Polimorfismi, mutazioni e metodi per evidenziarli.
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Polimorfismi, mutazioni e metodi
per evidenziarli
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Unità da 5 a 200 bp.Segmenti lunghi fino a qualche centinaio di chilobasi
DNA satellite
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Polimorfismi del DNA: microsatelliti
Allele A TACCAAGGTACACACACGGTACCATGG
Allele B TACCAAGGTACACACACACGGTACCATGG
Allele C TACCAAGGTACACACACACACGGTACCATGG
Allele D TACCAAGGTACACACACACACACGGTACCATGG
MinisatellitiUnità fino a 5 bp. Segmenti lunghi fino a 25 kb
MicrosatellitiUnità < 4bp. Segmenti lunghi fino150 bp
Allele A TACCAAGGTACGGACGGACGGACGGGGTACCATGG
Allele B TACCAAGGTACGGACGGACGGACGGACGGGGTACCATGG
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Perché i microsatelliti sono così polimorfici?
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Polimorfismi del DNA: SNP (single nucleotide polymorfism)
---ATGTTGAAGTTCAAGAATTCTGTGCGGAAC---
---ATGTTGAAGTTCAAGTATTCTGTGCGGAAC---
---ATGTTGAAGTTCAAGCATTCTGTGCGGAAC---
---ATGTTGAAGTTCAAGGATTCTGTGCGGAAC---
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Come evidenziare i polimorfismi?RFLP= restriction fragment length polymorphism
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Gli RFLP possono evidenziare sia polimorfismi dovuti a mutazione di singoli nucleotidi (che fanno comparire o scomarire siti di restrizione) sia polimorfismi di tipo minisatellite (VNTR = Variable Number of Tandem Repeats)
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I polimorfismi di tipo microsatellite possono essere evidenziati mediante PCR (STR = Short Tandem Repeat)
Due vantaggi principali rispetto agli RFLP: più facili da evidenziare (PCR), e molto più polimorfici (elevato tasso di eterozigosità)
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I marcatori polimorfici (soprattutto gli STR) sono stati estremamente utili per ottenere una prima mappa globale del genoma umano
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La mappa genetica ottenuta con i marcatori è fondamentale per mappare i geni responsabili di patologie umane (positional cloning)
La posizione di un gene malattia viene definita valutando la frequenza di ricombinazione del carattere fenotipico rispetto ai marcatori polimorfici disponibili (rivedere il concetto di linkage dalla genetica)
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I marcatori polimorfici sono molto usati nelle indagini di medicina legale (identificazionie di indivudui, attribuzione di paternità/maternità). In passato si usavano gli RFLP, oggi soprattutto gli STR (Test del DNA standard messo a punto dall’FBI= analisi di 13 marcatori STR altamente polimorfici). L’uso della PCR consente di fare diagnosi su tracce.
Quando il materiale biologico è troppo scarso o di qualità scadente, può essere utile analizzare i
polimorfismi del DNA mitocondriale (moltissime copie per cellula)
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Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o pochi) nucleotidi
Amplificazione della regione mediante PCR con oligonucleotidi fiancheggianti il punto di interesse e successiva digestione con enzimi di restrizione
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L’utilizzo combinato della PCR e dell’analisi di restrizione permette di diagnosticare specifiche mutazioni molto più facilmente che con il Southern Blot
Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o pochi) nucleotidi
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Amplificazione, mediante PCR, dot-blot e ibridazione con oligonucleotidi allele-specifici
AP1
P2
SP1
P2
PCR
Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o pochi) nucleotidi
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Amplificazione, mediante PCR, dot-blot e ibridazione con oligonucleotidi allele-specifici
Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o pochi) nucleotidi
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Amplificazione allele-specifica
Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli
(o pochi) nucleotidi
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Amplificazione (di DNA genomico o cDNA) e sequenziamento diretto.
Metodi per evidenziare polimorfismi di singoli (o pochi) nucleotidi
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L’utilizzo simultaneo della PCR e di traccianti fluorescenti consente l’analisi simultanea (multiplex) di
moltissimi polimoprfismi
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Diagnosi genetica pre-impianto
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Diagnosi genetica pre-impianto
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Diagnosi genetica pre-impianto
Possibile già oggi per malattie monogeniche per cui sia nota la mutazione
In futuro, almeno in teoria, è probabile che questa tecnica, in combinazione con l’analisi simultanea di
moltissimi polimorfismi, possa permettere una valutazione di tratti genetici complessi.
Quali i vantaggi, e quali i pericoli?