(1 objem bielidla na 10 objemov kontaminovanej kvapaliny, alebo vody), − alebo autoklávováním pri teplote 121 °C najmenej počas 2 hodín.

POZOR : DO AUTOKLÁVU NEDÁVAJTE ROZTOKY OBSAHUJÚCE CHLÓRNAN SODNÝ. • Zabráňte kontaktu substrátového pufru, chromogénu a zastavovacieho roztoku s kožou alebo sliznicou.

Kartu bezpečnostných údajov materiálu dodáme na požiadanie. • Nezabudnite neutralizovať/spracovať v autokláve roztoky alebo tekuté oplachy, či iné kvapaliny obsahujúce

biologické vzorky predtým, ako ich vylejete do výlevky. • Niektoré činidlá obsahujú azid sodný. Táto látka môže reagovať s oloveným a medeným potrubím a vytvárať

vysoko výbušné azidy kovov. Na zabránenie akumulácie týchto azidov v potrubných armatúrach, prepláchnite potrubie veľkým množstvom vody, ak sa roztoky obsahujúce azid po inaktivácii likvidujú vylievaním do odpadov.

• Niektoré činidlá obsahujú ProClin™ 300 (0.04%, 0.1%) a/alebo 0.5%). Xi Dráždivý R43 : Môže vyvolať senzibilizáciu pri kontakte s kožou.

Xi Dráždivý S28-37: Po kontakte s kožou je potrebné kožu okamžite umyť mydlovou vodou. Používajte vhodné ochranné rukavice.

• Kartu bezpečnostných údajov materiálu výrobcu dodáme na požiadanie. 6 – UPOZORNENIA

7

Spoľahlivosť výsledkov závisí od korektného dodržiavania zásad správnej laboratórnej praxe:

• Reagencie nepoužívajte po uplynutí dátumu použiteľnosti. • Počas testu nemiešajte reagencie z rozličných šarží.

POZNÁMKA: Pre premývací roztok (R2, označenie štítku: 20x, zelená farba), substrátový pufor peroxidázy (R8, označenie štítku: TMB buf, modrá farba), chromogén (R9, označenie štítku: TMB 11x purpurová farba) a zastavovací roztok (R10, označenie štítku: 1N červená farba). Je možné použiť aj iné šarže, ako boli dodané s testom za predpokladu, že v priebehu konkrétneho testu nedôjde ku výmene šarže. Tieto činidlá sa dajú použiť aj s inými výrobkami našej firmy. Naviac, premývací roztok (R2, identifikácia na štítku: 20x, zeleno sfarbený) možno zmiešať s 2 inými premývacími roztokmi obsiahnutými v rôznych Bio-Rad reagenčných súpravách (R2, identifikácie na štítku: 10x, modro sfarbený, alebo 10x oranžovo sfarbený), ak sú správne pripravené, za predpokladu použitia iba jedného zmiešania v danom teste. Podrobnosti vám poskytne naše technické oddelenie.

• Pred použitím je potrebné počkať 30 minút, to je čas, kedy sa činidlá stabilizujú na izbovú teplotu. • Činidlá opatrne rozpustite, aby nedošlo ku žiadnej kontaminácii. • Test nevykonávajte za prítomnosti reaktívnych výparov (kyslé, alkalické alebo aldehydy), alebo prachu, ktoré

môžu pozmeniť enzýmovú aktivitu konjugátu. • Sklo používajte dôkladné umyté a vypláchnuté deionizovanou vodou, alebo použite radšej jednorázový

materiál. • Nedovoľte, aby mikroplatnička vyschla medzi skončením umývania a nanášaním reagencie. • Enzymatická reakcia je veľmi citlivá na akékoľvek kovy, alebo ióny kovov. V dôsledku toho sa nesmie žiadny

kovový prvok dostať do styku s rozličnými roztokmi obsahujúcimi konjugát alebo roztok substrátu. • Vyvíjajúci roztok (substrátový pufor + chromogén) sa musí sfarbiť do ružova. Zmena tejto ružovej farby počas

niekoľkých minút po rozpustení indikuje, že činidlo nie je použiteľné, a musí sa vymeniť. Príprava vyvíjajúceho roztoku prebieha v čistej, na tento účel vhodnej jednorázovej plastovej miske alebo sklenenej nádobe, ktorá musí byť najprv vymytá 1N HCl a dôkladne vypláchnutá destilovanou vodou, potom vysušená. Toto činidlo musí byť uskladnené v tmavom prostredí.

• Pre každé sérum používajte novú nanášaciu špičku. • Premývanie jamiek je kritický krok pri tejto procedúre: Dodržte odporúčaný počet premývacích cyklov a

zaistite, aby všetky jamky boli úplne naplnené a následne kompletne vyprázdnené. Nesprávne vymývanie môže viesť ku nepresným výsledkom.

• Nikdy nepoužívajte tú istú nádobu na rozdeľovanie konjugátov a vývojky. 7 – VZORKY

Vzorky krvi odoberte bežným spôsobom. Test je potrebné robiť s nezriedeným sérom, alebo plazmou (odobratých do antikoagulačných roztokov na báze EDTA, citrátu, ACD a heparínu). Vzorky obsahujúce komplexy je potrebné pred testovaním vyčistiť centrifugovaním. Suspendované fibrínové komplexy alebo častice môžu spôsobiť falošne pozitívne výsledky. Vzorky je potrebné skladovať pri +2-8 °C, ak sa skríning bude robiť do 7 dní, inak musia byť zamrazené pri teplote -20 °C. Vyhýbajte sa opakovaným cyklom zmrazenia/rozmrazenia. Ak je potrebné vzorky zaslať, zabaľte ich podľa pokynov pre transport etiologických činidiel a podľa možnosti zmrazené. NEPOUŽÍVAJTE KONTAMINOVANÉ, HYPERLIPEMICKÉ, ALEBO HYPERHEMOLIZOVANÉ SÉRA. POZNÁMKA: Vzorky obsahujúce až 60 g/l albumínu a 100 mg/l bilirubínu, lipemické vzorky obsahujúce až 36g/l trioleínu a hemolizované vzorky obsahujúce až 5 g/ml hemoglobínu neovplyvňujú výsledky testu.

Vzorky negatívne a pozitívne na protilátky proti vírusu hepatitídy A (HAV) boli testované pred a po 3 cykloch zmrazenia/rozmrazenia. Táto úprava nemá žiadny vplyv na detekciu protilátok.

8 - ROZPÚŠŤANIE REAGENCIÍ – VALIDITA – UCHOVÁVANIE

Pred použitím reagencií testovacej súpravy MONOLISA® Total Anti-HAV PLUS ich stabilizujte na dobu 30 minút pri izbovej teplote.

1) Reagencie pripravené na použitiu

Mikroplatnička (R1)

sophieR1 1 SK

8

Negatívna kontrola (R3) Pozitívny štandard 20 mIU/ml (R4) Pozitívna kontrola (R5) Vírusový antigén (R6) Konjugát (R7) Činidlo pred použitím homogenizujte.

2) Rozpúšťané činidlá

Koncentrovaný premývací roztok (20x) : R2 Nariedením 1:20 v destilovanej vode sa pripraví premývací roztok o pracovnej koncentrácii. Na jednu platničku o 12 stripoch pripravte 800 ml.

Vyvíjajúci roztok (vývojka) (R8 + R9) Pomocou reagencie R8 zrieďte reagenciu R9 v pomere 1:11 (napríklad: pridajte 1 ml reagencie R9 do 10 ml reagencie R8). Objem 10 ml postačí na 1 až 12 stripov. Homogenizujte.

3) Rozpúšťané reagencie pre kvantitatívny test: Pre kvantitatívny test pripravte rozsah hodnôt 40 a 10 mIU/ml nariedením R4 a R5 v R3 v pomere 1:2. Kalibračný rozsah pozostáva z nasledujúcich hodnôt: Cal 80 = 80 mIU/ml kalibrátor = R5 Cal 40 = 40 mIU/ml kalibrátor = R5 ½ nariedený v R3 (100 + 100 µl) Cal 20 = Pozitívny štandard 20 mIU/ml = R4 Cal 10 = 40 mIU/ml kalibrátor = R4 ½ nariedený v R3 (100 + 100 µl) Cal 0 = 0 mIU/ml kalibrátor = R3

4) Platnosť – uchovávanie Súpravu uchovávajte pri teplote +2-8 °C. Ak je dodržané uchovávanie pri tejto teplote, každá reagencia obsiahnutá v súprave môže byť používaná až do dátumu exspirácie, uvedeného na obale (s výnimkou zvláštnych pokynov). R mR2: Nariedený premývací roztok je stabilný po dobu 2 týždňov, ak je uchovávaný pri +2-30 °C. Koncentrovaný premývací roztok (R2) môže byť uchovávaný pri +2-30 °C. R8 + R9: Po zmiešaní sú tieto reagencie, uchovávané v temne pri izbovej teplote (+18-30 °C) stabilné po dobu 6 hodín.

9 - POSTUP ANALÝZY • Dôsledne dodržiavajte protokol. • Za účelom validácie kvality testu pri každom teste použite sérum negatívnej a pozitívnej kontroly. • Dodržiavajte zásady správnej laboratórnej praxe. Metódy 1) Starostlivo definujte plán nanášania a identifikácie vzorky. 2) Pripravte zriedený premývací roztok (zriedený R2) a pracovný pozitívny roztok antigénu (R5a + R5b). 3) Odstráňte rámik mikroplatničky a stripy (R1) z ochranného obalu. 4) Pridajte postupne priamo, bez predchádzajúceho premytia platničky:

- 100 µl vírusového antigénu (R6) do každej jamky

Pre kvalitatívnu analýzu: 50 µl negatívnej kontroly (R3) do jamky A1, 50 µl pozitívneho štandardu 20 mIU/ml (R4) do jamky B1, C1, D1, 50 µl pozitívneho kalibrátora (R5) do jamky E1, 50 µl vzorky 1 do jamky F1, 50 µl vzorky 2 do jamky G1, atď...

Pre kvantitatívnu analýzu: 50 µl CAL 0 do jamky A1, B1 50 µl CAL 10 mIU/ml do jamky C1, D1

sophieR1 2 SK

9

50 µl CAL 20 mIU/ml do jamky E1, F1 50 µl CAL 40 mIU/ml do jamky G1, H1 50 µl CAL 80 mIU/ml do jamky A2, B2 50 µl vzorky 1, čistej, alebo zriedenej, do jamky C2 50 µl vzorky 2 do jamky D2, atď...

Vzorky je možné rozriediť s negatívnou kontrolou R3 (Cal 0mIU/ml). Ak distribúcia (nanášanie) vzoriek prekročí 10 minút, doporučujeme nanášať negatívne a pozitívne kontroly až po vzorkách. Polohu kontrol je možné meniť v závislosti od použitého systému.

POZNÁMKA: Po pridaní vzorky sa jamky obsahujúce roztok vírusového antigénu (R6) a vzorky, alebo kontroly sfarbia z červenej farby na oranžovú. Prítomnosť vzorky v jamkách sa dá overiť spektrofotometrickým odčítaním pri 490 nm (jedna vlnová dĺžka). (Pozri časť 13 : SPEKTROFOTOMETRICKÉ OVERENIE PIPETOVANIA VZORKY A REAGENCIÍ).

5) Pokiaľ je to možné, zakryte mikroplatničku adhezívnou fóliou. Fóliu pevne pritlačte na celú platničku, aby sa zaistila tesnosť.

6) Platničku inkubujte v termostaticky nastaviteľnom vodnom kúpeli, alebo v inkubátore mikroplatničiek po dobu 60 ± 5 minút pri teplote 37°C ± 1°C.

7) Odstráňte adhezívnu fóliu. Odsajte obsah všetkých jamiek do nádoby na tekutý odpad. Do každej jamky pridajte 0,370 ml premývacieho roztoku. Umožnite, aby sa jamky navlhčili (počas 30 sekúnd). Znovu odsajte. Opakujte tento postup aspoň dvakrát (tj. celkom minimálne 3 premytia). Reziduálny objem musí byť menší než 10 µl (v prípade potreby vysušte platničku tak, že ju obrátite a položíte na filtračný papier). Pri použití automatickej čističky (premývačky) postupujte rovnako.

8) Do každej jamky rýchlo nadávkujte 100 µl roztoku konjugátu (R7). Konjugát sa musí pred použitím zatrepať. Platničku zakryte novou adhezívnou fóliou (pokiaľ je to možné) a inkubujte po dobu 60 ± 5 minút pri teplote 37 °C ± 1 °C. POZNÁMKA: V tomto kroku sa dá vizuálne kontrolovať distribúcia (dávkovanie) roztoku konjugátu, ktorý má fialovú farbu, spektrofotometrickým odpočtom pri 620 nm (Pozri časť 13: SPEKTROFOTOMETRICKÉ OVERENIE PIPETOVANIA VZORKY A REAGENCIÍ (VOLITEĽNÉ)

9) Odstráňte adhezívnu fóliu, odsajte obsah všetkých jamiek a premyte aspoň štyrikrát postupom uvedeným hore.

10) Pripravte vyvíjajúci roztok (vývojku) (Pozri časť 8: ROZPÚŠŤANIE ČINIDIEL).

11) Do každej jamky rýchlo nadávkujte 80 µl pripraveného roztoku substrátu (R8 + R9). Umožnite vznik reakcie v tmavom prostredí po dobu 30 ± 5 minút pri izbovej teplote (18 - 30°C). V priebehu tejto inkubácie nepoužívajte adhezívnu fóliu. POZNÁMKA: V tomto kroku sa dá vizuálne kontrolovať distribúcia (dávkovanie) roztoku vývojky, ktorý má ružovú farbu: Medzi prázdnou jamkou a jamkou obsahujúcou ružový roztok substrátu je zreteľný rozdiel vo farbe (Pozri časť 13: SPEKTROFOTOMETRICKÉ OVERENIE PIPETOVANIA VZORKY A REAGENCIÍ).

12) Pridajte 100 µl zastavovacieho roztoku (R10) použitím rovnakého sledu a rýchlosti nanášania, ktoré boli použité pre substrátový roztok. POZNÁMKA: V tomto kroku sa dá vizuálne kontrolovať distribúcia (dávkovanie) zastavovacieho roztoku, ktorý je bezfarebný. Po pridaní zastavovacieho roztoku sa ružový substrát odfarbí u negatívnych vzoriek, modro sfarbený substrát sa zmení u pozitívnych vzoriek na farbu žltú.

13) Spodnú časť platničky opatrne utrite. Pomocou platničkového snímača odčítajte optickú denzitu pri 450/620-700 najskôr 4 minúty po pridaní zastavovacieho roztoku a najneskôr 30 minút po zastavení reakcie.

14) Pred zaznamenaním výsledkov skontrolujte zhodu medzi odčítaním a mikroplatničkou a plánom nanášania vzorky a identifikácie.

10 - ADAPTÁCIA SYSTÉMU PREMÝVANIE: Na dosiahnutie maximálnej účinnosti testu starostlivo dodržiavajte popísané premývacie postupy.

U niektorých systémov je potrebné na dosiahnutie akceptovateľných validačných kritérií upraviť počet premývacích cyklov a objemov premývacieho roztoku.

11 - VÝPOČET A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV - KVALITATÍVNA METÓDA

Prítomnosť alebo neprítomnosť detegovateľných protilátok proti anti-HAV sa určí porovnaním nameranej absorbancie jednotlivých vzoriek s vypočítanou hodnotou cut-off (medzná hodnota).

10

1. Vypočítajte priemernú absorbanciu pre pozitívny štandard 20 mIU/ml (R4)

Príklad: Pozitívny štandard 20 mIU/ml (R4) Jamky Optická denzita (OD)

B1 0,689 C1 0,673 D1 0,680

OD celkom = 2,042

Celková optická denzita 2,042 Priemerná OD R4 = ---------------------------- = ---------- = 0,680

3 3

2. Vypočítajte pomer pre každú vzorku:

Pomer vzorky = priemerná OD R4 / OD vzorky 3. Validačné kritériá sú nasledujúce:

a) Pre negatívnu kontrolu R3: Hodnota nameranej absorbancie musí byť väčšia ako 1,0.

b) Pre pozitívny štandard 20 mIU/ml R4: Hodnota nameranej absorbancie pre každý R4 musí byť väčšia, alebo rovná 0,350.

Ak sa jedna z individuálnych pozitívnych hodnôt pozitívneho štandardu 20 mIU/ml líši o viac ako 30 % od priemernej hodnoty, ignorujte túto hodnotu a urobte nový výpočet s 2 zvyšnými hodnotami pozitívneho štandardu 20 mIU/ml. Priemerná hodnota nameraných absorbancí pozitívneho štandardu 20 mIU/ml delená nameranou absorbanciou negatívnej kontroly (priemerná OD R4 / R3 OD) musí byť menšia než 0,6.

c) Pre pozitívnu kontrolu R5: Hodnota nameranej absorbancie musí byť menšia ako 0,300. Hodnota pomeru pozitívnej kontroly (R5 pomer = priemerná OD R4 / R5 OD) musí byť väčšia ako 1,5 .

Ak nie je splnené aspoň jedno z týchto kritérií, test je neplatný.

4. Interpretácia výsledkov Vzorky s hodnotou pomeru menšou než 0,9 sa považujú za negatívne pre test MONOLISA® Total Anti-HAV PLUS. Vzorky s hodnotou pomeru väčšou, alebo rovnou 1,1 sa považujú za pozitívne pre test MONOLISA® Total Anti-HAV PLUS. Vzorky s hodnotou pomeru väčšou, alebo rovnou 0,9 a menšou než 1,1 je potrebné pred finálnou interpretáciou opakovane testovať. Po opakovaní analýzy sú vzorky považované za pozitívne v teste MONOLISA® Total Ant-HAV PLUS, ak je hodnota pomeru väčšia, alebo rovná 1,1. Vzorka je považovaná za negatívnu, ak je hodnota pomeru menšia ako 0,9. Ak je hodnota pomeru väčšia, alebo rovná 0,9 a menšia ako 1,1, interpretáciu vzorky nie je možné vykonať a nasledujúca vzorka sa musí otestovať.

12 - VÝPOČET A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV - KVANTITATÍVNA METÓDA

1. Vypočítajte priemernú absorbanciu každého kalibrátora

Príklad: CAL 40 mIU/ml Jamky Optická denzita (OD) G1 0,295 H1 0,292

OD celkom 0,587

Celková optická denzita 0,587 Priemerná OD cal 40 mUI/ml = --------------------------- = -------- = 0,2935

2 2

11

2. Validačné kritériá sú nasledujúce

a) Pre negatívnu kontrolu (Cal 0 mIU/ml): Hodnota nameranej absorbancie každej negatívnej kontroly R3 musí byť väčšia ako 1,0.

b) Pre pozitívny kalibrátor (Cal 20 mIU/ml): Hodnota nameranej absorbancie každej R4 musí byť väčšia ako 0,350. Priemerná hodnota nameraných absorbancí pozitívneho štandardu 20 mIU/ml delená nameranou absorbanciou

negatívnej kontroly (priemerná OD R4 / R3 OD) musí byť nižšia než 0,6.

c) Pre pozitívnu kontrolu R5 (Cal 80 mIU/ml): Hodnota nameranej absorbancie pre každú pozitívnu kontrolu R5 musí byť menšia ako 0,300. Hodnota pomeru pozitívnej kontroly (RR5 pomer = priemerná OD R4 / R5 OD) musí byť väčšia ako 1,5.

d) Priemerná OD Cal 0 > priemerná OD Cal 10 mIU /ml Priemerná OD Cal 10 > priemerná OD Cal 20 mIU /ml Priemerná OD Cal 20 > priemerná OD Cal 40 mIU /ml Priemerná OD Cal 40 > priemerná OD Cal 80 mIU /ml Ak nie je splnené aspoň jedno z týchto kritérií, test je neplatný.

3. Interpretácia výsledkov Optická denzita každého bodu rozsahu sa bod po bode vynesie do grafu na os x a na os y sa vynesie priradená koncentrácia protilátok proti HAV vyjadrená v mIU/ml. Koncentráciu protilátok proti HAV (mIU/ml) každej vzorky je možné určiť zaznamenaním optickej denzity (OD) vzorky na os x a vyznačením priesečníka na osi y. Z grafu odčítajte koncentráciu testovaných vzoriek. Ak bola vzorka zriedená, vynásobte získanú koncentráciu faktorom zriedenia. Vzorky s koncentráciou menšou ako 18 mIU/ml sa považujú za negatívne pre test MONOLISA® Total Anti-HAV PLUS. Vzorky s koncentráciou väčšou, alebo rovnou 22 mIU/ml sa považujú za pozitívne pre test MONOLISA® Total Anti-HAV PLUS. Vzorky s koncentráciou väčšou, alebo rovnou 18 mIU/ml a menšou ako 22 mIU/ml je potrebné pred finálnou interpretáciou opakovane testovať. Po opakovanom testovaní je vzorka s koncentráciou menšou ako 18 mIU/ml považovaná za negatívnu v teste MONOLISA® Total Anti-HAV PLUS. Vzorka s koncentráciou väčšou, alebo rovnou 22 mIU/ml sa považuje za pozitívnu. Ak je koncentrácia retestovanej vzorky väčšia, alebo rovná 18 mIU/ml a menšia ako 22 mIU/ml, interpretáciu vzorky nie je možné vykonať a nasledujúcu vzorku je potrebné otestovať.

13 - SPEKTROFOTOMETRICKÉ OVERENIE PIPETOVANIA VZORKY A REAGENCIÍ (VOLITEĽNÉ) OVERENIE PIPETOVANIA VÍRUSOVÉHO ANTIGÉNU (R6) A VZORKY Prítomnosť vzorky a roztoku vírusového antigénu (R6) v jamke sa overí spektrofotometrickým odčítaním pri 490 nm: Hodnota OD v každej jamke obsahujúcej roztok vírusového antigénu (R6) musí byť väčšia, alebo rovná 0,500. Po pridaní vzorky sa musí hodnota OD v každej jamke zvýšiť aspoň na 0,100. Verifikáciu pipetovania vzorky nie je možné použiť v prípade homogenizácie R6 so vzorkou.

POZNÁMKA: Po pridaní vzorky sa roztok vírusového antigénu R6 sfarbí z červenej farby na oranžovú. OVERENIE PIPETOVANIA KONJUGÁTU (R7) Prítomnosť konjugátu (R7) v jamke sa overí spektrofotometrickým odčítaním pri 620 nm: Hodnota OD každej jamky musí byť väčšia, alebo rovná 0,500.

POZNÁMKA: Konjugát R7 má fialové sfarbenie. OVERENIE PIPETOVANIA ROZTOKU VÝVOJKY (R8 + R9) Prítomnosť roztoku vývojky (R8 + R9) v jamke je možné overiť spektrofotometrickým odčítaním pri 490 nm: Hodnota OD v každej jamke musí byť väčšia, alebo rovná 0,100 (menšia hodnota OD znamená nedostatočné rozpustenie roztoku vývojky).

POZNÁMKA: Po pridaní roztoku vývojky dochádza k významnej zmene farby prázdnych jamiek – od bezfarebnej po ružovú. 14 - PARAMETRE TESTU

Funkčné charakteristiky (parametre) testu MONOLISA® Total Anti-HAV PLUS boli určené na 3 miestach (pracoviskách) testovaním vzoriek od náhodných darcov krvi, pacientov s infekciou HAV, komerčnými panelmi a sérokonverznými panelmi a následnými vakcinačnými panelmi.

12

A – Špecificita Zistená špecificita v sérii 561 náhodne vybraných vzoriek darcov krvi bola 100 % [99,47 – 100 %] (IC 95), 561/561. Okrem toho sa testovalo 700 vzoriek od pacientov (zamrazených, alebo nezamrazených). Bola zistená špecificita 100% [ 99,57 %-100 %] (IC 95), 700/700.

V sérii192 pacientov s rôznymi patologickými stavmi, alebo stavmi nesúvisiacimi s hepatitídou A (tehotné ženy, pozitívny reumatoidný faktor, antinukleárné protilátky, antimyšacie Ig, alebo iné vírusové, či bakteriálne infekcie) sa urobilo testovanie súbežne s komerčným EIA testom. Zistená zhoda medzi týmito 2 testmi bola 99,48 % (191/192). Zistená špecificita bola 100% (95/95). Jedna vzorka chrípkovej vakcíny bola pozitívna pri použití alternatívneho komerčného EIA testu a negatívna pri použití testu MONOLISA® Total Anti-HAV PLUS.

B - Citlivosť

Citlivosť bola testovaná na 424 pozitívnych vzorkách od darcov krvi a 1274 pozitívnych vzorkách z 3 rôznych miest (pracovísk). Pomocou testu MONOLISA® Total Anti-HAV PLUS sa testovalo 1698 vzoriek a porovnalo s komerčným EIA testom. Zistená citlivosť bola 100 % u vzoriek darcov krvi alebo vzoriek od pacientov. 3 komerčné HAV sérokonverzné panely a 12 následných vakcinačných panelov bolo tiež študovaných a porovnaných s EIA testom. Zistená zhoda medzi týmito 2 testmi bola 100 %.

C – Presnosť Kvantitatívne výsledky sú dané v mIU/ml a kalibrované podľa štandardu WHO Anti-Hepatitis A Immunoglobulin 2nd International Standard, 1998. Porovnávacia štúdia bola vykonaná testovaním koncentrácií 0, 10, 20,40 a mIU/ml získaných z WHO medzinárodného štandardu a kalibrátorov zo súpravy. Korelačný koeficient a sklon získanej korelačnej krivky sú 0,98 a 1,04.

D – Reprodukovateľnosť testu

Reprodukovateľnosť testu MONOLISA® Total Anti-HAV PLUS bola stanovená pri analýze 4 vzoriek: 1 negatívna vzorka a 3 HAV Ab pozitívne vzorky (nízka, stredná, vysoká).

Reprodukovateľnosť "intra-assay" (v rámci testu) bola vyhodnotená testovaním týchto 4 vzoriek 30 krát v jednom behu. Reprodukovateľnosť "inter-assay" (v sérii testov) bola vyhodnotená testovaním 4 vzoriek dvojmo (testovaním dvojice) počas 20 dní s frekvenciou 2 nezávislé cykly denne. Výsledky sú zobrazené v nasledujúcich tabuľkách:

Tabuľka 1: Reprodukovateľnosť testu „intra-assay“ (v rámci testu)

Vzorka Negatívna Slabo pozitívna Stredne pozitívna Vysoko

pozitívna Priemerná hodnota pomerov 0,43 2,25 3,08 4,29

Smerodajná odchýlka (SD) 0,02 0,15 0,19 0,19

Variačný koeficient (CV) % 4,87 6,50 6,29 4,47

Vzorka Negatívna Slabo pozitívna Stredne pozitívna Vysoko pozitívna

Priemerný titer 2,78 39,96 67,33 >80 Smerodajná odchýlka (SD) 1,21 2,69 5,26 ND

Variačný koeficient (CV) % 43,53 6,72 7,81 ND

13

Tabuľka 2: Reprodukovateľnosť testu „inter-assay“ (v sérii testov)

Vzorka Negatívna Slabo pozitívna Stredne pozitívna Vysoko

pozitívna Priemerná hodnota pomerov 0,45 2,13 3,43 4,80

Smerodajná odchýlka (SD) 0,03 0,29 0,33 0,49

Variačný koeficient (CV) % 6,31 13,68 9,61 10,23

Vzorka Negatívna Slabo pozitívna Stredne pozitívna

Vysoko pozitívna

Priemerný titer 3,10 38,91 71,88 >80 Smerodajná odchýlka (SD) 1,24 3,65 4,13 NA

Variačný koeficient (CV) % 39,96 9,38 5,75 NA

15 – LIMITY TESTU

Diagnóza infekčného ochorenia sa nesmie určovať na základe výsledku jedného testu. Na presnú diagnózu je potrebné zobrať do úvahy klinickú anamnézu pacienta, symptómy a výsledky sérologických vyšetrení. Bakteriálna kontaminácia vzoriek môže ovplyvniť hodnoty absorbancie vzoriek.

16 - POUŽITÁ LITERATÚRA• Costa-Mattioli Mauro, Di Napoli A, Ferré V, Billaudel S, Perez-Bercoff R, Cristina J : Genetic variability

of hepatitis A virus. Journal of General Virology (2003), 84, 3191-3201• Normann A, Jung C, Vallbracht A, Flehmig B : Time course of Hepatitis A Viremia and Viral Load in the

Blood of Human Hepatitis A Patients. Journal of Medical Virology 9999 :1-7 (2003)• Lutz G. Guertler : Virus safety of human blood, plasma, derived products. Thrombosis Research 107

(2002)S39-S45• Jennifer A. Cuthbert : Hepatitis A : Old and New. Clinical Microbiology Reviews, Jan. 2001, p. 38-58• Morag Ferguson, Dawn Sands, Nico Lelie : Hepatitis A Immunoglobin : An International Collaborative

Study to Establish the Second Intertional Standard. Biologicals Vol. 28, Issue 4, December 2000, p.233-240

• World Health Organization, departement of communicable Disease Surveillance and Response : He-patitis A. Who/cds/csr/edc/2000.7 (http://www.who.int/emc)

• Centers for Disease Control and Prevention (CDC) : Prevention of hepatitis A through active or pas-sive immunization, recommendations of the advisory committee on immunization practices (ACIP).MMWR october 01, 1999 /48(RR12) ;1-37

• Rosa M. Pinto, Juan F. Gonzalez-Dankaart, Gloria Sanchez, Susana Guix, M. Jose Gomara, MonicaGarcia, Isabel Haro, Albert Bosch : Enhancement of the immunogenicity of a synthetic peptide bea-ring a VP3 epitope of hepatitis A virus. FEBS Letters 438 (1998) 106-110

• Stanley M. Lemon : Type A viral hepatitis : epidemiology, diagnosis, and prevention. Clinical Chemis-try 43 :8(B) 1494-1499 (1997)

• Stanley M. Lemon and Leonard N. Binn : Serum neutralizing antibody response to hepatitis A Virus.The Journal of Infectious Diseseases Vol. 148, no. 6 December 1983

• Bertram Flehmig, Michael Ranke, Hans Berthold, Hans-Joachim Gerth : A Solid-Phase Radioimmu-noassay for Detection of IgM Antibodies to Hepatitis A Virus. The Journal of Infectious Diseases Vol.140, no. 2 August 1979

(GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)(FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro)(ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)(IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)(DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)(PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro)(SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik)(DK) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)(GR) - ����������� CE (�������� ������ 98/79/CE ��� in vitro ���������� ������� ����)(PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro)(LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų)(HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről)(EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta)(SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy)(CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro)(NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk)(RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro)(BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия)

IVD

(GB) - For in vitro diagnostic use(FR) - Pour diagnostic in vitro(ES) - Para diagnóstico in vitro(IT) - Per uso diagnostico in vitro(DE) - In-vitro-Diagnostikum(PT) - Para uso em diagnóstico in vitro(SE) - In vitro-diagnostik(DK) - In vitro diagnose(GR) - ��� in vitro ���������� ����(PL) - Do stosowania in vitro(LT) - in vitro diagnostikai(HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra(EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks(SK) - Na diagnostiku in vitro(CZ) - Pro diagnostiku in vitro(NO) - Til in vitro-diagnostikk(RO) - Pentru diagnostic in vitro(BG) - За ин витро диагностика

(GB) - Catalogue number(FR) - Référence catalogue(ES) - Número de catálogo(IT) - Numero di catalogo(DE) - Bestellnummer(PT) - Número de catálogo(SE) - Katalognummer(DK) - Katalognummer(GR) - ������ ���������(PL) - Numer katalogu(LT) - Katalogo numeris(HU) - Cikkszám(EE) - Katalooginumber(SK) - Katalógové číslo(CZ) - Katalogové číslo(NO) - Katalognummer(RO) - Număr de catalog(BG) - Каталожен номер

(GB) - Manufacturer(FR) - Fabricant(ES) - Fabricante(IT) - Produttore(DE) - Hersteller(PT) - Fabricante(SE) - Tillverkad av(DK) - Fremstillet af(GR) - ����������(PL) - Producent(LT) - Gamintojas(HU) - Gyártó(EE) - Tootja(SK) - Výrobca(CZ) - Výrobce(NO) - Produsent(RO) - Producător(BG) - Производител

(GB) - Authorised Representative(FR) - Représentant agréé(ES) - Representante autorizado(IT) - Distributore autorizzato(DE) - Bevollmächtigter(PT) - Representante Autorizado(SE) - Auktoriserad representant(DK) - Autoriseret repræsentant(GR) - ����������

��� �����������(PL) - Upoważniony Przedstawiciel(LT) - Įgaliotasis atstovas(HU) - Meghatalmazott Képviselő(EE) - Volitatud esindaja(SK) - Autorizovaný zástupca(CZ) - Zplnomocněný zástupce(NO) - Autorisert representant(RO) - Reprezentant autorizat(BG) - Упълномощен представител

(GB) - Batch code(FR) - Code du lot(ES) - Código de lote(IT) - Codice del lotto(DE) - Chargen-Bezeichnung(PT) - Código do lote(SE) - Batchnr(DK) - Batchkoden(GR) - ������� ��������(PL) - Numer serii(LT) - Serijos numeris(HU) - Gyártási szám(EE) - Partii kood(SK) - Číslo šarže(CZ) - Číslo šarže(NO) - Partikode(RO) - Număr de lot(BG) - Партиден номер

(GB) - Expiry date YYYY/MM/DD(FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ(ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD(IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG(DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT(PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD(SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD(DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD(GR) - �

������ ����� YYYY/MM/DD(PL) - Data ważności YYYY/MM/DD(LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD(HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN(EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP(SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD(CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD(NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD(RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ(BG) - Срок на годност година/месец/ден

(GB) - Storage temperature limitation(FR) - Limites de températures de stockage(ES) - Temperatura límite(IT) - Limiti di temperatura di conservazione(DE) - Lagertemperatur(PT) - Limites de temperatura de armazenamento(SE) - Temperaturbegränsning(DK) - Temperaturbegrænsning(GR) - �������� ��������� ���������(PL) - Temperatura przechowywania(LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai(HU) - Tárolási hőmérsékleti határok(EE) - Piirangud säilitustemperatuurile(SK) - Skladovacia teplota od do(CZ) - Teplotní rozmezí od do(NO) - Oppbevaringstemperatur(RO) - Limitele de temperatură la stocare(BG) - Температурни граници на съхранение

(GB) - Consult Instruction for use(FR) - Consulter le mode d'emploi(ES) - Consulte las instrucciones de uso(IT) - Consultare le istruzioni per uso(DE) - Siehe Gebrauchsanweisung(PT) - Consulte o folheto informativo(SE) - Se bruksanvisningen(DK) - Se instruktion før brug(GR) - ���������� ��� ������ �����(PL) - Sprawdź instrukcję(LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje(HU) - Olvassa el a használati utasítást(EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni(SK) - Katalógové číslo(CZ) - Viz návod k použití(NO) - Se bruksanvisninger(RO) - Consultati prospectul de utilizare(BG) - Виж инструкцията за употреба

Bio-Rad3, bd Raymond Poincaré92430 Marnes-la-Coquette - FranceTél.: +33 1 47 95 60 00 01/2009Fax.: +33 1 47 41 91 33 Code: 883561