10 Curso Histoquimica Coloracion 1 1

5/24/2018 10 Curso Histoquimica Coloracion 1 1

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COLORANTES


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De forma genrica, todos los tejidos de

origen animal son incoloros salvo quecontengan algn tipo de pigmento, en

cuyo caso adoptan el color que aqul les

proporciona. As ocurre, por ejemplo, en la

piel, donde la melanina pigmenta de color

ms o menos pardo la epidermis y anejos

cutneos, o en la sangre y en todos los

tejidos vascularizados, a los que lahemoglobina confiere su caracterstica

coloracin roja o rosada.


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La primera utilizacin conocida de un agentecolorante para teir un tejido animal se debe a

Van Leeuwenhoek (1714), que emple unasolucin de azafrn en vino para facilitar laobservacin de las fibras musculares estriadasen sus preparaciones histolgicas. Ms tarde se

introdujeron como colorantes el carmn (Gopperty Cohn, 1849) y la hematoxilina (Waldeyer,1863). A partir de 1856 comienza la granexpansin mundial de la industria textil motivadapor la fabricacin de los primeros colorantesartificiales, los colorantes de anilina, querpidamente se extienden a los mtodos decoloracin para cortes histolgicos provocandoun vertiginoso desarrollo de la histotecnologa.


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El fundamento de cualquier mtodo detincin radica en la propiedad que poseen

todos los tejidos para incorporar y fijar demodo variable diversas sustanciascoloreadas llamadas colorantes.

La percepcin de los colores por la retinahumana est ligada a la capacidad queposeen sus fotorreceptores para captar laradiacin luminosa comprendida entre 400

y 800 nanmetros de longitud de onda ycuya mezcla homognea se denominaconvencionalmente luz blanca o espectrovisible de la radiacin solar.


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Cuando un cuerpo iluminado por la luz refleja ensu superficie toda la radiacin que recibe, laretina lo percibe de color blanco; si por elcontrario absorbe toda la radiacin emitida, sepercibe de color negro.

En el caso de que se produzca una absorcinparcial de la radiacin lumnica, los

fotorreceptores retinianos captan el espectrocomplementario de la radiacin absorbida,producindose la percepcin de los colores.

En otras palabras, puede decirse que el colorvisible es el complementario del color espectralabsorbido. Por ello y en sentido amplio, uncolorante puede definirse como una sustanciaque, puesta en contacto con un soporteadecuado, se une a l de forma perdurable

transmitindole su color.


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TIPOS DE COLORANTES

En funcin de su origen, se

distinguen dos tipos

fundamentales de colorantes:naturales y

artificiales


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Los colorantes naturales son

relativamente escasos y se obtienenen forma de extractos a partir de

ciertas plantas o insectos. En la

histotecnologa de rutina sonampliamente utilizados, siendo los

ms conocidos como colorantes

nucleares la hematoxilina y el carmn,y como colorantes citoplasmticos, la

safranina y la orcena.


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Los colorantes artificiales, en su mayor

parte derivados de la anilina (de rabe an-nil, azul oscuro) comenzaron a

introducirse en la segunda mitad de siglo

XIX, y hoy da en nmero de varios

centenares, constituyen la base denumerosas coloraciones histolgicas.

Aunque inicialmente se obtienen a partir

del alquitrn de carbn, en la actualidadse sintetizan en el laboratorio, por lo que

su gama crece continuamente.


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NATURALEZA QUMICA DE LOS COLORANTES:CROMOFOROS, CROMOGENOS Y

AUXOCROMOS

El soporte qumico fundamental de la mayorparte de los colorantes naturales y de latotalidad de los artificiales son anillos

aromticos derivados del benceno. El hechode que los dobles enlaces entre los tomos decarbono de estos anillos no sean fijos y, por

tanto, puedan ser reordenados, es la causa de

la gran diversidad posible de los derivados delbenceno y, en consecuencia, de los colorantes

de anilina.


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El benceno, al igual que todos los

hidrocarburos aromticos, es

originariamente una sustancia incoloraaunque susceptible de absorber radiacin

dentro del espectro de la luz ultravioleta.

Si en un momento determinado seproduce la fijacin de los dobles enlaces

dentro del anillo por ocurrir alguna

reaccin qumica sobre ste, el derivadobencnico que se obtiene puede absorber

radiacin luminosa dentro del espectro

visible y mostrar color.


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Los radicales qumicos responsables de

la modificacin molecular a la que se

debe la aparicin del color reciben elnombre genrico de gruposcromforos, reservndose ladenominacin de cromgeno para elconjunto formado por el grupo

cromforo ms anillo aromtico.

CROMGENO = grupocromforo +anillo

aromtico


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Debe tenerse en cuenta, sin embargo,

que cromgeno no es sinnimo de

colorante, ya que el primero no siempre

posee apetencia especfica por los

tejidos o, lo que es ms habitual, no se

liga fuertemente a ellos.


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En determinadas condiciones, un

colorante puede perder temporalmente

su capacidad para absorber radiacinlumnica dentro del espectro visible.

Ello ocurre por lo general a travs de un

proceso de reduccin del grupo

cromforo que lo transforma en un

leucoderivado. En estos casos, el color

suele reaparecer tras realizar unaoxidacin que restaura el grupo

cromforo.


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Los principales grupos

cromforos conocidos son

los radicales etileno (>C = CC=0),

tiazlico (>C=S),

imino (>C=N),

azoico (-N = N-),

nitroso (-N = 0),

nitro (-N02)

y en general cualquier anillo

derivado de las quinonas


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La conversin de un cromgeno en colorante

est vinculada a la adicin sobre la molcula

aromtica, de otros grupos atmicos que leconfieren la propiedad de disociarse

electrolticamente o de formar sales con los

tejidos. Estos radicales reciben la denominacin

genrica de grupos auxocromos opotenciadores de color, y por lo comn estndotados de carga elctrica, o lo que es igual,

poseen carcter cido o bsico, siendo los

responsables de que el colorante tenga mayor o

menor afinidad por la estructura que se va a

teir.


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Los grupos auxocromos de msimportancia son

los radicales hidroxilo (-OH),

carboxilo (-COOH), amino (-NH2),

sulfhidrilo (-SH) y

determinados iones metlicos derivados delhierro, cromo, aluminio, molibdeno, etc.


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CLASIFICACIN DE LOSCOLORANTES SEGN SUS

GRUPOS CROMOFOROS

En funcin del grupo cromgeno que

contienen, se distinguen 8 grandesgrupos de colorantes:


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a. Colorantes nitrados y nitrosados. Sonnitro (-NO2) o nitrosoderivados (-N = 0)del benceno o naftaleno con algunos

grupos hidroxilo, amino, etc. El ms

sencillo es el 2,4,6-trinitrofenol o cidopcrico, obtenido por nitracin del fenol.

La presencia de los tres grupos nitro

incrementa notablemente el carctercidodel grupo fenlico.


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b. Colorantes azoicos, que contienen el

cromforo -N = N- vinculando anillosadyacentes derivados del benceno o

antraceno. En general, se trata de

colorantes cidos, pero tambin los hay

neutros o bsicos. Pueden ser a su vez,

monoazoicos (orange G, cromotropo 2R,

ponceau de xilidina), o diazoicos (sudan

rojo y negro, rojo Congo, escarlata deBiebrich, azul tripn).


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c. Colorantes derivados de laantraquinona, obtenidos a partir de laoxidacin del antraceno para constituir

anillos quinnicos (rojo de alizarina S).

d. Colorantes derivados de la acridina yque contienen el cromforo >C = N-

(naranja de acridina).


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e. Colorantes derivados de iminasquinnicas, que poseen dos gruposcromforos y en funcin de ellos se

clasifican en:

a. derivados oxacnicos (galocianina, azul deNilo, violeta de cresilo);

b. derivados tiacnicos (tionina, azul demetileno, azur A, B y C, azul de toluidina,

tioflavina T), yc. derivados acnicos (rojo neutro, safranina

E, azocarmn


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f. Colorantes derivados del difenilmetano(auramina) y del trifenilmetano (fucsinas,

verde ligero), cuyo cromforo es el grupo>C=NH. Los colorantes de este grupo puedenser cidos o bsicos dependiendo de losauxocromos vinculados a la molcula.

g. Colorantes derivados del xanteno, concromforos variables entre los que seencuentra la pironina, rodamina y sulfaftalena)

h. Colorantes derivados de las ftalocianinas,

como el azul o amarillo alcin, que contienende dos a cuatro grupos de isotiouronioalrededor de un tomo de cobre para formaruna molcula que recuerda vagamente al anillohem- de la hemoglobina.


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Por lo comn, junto al nombre de los

colorantes y su designacin de grupo,figuran algunas siglas y ciertos cdigos

alfanumricos. Las primeras corresponden

a abreviaturas de caractersticas comunesa diversos colorantes, por ejemplo: B -azulado; G = verdoso; L = insensible ala luz; M = mezcla; R = rojizo; S =soluble; W = soluble en agua; Y =amarillento, etc.


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CLASIFICACION DE LOS COLORANTESSEGN SUS GRUPOS auxocromos Y

APETENCIA TISULAR

Se distinguen cinco grupos

fundamentales: colorantes bsicos,cidos, neutros, indiferentes y

metacromticos.


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COLORANTES BSICOS

Estn formados por la asociacin de uncromgeno de baja intensidad y carcter

dbilmente cido, con grupos auxocromos

catinicos fuertemente bsicos que son los

responsables de la carga global del colorante. Por este motivo se utilizan para colorear

estructuras acidas, principalmente contenidas

en el interior de los ncleos celulares en forma

de cidos nucleicos (lacas de hematoxilina,fucsina bsica, galocianina, etc.).


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COLORANTES CIDOS

Son productos de la unin de un

cromgeno de baja intensidad

dbilmente bsico con grupos

auxocromos cidos que confieren dicho

carcter al colorante. En general, tien

estructuras bsicas contenidas en los

citoplasmas celulares (eosinas, fucsina

acida, pironina, etc.)


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COLORANTES NEUTROS Se producen por la unin de carcter salino

entre colorantes cidos y bsicos para formarun precipitado, comnmente insoluble en agua ymuy estable en disolucin alcohlica. De estaforma, siendo su carga global neutra conservan

en parte la propiedad de colorear conjunta oseparadamente diversas estructuras.

Ello depende de que sean o no capaces deatrapar alguno de los iones generados cuando

la sal se disocia tras ser inestabilizada alcolocarla en disolucin acuosa (tincin deGiemsa). Las estructuras as coloreadasadquieren una tonalidad polcroma.


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COLORANTES INDIFERENTES

Son aquellos que no poseen un carctercido, bsico o salino definido, por lo que

habitualmente colorean los tejidos a travs

de un mecanismo por impregnacin fsica.


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COLORANTES METACROMATICOS En condiciones normales, la mayor parte de los tejidos

tienden a teirse con una tonalidad semejante a la del

colorante utilizado para su demostracin. Esta propiedadrecibe la denominacin de ortocromasia. Sin embargo,cuando se utilizan ciertos colorantes bsicos derivadosde la anilina, algunas estructuras tisulares se tien contonos de color totalmente distinto al que cabra esperar

por el colorante empleado (por ejemplo, grnulos de losmastocitos de coloracin roja con el azul de metileno ode toluidina). Este efecto se conoce con el nombre demetacromasia y las estructuras as teidas,cromtropas. Los colorantes metacromticos sonsustancias qumicamente puras y no de carcter salino.Por ello la explicacin ms comnmente aceptada paraeste fenmeno es la de que se produce unapolimerizacin entre las molculas de coloranteadyacentes a la estructura que se va a teir.


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MECANISMOS GENERALES DE LACOLORACIN

Segn la naturaleza de la vinculacinmolecular entre los colorantes y lostejidos, existen tres mecanismos

generales: de carcter fsico, fisicoqumicoo histoqumico.

Estos mecanismos combinados entre sen distinta medida explican lasparticularidades de las principalestcnicas de tincin en anatomapatolgica.


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Los mecanismos de carcterpuramente fsico estn ligados a laspropiedades de disolucin eimpregnacin del colorante sobre eltejido.

En el primer caso, el colorante es mssoluble en el tejido que en eldisolvente que acta como medio de

transporte, de forma que tiende apasar desde ste a aqul. Un ejemplocaracterstico de este tipo loconstituyen las tinciones para grasas.


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En el caso de la impregnacin, el

colorante, por su gran volumen molecularo por una precipitacin selectiva en forma

de agregados insolubles, queda atrapado

entre la malla de clulas y fibras queconstituyen los tejidos. Ejemplos tpicos

de impregnacin son algunas tinciones

argnticas para clulas nerviosas, as

como las coloraciones diferenciales para

fibras colgenas del tejido conjuntivo.


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Las tinciones ligadas a un mecanismo

principalmente qumico estnbasadas en el desarrollo de una

reaccin qumica entre el colorante

(comnmente un leucoderivado) y laestructura objeto de tincin de forma

que al interaccionar ambos se produce

un nuevo cromgeno responsable delcolor obtenido.


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Los mecanismos fisicoqumicos de

coloracin tisular estn vinculados a laformacin de uniones intermoleculares por

atraccin electrosttica o por fuerzas de

tensin superficial. Los primeros se basanen la propiedad de ligarse entre s que

poseen las molculas de carga elctrica

contraria, de manera que los colorantes

de carcter cido tien las estructuras

bsicas, y viceversa, por electroadsorcin.


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Los fenmenos de tensin superficial,

responsables de la interaccin molecularen los lquidos, son debidos a las fuerzas

de gravitacin generadas al disponerse

las molculas muy prximas entre s.

Este tipo de mecanismo tintorial est

implicado fundamentalmente en

coloraciones que utilizan molculas en

dispersin coloidal para interaccionar conagregados moleculares dispuestos en la

superficie de la estructura a colorear.


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COLORACIONES NUCLEARES

La mayor parte de las coloraciones que se utilizanhabitualmente en histopatologa contienen algncolorante que tie de manera especfica el ncleocelular, definiendo su contorno y realzando sucontenido cromatnico.

Con esta finalidad se utilizan generalmentecolorantes de carcter bsico con apetencia por losgrupos fosfricos cidos del ADN. Entre ellos seencuentran algunos colorantes artificiales como lagalocianina, el verde de metilo, el azul de alizarina

S, la fucsina bsica, el violeta de cresilo o el rojonuclear extra, si bien los de mayor importancia sonde origen natural como el carmn, la safranina ysobre todo la hematoxilina, que es el colorantenuclear por excelencia.


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Hematoxilinas

La hematoxilina es un colorante natural que se extraedel rbol hematoxylon campechianum, palo decampeche o palo azul de Centroamrica. Inicialmentefue utilizado para teir seda y lona, y en 1862 empez aemplearse en la coloracin de tejidos animales.

En el comercio se encuentra en forma de cristalesrosados o amarillentos solubles en agua y alcohol.

Tradicionalmente se ha mantenido que la hematoxilinaen su forma natural no es un colorante, pero losrecientes progresos de la qumica de los colorantes han

permitido establecer que pese a expenderse en formade leucocompuesto, la molcula de hematoxilina se uneespecficamente mediante puentes de hidrgeno adiversos sustratos entre los que se encuentran mltiplesderivados de la celulosa, si bien esta unin no generacolor.

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