MODULO GENETICA METODI PER LA RICERCA DI MUTAZIONI NEL DNA Lezione III.
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MODULO GENETICAMODULO GENETICAMODULO GENETICAMODULO GENETICA
METODI PER LA RICERCA DI METODI PER LA RICERCA DI MUTAZIONI NEL DNAMUTAZIONI NEL DNA
Lezione IIILezione III
Relazione tra condizioni patologiche umane ed elementi genetici
Linee Guida per I test genetici ISS
DIAGNOSTICI
•consentono di stabilire una diagnosi o di confermare un consentono di stabilire una diagnosi o di confermare un sospetto clinico in un individuo già affettosospetto clinico in un individuo già affetto
•permettono di stabilire un’associazione tra Malattia, permettono di stabilire un’associazione tra Malattia, Gene, Mutazione EreditariaGene, Mutazione Ereditaria
Validità Clinica: Validità Clinica: Sensibilità Sensibilità probabilità che il test sia positivo in probabilità che il test sia positivo in
soggetti con soggetti con la malattia, la malattia, SpecificitàSpecificità la probabilità che il test sia negativo la probabilità che il test sia negativo
in in soggetti senza la malattiasoggetti senza la malattia
PRECLINICI o PRESINTOMATICI
consentono di valutare se un soggetto asintomatico possa sviluppare in
futuro la malattia
VALUTAZIONE DELLA SUSCETTIBILITA’ GENETICA
consentono l’individuazione di genotipi che comportano un
aumento di rischio a sviluppare una determinata patologia in seguito
all’esposizione a fattori ambientali favorenti o alla presenza di altri
fattori genetici scatenanti Linee Guida per I test genetici ISS
INDIVIDUAZIONE DEGLI ETEROZIGOTI in caso di patologie autosomiche
recessive, finalizzate alla prevenzione della nascita degli
omozigoti
Linee Guida per I test genetici ISS
INDAGINI MEDICO-LEGALIconsentono l’accertamento o
l’esclusione di paternità e l’attribuzione di tracce biologiche a determinati individui, con un grado
di probabilità molto elevato
ITER PER UN TEST GENETICOITER PER UN TEST GENETICO
Fase preanalitica ACCETTAZIONE del CAMPIONE:
Consulenza genetica Consenso informato
Nome del paziente, Data di nascita, Luogo di nascita del paziente, dei genitori e dei nonni, Origine etnica, Storia familiare (raccomandata in tutti i casi)
Conoscenza dei test genetici da parte di chi richiede l’esame
Relazione tra condizioni patologiche umane ed elementi genetici
MUTAZIONI E MALATTIE GENETICHE MUTAZIONI E MALATTIE GENETICHE EREDITARIEEREDITARIE
Le mutazioni sono responsabili di un gran numero di Le mutazioni sono responsabili di un gran numero di malattie ereditarie (emofilia, fibrosi cistica, distrofia malattie ereditarie (emofilia, fibrosi cistica, distrofia muscolare, degenerazioni retiniche…)muscolare, degenerazioni retiniche…)
Isolare dall’intero genoma il tratto di DNA che si Isolare dall’intero genoma il tratto di DNA che si desidera studiaredesidera studiare
Ottenere molteplici copie (amplificazione) della Ottenere molteplici copie (amplificazione) della sequenza di interessesequenza di interesse
Presupposti necessari per lo studio di geni Presupposti necessari per lo studio di geni o di sequenze di interesseo di sequenze di interesse
Tecniche utilizzate nella diagnostica molecolare
Sequenziamento diretto
PCR CSGEDGGE
DHPLC
Mediante tecniche di biologia molecolare ogni Mediante tecniche di biologia molecolare ogni “segmento” di genoma di interesse può essere “segmento” di genoma di interesse può essere amplificato sufficientemente per analizzarne in amplificato sufficientemente per analizzarne in
dettaglio la sequenzadettaglio la sequenza
AMPLIFICAZIONE DEL GENE DI AMPLIFICAZIONE DEL GENE DI
INTERESSEINTERESSE
POLYMERASE CHAIN REACTIONPOLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)(PCR)
1983 1983 Kary Mullis scopre la reazione a catena Kary Mullis scopre la reazione a catena
mediata dalla polimerasimediata dalla polimerasi
1985 1985 Anno della pubblicazione del primo Anno della pubblicazione del primo
esperimentoesperimento
La PCR rivoluziona la biologia La PCR rivoluziona la biologia molecolaremolecolare
Il processo, ad alta efficienza, permette di Il processo, ad alta efficienza, permette di amplificare milioni di volte una sequenza specifica amplificare milioni di volte una sequenza specifica in 2-4 ore.in 2-4 ore.
CRESCITACRESCITA ESPONENZIALEESPONENZIALE2n n=numero di cicli
SEQUENZIAMENTOSEQUENZIAMENTO
manualemanuale
automaticoautomatico
PCRPCRDGGEDGGE
CSGECSGE
SSCPSSCP
TECNICHE DI
SCREENING
Wild-type
Paziente
Paziente
Wild-type
DHPLCDHPLC
AdeninaGuaninaCitosina
ddTimina
ddAdeninaddGuanina
ddCitosina
+
dNTP ddNTP marcati
LA REAZIONE AVVIENE IN UNA SOLA PROVETTA
SANGER IN AUTOMATICO
Timina
Ogni ddNTP è marcato con un diverso fluorocromo
SANGER IN AUTOMATICO
Denaturazione del prodotto di PCR
5’5’3’
3’
5’
5’
3’
3’
Primer 1
SANGER IN AUTOMATICO
Annealing del primer
Estensione: la DNA polimerasi inizia l’estensione del filamento a partire dall’estremità 3’ del primer in presenza di dNTPS e ddNTPS.
Primer 1
DNA polimerasi
SANGER IN AUTOMATICO
Estensione
Primer 1
DNA polimerasi
SANGER IN AUTOMATICO
L’elica del DNA viene estesa finchè non viene incorporato un ddNTP
Primer 1ddNTP
SANGER IN AUTOMATICO
L’elica neosintetizzata viene rilasciata e l’elica originale è pronta per essere estesa di nuovo.
ddNTP
SANGER IN AUTOMATICO
Si ripete il processo : denaturazione 95°
Primer 1
Annealing
Estensione 60°
25 CICLI
SANGER IN AUTOMATICO
La sintesi procede: grazie alla incorporazione casuale dei ddNTPs vengono sintetizzate centinaia di copie di DNA, ciascuna terminante con una diversa base. Ogni frammento neosintetizzato differisce dagli altri per una base in lunghezza.
27 basi
25 basi
26 basi
24 basi
28 basi
Gruppo di frammenti
SANGER IN AUTOMATICO
SANGER IN AUTOMATICO
PCR
Primer
Annealing
Estensione
A CT G
Taq e dNTPS AACACCACCGACCGTACCGTA
Eliminazione dei ddNTPs non incorporati
Preparazione gel di acrilammide
Elettroforesi
Analisi dei dati
Denaturazione
SANGER IN AUTOMATICO
Elettroforesi su gel di poliacrilammide mediante sequenziatore
Un laser eccita le molecole durante la loro migrazione
SANGER IN AUTOMATICO
Ogni fluorocromo emette ad una determinata lunghezza d’onda
Ognuno dei quattro ddNTPs è coniugato ad un fluorocromo di colore diverso: C, T, A, G
Il colore della banda che passa è registrato: i dati vengono inviati ad un computer che ne permette l’analisi
SANGER IN AUTOMATICO
ANALISI DEI DATI
ATGGCTGAAAATGCACCTG wild-type
ATGGCTGAAAATGCTTCTG paziente*
Wild-type
Paziente
R218C (652CT)
ANALISI DEI DATIANALISI DEI DATI
G>A: G1961EG>A: G1961E
C>A: C1177XC>A: C1177X
Wild-type
Paziente
Wild-type
Paziente
Interpretazione e Interpretazione e nomenclatura delle nomenclatura delle
mutazionimutazioni
ESEMPIO: nomenclatura per mutazioneESEMPIO: nomenclatura per mutazionedi splicing ivs24+1G>Tdi splicing ivs24+1G>T
ESEMPIO: nomenclatura per mutazioneESEMPIO: nomenclatura per mutazionemissense c. 2456G>A (p.Arg869His)missense c. 2456G>A (p.Arg869His)
ESEMPIO: nomenclatura per mutazioneESEMPIO: nomenclatura per mutazioneframeshift insC1065frameshift insC1065