FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA

MICROBIOLOGIA

PRÁCTICA Nº4

TEMA:

MÉTODOS DE COLORACIÓN.

INTEGRANTE:

BENAVIDES BERMUDEZ, JESSICA FORONDA BURGOS, ANGELICA MORENO LOARTE ,MARIBEL NUÑEZ GABRIEL,GUISSELA PEREZ HUAMAN,VANESSA YNOFUENTE,MARLENE

DOCENTE:

Q.F PEDRO JACINTO HERVIAS

2015-I

INTRODUCCION

Los microorganismos, concretamente las bacterias, pueden observarse directamente al microscopio de campo claro. Sin embargo, debido al bajo contraste entre las células y su entorno, estos procedimientos se utilizan en ocasiones muy limitadas, como por ejemplo para la observación de la movilidad bacteriana. Los microscopios de contraste de fases, interferencia diferencial (DIC o la microscopía de Nomarski) y campo oscuro permiten aumentar el contraste, empleándose para la observación de vainas, filamentos u otras estructuras bacterianas. La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de tinción con diversos colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el contraste. En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La fijación, procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. La fijación por calor es la más utilizada para la observación de bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensión bacteriana extendida y seca, a través de una llama de un mechero. La fijación por calor preserva la morfología externa de los microorganismos pero no las estructuras internas. La fijación química con agentes como etanol, folmaldehido y ácido acético entre otros muchos, se utiliza para preservar las estructuras celulares. Se pueden utilizar dos tipos de procedimientos, la tinción positiva es la más frecuente, en ella un colorante se une a ciertas estructuras microbianas. Todos los colorantes utilizados en microbiología tienen en común la presencia de grupos cromóforos, grupos con dobles enlaces conjugados que son los responsables del color mediante la unión a estructuras celulares por enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos, los que establecen enlaces iónicos son los más frecuentes. Por otra parte, en la tinción negativa se utilizan compuestos que no penetran en las células sino que impregnan el medio circundante. Los microorganismos aparecen refringentes sobre un fondo negro.

COMPETENCIAS:

Capacitar y adiestrar al estudiante para realizar manualmente los diferentes métodos de tinción

Aprender a realizar frotis y preparaciones fijas de bacterias. Conocer los métodos de tinciones, aprender a realizar la técnica de tinción simple usada en bacteriología. Conocer y distinguir que es tinción diferencial así como aplicar la técnica de

Tinción de Gram.

MARCO TEORICO

MEDIOS DE CULTIVO

La mayor parte de los colorantes usados en Microbiología son de tres tipos: A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromóforo) es el anión llamados colorantes ácidos Ej. Eosinato de sodio ó Eosina. B) Aquellos cuyo cromóforo es el catión llamados colorantes básicos Ej. Cloruro azul de metileno. C) Los colorantes neutros, compuestos por básicos y ácidos Ej. Hematoxilina (básico) Eosina (ácido). En los trabajos bacteriológicos generalmente se usan colorantes básicos como el azul de metileno, cristal de violeta, fucsina básica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los colorantes derivados de la anilina. Las coloraciones pueden ser según el número de colorantes que utilizan: A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de lactofenol B) Diferenciales: cuando utilizan más de un colorante como la coloración de Gram, y Ziehl - Neelsen. C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares como la coloración de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora) etc

Clasificación de los medios de cultivo

En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel.

Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:

Medios naturales o complejos:

Constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.

Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida cualitativa y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación.

(Para bacterias como: Echerichia coli y Leuconostoc citrovorum)

De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:

Medios de enriquecimiento: Son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.

Medios selectivos: Son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.

(Para bacterias como Salmonella typhi y Clostridium botulinum)

Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos.

(Para bacterias como: Streptococcus pyogenes y Escherichia coli)

Por su composición los medios de cultivo se clasifican en:

Líquidos: conocidos como caldos, estos son especialmente útiles para hacer diluciones, para homogenizar mezclas de microorganismos, para enriquecer cultivos y para rehidratar cepas liofilizadas.

Sólidos: Para separar microorganismos y favorecer el desarrollo de las colonias aisladas en las que es posible observar las características típicas de un solo tipo de microorganismo.

Semisólidos: Son aquellos medios líquidos a los que se adiciona agar en concentraciones de 0.4 a0.8%. Estos se emplean para determinar la movilidad de los microorganismos microaerofílicos.Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles. Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:

Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad.

Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.

Utilizar materiales de vidrio bien lavado y enjuagado con agua destilada o desmineralizada.

Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.

 Almacenamiento de los medios de cultivo:

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25_), con poca humedad y protegidos de la luz solar di recta. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor; Los medios de cultivo deshidratados se deben descartar cuando se hidraten o decoloren. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8_C, a menos que el medio requiera alguna condición diferente. Se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación. Cuando se usa tapón de algodón se debe colocar por encima una envolturade papel (Craft).

 ESTERILIZACIÓN

Es un procedimiento que engloba un término absoluto que significa la total destrucción o remoción de toda forma de vida. Para medios de cultivo se usan altas temperaturas, vapor saturado a presión, algunos agentes químicos (muy pocos) y ciertos filtros y radiaciones U.V.Se dividen en métodos

1) Físicos

2) Químicos.

CICLO DE ESTERILIZACIÓN:

1.- Tiempo de calentamiento (en autoclave) de aproximadamente 20’ desde 20ºC (temperatura ambiente) a 121ºC.2.- Tiempo de penetración: tiempo que tarda el calor en llegar a todo el objeto (121ºC)3.- Tiempo de alojamiento: es el tiempo en que va a estar el objeto a esa Temperatura 121ºC4.- Tiempo de enfriamiento: de 121ºC a 60ºC

AGAR TRIPTICASA DE SOYA

Principio del método:

El agar tripticase de soya garantiza el crecimiento de todos los microorganismos de importancia microbiológica tanto grampositivos como gramnegativos, hongos y levaduras, este medio tiene múltiples usos puede ser utilizado para el monitoreo microbiológico de áreas y superficies, para el mantenimiento de cepas ATCC y para el análisis de aguas y alimentos. El agar tripticase de soya contiene caseína digerida con enzimas pancreáticas 5.0 g. caseína digerida con papaína 5.0 g. Cloruro de Na 5.0 g Agar 15.0 g pH final (7.3 +/- 0.2).

CRITERIOS DE DESEMPEÑO Y LIMITACIONES DEL MÉTODO

El agar Tripticase de Soya debe permitir el crecimiento abundante de todos los microorganismos en estudio después de 18 horas de incubación en atmósfera de aerobios.

COMPETENCIA:

Realizar un listado de los principales medios de cultivo y su aplicación, así como los indicadores mas usados

AGUA PEPTONADA: método usado como diluyente y para enriquecimiento bacteriano de productos alimenticio y otros materiales de interés sanitario.

UREA AGAR BASE: recomendado para la detección de la producción de ureasa , en particular por proteusvulgaris , micrococos y organismos paracolon

AGAR XLD:agar xilosa tisina desoxicolato para microbiología

BLOOD AGAR BASE BBL: (base para agar sangre)(agar infusión)Base para el aislamiento y cultivo de estreptococos y otros microorganismos más delicados.

SABOURAUD DEXTROSE AGAR: Base para el cultivo de hongos y microrganismos aciduricos.

AGAR TRIPLE AZUCAR HIERRO: base para diferenciación de bacilos étnicos gramnegativos.

PEPTONA, CALDO: incluye contenido trytophan alta utilizado como ingrediente en medios de cultivo útil para la producción comercial de mes Enzy, vacunas, antibióticos y otros productos.

VIOLETA ROJO Y BILIS AGAR: medio selectivo para la investigación presuntiva de coliformes, en alimentos y productos lácteos.

AGAR SS: para aislamiento de Salmonella y Shigella

PAPA GLUCOSADO AGAR: adecuado para el cultivo, aislamiento y recuento de hongos y levaduras en alimentos y otros materiales

AGAR NUTRIENTE: base para el cultivo de una amplia variedad de microrganismos.

AGAR MC CONKEY: base para el aislamiento y la diferenciación de microorganismos entéricos

MATERIALES Y EQUIPO:

Probetas Solución de NaOH Tripones con rejilla metálica Tubos estériles y placas, baguetas, beakers Papel indicador de pH Agar tripticase de soja (TSA) Autoclave

AGAR DE SOJA TRIPTICASE

PROCEDIMIENTO:

SEMBRADO

Pesar 2.4 gr de tripticase de soya:

40gr agar ………….1000 Ml

X……………60Ml H20 dest

x= 2, 4 gr de agar

Agregar el agua dest 60 Ml y el agar de soya 2.4

gr

Medir en una probeta 60 ML de agua destilada

Luego se agitó para que se disolviera completamente

el agar

Se mide el PH con la cinta indicadora, y como resultado

se obtuvo 6.5 y se agregó NaOH para ajustar el PH.

ESTERILIZACION

INCUBACION:

Se puso el envase, rotulado en autoclave

para ser esterilizar durante 30 minutos a

100°c se cierra la espita para que suba a 125°c, se apaga en 3 tiempos

Se separa en 2 placas Petri y también en 2 tubos de ensayo y

esperar a que se solidifique ya que es un agar.

RESULTADO:

Como resultado se obtuvo:

En el medio de cultivo no se observó ningún defecto alguno.

CONCLUSION

El resultado indica que el procedimiento se realizó perfectamente

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué importancia tiene el uso de los medios solidos?

El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los más importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriológico, agares

Luego son llevados a la incubadora por 24 h

purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiológico, por lo que es importante la ausencia de metales tóxicos.

Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.

2. ¿Qué sustancia es la encargada de solidificar los medios de cultivo?¿De dónde se extraen?

Agentes solidificantes

El agar es un polímero de la galactosa que es esterificado con ácido sulfúrico y se extrae de ciertas algas marinas rojas, las Rhodophyceae, debe estar limpio y libre de desechos. Se agrega a la solución acuosa del 1,5 al 2%.El medio agarizado comienza a fundir a los 100°C, si bien se mantiene líquido hasta los 45°C, en donde se comienza a solidificar.

La gelatina Es poco usada ya que a temperaturas altas se disuelve y por otra parte numerosos microorganismos lo digieren, se usa principalmente en microbiología de suelos. 

La Agarosa es un polisacárido neutro que junto con la agaro pectina es un producto de disociación del agar. Se usa en pruebas de difusión inmuno electroforética, donde la claridad es especialmente importante

BIBLIOGRAFIA:

http://marisol-marysebastian.blogspot.com/2012/04/preparacion-y-esterilizacion- de.html

http://aline-m-e-p.blogspot.com/2012/04/practica-2-preparacion-y- esterilizacion.html

http://www.ms.gba.gov.ar/sitios/laboratorio/files/2012/08/ESTERILIZACI %C3%93N-DE-MEDIOS-DE-CULTIVO.pdf

https://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/US/8808511(0703)ES.pdf

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/ 10_Preparaci%C3%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf