Evaluación de la diversidad de bacterias degradadoras de...

i

Evaluación de la diversidad de bacterias degradadoras de hidrocarburos aisladas de suelos de las

cuencas de los ríos Otún y la Vieja.

HABIB FERNANDO YANINE Candidato Maestría Ciencias Microbiología

Director: Fabio Roldán, Ph.D. Director asociado: Daniel Uribe, Ph.D.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS

POSTGRADO MICROBIOLOGIA INTERFACULTADES

BOGOTA D.C., FEBRERO DE 2010

ii



HABIB FERNANDO YANINE Candidato Maestría Ciencias Microbiología

Trabajo de grado presentado como requisito Final para optar al título de Magister Scientiae en Microbiología

Director: Fabio Roldán, Ph.D.

Director asociado: Daniel Uribe, Ph.D.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS

POSTGRADO MICROBIOLOGIA INTERFACULTADES

BOGOTA D.C., FEBRERO DE 2010

iii

NOTA DE ACEPTACIÓN La presente tesis fue sustentada y aprobada para el grado de Maestría en Microbiología, el 26 de Enero de 2010. En constancia firman:

Jurado: Jairo Leonardo Cuervo Dr. Ciencias Agropecuarias Departamento de Agronomía Universidad Nacional de Colombia

Jurado: Wilson Terán Ph.D. Departamento de Biología Pontificia Universidad Javeriana

iv

A mi tío Farouk 1937-2009

Paso dado, paso asegurado.

A Carlos Andrés 1978-2009

Fácil… y con la izquierda.

v

AGRADECIMIENTOS

A Colciencias y la Vicerrectoria de Investigaciones de la Pontificia Universidad Javeriana por su apoyo para la

financiación, planeación, y ejecución de este proyecto.

Al centro de investigaciones y estudios en biodiversidad y recursos genéticos CIEBREG, por su apoyo logístico y

económico para la planeación y ejecución de este proyecto.

A la profesora Martha Raquel Fontanilla no solo por convertirse en una protectora sino por su denodano e inagotable

empeño de comunicarnos la alegría y pasión que emana de hacer bien lo que nos gusta y de nunca renunciar a ello.

A Socorrito Prieto, un ángel con los pies en la tierra, que con su cariño sin medidas, fortalece corazones, repara almas,

aliviana las cargas y desaparece el temor.

A Fabio Roldán Ph.D. y Daniel Uribe Vélez Ph.D., por su inmensa confianza, constante apoyo, completa comprensión y

calidez siempre presente.

A Erika García y Victoria Vallejo por facilitar mediante sus acciones que este proyecto pudiera ser realizado en su

totalidad.

A Lina Milena Sierra, no solo por su incondicional amistad, sino por su fidelidad, inmensa amabilidad y diligencia que me

facilitaron mi labor y me evitaron tantos problemas.

A Aydee Sofya Muñoz y Yamile Díaz, por siempre ser mí apoyo tanto personal como laboral, por ser mis ángeles de la

guarda.

A Javier Antonio Gómez, por hacer que todos los días fueran más amenos, por toda su paciencia, por toda su

comprensión, por su amistad.

A Carolina Díaz, Carolina Rubiano, Luisa Fernanda Bernal, Jacqueline Díaz, Patricia López, Karina Blanco y Gina López, por

convertirse en mi familia en el laboratorio; gracias a todas por su cariño, por sus sonrisas, y detalles diarios.

A María Magdalena Gómez y Gloria Acosta, por ser mí primer apoyo, por toda su confianza, por cuidarme tanto.

A Patricia Ahumada, por brindarme siempre todo su cariño, por su ternura, por sus detalles.

A Yamile Celis por sus pequeñas grandes ayudas en la consecución de materiales claves para la realización de este

proyecto.

Ana María Cubillos, por su ayuda en muestreo en campo, en documentación y en la estandarización de procesos de

biología molecular.

A Mauricio Romero, Margarita Gómez y Edson Ricardo Amaya por su apoyo y labor indispensable en la consecución de

las muestras de suelo.

A Amanda Varela, Ph.D. y Wilson Terán, Ph.D. por el tiempo dedicado a la revisión preliminar del presente trabajo.

vi

TABLA DE CONTENIDO

Pág.

LISTA DE ABREVIATURAS Y SIGLAS ix

LISTA DE TABLAS xi

LISTA DE FIGURAS xii

LISTA DE GRAFICOS xiii

RESUMEN xv

INTRODUCCION 16 1. TITULO 19

2. OBJETIVO GENERAL. 19

3 OBJETIVOS ESPECIFICOS. 19 4 PROBLEMA. 20 4.1 Formulación. 20 4.2 Planteamiento. 20 5 HIPOTESIS. 21 6 JUSTIFICACION. 22

7. MARCO TEORICO Y ANTECEDENTES 24

7.1 Hidrocarburos en la naturaleza. 24

7.1.1 Degradación microbiana de hidrocarburos. 25

7.2 DIVERSIDAD BACTERIANA 27

7.2.1 Diversidad bacteriana y ambiente. 28

7.2.2 Diversidad bacteriana en el suelo. 28

7.2.2.1 Efecto del tipo de suelo en la diversidad y estructura de comunidades

microbianas. 29

7.2.2.2 Efecto de la vegetación en la diversidad y estructura de comunidades

microbianas. 29

7.2.2.3 Efecto del tipo de manejo del suelo sobre la abundancia, diversidad y estructura

de comunidades microbianas. 30

7.3 MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD BACTERIANA. 32

7.3.1 Métodos dependientes de cultivo. 32

7.3.2 Métodos independiente de cultivo. 32

vii

7.3.3 Electroforesis en gel de gradiente denaturante (DGGE) en el estudio

de la diversidad bacteriana. 33

8 MATERIALES Y METODOS. 35

8.1 Área de estudio 35

8.2 Diseño de muestreo 36

8.2.1 Toma de muestra 38

8.3 Determinación de parámetros fisicoquímicos y ambientales in situ y ex situ. 38

8.3.1 Determinaciones in situ. 38

8.3.2 Determinaciones ex situ. 38

8.3.2.1 Determinación de pH del suelo. 38

8.3.2.2 Determinación de humedad del suelo. 38

8.3.2.3 Determinación de materia orgánica total. 38

8.3.2.4 Determinación de la distribución de agregados del suelo. 38

8.3.2.5 Determinación de la textura del suelo. 39

8.4 Recuento de microorganismos cultivables degradadores de hidrocarburos. 39

8.4.1 Recuento de microorganismos cultivables degradadores de HC por la técnica

de número más probable. 39

8.4.2 Recuperación y aislamiento de bacterias degradadoras de HC 40

8.5 Extracción de DNA a partir de cultivos puros de aislados de muestras

de suelo. 41

8.6 Amplificación de genes de DNAr 16S por PCR. 41

8.7 Análisis de ribotipos por separación diferencial mediante electroforesis

en gel de gradiente denaturante (DGGE). 41

8.8 Secuenciación de productos de amplificación. 42

8.9 Determinación de afiliación taxonómica. 42

8.10 Determinación de los índices de diversidad. 43

8.11 Elaboración de dendrogramas. 43

8.12 Evaluación de la relación entre la capacidad degradadora de hidrocarburos

totales de petróleo y diversidad genética en muestras de suelo. 43

8.12.1 Determinación de hidrocarburos totales de petróleo de las muestras

de suelo. 44

8.13 Análisis estadísticos. 44

8.13.1 Análisis multivariados. 44

9. RESULTADOS Y ANALISIS 46

9.1 VARIABLES FISICOQUIMICAS Y AMBIENTALES 46

9.1.1 Determinación de variables fisicoquímicas y ambientales relevantes. 47

9.1.1.1 Cuenca del rio la Vieja. 47

viii

9.1.1.2 Cuenca del rio Otún. 47

9.1.2 Análisis de variables fisiccoquimicos y ambientales para la cuenca del rio La Vieja 49

9.1.3 Análisis de variables fisiccoquimicos y ambientales para la cuenca del rio Otún. 52

9.2 RECUENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE HC POR LA TÉCNICA DE

NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP). 56

9.2.1 Cuenca del rio La Vieja 58

9.2.2 Cuenca del rio Otún 60

9.3 ANALISIS DE DIVERSIDAD DE GREMIOS DE DEGRADADORES DE HC 62

9.3.1 Cuenca del río La Vieja. 62

9.3.2 Cuenca del río Otún. 65

9.4 ANÁLISIS DE SIMILITUD DE GREMIOS DE BACTERIAS DEGRADADORAS DE HC. 68

9.5 RELACION ENTRE VARIABLES FISICOQUIMICAS Y AMBIENTALES Y COMPOSICION

DE GREMIOS. 73

9.6 ANÁLISIS DE RIBOTIPOS POR SEPARACIÓN DIFERENCIAL MEDIANTE

ELECTROFORESIS EN GEL DE GRADIENTE DENATURANTE (DGGE). 77

9.7 DETERMINACIÓN DE LA AFILIACIÓN TAXONÓMICA. 79

9.8 DINÁMICA DE LA COMPOSICIÓN DE GREMIOS EN LOS USOS DE SUELO 79

9.9 RELACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DEGRADACION CON LA DIVERSIDAD 85

10. CONCLUSIONES 92

11. RECOMENDACIONES 93

ANEXO A Ecuaciones para determinación de humedad, e índices de riqueza equitatividad y similitud 94 ANEXO B Caldo y medio de cultivo Bushnell y Hass 96 ANEXO C Soluciones y reactivos para DGGE 97 ANEXO D Ecuaciones para estandarización de datos y prueba de comparaciones múltiples de Siegel-Castellan 99 ANEXO E Matrices de correlación de variables biológicas, ambientales y fisicoquímicas para las cuencas de los ríos La Vieja y Otún. 100 ANEXO F Encuestas sobre manejo de cultivos de cafetal SS, pastizal y cebollares, en EM1 y EM2. 105 ANEXO G Matrices de riqueza y abundancia de especies para las fincas de las cuencas de los ríos Otún y La Vieja. 106

BIBLIOGRAFIA 108

ix

LISTA DE ABREVIATURAS Y SIGLAS

ARDRA: análisis de restricción de DNA ribosomal amplificado, del inglés: amplified ribosomal DNA

restriction analysis.

BLAST: Herramienta de búsqueda básica de alineamientos locales, del inglés basic local alignment

search tool.

BOA: bacterias oxidadoras de amonio.

DGGE: electroforesis en gel de gradiente denaturalizante, del inglés: denaturing gradient gel

electrophoresis.

DNA: ácido desoxirribonucleico, del inglés: desoxyribonucleic acid.

EM: evento de muestreo.

FAME: análisis de ácidos grasos metil éster, del inglés: fatty acid methyl ester analysis.

HC: hidrocarburos.

NMP: número más probable.

OTU: unidad taxonómica operativa, del inglés: operational taxonomic unit.

PCR: reacción en cadena de la polimerasa, del inglés: polymerase chain reaction

pb: pares de bases de DNA.

PAH: hidrocarburos policíclicos aromáticos, del inglés: polycliclic aromatic hydrocarbons.

PLFA: análisis de fosfolípidos de ácidos grasos, del inglés: phospholipid fatty acid analysis

RAPD: polimorfismos de DNA amplificado al azar, del inglés: random amplified polimorfic DNA.

RDP: proyecto base de datos ribosomal, del inglés: ribosomal database project.

rDNA : genes que codifican para RNA ribosomal (rRNA).

RISA: análisis de secuencia espaciadora intergénica ribosomal, del inglés: ribosomal intergenic

spacer analysis.

RNA: ácido ribonucleico, del inglés: ribonucleic acid.

rRNA: RNA ribosomal.

SSCP: polimorfismo conformacional de cadena sencilla, del inglés: single strand conformation

polymorphism.

SSU: subunidad pequeña del ribosoma bacteriano, del inglés small subunit.

x

sp.: especie.

TGGE: electroforesis en gel con gradiente de temperatura, del inglés temperature gradient gel

electrophoresis.

TPH: Hidrocarburos totales de petróleo, del inglés total petroleum hydrocarbons.

t-RFLP: polimorfismo de tamaño de fragmentos de restricción terminal, del inglés: terminal

restriction fragment length polymorphism.

UFC: unidad formadora de colonia.

XTT: sodio-2,3-bis-[2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazolio-5-carboxanilida.

xi

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Coordenadas geográficas de las fincas seleccionadas para el estudio según uso

del suelo en las cuencas del rio la Vieja y Otún. 37

Tabla 2. Programa de ciclos de amplificación de región V3 de rDNA 16S para los

iniciadores 341F GC y 907R. 42

Tabla 3. Número más probable (NMP) del recuento de bacterias degradadoras de HC

y logaritmo de NMP en los suelos de las fincas seleccionadas para el estudio. 57

Tabla 4. Índices de diversidad, dominancia y equitatividad según usos del suelo en

cada evento de muestreo en la cuenca del rio La Vieja. 63

Tabla 5. Índices de diversidad, dominancia y equitatividad según usos del suelo

en cada evento de muestreo en la cuenca del rio Otún. 66

Tabla 6. Taxa presentes por uso de suelo y evento de muestreo en la Cuenca del rio

La Vieja. 81

Tabla 7. Taxa presentes por uso de suelo y evento de muestreo en la Cuenca del rio

Otún. 84

Tabla 8. Taxa identificados en los suelos utilizados para pruebas de remoción de TPH’s. 89

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema de reacciones del catabolismo aerobio de hidrocarburos alifáticos.

Catabolismo del octano en Pseudomonas putida. 26

Figura 2. Esquema de reacciones del catabolismo aerobio de hidrocarburos aromáticos.

Catabolismo del benceno en Pseudomonas spp. 26

Figura 3. Localización geográfica de las fincas seleccionadas para el estudio. 37

Figura 4. Foto de un gel de poliacrilamida luego de un proceso de DGGE.

Gel poliacrilamida 6%, gradiente formamida-urea (30-60%). 77

Figura 5. Foto de un gel de poliacrilamida luego de un proceso de DGGE.

Gel poliacrilamida 6%, gradiente formamida-urea (30-60%). 78

xiii

LISTA DE GRAFICOS

Gráfico 1. Precipitación mensual promedio obtenida de series históricas por la estación climatológica El Agrado del municipio de Montenegro (Quindío). 36

Gráfico2. Proyección de las variables ambientales y fisicoquímicas de las fincas de la cuenca del rio La Vieja en el plano de factores. 46

Gráfico 3. Proyección en el plano de factores de las fincas muestreadas en la cuenca del rio La Vieja. 47

Gráfico 4. Proyección de las variables ambientales y fisicoquímicas de las fincas de la cuenca del rio Otún en el plano de factores 48

Gráfico 5. Proyección en el plano de factores de las fincas muestreadas en la cuenca del rio Otún. 49

Gráfico 6. Valores promedio para variables fisicoquímicas y ambientales por uso de suelo en la cuenca del rio La Vieja durante el estudio. 51

Gráfico 7. Valores promedio para variables fisicoquímicas y ambientales por uso de suelo en la cuenca del rio Otún durante el estudio. 54

Gráfico 8. Número más probable de bacterias degradadoras de HC por uso de suelo en la cuenca del rio La Vieja durante el estudio. 58

Gráfico 9. Número más probable de bacterias degradadoras de HC por uso de suelo en la cuenca del rio Otún durante el estudio. 60

Gráfico 10. Índices de diversidad de Shannon según usos del suelo en la cuenca del rio La Vieja. 63 Gráfico 11. Índices de diversidad de Shannon según usos del suelo en la cuenca del rio Otún. 66 Gráfico 12. Dendrograma de asociación de usos del suelo en la cuenca del rio La Vieja mediante índice de asociación de Raup-Crick. 68 Gráfico 13. Análisis correspondencia. Proyección en el plano de dimensiones de las fincas muestreadas en la cuenca del rio la Vieja. 69

xiv

Gráfico 14. Dendrograma de asociación de usos del suelo en la cuenca del rio Otún mediante índice de asociación de Raup-Crick. 70 Gráfico 15. Análisis correspondencia. Proyección en el plano de dimensiones de las fincas muestreadas en la cuenca del rio Otún. 71 Gráfico 16. Dendrograma de asociación de usos del suelo en el EM1 mediante índice de asociación de Raup-Crick. 72 Gráfico 17. Dendrograma de asociación de usos del suelo EM2 mediante índice de asociación de Raup-Crick. 73 Gráfico 18. Análisis de correlación canónica. Proyección de las fincas, variables fisicoquímicas y ambientales para la cuenca del rio La Vieja. 74 Gráfico 19. Análisis de correlación canónica. Proyección de las fincas, variables fisicoquímicas y ambientales para la cuenca del rio Otún. 76 Gráfico 20. Distribución porcentual de los phyla representados por los aislamientos obtenidos en las cuencas de los ríos La Vieja y Otún. 79 Gráfico 21. Porcentajes promedio de mgTPH/gps removidos en cada tratamiento. 85 Gráfico 22. Gráfico agrupado de mgTPH/gps degradado e índice de Shannon para cada tratamiento. 86 Gráfico 23. Relación entre la cantidad de mg TPH/gps removidos y la diversidad expresada con el índice de Shannon. 87 Gráfico 24. Gráfico agrupado de mgTPH/gps degradado y logaritmo del NMP de bacterias degradadoras para cada tratamiento. 87 Gráfico 25. Relación entre la cantidad de mg TPH/gps degradados y el logaritmo del NMP de bacterias degradadoras en los tratamientos. 88

xv

RESUMEN

En el presente trabajo se evaluó el efecto del uso del suelo, sobre la densidad y diversidad de

bacterias degradadoras de hidrocarburos (HC) y su la relación con la capacidad de degradación de

HC. Se seleccionaron los usos de suelo: bosque, pastizal y cafetal sin sombrío en la cuenca del rio

La Vieja, y bosque, cebollar y plantación forestal de pino en la cuenca del rio Otún. Se realizó un

evento de muestreo en época lluviosa y otro en época seca. La densidad de bacterias se evaluó

mediante la técnica de NMP en medio Bushnell-Hass, suplementado con diesel y usando XTT como

indicador de actividad. Las bacterias fueron recuperadas en agar nutritivo y se verificó la capacidad

degradadora de cada aislado mediante cultivos consecutivos en agar Bushnell-Hass en atmosfera

saturada de diesel. La afiliación taxonómica de los aislados, se realizó por secuenciación de una

región de gen rDNA 16S. Para evaluar la relación entre diversidad y capacidad degradadora, suelos

con diversidad inicial conocida fueron contaminados con 20.000 mg diesel/kg suelo y se evaluó el

contenido inicial y final de hidrocarburos totales luego de 45 días. No se observaron diferencias

significativas en densidad ni en diversidad entre los usos de suelo y entre épocas climáticas,

aunque se observó la tendencia a que suelos de pastizal y cebollar tuvieran mayores densidades y

fueran más diversos. El análisis de correspondencia y la secuenciación, mostraron que el uso de

intensivo del suelo como pastizal y monocultivos con o sin rotación, así como el cambio en la

época climática, conllevó cambios en la composición de los gremios de degradadores de

hidrocarburos, que pueden ser indicativos de cada uso y época climática. El análisis de correlación

canónica determinó que la estructura de los gremios no estuvo determinada ni por factores

ambientales, ni por las propiedades fisicoquímicas del suelo, pero pueden estar relacionadas con

el uso del suelo. La capacidad degradadora de hidrocarburos, se relacionó con la diversidad pero

no con la densidad de organismos degradadores de hidrocarburos, y puede estar relacionada con

la historia de uso del suelo y la vegetación. Se reportan especies de bacterias degradadoras de HC

que antes no habían sido asociadas con esta función.

16

INTRODUCCIÓN

El complejo ecoregional Andes del Norte en nuestro país, dentro del cual se localiza la ecoregión

cafetera, ha experimentado desde el siglo pasado, alteraciones producto de las actividades de

explotación humana de bienes y servicios ambientales, que han conllevado a la fragmentación de

los ecosistemas naturales, por la expansión de la frontera agrícola; esto ha conducido a que las

zonas de boque hayan llegado en la actualidad a representar solo el 30% del área en esa zona,

estando el 70% restante representado por usos del suelo para actividades pecuarias y agrícolas

como ganadería, cafetales, cañaduzales, cebollares y plantaciones forestales de pino (Rodriguez,

2009). La transformación del paisaje y el cambio en el uso del suelo constituyen factores

determinantes en la pérdida de fertilidad y calidad del suelo, la modificación de nichos ecológicos

y la reducción de la diversidad biológica.

Los microorganismos son un componente muy importante del suelo, dada su alta abundancia

(cerca de 109 individuos por gramo de suelo), su alta diversidad aparente (un mínimo de 6000 a

38000 genomas por gramo)(Curtis, 2002) y la multiplicidad de funciones metabólicas implicadas

en procesos ecosistémicos que incluyen: ciclos biogeoquímicos, la transformación y mineralización

de materia orgánica y la degradación de compuestos xenobióticos, (Torsvik et al., 1990; Whitman

et al., 1998; Schloter et al., 2003) funciones que en muchos casos son realizadas exclusivamente

por bacterias.

La interacción existente entre los productores primarios (i.e, plantas, microalgas, cianobacterias) y

los microorganismos descomponedores, la cual en muchos casos es especie-especifica, contribuye

a la estabilidad y fertilidad del suelo. La composición de las comunidades bacterianas no sólo está

determinada por las características fisicoquímicas del suelo, sino también por las poblaciones

vegetales que éste sustenta (Garveva et al., 2004), siendo la rizósfera un ambiente propicio para la

proliferación de poblaciones de heterótrofos. Dada esta estrecha relación, los microorganismos

han sido postulados como indicadores de peturbaciones en la calidad del suelo producto del

cambio en las coberturas vegetales y por ende del uso del mismo.

El estudio de los microorganismos edáficos está frecuentemente enfocado a las variaciones de la

densidad y diversidad de grupos funcionales implicados en ciclos biogeoquimicos del carbono,

nitrógeno y fosforo, como lo son los hongos y bacterias celuloliticas, proteolíticas y ligninoliticas,

bacterias denitrificantes, bacterias fijadoras de nitrógeno y bacterias solubilizadores de fósfatos

(Roldán, 2009). Implicados en el ciclo biogeoquimico del carbono, se encuentran los

microorganismos degradadores de hidrocarburos (HC), los cuales desempeñan un papel

fundamental y exclusivo, en la mineralización de este tipo de compuestos. A pesar de la creencia

generalizada que los organismos degradadores de HC solo pueden ser encontrados en lugares

17

expuestos a contaminaciones agudas o crónicas con derivados del petróleo, las bacterias

degradadoras de HC son considerados microorganismos cosmopolitas en ecosistemas edáficos y

acuáticos (Leahy y Colwell, 1990).

Los HC son una clase de compuestos naturales que no solo pueden ser encontrados en

áreas contaminadas por petróleo y sus derivados, sino que pueden ser halladas en

cantidades relativamente pequeñas en suelos y sedimentos, derivados de la biosíntesis por

parte de plantas (Kolattukudy, 1970), insectos (Stanley-Samuelson y Nelson, 1993) y algunos

microorganismos (e.g., bacterias, levaduras, hongos miceliales y microalgas) (Ladygina et al.,

2006), y son considerados como los compuestos de origen natural más estables (Eugene,

2006). Una fuente importante de HC en suelo, la constituye la capa cerosa que recubre

algunas estructuras vegetativas en plantas, así como polifenoles y resinas presentes en

acículas de coníferas. La degradación de estas ceras por parte de algunos animales es

limitada, siendo los microorganismos los que logran la mineralización completa. A nivel

interno de la región vegetativa de la planta, los HC pueden ser encontrados como parte de

la lignina, la cual en el suelo puede unirse a partículas de arcilla y ser degradada por bacterias

de los géneros Pseudomonas spp., Xanthomonas spp., Acinetobacter spp., Bacillus spp.,

Arthrobacter spp., Micrococcus spp. y Bacillus spp.

La respuesta de la microflora edáfica ante disturbios externos que pueden modificar las

condiciones ambientales, suele estar representada por cambios en las tasas metabólicas, en la

biomasa o en la estructura de las comunidades. Los cambios en las comunidades bacterianas

pueden obedecer a la entrada de nuevas poblaciones o de nutrientes como carbono (Drenovsky et

al., 2004), a cambios en propiedades fisicoquímicas del suelo por disturbios de origen

antropogénico o natural, (Wu et al., 2004), a cambios en variables ambientales (Grüter et al.,

2006), aplicación de fertilizantes (Susuki et al., 2005) o compuestos xenobióticos (Chen et al.,

2007). A su vez los agro-ecosistemas tropicales generan procesos de degradación del suelo por

pérdida de carbono y nitrógeno en la biomasa vegetal, agotamiento de nutrientes y reducción de

la capacidad de retención de agua. Aunque en muchos casos sea el tipo de suelo el determinante

de la composición de las comunidades bacterianas, en otros casos es el tipo de manejo el

parámetro más relevante en la diversidad bacteriana. La diversidad bacteriana puede verse

reducida por procesos como el arado (Bruns et al., 1999) o puede incrementarse en suelos con

rotación de cultivos (Yao et al., 2006).

Para el estudio de las comunidades microbianas se han empleado diversas estrategias que pueden

basarse en métodos de cultivo de los organismos o más recientemente en herramientas

moleculares independientes del cultivo de los mismos.

Los estudios de diversidad microbiana pueden enfocarse en una descripción funcional de las

comunidades, caracterizando grupos específicos (e.g. fijadores de nitrógeno, denitrificantes,

18

nitrificantes, sulfato reductores, sulfuro oxidadores o degradadores de hidrocarburos) (Muyzer,

1999); para ello se vale del estudio de genes implicados en rutas metabólicas específicas y lo

suficientemente conservadas dentro del grupo, para identificar taxonómica y filogenéticamente a

las poblaciones implicadas. También puede seguirse una descripción general de la comunidad,

caracterizando genes implicados en procesos o estructuras con una función esencial, distribuida

universalmente, cuyo cambio en la secuencia refleje la historia evolutiva del organismo y que sea

altamente conservado (e.g., genes ribosomales, genes de polimerasas de RNA).

El uso de técnicas dependientes de cultivo es reconocido por su selectividad, reflejando en

ocasiones microorganismos con fenotipos muy diferentes a los presentados in situ, lo cual puede

deberse a la limitación de las técnicas actuales de cultivo de reproducir las condiciones

ambientales específicas. Esto tiene como consecuencia una subestimación de la riqueza y

abundancia tanto de las especies como de las funciones que éstas desempeñan. Se calcula que el

porcentaje de organismos cultivables conocidos representa aproximadamente del 0,1% a un

máximo de 10% del total de especies en todos los hábitats (Davis et al., 2005). Es así como el

aislamiento de cepas y su caracterización feno y genotípica conlleva a un conocimiento limitado y

sesgado de la composición de las comunidades.

Por ello se han planteado estrategias de estudio a nivel de comunidades utilizando técnicas

independientes de cultivo. Los análisis moleculares usando ácidos nucleicos han permitido el

desarrollo de técnicas que ya no necesitan del aislamiento y cultivo de organismos, reduciendo la

subestimación inherente al cultivo in vitro. Estas técnicas implican la lisis celular, extracción de

ácidos nucleicos y el análisis de genes específicos o el análisis a nivel de genoma de muestras

ambientales. Las herramientas moleculares pueden igualmente proporcionar información que

permite relacionar las diferentes medidas de diversidad ambiental (riqueza y abundancia) con los

análisis de ecología de las poblaciones implicadas (Ranjard et al., 2000).

Sea cual fuere la estrategia en el estudio de las comunidades bacterianas, para la valoración de los

bienes y servicios ambientales, así como para el entendimiento de la dinámica de los sistemas

ecológicos, la necesidad del reconocimiento y descripción de los organismos que están implicados

en los procesos ecosistémicos, asi como la estructura de sus comunidades y la naturaleza de sus

interacciones constituye una prioridad.

19

1. TITULO



2. OBJETIVO GENERAL

Evaluar el efecto del uso del suelo sobre la diversidad de bacterias degradadoras de hidrocarburos

en las cuencas de los ríos La Vieja y Otún y la relación de ésta diversidad con la capacidad

degradadora.

3. OBJETIVOS ESPECIFICOS

Estimar y comparar la densidad de bacterias degradadoras de hidrocarburos, aisladas de

suelos con diversos tipos de uso.

Estimar y comparar la diversidad y composición de especies de bacterias degradadoras de

hidrocarburos aisladas de suelos con diversos tipos de uso.

Evaluar en forma prelimiar el efecto de la época climática en la diversidad y la composición de

especies de bacterias degradadoras de hidrocarburos.

Analizar la relación entre la diversidad de bacterias degradadoras de hidrocarburos y la

capacidad degradadora de hidrocarburos totales de petróleo, en suelos asociados a diferentes

usos.

20

4. PROBLEMA

4.1 Formulación. ¿Diferentes usos del suelo generan un impacto sobre la densidad, diversidad y

capacidad degradadora de bacterias degradadoras de hidrocarburos?

4.2 Planteamiento. Frecuentemente se menciona el aparente impacto que suponen sobre la

diversidad biológica (evaluada ésta por taxones o por la funciones que éstos taxones cumplen), los

manejos intensivos y en ocasiones excesivos de los sistemas ecológicos. En la mayoría de los casos

esto se ve reflejado en la reducción o la desaparición de los hábitat y la modificación de nichos de

especies animales y vegetales, justificando su conservación y protección, con fines paisajísticos y

ecológicos. Sin embargo, a pesar del conocimiento general del papel que cumplen los

microorganismos en la productividad de los sistemas ecológicos naturales o artificiales, en el

ciclaje de nutrientes, e inclusive en la regulación climática global (Atlas y Bartha, 2002), poco se

conoce, no solo acerca de la diversidad específica de microorganismos asociados a suelos

tropicales andinos, sino también acerca de los efectos que los cambios hechos en el uso del suelo,

tienen en la diversidad de microorganismos, ni si estos cambios se corresponden con pérdidas en

la funcionalidad, resiliencia y resistencia, propios de sistemas sucesionales.

21

5 HIPOTESIS

HO: La densidad de microorganismos degradadores de hidrocarburos no presentará diferencias

entre diversos usos del suelo.

HA: La densidad de microorganismos degradadores de hidrocarburos presentará diferencias

entre diversos usos del suelo.

HO: La diversidad y composición de especies de bacterias degradadoras de hidrocarburos no

presentará diferencias entre suelos sometidos a diferentes usos del suelo.

HA: La diversidad genética y composición de especies de bacterias degradadoras de

hidrocarburos presentará diferencias entre suelos sometidos a diferentes usos del suelo.

HO: La diversidad y composición de especies bacterianas degradadoras de hidrocarburos será

igual entre eventos de muestreo.

HA: La diversidad y composición de especies bacterianas degradadoras de hidrocarburos será

diferente entre eventos de muestreo.

HO: Suelos con número de filotipos bacterianos diferente, presentarán igual capacidad

degradadora de hidrocarburos.

HA: Suelos con número de filotipos bacterianos diferente, presentarán diferente capacidad

degradadora de hidrocarburos.

HO: La diversidad de especies de bacterias degradadoras de hidrocarburos no se correlacionará

con la capacidad degradadora de hidrocarburos.

HA: La diversidad de especies de bacterias degradadoras de hidrocarburos se correlacionará

con la capacidad degradadora de hidrocarburos.

22

6 JUSTIFICACION

Son múltiples los estudios en diversidad y biología de la conservación de especies, basados en

macro-organismos (i.e., animales, plantas y algunos hongos filamentosos macroscópicos); dada la

relativa facilidad en la descripción de este tipo de organismos, de su ubicación en las redes tróficas

y en los procesos de dinámica de los ecosistemas de los cuales hacen parte, ha sido posible

entender e incluso predecir los efectos que ocasionaría la desaparición de poblaciones y especies

en una región dada, causando alarma por las consecuencias que esto puede generar en la

productividad primaria o secundaria de estos ecosistemas.

Para el entendimiento de la dinámica de los sistemas ecológicos y del ciclaje de materia y energía,

es clara la necesidad del reconocimiento y descripción de los organismos que están implicados en

estos procesos. Esto incluye el conocimiento de cuántos están implicados, en qué momentos y,

junto con quiénes realizan los procesos, así como los cambios que los factores externos ejercen

sobre la estructura y composición de las comunidades de estos organismos; dentro de ésta

dinámica, las poblaciones bacterianas en el suelo constituyen un componente fundamental.

La falta de información derivada del escaso conocimiento a acerca de la totalidad de los

microorganismos presentes en el suelo, conlleva a un desconocimiento de la base productiva de la

mayoría de biomas mundiales, la cual sin duda está basada en las interacciones microbianas. En

algunos casos los procariotas constituyen las únicas formas de vida en ambientes extremos y

conforman las primeras poblaciones colonizadoras en ambientes intervenidos severamente por el

hombre o por eventos naturales de gran magnitud. Es claro que sin la presencia de

microorganismos en el suelo, el ciclaje de nutrientes se interrumpiría y llegaría al punto que o bien

los reservorios naturales de estos elementos se agotarían, o no quedarían disponibles. Este

impacto podría reflejarse en la desaparición de poblaciones de macro-organismos dependientes

de estos reservorios. Puede ser entonces, que la extinción de algunas poblaciones de plantas o

animales que son atribuidas a la explotación agrícola intensiva, sea en realidad un evento

posterior al impacto generado en las comunidades microbianas.

Dentro de los ciclos biogeoquímicos del nitrógeno y del carbono en los sistemas ecológicos, las

bacterias degradadoras de hidrocarburos (HC), desempeñan un papel fundamental, al ser

responsables dentro de las comunidades microbianas, de la mineralización de los hidrocarburos

como heptadecano, fitano, pristano, derivados de la biosíntesis por parte bacterias, hongos,

plantas y algunos insectos, como parte de su estructura.

Las actividades pecuarias y agrícolas intensivas, han fomentado el uso indiscriminado de

compuestos biocidas para el control de plagas y malezas, compuestos que pueden ser estructural

23

y químicamente relacionados con los HC, lo que podría conducir a cambios en la densidad y

estructura de las poblaciones de microorganismos degradadores de estos compuestos, que

podrían ser indicativos de estos tipos de uso.

Es así como el estudio de poblaciones microbianas edáficas específicas, de la estructura de las

comunidades, de la función que éstas cumplen y del impacto generado sobre éstas con las

actividades pecuarias y agrícolas, constituye una prioridad. Estos estudios no sólo son cruciales

para el conocimiento básico de la dinámica ecológica sino como información base para la

aplicación de herramientas que permitan aumentar o estabilizar la productividad y el rendimiento

sostenible de sistemas agrícolas y servicios ambientales de la ecorregión cafetera colombiana, a

nivel de las cuencas de los ríos Otún y La Vieja.

Acogiéndose al concepto de áreas estratégicas aprobadas por el Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología, en el año 2004, el Centro de Investigación y Estudios en Biodiversidad y Recursos

Genéticos (CIEBREG), presenta un proyecto enmarcado en el conocimiento y valoración de bienes

y servicios ambientales de la biodiversidad para el desarrollo sostenible de paisajes rurales

colombianos específicamente del complejo ecorregional Andes del Norte, del cual hacen parte las

cuencas de los ríos La Vieja y Otún, tanto en sus componentes de bioma, ecosistema, y cobertura

vegetal, a nivel de macro y microorganismos.

Enmarcados dentro del primer objetivo específico del CIEBREG mediante el cual se desea

“caracterizar, evaluar y monitorear la biodiversidad en paisajes naturales asociada a sistemas

productivos para el mantenimiento de la funcionalidad ecológica” (Rodríguez, 2007), la unidad de

saneamiento y biotecnología ambiental (USBA) de la Pontificia Universidad Javeriana, ha

planteado contribuir a la caracterización de la diversidad microbiana de suelos de las cuencas de

los ríos la Vieja y Otún. En el presente estudio se evaluó la densidad y diversidad de bacterias

degradadoras de hidrocarburos, a partir de muestras de suelo provenientes de biomas de las

cuencas de los ríos La Vieja (Departamentos del Quindío, Valle del Cauca, Risaralda) y Otún

(Departamento de Risaralda) y su relación con el uso del suelo en sistemas productivos agrícolas y

pecuarios, mediante cultivo y recuento selectivo por la técnica de número más probable (NMP),

discriminación de ribotipos por PCR-DGGE del DNAr 16S y su afiliación taxonómica por

secuenciación. De igual manera se evaluó la relación entre densidad, diversidad y capacidad de

degradación de hidrocarburos totales de petróleo.

24

7. MARCO TEORICO Y ANTECEDENTES

7.1 HIDROCARBUROS EN LA NATURALEZA.

“Los hidrocarburos (HC) son un clase de compuestos naturales que no solo pueden ser encontrados en áreas contaminadas por petróleo y sus derivados, sino que cantidades relativamente bajas pueden ser halladas en suelos y sedimento, derivados de la biosíntesis por parte de plantas, insectos y algunos microorganismos mediante la reducción de acil-CoA con NADH o NADPH” (Rosenberg, 2006) y se consideran como los compuestos de origen natural más estables. En el suelo, varios tipos de microorganismos han sido reportados como productores de hidrocarburos, ya sea como productos intracelulares o extracelulares; intracelularmente algunos tipos de cianobacterias se caracterizan por la producción de 7- y 8-metil-heptadecanos; otras bacterias fotosintéticas se distinguen por la producción de hidrocarburos acíclicos como pristano y fitano, mientras que la producción de hidrocarburos alifáticos de cadena larga es predominante en ciertos hongos miceliales. Extracelularmente algunos producen hidrocarburos alifáticos y volátiles diferentes a metano (e.g. Bacillus spp. productor de isoprenoides)(Ladygina et al., 2006).

Otra fuente importante de hidrocarburos en suelo la constituye las plantas, la superficie de los tallos, raíces y en especial las hojas, las cuales están cubiertas por una mezcla a menudo cristalina, de lípidos llamados comúnmente como ceras. Los componentes más comunes de las cuales son hidrocarburos, ésteres, flavonas y terpenos, muchos de los cuales tienen como función la protección contra la desecación, en especial en regiones con vientos fríos secos. En especies de coníferas y otras gimnospermas, las hojas contienen cantidades menores de polifenoles y resinas, las cuales también son usadas en procesos de cicatrización. La degradación de estas ceras por parte de algunos animales es limitada, siendo los microorganismos los que logran la mineralización completa (Kolattukudy, 1970). A nivel interno de la región vegetativa de la planta, los hidrocarburos pueden ser encontrados en forma de lignina, la cual es un compuesto aromático conformado por subunidades de oxifenilpropano, formados a su vez por la polimerización de tres tipos de alcoholes p-coumaril, coniferil y sinapil. La lignina puede unirse a partículas de arcilla y ser degradado por bacterias de los géneros Pseudomonas spp., Xanthomonas spp., Acinetobacter spp., Bacillus spp., Arthrobacter spp. y Micrococcus spp. En el reino animal, los lípidos cuticulares de los insectos contienen hasta un 60% de alcanos, todos los cuales son saturados, aunque pueden presentarse en forma ramificada como metil alcanos, y que además de servir como una protección contra la desecación, también se han vinculado con señales de comunicación para atracción de parejas (Stanley-Samuelson y Nelson, 1993). El proceso general de formación de alcanos comienza a partir de ácidos grasos ya sea por elongación luego de una decarboxilación, o por condensación entre dos ácidos grasos

25

bioquímicamente disimilares. El acil-CoA graso es luego reducido al aldehído, posteriormente a alcohol, el cual luego es esterificado con radicales acilo, acil-CoA o fosfolípidos.

7.1.1 Degradación microbiana de hidrocarburos. Los hidrocarburos de petróleo pueden ser divididos en cuatro clases: los saturados, los aromáticos, los asfaltenos (e.g., fenoles, ácidos grasos, cetonas, esteres y porfirinas) y las resinas (piridinas, quinolonas, carbazoles, sulfóxidos y amidas). Todos difieren en su susceptibilidad al ataque microbiano, siendo las tasas de degradación mayores para los saturados, seguido por los aromáticos ligeros, siendo los aromáticos de alto peso molecular y los compuestos polares los que exhiben las tasas más bajas. Los HC se han clasificado en un orden de susceptibilidad al ataque microbiano en forma decreciente así: n-alcanos, alcanos ramificados, aromáticos de bajo peso molecular y alcanos cíclicos. Sin embargo esto no es una regla, ya que esto depende de factores como: concentración del HC, estado físico del HC, la temperatura, oxigeno disuelto disponible, nutrientes como N, P y K, y en menor grado, la salinidad, la presión, actividad del agua y pH (Leahy y Colwell, 1990).

La degradación de HC se realiza solamente en presencia de agua y el crecimiento de los microorganismos degradadores no se efectúa sobre estos compuestos, sino en el agua que los rodea, ya que la mayoría de estos compuestos son solubles en cierto grado, siendo la formación de emulsiones un paso fundamental en el proceso de degradación1

El proceso general en la vía asimilatoria de alcanos, alquenos y alquinos en Pseudomonas spp.(Figura 1) incluye inicialmente la acción de una mono-oxigenasa unida a membrana, que junto con rubredoxina y rubredoxina reductasa, ayudan a transferir electrones desde NADH+H+, hasta una hidroxilasa citoplasmática, para la conversión de los alcanos en alcoholes; posteriormente el

alcohol es oxidado a aldehído y luego a ácido antes de proceder a la -oxidación y luego al ciclo de ácidos tricarboxílicos (ATC) o ciclo de Krebs, para servir tanto como fuente de carbono como de energía. (Van Hamme et al., 2003). En el caso de los hidrocarburos aromáticos, el metabolismo asimilatorio en Pseudomonas spp. (Figura 2), implica inicialmente un primer conjunto de reacciones las cuales median la conversión del núcleo aromático en catecol mediante la acción de dioxigenasas, y luego la conversión vía rompimiento orto o meta del catecol, que conduce a acetaldehído y piruvato, y posteriormente a la formación de acetil-CoA los cuales son incorporados en el ciclo ATC. La mayoría de estudios en la genética del metabolismo de hidrocarburos han identificado que los genes implicados en la degradación están codificados en su mayoría en plásmidos tanto para la degradación de alcanos como de PAH. Bacterias, cianobacterias, algas y hongos, son capaces de degradar HC policíclicos de bajo (dos o tres anillos) o alto peso molecular (cuatro o más anillos) como naftaleno, acenafteno, antraceno, fluoranteno, pireno y criseno y usarlos como única fuente de carbono (Leahy y Collwel, 1990; Van Hamme et al., 2003), y benzo(a) pireno por cometabolismo.

1Module Five: Biodegradation Microbiology: Mechanisms of degradation. Disponible en línea en: <<

http://wvlc.uwaterloo.ca/biology447/modules/module5/5_main.htm>>. Septiembre 16 2009.

http://wvlc.uwaterloo.ca/biology447/modules/module5/5_main.htm

26

Figura 1. Esquema de reacciones del catabolismo aerobio de hidrocarburos alifáticos. Esquema general del catabolismo del octano en Pseudomonas putida. Modificado de: Module Five: Biodegradation

Microbiology: General biodegradation of naturally-occurring compounds. Disponible en línea en: <<http://wvlc.uwaterloo.ca/biology447/modules/module5/5a9_s1.htm>>. Septiembre 16 2009.

-oxidación

Figura 2. Esquema de reacciones del catabolismo aerobio de hidrocarburos aromáticos. Esquema general del catabolismo del benceno en Pseudomonas spp. Modificado de: Biodegradation Microbiology:

General biodegradation of naturally-occurring compounds. Disponible en línea en:<<http://wvlc.uwaterloo.ca/biology447/modules/module5/5a9_s1.htm>>. Septiembre 16 2009.

http://wvlc.uwaterloo.ca/biology447/modules/module5/5a9_s1.htm

http://wvlc.uwaterloo.ca/biology447/modules/module5/5a9_s1.htm

27

7.2 DIVERSIDAD BACTERIANA

La diversidad bacteriana puede ser definida como el número de especies o biotipos y su abundancia relativa en un espacio y tiempo determinados dentro de una comunidad o también puede ser definida como la cantidad y distribución de información (e.g. genética, funcional) dentro de la comunidad (i.e. comunidades complejas poseen mayor información). Esto incluye la diversidad de genes, hábitats, nichos y la diversidad funcional de las poblaciones; de esta forma la diversidad puede considerarse un atributo de la comunidad, relacionada con estabilidad, productividad y estructura trófica (Stirling y Wilsey, 2001). No obstante conocer que en representantes de los dominios Arquea y Bacteria se pueden encontrar todos los sistemas biológicos de conversión de energía conocidos por el hombre, nuestro conocimiento sobre la estructura y composición de las comunidades de procariotas, responsables en gran parte del ciclaje de materia y energía de compuestos orgánicos e inorgánicos, es aún mínimo. Este fenómeno no solo puede ser atribuido a las limitaciones de las herramientas técnicas y teóricas para medir, evaluar e interpretar la diversidad de especies, sino también en parte por la falta de acuerdo en la definición misma de especie bacteriana. La definición actual de especie propuesta por Rosello-Mora y Amann (2001), reconocida por el comité ad-hoc para la re-evaluación de la definición de especie en bacteriología es: “es un grupo monofilético y genómicamente coherente de organismos individuales que muestran un alto grado de similaridad en muchas características independientes, diagnosticables por una propiedad fenotípica discriminativa”, referido por los autores como el concepto polifásico de especie, afirmando que una especie procariota debe ser clasificada después de analizar y comparar tantos parámetros como sea posible incluyendo caracteres feno y genotípicos. A pesar del acuerdo sobre este concepto de especie y del conocimiento que las comunidades bacterianas no se comportan de igual manera que las comunidades vegetales o animales, los estudios de diversidad bacteriana se basan aún en índices y modelos de diversidad diseñados para el estudio ecológico de comunidades de macro-organismos. Estos índices de valoración de diversidad podemos dividirlos en tres grupos: a) índices de riqueza de especies, como los índices de Shannon-Wiener, índice de Margalef, estadística Q y estimadores de la riqueza de OTU’s; b) índices basados en abundancias proporcionales de especies (i.e., medidas de equitatividad/dominancia), como el índice de equitabilidad de Shannon, índice de Simpson, índice de Berger-Parker e índice de Lloyd y Ghelardi; y c) modelos de abundancia de especies como el modelo serie log, modelo log normal, modelo de la “palo quebrado (broken stick)” y modelo de nicho sobrelapante (Magurran, 1988; Hill, 2003). Muchos de estos índices se han adaptado para su aplicación con datos discretos como los proporcionados por técnicas moleculares, pero su uso e interpretación debe ser cuidadoso, pues cada uno así como tiene ventajas tiene limitaciones. La extensión de su utilidad depende tanto del tipo de muestreo, tamaño de la muestra, así como de la sensibilidad inherente que algunos índices poseen respecto a la dominancia o equitatividad de las poblaciones. Existen propuestas alternas para la determinación de la diversidad que no utilizan los índices antes mencionados; Curtis et al. (2002), afirma que es suficiente conocer el área bajo la curva de abundancia de especies de un ambiente dado, para determinar la diversidad de especies,

28

demostrando que la diversidad de procariotes puede estar relacionada solo con el número total de individuos y la abundancia del grupo más predominante de esa comunidad. 7.2.1 Diversidad bacteriana y ambiente. La conexión entre la diversidad y la función de los sistemas biológicos es aún un tema de discusión abierto. Para algunos una mayor diversidad implica un detrimento para el sistema ya que como afirman Atlas y Bartha (2002), las comunidades que poseen una estructura compleja generalmente poseen tasas de producción primaria menor, debido a que se necesita menor cantidad de energía para mantener la estabilidad de la comunidad, sin embargo, las comunidades diversas poseen un mayor rango de respuestas ante una perturbación.

A pesar de esta flexibilidad, las comunidades expuestas a un factor unidireccional fuerte (e.g. estrés fisicoquímico) tienden a ser menos diversas debido a los procesos de selección, asegurando la estabilidad con pocas especies especializadas. Este fenómeno lo han reportado Rainey et al. (2005) en bacterias resistentes a ionización, reduciéndose la diversidad taxonómica a medida que la dosis ionizante aumentaba y Leys et al. (2004) y Nakatsu et al. (2000) para suelos contaminados con fenantreno y PAH respectivamente; cuando el control de la comunidad deja de ser abiótico, dejando paso al predominio de las interacciones biológicas, la diversidad aumenta y la estabilidad de la comunidad se asocia al alto número de especies. En general tanto el grado de relación entre diversidad y estabilidad de la comunidad, como el grado de relación entre diversidad y funcionalidad del sistema ecológico, son aspectos aún poco entendidos (Saville, 1999). Aunque una alta diversidad pueda significar una amplia flexibilidad frente a cambios ambientales, esto no quiere decir que pueda soportar alteraciones crónicas extremas y conocida la alta redundancia funcional de los microorganismos en el suelo se desconocen los efectos que la ausencia de algunas poblaciones tengan en la función total de la comunidad (Andren y Balandreau, 1999; Bardgett et al., 2005). Teóricamente la diversidad debería aumentar con la sucesión ecológica, generalmente en sus primeras etapas y etapas intermedias, tendiendo a la estabilidad con una disminución de especies en la comunidad clímax. 7.2.2 Diversidad bacteriana en el suelo. Dada la multiplicidad de microambientes disponibles en el suelo y las múltiples interacciones con organismos animales y vegetales, la diversidad esperada de microorganismos en el suelo es alta. Curtis et al.(2002), estimaron usando curvas de abundancia de especies que en el suelo pueden encontrarse de 6.000 a 38.000 taxa por gramo, una cantidad enorme comparada con las aproximadamente 5000 especies de bacteria reportadas hasta ahora, indicando el gran desconocimiento que se tiene de la composición de las comunidades. Por su parte Whitman et al. (1998), estimaron el número total global de procariotes en 4-6 x1030 células, de las cuales 2,6 x1029 células corresponden a procariotas en hábitat de suelo, siendo la mayor abundancia la de suelos de matorrales desérticos (63.2 x1027 células) y la menor la de bosques tropicales estacionales (1x1027 células). Estos altos tamaños poblacionales pueden implicar que eventos que ocurren rara vez en el laboratorio (i.e. interacciones con otros organismos), sean frecuentes en la naturaleza, reflejándose en un número limitado de taxa cultivables reconocidos.

29

Las interacciones con otros microorganismos constituyen un factor determinante en la

composición de las comunidades, como lo demuestra la reducción en miembros de la división -Proteobacteria y el aumento en Gram positivos con bajo contenido G+C debido a la depredación por protistos en suelos de arrozales, aunque paradójicamente la diversidad presentó un aumento con la presencia de esta población de depredadores (Murase et al., 2006).

7.2.2.1 Efecto del tipo de suelo en la diversidad y estructura de comunidades microbianas. En la mayoría de estudios en diversidad y efecto de usos del suelo en la actividad microbiana, el tipo de suelo se ha identificado como factor relevante en la estabilidad de las comunidades microbianas; Mummey et al., (2006) reportan una mayor abundancia de Gemmatimonadales en un ultisol, y de

Rubrobacteridae y -Proteobacteria en un molisol. El efecto del tipo de suelo incluso prevalece sobre el tipo de manejo, separando las comunidades en virtud de las características fisicoquímicas y no de las prácticas agrícolas como lo reportan Girvan et al.(2003), y Bossio et al. (2005), independientemente si es uso agrícola o forestal. En un gran esfuerzo por catalogar la biodiversidad en suelo a escala continental, así como los factores ambientales que la influencian, Fierer y Jackson (2006), basándose en la comparación de secuencias de rDNA, colectaron muestras a lo largo de norte y sur América y encontraron que la diversidad no estaba relacionada con factores biogeográficos como la temperatura, latitud y otras variables que predicen típicamente la diversidad de plantas y animales. La composición de especies tampoco se relacionó a la posición geográfica, aunque si encontraron que la riqueza de las comunidades difería entre tipos de ecosistema, pudiendo ser explicados estos cambios, por diferencias en el pH del suelo, siendo mayor en suelos neutros y menor en ácidos, sugiriendo que la biogeografía es un factor irrelevante en la definición de la composición de comunidades y la diversidad.

7.2.2.2 Efecto de la vegetación en la diversidad y estructura de comunidades microbianas. La composición de las comunidades bacterianas no sólo está determinada por las características fisicoquímicas del suelo, sino que también los cambios en la aparición y frecuencia de taxa pueden

estar determinadas por la diversidad vegetal (Garveva et al., 2004; Grüter et al., 2006), siendo la rizósfera un ambiente propicio para la proliferación de poblaciones de heterótrofos. En algunos casos, la presencia de ciertas especies vegetales puede ser un factor predictor de la presencia de grupos bacterianos específicos, como lo demuestra Hackl et al. (2004), para bosques de picea y

roble, donde predominan grupos de Proteobacteria, Holophaga/Acidobacterium y Verrucomicrobia en contraposición a bosques de pino donde predominan Gram positivos ricos en G+C (Grüter et al., 2006).

El efecto que la vegetación puede inferir sobre el número, biomasa y actividades metabólicas de bacterias, se observa en trabajos de Rooney et al. (2006), quienes identificaron mayores tasas de actividad enzimática microbiana en rizósfera de legumbres versus cereales. Para Stephan et al. (2000), tanto la densidad como la diversidad funcional, se incrementaron linealmente con el logaritmo del número de especies vegetales y con el número de grupos funcionales vegetales en pastizales experimentales, relación que no encuentran Orwin y Wardle (2005), quienes observan un efecto de la comunidad vegetal en la resistencia y resiliencia de las comunidades microbianas,

30

independiente de la especie; no encuentran relación entre el grupo funcional de una planta y las comunidades bacterianas, pero si encuentran relación con especies bacterianas individuales.

Incluso la respuesta a impactos externos puede ser diferencial, dependiendo del tipo de vegetación, favoreciendo a algunos grupos bacterianos como lo reporta Höflich et al. (2000) para Pseudomonas spp., Agrobacterium spp. y Xanthmonas spp., en presencia de leguminosas en suelo margoso. Este efecto puede incluso estar influenciado por el estado de desarrollo de la planta y ser independiente del lugar de la raíz (Duineveld et al., 2001) y del gradiente sucesional de vegetación en términos de estructura funcional y genética (Chabrerie et al.(2003). Los cambios en las coberturas vegetales, pueden inferir en la composición de las comunidades bacterianas, como reportan Nüsslein y Tiedje (1999), para un cambio de predominio de Fibrobacter spp.y Syntrophomonas spp. en bosque a Burkholderia spp. y Rhizobium-Agrobacterium en pastizal

Aunque las plantas pueden actuar indirectamente sobre las comunidades microbianas mediante compuestos generados durante la descomposición de hojas, frutos y ramas en la hojarasca que generan, gran parte de su influencia es ejercida por el rizoplano y la rizósfera, que establecen ambientes que pueden ejercer quimiotaxias positivas o negativas en tipos específicos de poblaciones, gracias a la gran variedad de exudados que secretan al suelo y maximizado por una mayor área superficial (Bremer et al., 2007). Aunque el cultivo de especies como leguminosas represente cambios en las entradas de materia orgánica post-cosecha, eso no necesariamente se refleja en cambios significativos en las poblaciones bacterianas activas. Duineveld et al. (2001), reportan sin embargo mayor complejidad en suelo no asociado a rizósfera de crisantemo, influencia que parece no estar determinada a un nivel taxonómico amplio, sino a nivel de cepa o de especie.

7.2.2.3 Efecto del tipo de manejo del suelo sobre la abundancia, diversidad y estructura de comunidades microbianas. Aunque en muchos casos sea el tipo de suelo el determinante de la composición de las comunidades bacterianas, en otros casos es el tipo de manejo el parámetro más relevante. Procesos como el arado pueden aumentar el número de bacterias de grupos específicos como BOA, como mencionan Bruns et al. (1999), pero a la vez disminuir su diversidad; o no tener efecto como reportan Lupwaji et al. (2001), quienes tampoco identifican un efecto del tamaño de agregados en la diversidad. Por su parte Neufeld y Mohn (2005) reconocen que durante el crecimiento de las plantas, la diversidad se incrementó en ausencia de arado y de manera proporcional al tamaño del agregado, reconociendo una menor diversidad en suelos compactados. Por otro lado, Yao et al. (2006), reportan mayor índice de diversidad y mayor coeficiente de similaridad de secuencias en suelos bajo rotación. Los cambios en las comunidades pueden obedecer a la entrada de nuevas poblaciones, nutrientes como carbono (Drenovsky et al., 2004), cambios en propiedades fisicoquímicas del suelo por disturbios de origen antropogénico o natural, (Wu et al., 2008), cambios en variables ambientales

(Grüter et al., 2006), aplicación de fertilizantes (Susuki et al., 2005) o compuestos xenobióticos (Chen et al., 2007); a su vez los agro-ecosistemas tropicales generan procesos de degradación del suelo por pérdida de carbono y nitrógeno en la biomasa vegetal, agotamiento de nutrientes y reducción de la capacidad de retención de agua; estos cambios sin embargo pueden reversarse en tiempos que varían entre tres días, como lo reportan Fang et al. (2009), para uso del herbicida

31

butaclor, a dos semanas como lo reportan Meier et al. (2008) en la introducción de una cepa pura, un herbicida y nutrientes inorgánicos.

Los organismos responden ante los disturbios causados por entradas de materia y energía al sistema con cambios en la abundancia de grupos específicos de organismos consecuencia de competencias en la explotación de nuevos sustratos, y la ocupación de nichos de especies que no se adecuan a las nuevas condiciones. El efecto de xenobióticos como pesticidas y herbicidas sobre la biomasa y los recuentos microbianos es variable; en algunos casos la aplicación de pesticidas puede incrementar (clorinfos, fostiazato) o disminuir (dimetoato, diuron) parámetros microbianos como: respiración basal, biomasa y respiración de microorganismos específicos, efectos que no varían ni con la especie de plantas ni con la riqueza de grupos funcionales vegetales (Prado y Airoldi, 2001; Eisenhauer et al., 2009). Tambíen se puede dar el caso que estos tipos de compuestos sean neutrales; Gigliotti y Allievi (2001), observaron que incluso la aplicación de dosis altas (100X) de herbicidas como cinosulfuron y bensulfuron no tuvieron efecto en el número total de bacterias totales, aunque pueden afectar su actividad.

Un factor importante que influye en el desarrollo y mantenimiento de las comunidades microbianas, es la disponibilidad de macroelementos como carbono, nitrógeno y fósforo, suministrados por sustratos colonizables, ya sea de forma endógena por el mismo sistema vegetal/animal o de manera exógena en la forma de fertilizantes y enmiendas orgánicas. Esto es corroborado por autores como Buckley et al. (2006), quienes asocian las variaciones en composición de filotipos con variaciones en el contenido de materia orgánica, Ca+2 , pH y distribución espacial del aceptor final de electrones y Øvreas y Torsvik (1998) quienes asocian una mayor diversidad bacteriana a suelos orgánicos en comparación a suelos arenosos. En otros casos los impactos antropogénicos no tienen efecto en las comunidades como lo reportan

Höflich et al. (2000), tras varias aplicaciones de nitrógeno inorgánico, Ellis et al. (2003) para suelos contaminados con metales pesados, y Susuki et al. (2005), para aplicación de fertilizantes orgánicos. En otros casos, la ausencia de efectos solo se observa en poblaciones específicas; Freitag et al. (2005) reportaron que la diversidad de Nitrobacter spp., no varió significativamente entre suelos fertilizados y no fertilizados con nitrógeno inorgánico; en forma similar Macur et al. (2007) lo reportan para el caso de la aplicación del herbicida 2,4-D. en poblaciones de Burkholderia spp.

Otra forma en que se afecta la diversidad, es en cuanto a cambios en la diversidad funcional; Chen et al. (2007), detectaron en tres tipos de suelo diferentes, cambios en perfiles metabólicos evaluados por BIOLOG, ejercidos por una combinación de fertilización inorgánica y pesticidas, pero sin diferencias en la diversidad luego de 90 días. Por su parte, Ratcliff et al. (2006), observaron un aumento en la diversidad funcional tras aplicación de altas dosis de glifosato en suelo arcilloso. Cabe resaltar que una pérdida en riqueza de especies no siempre significa un detrimento en la funcionalidad, como lo reportan Sánchez et al.(2004), en la bioremediación de 2,4,6 Triclorofenol.

32

7.3 METODOS DE ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD BACTERIANA.

Dentro de los estudios de la dinámica de los sistemas ecológicos, el entendimiento de la estructura y composición de las comunidades constituye un requisito fundamental, siendo la biodiversidad un componente más de estos sistemas y no simplemente un concepto descriptor (Gaston, 1996).

Debemos mencionar inicialmente que en sí mismas, las fluctuaciones naturales de las poblaciones microbianas son difíciles de evaluar dada la dificultad inherente del análisis simultáneo de abundancia, actividad y respuesta a disturbios en múltiples poblaciones.

Los intentos por describir la dinámica de las poblaciones microbianas han incluido métodos de análisis de comunidades y su diversidad, que han utilizado para la determinación de la abundancia, tanto técnicas de recuento dependientes de cultivo, como métodos independientes de cultivo que incluyen herramientas moleculares como sondas de ADN, PCR competitiva y PCR en tiempo real.

7.3.1 Métodos dependientes de cultivo. Entre los métodos dependientes de cultivo, las técnicas más utilizadas son el recuento el placa, en el cual se seleccionan y se registra el número de colonias de organismos viables bajo condiciones específicas de nutrientes, temperatura, humedad, pH o resistencia a bioestáticos o a biocidas. Otros métodos dependientes del cultivo hacen uso del cultivo líquido en microplacas, como el método BIOLOG y la técnica de número más probable (Song, et al., 2001). En la técnica BIOLOG, se evalúan los patrones de uso que hace una comunidad microbiana ya sea de una fuente única de carbono o de múltiples fuentes de carbono. La técnica de número más probable, es una alternativa al recuento en placa para conteo de organismos viables, en la cual se hace uso del cultivo en líquido en microplacas, de diluciones seriadas de una muestra, conteo basado en modelos de distribución estadística binaria (distribución de Poisson) del número probable de organismos en una muestra. Estos conteos se realizan ya sea valiéndose simplemente del grado de turbidez del medio como indicador de crecimiento o mediante el uso de indicadores de crecimiento, por cambio de pH (e.g. fenolftaleína, naranja de metilo), por el uso o extinción de nutrientes (e.g. reactivo de Griess-Illosvays, reactivo de Nessler, difenilamina), por la

presencia de metabolitos o productos finales (i.e. naftol), o por indicadores de actividad bacteriana aerobia o anaerobia, heterotrófica o autotrófica (i.e. sales de tetrazolio).

Las técnicas dependientes de cultivo muy a menudo representan una desviación de la composición real de las comunidades dado que suelen proporcionarse condiciones que distan de las presentes en el medio del cual fueron extraídas. En la mayoría de los casos la ausencia de interacciones con otras poblaciones, implica que sólo presenten crecimiento poblaciones con la mayor representatividad o cuyo nicho ecológico incluye las condiciones representadas in vitro. Para resolver este tipo de problemas se ha planteado el uso de técnicas independientes del cultivo para el estudio de comunidades bacterianas complejas.

7.3.2 Métodos independientes de cultivo. Este tipo de estudios puede involucrar el análisis de componentes de la membrana celular, como lo son los análisis de PLFA (Ranjard et al., 2000; Liu y Stahl, 2001; Kirk et al., 2004), el análisis FAMES (Atlas y Bartha, 2002) o el análisis de las secuencias de ácidos nucleicos. Los análisis de ácidos nucleicos en especial del DNA, pueden enfocarse ya sea en toda la información genética del DNA extraído (análisis completo de DNA comunitario) o en secuencias genómicas especificas (análisis parcial del DNA comunitario), de una muestra ambiental o de cepas puras. Las técnicas de análisis de ácidos nucleicos, se han enfocado

33

principalmente en genes del operón ribosomal particularmente en los genes rrs (i.e., RNAr 5S, 16S), rrl (i.e., RNAr 23S) y en la región espaciadora intergénica (IGS) entre los genes rrs y rrl.

Los métodos de análisis del DNA pueden estar basados en la diferencia de tamaño de fragmentos generados por restricción enzimática de productos de PCR tanto de DNA como cDNA, o por amplificación aleatoria de una región del genoma (RAPDs); otro grupo de técnicas que también permiten realizar el análisis basado en las diferencias en la secuencia de nucleótidos de un fragmento de DNA son DGGE, TGGE y la secuenciación (Muyzer 1999; Nakatsu et al., 2000; Garcia-Pichel et al., 2001). En éstas técnicas, las diferencias en la migración electroforética permiten obtener perfiles de bandas (i.e., genetic fingerprinting) que proporcionan una visión global de la estructura genética de la comunidad microbiana. Estos datos permiten la estimación y evaluación de la diversidad de la comunidad y en menor medida la abundancia de poblaciones específicas en el caso de DNA total procedente de muestras ambientales

En el caso de ARDRA, el análisis de los genes rrs y rrl implica la amplificación y discriminación de diferencias en la secuencia de nucleótidos por el uso de enzimas de restricción, que en si mismo representa una limitación debido a la escogencia de las enzimas adecuadas que sean lo suficientemente informativas, pero a su vez no generen patrones de bandeo muy complejos para ser interpretados. Una alternativa lo constituye la técnica t-RFLP, en la cual se hace uso de iniciadores marcados con fluorocromos, lo que permite ver no todo el conjunto de bandas generado en la digestión enzimática sino solo aquellos fragmentos unidos al iniciador marcado, facilitando la interpretación de los perfiles (Ranjard, et al., 2000; Liu, y Stahl, 2001).

Existen algunas dificultades inherentes al uso de técnicas basadas en amplificación de genes por PCR y su interpretación; estas incluyen a los iniciadores escogidos que pueden presentar diferencias en cuanto a su hibridación preferencial por ciertas secuencias en la comunidad; también, a pesar de la alta sensibilidad de la técnicas basadas en PCR, éstas pueden no reflejar la presencia de comunidades con baja representación, debido a los problemas inherentes a la lisis y extracción de ácidos nucleicos, así como a la presencia de sustancias inhibitorias como los ácidos húmicos y fúlvicos, los cuales están presentes en grandes cantidades en muestras de suelo y sedimento (von Wintzingerode et al., 1997). Existe también la posibilidad de generación de moléculas heteroduplex que pueden formarse entre cadenas sencillas de dos moléculas similares pero no idénticas del DNA o la generación de artefactos sobretodo en técnicas como RAPD dada la naturaleza aleatoria de este tipo de amplificación, lo que conduce a conclusiones erróneas acerca de la composición de la comunidad (von Wintzingerode et al., 1997; Ranjard et al., 2000; Liu y Stahl, 2001 ).

Ahora, sin embargo varios estudios han empezado a utilizar un enfoque polifásico en el que se incluyen tanto técnicas cultivo dependiente, cultivo independiente, análisis químico y fisicoquímico y análisis de nemátodos (Phillips et al., 2000; van Diepeningen et al., 2006). Edenborn y Sextone (2007), recomiendan seguir un enfoque polifásico para el estudio de comunidades ya que encontraron que cuando compararon perfiles de DGGE cultivo dependiente con los constituidos por librerías de clones, 34% de las bandas eran exclusivas de cultivo dependiente, 32% de cultivo independiente y 34% compartido.

7.3.3 Electroforesis en gel de gradiente denaturalizante (DGGE) en el estudio de la diversidad bacteriana. Dentro de las estrategias para la caracterización del ARN SSU que frecuentemente son

Fuente: los autores Fuente: los autores

34

usadas para diferenciar cepas o aislados, se encuentra la evaluación de perfiles electroforéticos generadas por separación diferencial en geles de agarosa o poliacrilamida dependiendo de su tamaño como en las técnicas ARDRA, t-RFLP, RISA o RAPD o por su secuencia como en DGGE (Nakatsu, et al., 2000; Schafer y Muyzer, 2001; Green, 2005), TGGE (Muyzer, 1999) o SSCP (Schwieger y Tebbe, 2000). Estas últimas estrategias se han convertido en las más utilizadas dada su capacidad de discriminar diferencias incluso de un solo nucleótido, sin incluir el uso de enzimas de restricción o sondas ligadas a isotopos radiactivos o fluorocromos

En la electroforesis en gel de gradiente denaturante descrito por primera vez por Fisher y Lerman, (1983), el DNA de doble cadena está sujeto a un ambiente denaturalizante creciente en el cual la doble cadena de DNA se separa en segmentos discretos llamados ‘dominios de denaturación”. Las condiciones de denaturación de estos segmentos son específicos de su secuencia, así cuando la menor resistencia al ambiente iónico presente es alcanzada, en el DNA parcialmente denaturado se crean moléculas ramificadas lo cual reduce su movilidad en un gel. Dado que esta denaturación es dependiente de secuencia, la presencia de mutaciones alterará la migración de la molécula en el gel, permitiendo de este modo la discriminación de secuencias que se diferencian en tan solo una base (Muyzer et al., 1993).

Debido a que cuando las moléculas de DNA se denaturan completamente la migración vuelve a ser función del tamaño y no de su secuencia, los iniciadores utilizados en los procesos previos de amplificación poseen una secuencia de 30 a 40 guaninas-citocinas (GC), lo que permite que la molécula no se denature completamente (Green, 2005). El proceso de DGGE transcurre a temperatura constante en un gradiente lineal de denaturación con urea y formamida (usualmente se utilizan rangos de denaturación amplios de 0 a 100% ó 20 a70%), el cual es paralelo al sentido de la corriente aplicada. La técnica de separación en gradiente denaturante es muy útil cuando se pretende evidenciar diferencias de secuencia entre fragmentos de DNA de igual tamaño, los cuales en un gel no denaturante de poliacrilamida o agarosa, serian indistinguibles. La presencia de diferentes secuencias en un perfil electroforético en un gel DGGE puede evidenciar la existencia de poblaciones diferentes que procedan de una muestra ambiental, de un sistema cerrado o de un banco de cepas morfológica y/o funcionalmente indistinguibles.

La técnica DGGE ha sido ampliamente usada ligada a amplificación previa por PCR para el estudio de comunidades complejas de ambientes naturales (Muyzer et al., 1993) tanto en sistemas terrestres y acuáticos (Schafer y Muyzer, 2001), o en sistemas controlados (Amador, 2006), basado en el análisis de genes específicos como genes ribosomales, genes del metabolismo del nitrógeno (Muyzer, 1999) o del metabolismo del azufre (Dar et al., 2007).

35

8 MATERIALES Y METODOS

8.1 ÁREA DE ESTUDIO.

El área donde se ubicaron los sitios de muestreo corresponde al Complejo Ecorregional Andes del Norte (CEAN) que incluye las cuencas de los ríos Otún y La Vieja. El rio Otún tiene su origen en la laguna del mismo nombre en el parque de Los Nevados, con una trayectoria este-oeste de 67 Km, un área de cuenca de 499 km2, que incluye al municipio de Pereira. Presenta una precipitación de 2700 mm/año en la parte media, 1000 mm/año en la parte alta y 1600 mm/año en su parte baja, desembocando finalmente en el rio Cauca. En la cuenca se encuentran los parques nacional natural de Los Nevados, Ucumaní y el santuario de fauna y flora (SFF) Otún-Quimbaya, localizado este último sobre el flanco occidental de la cordillera central zona media-alta del rio Otún en la vertiente izquierda de la verada La Suiza, corregimiento de La Florida, con 4,89 Km2 de extensión, localizado entre los 1815-2300 msnm, temperatura media de 15oC y precipitación media anual de 2638,5 mm. Por su ubicación (4o 40’ a 5o36’ latitud norte), las cuencas hidrográficas que constituyen el Departamento de Risaralda están comprendidas en la zona del ecuador climático, que esta influenciado por la zona intertropical de convergencia (ZIC) con lluvias cenitales y calmas sofocantes en los meses de Abril-Mayo-Junio y Septiembre-Octubre-Noviembre con un patrón de lluvias típico bimodal, después de los equinoccios de primavera y otoño en los meses de Abril y Octubre respectivamente, con épocas secas en los meses de Enero-Febrero y Junio-Agosto (Rodríguez et al., 2009).

El río La Vieja se origina por la confluencia de los ríos Quindío y Barragán y en su cuenca formada por 17 subcuencas, se incluyen municipios de los Departamentos de Quindío, Risaralda y Valle del Cauca; la cuenca está localizada en la zona hidrográfica Magdalena–Cauca con un área de 2.836 Km2 y un recorrido de 102 Km; cuenta con un clima caracterizado por precipitaciones anuales mayores a 2000 mm/año a alturas superiores a los 1400 msnm, con humedad relativa de 80%, una temperatura media anual de 20oC, y gran variabilidad climática, dado el gran número de zonas de vida que sustenta y que van desde los 950 msnm hasta los 4600.

La cuenca del rio La Vieja, se encuentra para su estudio dividida en dos áreas, cada una con una extensión de 75 Km2, representativas de la heterogeneidad ambiental de la cuenca. La primera llamada Cartago comprende los municipios de Quimbaya, Cartago y Montenegro, localizada sobre el margen derecho del rio la Vieja e incluye 18 fincas, correspondiente al bioma basal, donde predominan las consociaciones Guadua-Bosque y pastizales para ganadería de carne y leche. La segunda, llamada Montenegro localizada en el centro de la cuenca, corresponde al bioma subandino (1200 a 1400 msnm), donde los ecosistemas naturales están seriamente transformados, con una pobre cobertura de ecosistemas naturales de guadua en medio de una matriz dominante de monocultivos de café, caña de azúcar y plátano.

En el área existe el ecosistema andino, con bosques montano altoandinos (bosques de niebla), siendo especies vegetales representativas de esta zona, la ceiba (Ceiba pentandra), el cedro negro (Juglans neotropica), el cedro rosado (Cedrela odorata), el higuerón (Ficus sp.), el abrazapalos (Anthurium crassinervium), el comino laurel (Aniba perutilis Hemsley), el pino colombiano

36

(Decussocarpus rospigliosii), la palma macana (Euterpe precatoria) y la palma de cera (Ceroxylon quindiuense), caracterizados en su mayoría por su gran altura, fustes rectos y corpulentos, con ramificaciones por encima de los 10 m y copas bien desarrolladas. Los suelos se caracterizan por la presencia de Andisoles, siendo los factores predominantes de su formación, el clima húmedo sin periodos secos, la presencia de material mineral de origen volcánico, rico en productos amorfos silicoluminosos hidratados y asociados a materia orgánica (Parques Nacionales de Colombia, 2007). En el área también se presenta una fragmentación del ecosistema andino debido al aumento de áreas con monocultivos de cafeto (Coffea arabica), pasto kikuyo (Pennisetum clasdestinum), caña de azúcar (Saccharum officinarum L.) y plátano (Musa spp.) en la cuenca del rio La Vieja así como cebolla junca o larga (Allium fistulosum L.) y pino pátula (Pinus patula) en la cuenca del rio Otún.

8.2 DISEÑO DE MUESTREO.

Se realizaron dos eventos de muestro (EM) correspondientes a la época lluviosa (primer evento de muestreo (EM1): 14 al 21 de Abril) y la época seca (segundo evento de muestreo (EM2): 24 agosto al 1 Septiembre)(Gráfico 1), tanto en la cuenca del rio la Vieja como en la cuenca del rio Otún. En cada una de estas cuencas se eligieron tres usos del suelo diferentes, elegidos por ser los usos más representativos en extensión para cada cuenca, considerando a bosque en ambas cuencas como referencia de un suelo no intervenido y otros dos usos en representación de monocultivos con o sin rotación propios de la región. Por cada uso del suelo se seleccionaron tres fincas, elegidas por asequibilidad geográfica, antigüedad del uso del suelo mayor a 15 años y el beneplácito de los dueños; los usos elegidos por cada ventana, así como las fincas y sus coordenadas geográficas se muestran en la Tabla 1 y Figura 3.

Gráfico 1. Precipitación mensual promedio obtenida de series históricas por la estación climatológica el Agrado del municipio de Montenegro (Quindío). Las flechas indican los meses en los que

se realizaron los muestreos. 1EM: primer evento de muestreo: 14 a 21 Abril de 2007; EM2: segundo evento de muestreo: 24 Agosto a 1 Septiembre de 2007.

Meses

Pre

cip

itac

ión

EM1

EM2

Fuente: Cenicafé

37

Tabla 1. Coordenadas geográficas de las fincas seleccionadas para el estudio según uso del suelo en las cuencas de los ríos La Vieja y Otún.

Fuente: Mauricio Romero, LESYTH, Pontificia Universidad Javeriana.

Figura 3. Localización geográfica de las fincas seleccionadas para el estudio.

Cuenca Cobertura Finca Coordenadas

Norte Oeste

La Vieja

Bosque Secundario

La Ilusión 4°32'02.08" 75°51'59.3"

Lusitania 4°41'48" 75°50'18.19"

Veraguas No disponible No disponible

Pastizal

La Ramada 4°35'0.4" 75°49'43.9.3"

Villa Ximena 4°35'57.8" 75°40'2.7"

Tesalia Baja 4°35'19.3" 75°40'12"

Cafetal sin sombrío

El Descanso 4°41'7.3" 75°45'10.4"

Buenos Aires 4°40'14.9" 75°45'46.6"

La Aldea 4°39'41.4" 75°43'31.7"

Otún

Bosque Secundario

El Manzano 4°43'15.7" 75°34'33.8"

Bejucos 4°43'44.5" 75°34'45"

La Selva 4°47'20.4" 75°35'48.9"

Cebollar

Bellavista 4°45'54.8" 75°36'48.1"

Macarena 4°45'8.9 75°36'58.3"

Manzano 4°45'5.2" 75°36'49.7"

Plantación Forestal

La Selva 4°47'28.1" 75°35'41.7"

Playa Rica 4°45'35.4" 75°35'41.2"

Lisbrán 4°44'5.23" 75°34'57.3"

Fuente: los autores.

38

8.2.1 Toma de muestra. En cada finca se delimitaron 3 cuadrantes (2.5 m x 2.5 m), seleccionados en forma aleatoria, sin tener en cuenta diferencias en zona de influencia de rizósfera y ubicados al menos a 30 m de los limites físicos de la finca. Por cada cuadrante se tomaron 5 submuestras (vértices y centro) para formar una muestra compuesta utilizando un barreno de torsión a una profundidad aproximada de 15 cm. De la muestra compuesta, aproximadamente 500 g fueron depositados en bolsas plásticas resellables estériles, debidamente rotuladas (fecha, hora, tipo de

uso del suelo, nombre de la finca y número de cuadrante) conservadas en refrigeración a 4°C hasta su análisis. El total de muestras por uso del suelo en un evento de muestreo fue de nueve.

8.3 DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS Y AMBIENTALES IN SITU Y EX SITU.

8.3.1 Determinaciones in situ. Previo a la toma de la muestra, para cada vértice de un cuadrante se determinaron: la profundidad de hojarasca (cm) utilizando una regla acrílica; la temperatura del suelo a 20 cm de profundidad utilizando un termómetro de suelo con permanencia de 1 a 2 minutos antes de lectura; las temperaturas ambientales mínima y máxima utilizando un termómetro de máximas y mínimas, y el porcentaje de cobertura vegetal mediante un densitómetro.

8.3.2 Determinaciones ex situ.

8.3.2.1 Determinación de pH del suelo. Se mezclaron 10 g de suelo con 10 mL de agua destilada deionizada y se sometieron a agitación orbital a 160 rpm por 15 min. Transcurrido este tiempo se dejaron decantar las muestras por 1 h a temperatura ambiental y se midió el pH de la solución acuosa sobrenadante empleando un pHmetro (Metrohm E-744)(EPA, 1995).

8.3.2.2 Determinación de humedad del suelo. Se pesaron 10 g de muestra de suelo sobre una bandeja de aluminio (previamente pesada) en una balanza de precisión y se llevaron las muestras a un horno de secado a 105°C durante 24 h. Transcurrido ese tiempo, la bandeja con el suelo se pesó nuevamente (Olarte et al., 1979). El porcentaje de humedad será determinado según la ecuación 1 (Anexo A).

8.3.2.3 Determinación de materia orgánica total. Siguiendo el procedimiento de pérdida de peso por ignición (LESYHT, 2009a) 10 g de muestra de suelo fueron secados en crisol (previamente pesado) a 105°C por dos horas; el crisol se dejó enfriar y se registró el peso (hasta 4 cifras significativas, i.e. +0.001 g). El crisol luego se llevó a calentamiento en mufla (Termoline 48000 Furnace) a 550°C por 2 h; se permitió su enfriamiento en desecador y se registró de nuevo el peso del crisol. La pérdida de peso por ignición que corresponde al porcentaje de materia orgánica se calculó mediante la ecuación 5 (Anexo A). Este análisis fue llevado a cabo en el laboratorio de ecología de suelos y hongos tropicales (LESYHT) del Departamento de Biología, Pontificia Universidad Javeriana.

8.3.2.4 Determinación de la distribución de agregados del suelo. Se dispuso en bolsas de papel una cantidad de muestra de suelo superior a 10 g y se permitió su secado a temperatura ambiental durante tres días. Conocido previamente el porcentaje de humedad de la muestra se

39

tomó el equivalente en peso seco a 100 g de suelo peso fresco. La muestra se colocó en la parte

superior de una torre de tamices con diámetros de poro de 1.18 mm, 600, 300, 54 y menor a 54 m;

la torre fue agitada en tamizador por 5 min a 800 rpm. La fracción de suelo recolectada en cada una de las bandejas de los tamices se pesó en balanza analítica y se registró el dato por cada tipo de tamiz. La determinación del rango promedio de tamaño de agregados se calculó basada en el peso de diámetros medidos (PDM)(LESYTH, 2009b) (Ecuación 6, Anexo A). Este análisis fue llevado a cabo en el laboratorio de ecología de suelos y hongos tropicales (LESYHT) del Departamento de Biología, Pontificia Universidad Javeriana.

8.3.2.5 Determinación de la textura del suelo. Esta determinación se realizó por medio del método de Bouyoucos (LESYHT, 2009c). Partiendo de 25 g muestra de suelo previamente secado en bolsas de papel a temperatura ambiente por 24 h, los cuales luego se disolvieron en 5 mL de solución dispersante [18,75 g de tripolifosfato de sodio (Na5P3O10) y 3,75 g de carbonato de sodio (Na2CO3) en 500 mL de agua destilada] y 60 mL de agua destilada, se procedió a agitar la mezcla y se dejó en reposo por 24 h. Pasado este tiempo se aforó la mezcla hasta 250 mL con agua destilada, para luego agitar vigorosamente, trasvasar la mezcla a una probeta de 250 mL e inmediatamente introducir en ésta el hidrómetro de Bouyoucos permitiendo que éste flote; se realizó la primera lectura (C1) que corresponde a la densidad de la suspensión arcilla+limo. Se retiró el hidrómetro y luego de una hora se realizó una segunda lectura (C2) que corresponde a la densidad de la suspensión de arcilla. Los porcentajes de arcilla, limo y arena son determinados teniendo en cuenta las lecturas anteriores mediante las siguientes ecuaciones:

% Arena+Limo = C1 x 2

% Arena = C2 x 2

% Limo = % de Arena+Limo - % Arena

% Arcilla = 100 - (%Arena+Limo)

Este análisis fue llevado a cabo en el laboratorio de ecología de suelos y hongos tropicales (LESYHT) del Departamento de Biología, Pontificia Universidad Javeriana.

8.4 RECUENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE HIDROCARBUROS.

La determinación de la densidad de microorganismos degradadores de HC se realizó mediante el método de NMP en microplacas de 96 pozos, como lo sugieren Hainnes et al. (1996), Wrenn y Venosa (1996), modificado usando como indicador la sal de tetrazolio XTT (Polysciences, Warrington PA), como lo sugieren Roehm et al. (1991), Roslev y King (1993), Hatzinger et al. (2003) y McCluskey et al. (2005) y adaptado para el recuento de microorganismos degradadores de hidrocarburos como lo sugieren Vallejo et al. (2007).

8.4.1 Recuento de microorganismos cultivables degradadores de HC por la técnica de NMP. Inicialmente de una muestra de suelo fragmentada manualmente para disgregar los gránulos más grandes, se pesaron 10 g de suelo y se diluyeron en 90 mL de solución salina estéril; esta mezcla se agitó durante 15 min a 160 rpm y a partir se esta dilución (10-1) se prepararon diluciones seriadas hasta 10-7; las microplacas de poliestireno fueron esterilizadas por exposición a luz ultravioleta

40

durante 1 h. Se emplearon por pozo 180 L de medio sales mínimas Bushnell & Hass (Bushnell y

Hass, 1941) recomendado por Rosenberg (2006) (Anexo B), 5 L de diesel comercial previamente

filtrado por membrana de nitrocelulosa 0,22 m, como fuente única de carbono y 20 L de dilución de suelo con cinco repeticiones por dilución (Maldonado, 2003); las placas fueron

cubiertas con plástico Saranwrap® para evitar pérdidas de hidrocarburos por evaporación.

Después de incubación en oscuridad por 15 d a 22±1.2°C se añadieron 50 L de XTT 2 mM. Las

placas fueron incubadas a 223°C en agitación orbital a 150 rpm durante 18 h en oscuridad. Después de este tiempo los pozos que mostraron coloración naranja (XTT-formazán) fueron considerados como positivos. Los resultados de pozos positivos/negativos de las 5 diluciones realizadas se analizaron en el programa Most Probable Number Calculator2; los resultados fueron expresados como NMP/gps.

Se establecieron tres controles por placa: a) medio de cultivo, b) medio de cultivo + fuente de carbono (diesel) y c) medio de cultivo + fuente de carbono + Bacillus cereus cepa PUJ-M-Bio-USBA-121 (como control negativo, por ser éste un microorganismo no reportado como degradador de

hidrocarburos). Como control positivo se incluyó un pozo al que se adicionaron 20l de cultivo de una cepa control degradadora de hidrocarburos (Acinetobacter sp, PUJ-M-Bio-USBA-98). Para el caso de los organismos control se tomaron diluciones 10-2 preparadas a partir de la dilución de un cultivo en solución salina estéril con absorbancia 0.6 medida a una longitud de onda de 600 nm. Las diluciones menores que no se incluyeron en el ensayo de NMP se consideraron como positivas y esto fue igual para todas las determinaciones de NMP. Para efectos de comparación entre muestras de suelo, todas las determinaciones se expresaron por gramo de peso seco, así que las determinaciones de NMP se debieron multiplicar por un factor de corrección (peso suelo seco/peso suelo húmedo).

8.4.2 Recuperación y aislamiento de bacterias degradadoras de HC. Las bacterias degradadoras fueron recuperadas directamente de los pozos positivos de las diluciones más altas del NMP como lo sugieren Wrenn y Venosa (1996) y Schinner et al. (2003). Para su recuperación se realizó

siembra en superficie en agar nutritivo (suplementado con nistatina 0,2%), de 100 L de una dilución 10-4 del contenido de cada pozo seleccionado, con tres replicas por cuadrante muestreado, realizando el recuento y descripción macroscópica de cada morfotipo. La capacidad degradadora de cada aislado identificado se verificó mediante cuatro repiques sucesivos en agar de sales mínimas Bushnell-Hass (Anexo B), con atmósfera saturada de HC, mediante la ubicación de discos de papel filtro (0,5 cm de diámetro) en la tapa de la caja de Petri e impregnados con

diesel (20 µL) como lo sugieren Maldonado et al. (2003), las cuales fueron incubadas a 223°C durante ocho días por cada repique. Esta prueba se realizó para evitar contaminación con compuestos orgánicos provenientes de las muestras de suelo y del agar nutritivo. Los aislados cuya capacidad degradadora fue confirmada fueron cultivadas en agar nutritivo e incubadas a

223°C por 24 h tras lo cual se registraron las características macroscópicas de las colonias así como las características microscópicas por tinción diferencial de Gram, hasta asegurar la obtención de aislamientos puros con características uniformes. Los aislamientos fueron finalmente

2 Most probable number calculator V.4.04. Disponible en línea.

en:<http://www.i2workout.com/mcuriale/mpn/index.html>.(citado Junio 24 de 2009).

http://www.i2workout.com/mcuriale/mpn/index.html

41

conservados en medio leche descremada (1%) a -80 °C y adscritas a la colección de cepas de la Pontificia Universidad Javeriana.

8.5 EXTRACCIÓN DE DNA A PARTIR DE CULTIVOS PUROS DE AISLADOS DE MUESTRAS DE SUELO.

A partir de colonias de cultivos puros de los aislamientos de suelo, se realizó la liberación de ácidos nucleídos, suspendiendo una asada de una colonia de cada aislamiento de 24 h de crecimiento, en

50 l de búfer TE (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, pH 8.0), en tubos de PCR de 200 L. La suspensión se sometió a calentamiento a 100oC por 15 min., tras lo cual los tubos fueron colocados inmediatamente en baño de hielo. Posteriormente los tubos fueron centrifugados a

13.000 rpm por 2 minutos. Para evaluar la integridad del DNA, se realizó electroforesis de 3 L de sobrenadante, en agarosa al 1% (p/v) adicionada con un microlitro de bromuro de etidio (10 mg/mL), a 120 V por 40 min (Sambrook, 2000).

8.6 AMPLIFICACIÓN DE GENES DE rDNA 16S POR PCR.

Para la identificación y diferenciación de ribotipos procedentes de los aislamientos de muestras de suelo, se realizó la amplificación selectiva de la región variable V3 del rDNA 16S. Para esto y siguiendo las recomendaciones del protocolo sugerido por Casamayor et al. (2000), se prepara la mezcla de reacción de amplificación para volumen final de 20 µL con concentraciones finales de 1X de GoTaq Flexi búfer PCR 5X (Promega), 2,5 mM de MgCl2 25 mM (Promega), 0.2 mM de cada deoxinucleótido trifosfato (dATP, dTTP, dCTP, dGTP-PCR Nucleotide Mix Promega), 0.1 µM de cada iniciador universal (341F GC3 y 907R4), 0,025 U/µL de polimerasa recombinante (GoTaq DNA Polymearse, Promega) y 1 µl de DNA liberado por ebullición. El programa secuencial de ciclos de amplificación sugerido por Casamayor et al. (2000) se muestra en la Tabla 2. El producto de amplificación con los iniciadores antes mencionados tiene un tamaño molecular de 535pb. Estos productos de amplificación fueron separados y visualizados inicialmente cargando 3 µL de

producto de PCR + 3 µL de búfer de carga en un gel de agarosa al 1% (p/v) adicionado con 1 l bromuro de etidio (10 mg/mL) para su coloración, corrido a 120 V por 25 min. Como control negativo de reacción se incluiyó una muestra que utilizó agua MiliQ en lugar de DNA.

8.7 ANÁLSIS DE RIBOTIPOS POR SEPARACIÓN DIFERENCIAL MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL

DE GRADIENTE DENATURANTE (DGGE).

Un volumen de ocho microlitros de producto de reacción de PCR correspondiente a cada aislamiento, fue cargado por pozo, en un gel de poliacrilamida al 6% p/v (acrilamida-bisacrilamida 37.5:1 40% p/v, Sigma-Aldrich) (Anexo C) en búfer TAE 1X (Anexo C), con dimensiones de 16 x 16 cm y 0,75 mm de grosor con un gradiente denaturante urea-formamida (Sigma-Aldrich) de 30% a 60%; El gel fue corrido en cámara de electroforesis vertical (Dcode Universal Mutation Detection System, Bio-Rad), en inmersión total en búfer TAE 0,5X (Anexo C), a voltaje constante de 100 V, y

3 GC es una secuencia de 40 nucleótidos rica en GC añadida al extreme 5’. La secuencia es 5’-CGC CCG CCG

CGCCCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G. 4 El iniciador 341F GC esta dirigido a los nucleótidos 341 a 357 del DNAr de E. coli y el iniciador 907R a los

nucleótidos 907 a 926 del DNAr.

42

temperatura constante de 60 oC durante 17 h. Posteriormente los geles fueron teñidos mediante coloración con nitrato de plata (Velandia, 2006) que permitiera determinar el frente de corrida de la(s) banda(s) por aislado. Solo los aislados que poseían una similitud de 100% en su perfil electroforético se consideraron como una misma OTU.

Tabla 2. Programa de ciclos de amplificación de región V3 de rDNA

16S para los iniciadores 341F GC y 907R.

Numero de ciclos

Denaturación Anillamiento Extensión

1 940C x 5 min. - -

1 940C x 1 min. 650C x 1min. 720C x 1min.

19 940C x 1 min.

640C 0,5

0C x

ciclo x 1min. 72

0C x 1min.

10 940C x 1 min. 550C x 1min. 720C x 1min.

1 - - 720C x 7min.

8.8 SECUENCIACIÓN DE PRODUCTOS DE AMPLIFICACIÓN.

Dado que el análisis de perfiles electroforéticos solo permite determinar diferencias inespecíficas entre los aislados de poblaciones de organismos, en este caso, degradadores de HC, pero no proporciona información sobre cuales son los organismos implicados en ese cambio, la estrategia más directa para este conocimiento es la secuenciación enzimática de los amplificados de genes ribosomales, eliminando los errores en la identificación por métodos convencionales (e.g., pruebas bioquímicas, morfología macro y microscópica)(Petti, 2005). Para esto, los productos de amplificación de aquellos aislados que según el perfil electroforético en el gel denaturante, no son redundantes (i.e., representan OTUS diferentes), fueron enviados a un servicio de secuenciación externo (Macrogen Global Genome Center).

8.9 DETERMINACIÓN DE AFILIACIÓN TAXONÓMICA.

Los cromatogramas resultantes de la secuenciación fueron analizados y editados en el programa Chromas (v2.13)(Technelysium, 2009), para luego ser exportados en formato FASTA a las bases de datos RDP y Genbank y analizados mediante sus herramientas SeqMatch (RDP, 2009) y BLAST (NCBI, 2009), respectivamente. Se determinó la afiliación taxonómica de los aislados, así como su porcentaje de similitud con dichas afiliaciones. Los resultados de la búsqueda más similares a la secuencia del aislado, fueron aquellos con valores E más bajos; estos resultados permiten determinar la afiliación taxonómica con respecto a género y especie al que corresponde cada secuencia (Claverie y Notredame, 2003).

43

8.10 DETERMINACIÓN DE LOS ÍNDICES DE DIVERSIDAD.

Partiendo de los datos de afiliación taxonómica se elaboraron matrices de ausencia/presencia de taxa y matrices de abundancia de taxa (i.e. género y/o especie) para las fincas muestreadas y por uso de suelo, en las dos cuencas y eventos de muestreo. A partir de estas matrices de abundancia, se calculó mediante el programa PAST (Hammer et al., 2001) el índice de diversidad de Shanon-Wiener (Ecuación 2, Anexo A), la riqueza, la dominancia (1-índice de Simpson) e índice de equitabilidad de Shannon (Ecuación 3, Anexo A). Para evaluar la existencia de diferencias en éstas medidas entre usos del suelo y entre eventos de muestro, se utilizó la prueba de comparación de diversidades mediante permutación, del programa PAST. Se determinó también el ajuste de las matrices de abundancia de taxa, a un modelos de abundancia (i.e., geométrico, log series, log normal, palo quebrado), mediante el programa PAST.

8.11 ELABORACIÓN DE DENDROGRAMAS.

Basados en las matrices de ausencia/presencia de taxa, se determinó la asociación de los usos del suelo en ambas cuencas utilizando un método de agrupamiento sencillo basado en los índices de similitud de Raup-Crick y Dice-Søerensen (Ecuación 4, Anexo C).

Para determinar la existencia de diferencias significativas en la composición de especies entre los gremios de bacterias degradadoras de cada uso del suelo, se utilizó el análisis de similitud (ANASIM); el test de Mantel se utilizó para determinar las diferencias entre eventos de muestreo de un uso del suelo. Todas las pruebas se realizaron con un nivel de significación de 0,05 en el programa PAST.

8.12 EVALUACIÓN DE LA RELACIÓN ENTRE LA CAPACIDAD DEGRADADORA DE HIDROCARBUROS

TOTALES DE PETRÓLEO Y DIVERSIDAD EN MUESTRAS DE SUELO.

Con el fin de establecer si las diferencias en diversidad, se relacionan con cambios en la capacidad degradadora de TPH (hidrocarburos totales de petróleo) en las muestras de suelo, se evaluó la capacidad potencial de degradación de TPH por parte de los microorganismos procedentes de muestras con diversos índices diversidad, mediante un diseño completamente al azar. Se seleccionaron diez tratamientos con tres replicas, elegidos mediante una lista aleatoria; 25 g de muestra de suelo se agregaron a un frasco ámbar estéril de vidrio de 50 ml, sin ajuste de humedad

y se agregaron 650 L de diesel (=0,7699 g/mL) filtrado por membrana de nitrocelulosa de 0,22

m, para una concentración final de 40 mg/kgps (40 ppm) (García et al., 2005); se añadieron 0,5 mL de NH4NO3 (284 mg/mL) y 0,5 mL de K2HPO4 (55,1 mg/mL), para ajustar la relación C:N:P a 100:10:1 teniendo en cuenta la cantidad de diesel agregado como recomiendan Wrenn y Venosa

(1993) y Vallejo (2004). Los frascos fueron cerrados e incubados a 22 3°C durante 45 d protegidos de la luz; cada dos días los frascos fueron destapados en cabina de flujo para permitir el recambio gaseoso y reducir la inhibición metabólica por acumulación de CO2. El contenido de TPH de cada unidad experimental es determinada al inicio y al final del ensayo.

44

8.12.1 DETERMINACIÓN DE HIDROCARBUROS TOTALES DE PETRÓLEO DE MUESTRAS DE SUELO.

La determinación de TPH en muestras de suelo se realizó mediante extracción con solventes orgánicos. Para ello se mezcló en un tubo plástico tapa rosca, un gramo de muestra de suelo con 10 mL de diclorometano:acetona (Mallinnckrodt:J.T.Baker)(1:1, v/v) y se sometió a agitación horizontal a 120 rpm por 30 min, luego de lo cual la mezcla se centrifugó a 1100 rpm por diez minutos y se extrajo el sobrenadante; este procedimiento se repitió cuatro veces. El sobrenadante se filtró a través de papel Whatman No. 40 conteniendo sílica gel (Merck)(previamente secada en horno en cajas Petri a 120°C por 24 h), a un tubo vidrio (lavados con HNO3 (Carlo Erba), 1N) previamente pesado. Los tubos con el filtrado fueron depositados posteriormente en baño a 50oC (temperatura a la cual el diclorometano y la acetona se volatilizan, pero los TPH no) hasta la volatilización total del solvente (aproximadante cuatro horas). Los tubos fueron enfriados en desecador y pesados hasta alcanzar peso constante; la diferencia entre el peso inicial y el final corresponde al contenido en hidrocarburos totales, expresado en mg/g de peso seco de suelo (ASTM, 1995; Sadler y Cornell, 2003; Vallejo, 2004).

8.13 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS.

Tanto los datos de los recuentos de NMP, como los parámetros ambientales y fisicoquímicos, fueron analizados en su ajuste a una distribución normal mediante las pruebas de bondad de ajuste de Shapiro Wilks y Kolmogorov-Smirnov. Las variables que no se ajustaban a una distribución normal fueron transformadas mediante raíz cuadrada de los datos.

Para evaluar las diferencias en los recuentos de NMP, parámetros ambientales y fisicoquímicos entre los usos del suelo se utilizaron las pruebas de ANAVA con comparaciones múltiples de Tukey y ANAVA de Kruskall-Wallis con la prueba de comparaciones múltiples sugerida por Siegel y Castellan (1995)(Anexo D); la evaluación de la diferencia entre eventos de muestreo se realizó mediante prueba t para muestras dependientes o mediante una prueba no paramétrica U de Mann-Whitney.

La correlación entre los datos de recuento por NMP, los parámetros ambientales y fisicoquímicos se evaluó mediante las correlaciones lineal r de Pearson y correlación por rangos de Spearman para cada cuenca durante los dos eventos de muestreo.

Para el análisis de la relación entre diversidad y degradación, se evaluó la correlación entre los datos de los índices de diversidad y los valores de TPH mediante análisis de regresión lineal.

Las diferencias entre las cantidad de TPH degradado entre unidades experimentales, fue evaluada mediante ANAVA de Kruskall-Wallis con prueba de comparaciones múltiples para k grupos sugerida por Siegel y Castellan (1995).

8.13.1 Análisis multivariados. Dado que las variables de recuento de NMP, ambientales y fisicoquímicas poseen datos en escalas de medida diferentes estos fueron estandarizados primero (Ecuación 7, Anexo D). Para evaluar cuales eran las variables (ambientales, fisicoquímicas y biológicas) que pudieran explicar la mayor parte de la varianza total de los datos, permitiendo de esta forma discriminar los usos del suelo según estas variables, se utilizó un análisis de

45

componentes principales mediante el programa STATISTICA (version 8.0, StatSoft Inc. 2007). Para evaluar los patrones de ordenamiento de los usos del suelo basado en la distribución de especies, se realizó un análisis de correspondencia mediante el programa PC-ORD para Windows (McCune y Mefford, 1997). Para determinar si las variables ambientales y fisicoquímicas podían explicar la distribución de especies en los diferentes usos del suelo se utilizó un análisis de correlación canónica en el programa CANOCO para Windows (Ter Braak Cajo y Smilauer, 1997-2003).

46

9. RESULTADOS Y ANALISIS 9.1 VARIABLES FISICOQUÍMICAS Y AMBIENTALES

Se determinaron las variables: pH, porcentaje de humedad, porcentaje de materia orgánica, porcentaje de cobertura vegetal, temperatura del suelo, temperatura ambiental máxima y mínima. En cuanto a características del suelo se determinaron los porcentajes de agregados del suelo y sus propiedades texturales. La variable profundidad de hojarasca se determinó solo para los usos bosque, cafetal y forestal; los resultados se pueden observar en los Gráficos 6 y 7.

9.1.1 Determinación de variables fisicoquímicas y ambientales relevantes. Se realizó un un análsis de componentes principales para identificar aquellos factores fisicoquímicos y ambientales que podrían explicar el mayor porcentaje de la variabilidad de los datos. El análisis de componentes principales permite no solo observar las variables que mayor efecto tienen en nuestros datos, sino que también nos pemiten discriminar nuestros sitios de muestreo con base en estos componentes.

Gráfico 2. Proyección de las variables ambientales y fisicoquímicas de las fincas de la cuenca del rio

La Vieja en el plano de factores(n=18). a. TempAmbMax: temperatura ambiental máxima; TempAmbMín: temperatura

ambiental mínima; Temp suelo: temperatura de suelo in situ; pH: valor de potencial de hidrogeniones del suelo; hojarasca:

profundidad de hojarasca (cm); %MatOrg: porcentaje de materia orgánica; %Cobveg: porcentaje de cobertura vegetal; agreg1,18:

porcentaje de agregados de 1,18mm; agreg600: porcentaje de agregados de 600m; agreg300: porcentaje de agregados de 300m;

agreg54: porcentaje de agregados de 54m; agreg<54: porcentaje de agregados menores a 54m. b. Tabla de coordenadas en los

factores para las variables; las variables representativas para cada factor (valor > l0,5l) se muestran en rojo.

Factor 1 Factor 2

Variable

pH 0.228387 0.222904

% Humedad -0.744999 -0.494673

temperatura suelo 0.212114 0.387047

% Materia orgánica -0.455905 -0.424389

Prof. hojarasca 0.638015 0.034992

TempAmbMax 0.247379 0.702184

TempAmbMin 0.193950 0.813819

%CobVeg 0.784247 -0.424663

% arcilla 0.878437 -0.050955

% limo 0.324545 0.702728

% arena -0.680542 -0.484144

%agreg1,18 0.919585 -0.371526

%agreg600 -0.854102 0.187401

%agreg300 -0.903040 0.208833

%agreg54 -0.760768 0.402634

%agreg<54 -0.377898 0.614003

a

b

Fuente: los autores

47

9.1.1.1 Cuenca rio la Vieja. Se observa, que el primer factor incluye variables que influyen en la estructura del suelo y su contenido de humedad (Gráfico 2). El segundo factor incluye las temperaturas ambientales y otras variables que influyen en la estructura del suelo. El porcentaje de materia orgánica, el pH y la temperatura del suelo, no constituyen variables que permitan discriminar nuestros sitios de muestreo.

En el Gráfico 3a, se observa la distribución de los sitios de muestreo según la proyección en el plano de factores, mostrando que la época climática no tiene una influencia marcada en la variabilidad de los parámetros ambientales, puesto que no se observa una distribución excluyente de los dos eventos de muestreo. La distribución por usos del suelo, Gráfico 3b, muestra en cambio, una marcada diferenciación entre las fincas con intervención y los bosques, dada en estos últimos, por sus altos valores en % de cobertura vegetal, profundidad de hojarasca, % de arcilla y % de agregados de mayor tamaño (1,18 mm).

Gráfico 3. Proyección en el plano de factores de las fincas muestreadas en la cuenca del rio La

Vieja(n=18). a. agrupación según época climática (eventos de muestreo). b. agrupación según uso del suelo.

Este análisis nos muestra que las variables ambientales y fisicoquímicas, pueden ser una herramienta útil en la discriminación de sitios de muestreo según sea su nivel de intervención, pues a pesar de no estar sometidos a cambios estacionales, existen cambios en los factores ambientales y fisicoquímicos. En general podemos afirmar que existe una mayor homogeneidad entre bosques, que la que podemos encontrar entre cafetales o pastizales. Observamos también que algunos cafetales y pastizales se relacionan más entre sí que con otros de su mismo tipo, denotando la relación de origen que presentan los pastizales a partir de antiguos cafetales.

9.1.1.2 Cuenca del rio Otún. Se observa que el primer factor es el que explica la mayoría de la variación incluyendo casi todos los parámetros; el pH, la temperatura del suelo, y % de materia orgánica, no constituyen variables que permitan discriminar nuestros sitios de muestreo (Gráfico 4). Este primer factor al igual que en el caso de la cuenca del rio La Vieja, corresponde a variables que influyen en la estructura del suelo y su contenido de humedad. El segundo factor menos importante, incluye dos variables que influyen en la estructura del suelo.

-4 -2 0 2 4 6

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

Bosque

Pastizal

Cafetal

-4 -2 0 2 4 6

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

época lluviosa

época seca

a b

Fuente: los autores

48

Gráfico 4. Proyección de las variables ambientales y fisicoquímicas de las fincas de la cuenca del rio

Otún en el plano de factores (n=18). a. TempAmbMax: temperatura ambiental máxima; TempAmbMín: temperatura ambiental mínima; Temp suelo: temperatura de

suelo in situ; pH: valor de potencial de hidrogeniones del suelo; hojarasca: profundidad de hojarasca (cm); %MatOrg: porcentaje de

materia orgánica; %Cobveg: porcentaje de cobertura vegetal; agreg1,18: porcentaje de agregados de 1,18mm; agreg600: porcentaje

de agregados de 600m; agreg300: porcentaje de agregados de 300m; agreg54: porcentaje de agregados de 54m; agreg<54:

porcentaje de agregados menores a 54m. b. Tabla de coordenadas en los factores para las variables; las variables representativas

para cada factor (lvalorl > 0,5) se muestran en rojo.

En el Gráfico 5a, se observa la distribución de los sitios de muestreo según la proyección en el plano de factores, mostrando que la época climática no tiene una influencia marcada en la variabilidad, puesto que no se observa una distribución excluyente de los dos eventos de muestreo. La distribución por usos del suelo (Gráfico 5b), muestra en cambio, una marcada diferenciación entre las fincas con cultivos de cebollar y los bosques (nativos y plantaciones), dada en estos últimos, por sus altos valores en % de cobertura vegetal, profundidad de hojarasca, % de humedad y los cultivos de cebollar caracterizados por mayores temperaturas ambientales y mayor contenido de arcilla.

Teniendo presente estas distribuciones, podemos decir que los sitios de muestreo según su uso del suelo pueden ser discriminadas teniendo en cuenta las variables ambientales seleccionadas en el estudio.

De manera inesperada, son los cebollares los que presentan mayor estabilidad con respecto a la época climática. Esto puede sin embargo ser explicado porque, actividades como labranza, fertilización inorgánica y deshierbe, se ejecutan de manera predecible en el tiempo, en cantidades fijas y constantes, tanto en cantidad como en clase, mientras que en bosques o plantaciones

Factor 1 Factor 2

Variable

pH -0.192418 -0.010053

% Humedad 0.741201 0.450724

temperatura suelo -0.312171 -0.464925

% Materia orgánica 0.440143 0.186782

Prof. hojarasca 0.810069 0.432502

TempAmbMax -0.675387 -0.072603

TempAmbMin -0.614216 -0.098913

%CobVeg 0.811600 0.475445

% arcilla -0.921393 -0.142572

% limo -0.635781 0.451695

% arena 0.797176 -0.329348

%agreg1,18 -0.811744 0.500471

%agreg600 0.729926 -0.345348

%agreg300 0.906175 -0.254128

%agreg54 0.701797 -0.607651

%agreg<54 -0.416255 -0.778493

a

b

Fuente: los autores

49

forestales, la época climática afecta de manera variable las entradas de materia y energía las cuales dependen de la variedad de individuos presentes en un área específica. Globalmente, los bosques resultan ser más homogéneos entre sí, de lo que son los cebollares o las plantaciones forestales, como sucedió en la cuenca del rio La Vieja.

-6 -4 -2 0 2 4 6

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

época lluviosa

época seca

-6 -4 -2 0 2 4 6

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

Bosque

Cebollal

Forestal

Gráfico 5. Proyección en el plano de factores de las fincas muestreadas en la cuenca del rio Otún (n=18). a. agrupación según eventos de muestreo (época climática). b. agrupación según uso del suelo.

9.1.2 Análisis de variables fisicoquímicas y ambientales para la cuenca del rio La Vieja. 9.1.2.1 Humedad: En los dos eventos de muestreo se observaron valores significativamente mayores en pastizal que en bosque, a pesar del bajo porcentaje de cobertura vegetal. Pastizal no presentó diferencias entre los eventos de muestreo, lo que si sucedió tanto en bosque como en cafetal, donde el EM2 (época seca) presentó valores significativamente mayores. Aunque la época seca presente para todos los usos, mayores valores promedio, esta contradicción puede verse explicada por el hecho que en los días de muestreo se presentaron lluvias copiosas. Valores siempre superiores en pastizal, reflejan la acción protectora de la capa de pasto en la disminución de evapotrasnpiración. No se conocen sin embargo los valores de la capacidad de campo y retención de agua, pronosticada para pastizal como menor, debido a su mayor contenido de arena. 9.1.2.2 Hojarasca: No se presentaron diferencias en la profundidad de hojarasca entre bosque y cafetal en los dos eventos de muestreo, sin embargo se observó una disminución significativa para bosque en el EM2; para cafetal no hubo diferencias entre eventos de muestreo. Aunque la época vegetativa en las plantas se ve favorecida en época lluviosa, una menor cantidad de hojarasca en época seca puede deberse a mayores tazas de degradación, relacionadas con mayores temperaturas del suelo. 9.1.2.3 Cobertura vegetal: Para ambos eventos de muestreo se observó que bosque presentó un porcentaje de cobertura significativamente mayor que pastizal y cafetal. Tanto para bosque, como

a b

Fuente: los autores

50

para pastizal, se observó un incremento significativo en el EM2. Durante la época seca se observa el resultado del incremento del crecimiento vegetativo impulsado por las lluvias del EM1; este efecto no es tan claro en cafetal, donde el número de plantas por hectárea es fijo y el carbono fijado se dirige a la producción de frutos y no de follaje. Entradas adicionales de carbono y nitrógeno se encuentran solo en cafetales con sombrío, procedentes de árboles como el guamo (Inga spp.). 9.1.2.4 Temperatura ambiental máxima: Se observó la tendencia de menores valores en el EM2, siendo esta disminución significativa solo en cafetal, el cual tambien presentó en este evento valores significativamente menores que bosque y pastizal. 9.1.2.5 Temperatura ambiental mínima: para el EM1 cafetal presentó valores significativamente mayores que bosque y pastizal. En el EM2 cafetal presentó valores significativamente menores que pastizal. Esta disminución en cafetal, tambien fue significativamente menor a la reportada para el EM1. Para bosque y pastizal los cambios entre eventos no fueron significativos. Las temperaturas ambientales no poseen un patrón estacional; las diferentes horas del día en el que se toman estas mediciones y la capacidad conductiva y convectiva del aire hacen difícil la interpretación de los cambios según el uso del suelo y el evento de muestreo. 9.1.2.6 Textura del suelo. No se observaron diferencias significativas ni en el % de arena ni en el % arcilla entre los usos de suelo, aunque pastizal y cafetal presentan valores de arcilla similares y menores que bosque, acorde con un cambio en el uso del suelo (Volverás et al., 2007). Bosque presentó un porcentaje de limo significativamente mayor que pastizal; cafetal no presentó diferencias en el % de limo con los otros dos usos. La ausencia de diferencias en las propiedades texturales refuerzan el hecho que todos los usos posean un origen edáfico común; esta similitud sin embargo no ayuda a explicar las diferencias en humedad de los suelos, ya que basados en esta información todos deberían tener una humedad similar o al menos, ésta debería ser proporcional al % de cobertura vegetal. Se observa una mayor similitud entre cafetal y pastizal, que denotan posiblemente el origen de los pastizales a partir de antiguos cafetales.

9.1.2.7 Estructura del suelo. Excepto para el porcentaje de agregados menores a 54 m, en el cual cafetal presentó valores significativamente mayores que pastizal, estos dos usos no presentan diferencias en el restante de porcentajes de agregados. Bosque presentó porcentaje de agregados de 1,18 mm significativamente mayores que cafetal y pastizal, y significativamente menores en los demás tamaños de agregados, acorde con una ausencia de actividades agricolas, como el arado (Lupwaji et al., 2001). Al igual que con las propiedades texturales cafetal y pastizal presentan similitudes, con una ligera diferencia de mayor compactación de pastizal posiblemente favorecida por el pisoteo constante del ganado.

51

0

1

2

3

4

5

6

7

Bosque Pastizal Cafetal

% p

érd

ida

po

r ig

nic

ión

Materia orgánica

EM1

EM20

2

4

6

8

10

Bosque Cafetal

pro

fun

did

ad (

cm)

Hojarasca

EM1

EM2

0

5

10

15

20

25

30

35

40


tem

pe

ratu

ra °

C

Temperatura ambiental máxima

EM1

EM2

-20

0

20

40

60

80

100

120


% c

ob

ert

ura

ve

geta

l

Cobertura vegetal

EM1

EM2

Fuente: los autores

Grafico 6. Valores promedio para variables fisicoquímicas y ambientales por uso de suelo en la

cuenca del rio La Vieja durante el estudio (n=9). Diferente letra minúscula indica diferencia significativa

(P ≤ 0,05) entre los eventos de muestreo en cada uso del suelo. Diferente letra mayúscula indica diferencia significativa

(P ≤ 0,05) entre usos del suelo para cada evento de muestreo. 1EM: primer evento de muestreo: 14 a 21 Abril de 2007;

EM2: segundo evento de muestreo: 24 Agosto a 1 Septiembre de 2007.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9


pH

EM1

EM2 0

10

20

30

40

50

60


% h

um

ed

ad

Humedad

EM1

EM2

a

a

a

a b

b

a

a

a

a

b b

a

b

a

a a

a

a

a

b

b

a

b

a

b

a a

a a

a a

a

b

A

AB

A

A

A B

A

A

B

B

AB

AB

A A

A A

A

A A

A

A

A

A

A

B

B

B B

A

A

A A

A B

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

─

52

0

5

10

15

20

25

30

35

40


Tem

pe

ratu

ra °

C

Temperatura suelo

EM1

EM20

5

10

15

20

25

30

35

40


Tem

pe

ratu

ra °

C

Temperatura ambiental mínima

EM1

EM2

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Bosque Cafetal Pastizal

arcilla

limo

arena

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Bosque Cafetal Pastizal

<54 um

600 um

300 um

54mm

1,18mm

Gráfico 6. Valores promedio para variables fisicoquímicas y ambientales por uso de suelo en la

cuenca del rio La Vieja durante el estudio (n=9). Diferente letra minúscula indica diferencia significativa

(p ≤ 0,05) entre los eventos de muestreo en cada uso del suelo. Diferente letra mayúscula indica diferencia significativa

(p ≤ 0,05) entre usos del suelo para cada evento de muestreo. 1EM: primer evento de muestreo: 14 a 21 Abril de 2007;


9.1.3 Análisis de variables fisiccoquimicos y ambientales para la cuenca del rio Otún. 9.1.3.1 Humedad: Se observa la tendencia a que sea bosque el que presenta mayores valores de humedad en suelo; esto se refleja en la diferencia significativa con cebollar en ambos eventos de muestreo, el cual presenta los valores más bajos. La humedad no presentó un cambio significativo durante el EM2. Mayores porcentajes de humedad en bosque y forestal reflejan la relación directa y positiva con el porcentaje de cobertura de vegetal, la cual permite ejercer un efecto de amortiguamiento de la radiación solar y retiene parte de la humedad perdida por transpiración vegetal y animal. Aunque en el EM2 se observan mayores valores de humedad a pesar de ser época seca, estos valores pueden ser resultado de la coincidencia de los muestreos con episodios de intensa precipitación. Los cambios observados en las densidades pueden entonces ser tal vez atribuidos, a tipos de carbono no evaluados; Chen et al. (2004) observó que la conversión de bosque natural a

a

A ─

a

A ─

a

A ─

a

A ─

a

A ─

a

AB ─

a

A ─

a

A ─

a

B ─

b

B ─

a

A ─

a

A ─

A

A

A

A A

B

B A

B

B

B

B

A

B

B

A

A

B

A

A

A

A

A

B

B

Fuente: los autores

53

plantación de pino no solo reduce significativamente el carbono total (en 19,8%) sino el carbono orgánico soluble (en 17,7%), el carbono extraíble por CaCl2 (en 38,8%) y el carbono extraíble por agua caliente (30,9%) así como la biodisponibilidad del carbono. Estos cambios pueden ser debidos a la cantidad y naturaleza de la hojarasca, diversidad microbiana, y su actividad y a los disturbios durante la preparación de la zona de siembra (Chen et al., 2004). 9.1.3.2 Hojarasca: No se observaron diferencias significativas entre los usos bosque y forestal del suelo, a pesar que bosque posee valores más altos en ambos eventos de muestreo; la alta variabilidad de los datos entre fincas puede explicar la ausencia de diferencias; una menor cantidad de hojarasca en el EM2, puede relacionarse con mayores tasas de degradación, lo cual se ve respaldado por un aumento en la materia orgánica y la temperatura del suelo para este evento de muestreo. 9.1.3.3 Cobertuta vegetal: Se observa que en ambos eventos de muestreo, bosque y forestal poseen valores significativamente mayores a cebollar. Solo en cebollar se observa una diferencia significativa entre eventos de muestreo. La ausencia de diferencias en cobertura vegetal entre bosque y forestal, ayudan a explicar la similitud en el % de humedad y temperaturas del suelo y ambientales entre los dos usos.

9.1.3.4 Temperatura ambiental máxima: En el EM1 no se observan diferencias entre usos del suelo; sin embargo, en el EM2 cebollar presenta valores significativamente mayores que bosque y forestal. Cebollar y forestal presentan diferencias significativas entre eventos de muestreo, existiendo en el EM2 un aumento en cebollar y una reducción para forestal. 9.1.3.5 Temperatura ambiental mínima: En el EM1 no se observaron diferencias entre usos del suelo, sin embargo en el EM2 cebollar presenta valores significativamente mayores que bosque y forestal. Cebollar y forestal presentan diferencias significativas entre evetos de muestreo existiendo en el EM2 un aumento en cebollar y una reducción para forestal. Mayores valores para cebollar en el EM2, respaldan la idea que aunque exista una exposición solar mayor, la cobertura vegetal ejerce un efecto de bloqueo, reduciendo la temperatura ambiental a nivel del suelo.

9.1.3.5 Textura del suelo. Plantacion forestal presentó un % de arena significativamente mayor que cebollar y un porcentaje de arcilla significativamente menor que cebollar y bosque; mayores valores de arcilla en cebollar son acordes con un cambio en el uso del suelo (Volverás et al., 2007). No se presentó diferencia significativa en el porcentaje de limo entre usos del suelo. Menores cantidades de % de arcilla y mayores de % de arena en bosque y forestal, pueden explicar los mayores valores de humedad, dada su mayor permeabilidad y capacidad de campo.

54

0

5

10

15

20

25

30

Bosque Cebolla Forestal

Tem

pe

ratu

ra °

C

Temperatura suelo

EM1

EM2

-20

0

20

40

60

80

100

120


% c

ob

ert

ura

ve

geta

l

Cobertura vegetal

EM1

EM2

0

1

2

3

4

5

6


% p

érd

ida

po

r ig

nic

ión

% Materia orgánica

EM1

EM20

2

4

6

8

10

12

14

16

Bosque Forestal

Pro

fun

did

ad (

cm)

Hojarasca

EM1

EM2

0

1

2

3

4

5

6

7

8


pH

pH

EM1

EM20

10

20

30

40

50

60

70


% h

um

ed

ad

% Humedad

EM1

EM2


cuenca del rio Otún durante el estudio (n=9). Diferente letra minúscula indica diferencia significativa (p ≤ 0,05)

entre los eventos de muestreo en cada uso del suelo. Diferente letra mayúscula indica diferencia significativa (p ≤ 0,05)

entre usos del suelo para cada evento de muestreo. 1EM: primer evento de muestreo: 14 a 21 Abril de 2007; EM2:

segundo evento de muestreo: 24 Agosto a 1 Septiembre de 2007.

a

A ─

a

A ─

a

A ─

a

A ─

a

A ─

a

A ─

a

B ─

b

B ─

a

AB ─

b

A ─

a

A ─

a

A ─

a

B ─

a

B ─

a

A ─

a

A ─

a

A ─

a

A ─

a

B ─

b

A ─

a

AB ─

b

A ─

a

A ─

a

A ─

─

B a

─

B b

a

A ─

a

A ─

a

A ─

b

A ─

a

B ─

a

A ─

a

A ─

b

A ─

55

0

5

10

15

20

25

30


Tem

pe

ratu

ra °

C

Temperatura ambiental mínima

EM1

EM20

5

10

15

20

25

30


Tem

pe

ratu

ra °

CTemperatura ambiental máxima

EM1

EM2

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%


arcilla

limo

arena

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%


<54 um

54 um

300 um

600 um

1,18 mm


cuenca del rio Otún durante el estudio (n=9). Diferente letra minúscula indica diferencia significativa (p ≤ 0,05)

entre los eventos de muestreo en cada uso del suelo. Diferente letra mayúscula indica diferencia significativa (p ≤ 0,05)

entre usos del suelo para cada evento de muestreo. 1EM: primer evento de muestreo: 14 a 21 Abril de 2007; EM2:

segundo evento de muestreo: 24 Agosto a 1 Septiembre de 2007.

9.1.3.6 Estructura del suelo. Para los porcentajes de agregados de 600 m y 300 m forestal presenta valores significativamente mayores que cebollar; para el porcentaje de agregados de 1,18 mm es cebollar el que presenta valores significativamente mayores que forestal, lo que indica

una mayor compactación en cebollar. No se presentaron diferencias en el pocentaje de 54 m

para los tres usos. Cebollar presentó porcentaje de agregados menores a 54 m significativamente mayores que bosque. Aunque estadísticamente bosque y forestal no presentan diferencias, se observó una ligera diferencia de menor compactación en bosque, favorecida tal vez por una mayor densidad de individuos vegetales, derivando en agregación producto la extensión radicular y la ausencia de prácticas de arado, como reporta Lupwaji et al. (2001); menores compactaciones tienden a favorecer el incremento en la respiración, biomasa y actividad de comunidades microbianas (Merriles et al., 2008)

b

A ─

a

A ─

a

A ─

b

B ─

a

A ─

a

A ─

a

A ─

a

A ─

a

A ─

b

B ─

a

A ─

b

A ─

AB

A

B

A

A

A

A A

B A

A

A

AB B

A

AB

A

B

A

A

B

B

A

B

A B

Fuente: los autores

56

9.2 RECUENTO DE MICROORGANISMOS CULTIVABLES DEGRADADORES DE HC POR LA TÉCNICA DE NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP). La técnica de número más probable constituye una herramienta útil en el recuento de densidades microbianas cuando se preveen conteos bajos, como es el caso de bacterias degradadoras de hidrocarburos. Esta técnica permitió la estimación de las densidades de bacterias degradadoras de HC en todos los usos del suelo seleccionados, evidenciando el carácter cosmopolita de este grupo funcional (Leahy y Colwell, 1990). Se debe resaltar el hecho que estos microorganismos hayan crecido en la presencia de diesel, dado que los sistemas muestreados no presentan historia de contaminaciones accidentales o premeditadas previas; sin embargo como lo afirman Leahy y Colwell (1990), la exposición previa a otros hidrocarburos puede pre-adaptar a los organismos y favorecer el metabolismo de compuestos estructuralmente similares, como se ha descrito para la microbiota de suelos de bosques nunca expuestos a 2,4,6 TCP (triclorofenol) en la degradación de altos niveles de éste compuesto (Sánchez et al., 2004).

Aunque el número de microorganismos degradadores puede ser indicativo del grado de contaminación de un lugar (Braddock y Catterall, 1999), esto puede solo revelar el nivel de hidrocarburos presentes producto de la humificación y descomposición de material proveniente de la cobertura vegetal sobre el suelo y bajo éste. Los recuentos obtenidos en este estudio,

concuerdan en magnitud con los valores en el orden de 103 a 104 bacterias degradadoras por gramo de suelo, reportados por Rosenberg (2006), para suelos, subsuelos y aguas costeras no contaminados, utilizando diferentes técnicas de enumeración, mientras que para suelos con

contaminación crónica se elevan hasta 4 órdenes de magnitud de 0,7 x 108 a 28,2 x 10

8 UFC/g,

como reporta AlGhazawi et al. (2005). Aunque se reconocen las limitaciones de los métodos de enumeración dependientes de cultivo siguen siendo técnicas muy útiles para comparar muestras procedentes de distintos tipo de suelo y sujetos a distintos niveles de HC. La elección de un método dependiente de cultivo para evaluar los cambios en el gremio de degradadores está respaldada por la idea que las poblaciones activas son mejores indicadores de los cambios de manejo a corto plazo que la población bacteriana total (cultivables, no cultivables, activas y latentes)(Girvan et al., 2003). De forma similar Ellis et al. (2003), encontró que el número de bacterias cultivables se correlacionó negativamente con la concentración de metales pesados, y Brandt et al. (2006) reconocen en Pseudomonas spp., un bioindicador altamente sensible a contaminación por cobre, siendo el conteo en placa el método más apropiado para determinar el efecto de metales que los métodos independiente de cultivo. Incluso, Macur et al. (2007) reportan que el aislamiento de cepas degradadoras del herbicida 2,4-D, fue más sensible que la técnica molecular DGGE, para detectar cambios en la estructura de comunidades

57

Tabla 3. Número más probable (NMP) del recuento de bacterias degradadoras de HC y logaritmo

de NMP de los suelos de las fincas seleccionadas para el estudio.

EM A Ventana Cobertura Finca NMP B/gps C

Log10

NMP/gps C

Log10 NMP/gps ± DE D

1

La Vieja

Bosque

Ilusión 7370.71581 3.87

4.0 ± 0.115 Lusitania 16636.347 4.03

Veraguas 16293.6373 4.09

Pastizal

La Ramada 18143.9746 4.11

4.50 ± 0.625 Villa Ximena 318960.596 5.22

Tesalia Baja 24248.9353 4.18

Cafetal

El Descanso 2815.32549 3.44

3.87 ± 0.443 Platanera 28920.6829 4.33

La Aldea 6997.12376 3.84

Otún

Bosque

Manzano 3650.74562 3.52

3.17 ± 0.4026 Bejucos 2030.05209 3.27

La Selva 536.142612 2.73

Cebollar

BellaVista 8639.37204 3.91

3.95 ± 0.256 Macarena 8235.93576 3.72

Manzano 19950.6997 4.23


La Selva 2817.64992 2.95

3.34 ± 0.3430 PlayaRica 4915.84084 3.60

Lisbrán 4039.5571 3.48

2

La Vieja

Bosque

Ilusión 2455.12697 3.38

3.97 ± 0.603 Lusitania 262547.109 4.58

Veraguas 8710.12457 3.94

Pastizal

La Ramada 48778.9858 4.63

4.03 ± 0.54 VillaXimena 3967.75982 3.59

Tesalia Baja 7363.47836 3.85

Cafetal

El Descanso 5697.50048 3.74

3.8 ± 0.312 Platanera 3381.05321 3.52

La Aldea 20612.5904 4.14

Otún

Bosque

Manzano 29800.4078 4.23

3.98 ± 1.001 Bejucos 1213.06902 2.89

La Selva 1130389.28 4.85

Cebollar

BellaVista 837867.088 4.72

4.21 ±0.448 Macarena 8011.2042 3.88

Manzano 18579.8349 4.03


La SelvaPF 3180.90706 3.26

3.83 ±0.546 Playa Rica 28346.8965 4.35

Lisbrán 9824.21819 3.87

A : Evento de muestreo: 1: 14 a 21 de abril de 2007 y 2: 24 Agosto a 1 Septiembre de 2007.

B : NMP: número más probable de bacterias degradadoras de HC

C : Se presenta el promedio de tres datos.

D : Se presenta el promedio y la desviación estándar típica de nueve datos.

gps : gramos de peso seco.

Fuente: los autores

58

Adicionalmente, este tipo de enfoque permite obtener cultivos que pueden ser potencialmente usados en procesos de bioaumentación, en lugares donde los microorganismos degradadores de HC nativos están ausentes o no son suficientes para realizar la mineralización completa del contaminante. 9.2.1 Cuenca del rio La Vieja. Como se observa en el Gráfico 8 no se observaron diferencias significativas en las densidades entre los tres usos del suelo en ningún evento de muestreo (EM1 ANOVA, p=0,056; ANOVA, EM2 p=0,694), aunque se observa la tendencia a presentarse mayores valores de NMP en pastizal, seguido por bosque y cafetal (Tabla 3). Tampoco se observaron diferencias entre eventos de muestreo en los recuentos para cada uso del suelo (t Student, EM1 vs EM2, Bosque p=0,937; Pastizal, p=0,135; Cafetal, p=0,737), aunque exista la tendencia a ser menores en el EM2, que corresponde a la época seca. No se presentaron correlaciones con ningún parámetro fisicoquímico o ambiental para los dos eventos de muestreo (Anexo E). Estos resultados contrastan por lo reportado por Roldán et al., (2009), quienes reportan para el año de muestro 2006, que es Bosque en las dos épocas climáticas, el uso que presenta la mayor densidad de bacterias degradadoras de HC.

Gráfico 8. Número más probable de bacterias degradadoras de HC por uso de suelo en la cuenca del rio La Vieja durante el estudio (n=9). Diferente letra minúscula indica diferencia significativa (p ≤ 0,05) entre

los eventos de muestreo en cada uso del suelo. Diferente letra mayúscula indica diferencia significativa (p ≤ 0,05) entre usos del suelo para cada evento de muestreo. 1EM: primer evento de muestreo : 14 a 21 Abril de 2007; EM2: segundo evento de muestreo : 24 Agosto a 1 Septiembre de 2007.

Esta ausencia de diferencia entre usos y eventos de muestreo puede verse enmascarada por la amplia variabilidad que presentan los valores de NMP para cada finca; esto puede deberse en el caso de los bosques, a la alta heterogeneidad intrínseca de cada bosque e incluso de cada cuadrante muestreado, tanto a nivel de las especies vegetales, como a nivel del tipo de textura y porcentaje de agregados que presentan los suelos (datos no mostrados).

0

1

2

3

4

5

6


Log

10

NM

P/g

ps

Uso del suelo

EM1

EM2

a

a a a a

a

A A A A

A

A

▬

▬

▬

▬

▬

▬

Fuente: los autores

59

La alta variabilidad en los datos se reduce en el caso de los cafetales, donde no solo la cantidad, sino el tipo de materia orgánica que entra al suelo, no varía, debido a la uniformidad de las especies vegetales que cubren el suelo; salvo en el caso de la finca El Descanso donde el suelo se encuentra parcialmente cubierto por especies arvenses (i.e., vegetación que invade los cultivos; plantas que crecen donde el agricultor no las quiere, limitando e interfiriendo el crecimiento y la producción. Algunas arvenses pueden ser mantenidas en las calles del cultivo como capa protectora del suelo, pero ausentes en el plato de la planta)(Fedecafé, 2009). La susceptibilidad de distintas poblaciones a trazas de plomo, azufre y biocidas, en el diesel usado para el recuento, puede también contribuir a variabilidades entre distintas muestras de suelo (Bento y Gaulore, 2001).

Se ha reportado que los sistemas ecológicos de bosque incluido su suelo, presentan la diversidad más alta de microorganismos, tanto en especies como funcional, para todos los grupos implicados en el ciclaje de nutrientes, al igual que un mayor recuento de ellos, al ser comparados con cultivos monoespecíficos, debido en gran parte a la mayor cantidad de carbono de biomasa microbiana (Zheng et al., 2004). En el presente estudio sin embargo no fue este el caso, lo cual posiblemente puede estar relacionado con una reducción en las actividades enzimáticas que se correlacionan negativamente con los contenidos de lignina de la hojarasca y con la presencia de arbustos (ambas características mayores en bosque) y positivamente con la de pastizales (Chabreriè et al., 2003).

En el caso de los pastizales, debido al bajo porcentaje de cobertura vegetal, la incidencia más directa de luminosidad solar puede provocar cambios más acentuados de la temperatura del suelo, que pueden influir en las tasas metabólicas, evidenciadas en mayores tasas de reproducción. Presentan así mismo una entrada de materia orgánica, representada en las heces de ganado vacuno y otros organismos de meso y macrofauna edáfica, las cuales poseen un alto contenido de azúcares y biomasa microbiana metabólicamente activa, que puede contribuir a los altos recuentos (Davidson y Grieve, 2006). Adicionalmente, Castro, J. (2007), reportó que en pastizales con predominio de pasto kikuyo, se presenta mayor biomasa de lombrices lo que favorece los procesos de aireación del suelo y aumenta la cantidad de organismos degradadores de material vegetal. Esto sumado al hecho que en suelos de pastura de 25 años, existe una menor tasa de pérdida de suelo y materia orgánica y mayor infiltración de agua (94% vs 56%), comparado con suelos de cultivo monoespecífico (Volverás et al., 2007), puede contribuir a elevar los recuentos de heterótrofos. Aunque el número de especies vegetales sea limitado en un pastizal [predominio de pasto kikuyo (Pennisetum clasdestinum), se ha reportado el uso de sistemas de praderas de gramíneas para estimular la biodegradación de compuestos recalcitrantes como los PAH (hidrocarburos policíclicos aromáticos)(April y Sims, 1990); el sistema radicular de algunas gramíneas constituye una alternativa a la adición y distribución de materia orgánica en el suelo, gracias a la gran cantidad de exudados que secretan; esta materia orgánica lipofílica actúa como un adsorbente e inmoviliza los PAH, favoreciendo la biodisponibilidad de estos sustratos.

Las densidades en cafetal similares a las encontrados en bosque, pueden estar favorecidas porque los cafetales sin sombrío presentan entradas adicionales de nutrientes provenientes de fertilizantes, con un alto contenido de nitratos y amonio, altamente solubles, que favorecen la

60

proliferación de organismos de estrategia r (Atlas y Bartha, 2002), y de los pesticidas, que presentan sustratos estructuralmente similares a y quimicamente derivados de hidrocarburos. Sin embargo, estos niveles elevados de nutrientes caen rápidamente cuando los cafetales son transformados en pastizales permanentes (Felske et al., 2000). Los cafetales dada su tipo de siembra en laderas y falta de protección del suelo, experimentan en mayor medida el arrastre de nutrientes por lluvia, experimentando declinación en poblaciones tanto de heterótrofos como de degradadores, por perdidas en materia orgánica, producto también de prácticas culturales como la remoción de residuos vegetales (Govaerts et al, 2000), lo que puede explicar porque, a pesar de estas entradas, sus niveles no superan a los de pastizales no fertilizados.

Adicionalmente, Cardona y Sadeghian (2005) han identificado que las entradas de materia orgánica, nutrientes y actividad microbiana medida como liberación de CO2 en cafetales expuestos al sol, son menores que en cafetal de sombrío con Inga spp. Paz et al.(2006), concuerdan con este hallazgo y adicionalmente identifican una menor capacidad de retención de humedad y menor disponibilidad de N, P, K, Ca+2 y Mn+2. 9.2.2 Cuenca del rio Otún. Como se observa en la Gráfico 9 y la Tabla 3, solo se observaron diferencias significativas en las densidades en el EM1, donde los usos de suelo de bosque y plantación forestal presentan diferencia con Cebollar que presenta una densidad mayor.

Gráfico 9. Número más probable de bacterias degradadoras de HC por uso de suelo en la cuenca del rio Otún durante el estudio (n=9). Diferente letra minúscula indica diferencia significativa (p ≤ 0,05) entre los

eventos de muestreo en cada uso del suelo. Diferente letra mayúscula indica diferencia significativa (p ≤ 0,05) entre usos del suelo para cada evento de muestreo. 1EM: primer evento de muestreo: 14 a 21 Abril de 2007; EM2: segundo evento de muestreo : 24 Agosto a 1 Septiembre de 2007.

Estas diferencias desaparecen para el EM2 en el cual los recuentos tienden a ser mayores; sin embargo no se observaron diferencias entre eventos de muestreo para ningun uso del suelo. Esta ausencia de diferencia significativa entre eventos de muestreo puede verse enmascarada por la

0

1

2

3

4

5

6

Bosque Cebollar Forestal

Log

10

NM

P/g

ps

Uso del suelo

EM1

EM2

Fuente: los autores

a a

a a a

a

A A

A A A

B

▬

▬

▬

▬

▬

▬

61

amplia desviación que presentan los valores en el EM2. El aumento en NMP para el EM2 podría estar relacionado con cambios en las actividades enzimáticas y biomasa, las cuales como lo reporta Chabrerie et al. (2003), se correlacionan positivamente con la humedad del suelo, carbono soluble y contenido de polisacáridos, lo que se corresponde con al aumento en humedad y materia orgánica en el EM2 (Gráfico 7). Phllips et al., (2000) tampoco observaron diferencias en el recuento de BOA entre usos por NMP pero si por PCR competitiva, siendo mayor en suelos fertilizados. Estos resultados contrastan por lo reportado por Roldán et al., (2009), quienes reportan para la misma zona de muestreo en el año 2006, que es Bosque en época lluviosa, el uso que presenta la mayor densidad de bacterias degradadoras de HC. Se observan tambien altas desviaciones en las densidades, en bosque para el EM2, lo que podría verse explicado si se tiene en cuenta que también aumenta la temperatura del suelo lo que podría favorecer el incremento de sustratos disponibles tanto en cantidad como en número, incrementando a su vez la heterogeneidad local de los suelos, conduciendo a mayor variabilidad en las densidades. La ausencia de diferencia entre bosque y forestal pude verse apoyado por el hecho que en las plantaciones forestales, aunque prevalezca una especie como el pino patula, esto no sucede en el sotobosque donde predominan varias especies de pteridofitas y angiospermas; esto puede suceder igualmente en áreas de bosque secundario donde existen zonas en las cuales prevalecen árboles de una especie, pero a nivel de sotobosque son varias las especies arbustivas y herbáceas presentes. Igualmente los altos contenidos de HC (resinas) presentes en las aciculas de pino y otras coniferas, podría suplir la reducción en calidad y cantidad con respecto a los sustratos disponibles en el bosque. La mayor densidad de bacterias degradadoras de HC en cebollares puede verse influenciado por compuestos utilizados para el control de malezas e insectos plaga. Ratcliff et al., (2006), observaron que la aplicación de herbicidas, incluso en dosis altas, puede provocar un aumento en el número de bacterias totales y bacterias cultivables, indicando enriquecimiento de bacterias generalistas; Haney et al. (2002), identificaron un fenómeno similar en el caso de RoundUp Ultra (N-[fosfonometil] glicina), el cual estimuló la actividad y biomasa microbiana y se relacionó con la mineralizacion de carbono y nitrógeno. Esto podria no tener efecto sin el nitrogeno suficiente que garantice una relación C:N apropiada para la degradación de los HC; este nitrogeno es proporcionado por los fertilizantes inorganicos amoniacales adicionados periódicamente. En algunos cebollares como El Manzano, se promueve la no remoción de malezas y retención de residuos en el suelo lo cual favorece conteos más altos de bacterias como lo reporta Govaerts et al. (2008) para bacterias totales, Pseudomonas fluorescens y Actinomycetes en cultivos de trigo con y sin arado. Esto a su vez se ve favorecido por la ausencia de prácticas de arado con maquinaria que ayudan a incrementar la respiración, biomasa y actividad tanto en siembra como en cosecha como lo reporta Merriles et al., (2008). La ausencia de arado en los cebollares muestreados, como observa Zhou et al. (2002), se traduce en una mayor agregación, posibilitando aislamiento espacial, que puede ayudar a limitar competición y obtener mayores recuentos y mayor número de aislados.

62

La fertilización con compuestos inorgánicos en cebollares, puede aumentar el número de bacterias totales y cultivables como lo mencionan Girvan et al. (2004), al usar dosis a niveles de BPA (buenas prácticas de manejo) e igualmente incrementar la actividad de grupos microbianos específicos, dependiendo del tipo de fuente y época de aplicación; Castro et al. (2007) reporta que dosis altas

de KNO3, aumentaron la actividad de bacterias y Actinomicetes en la siembra. Este aumento en el número de bacterias cultivables puede también observarse, tras la aplicación de combinaciones de pesticidas, como observan Nicholson y Hirsch (1998).

Para el EM1 en la cuenca del rio Otún, el NMP se correlacionó negativamente con el porcentaje de humedad (rpearson= -0,394, p<0,05)), y el % de cobertura vegetal (rpearson= -0,576, p<0,01) y positivamente con la temperatura del suelo (rpearson = 0,518, p<0,01)(Anexo E). A medida que aumenta la humedad tienden a prevalecer las condiciones anoxigénicas, disminuyendo las poblaciones aerobias, y favoreciendo a poblaciones anaerobias, las cuales no fueron tenidas en cuenta; una mayor temperatura del suelo podría influir en el aumento de las tasas para algunas vias metabólicas, reflejado en mayores tasas de reproducción, y como se observa, los conteos se correlacionaron negativamente con la cobertura vegetal (rpearson =-0,746, p<0,01), posiblemente debido a que el aumento de cobertura disminuye la cantidad de radiacion que llega al suelo, disminuyendo las temperaturas del suelo y las tasas metabólicas. Globalmente, a pesar de no observar una diferencia estadística, los usos de suelo diferentes a bosque, ejercen cambios en la densidad de bacterias degradadoras de HC. Mejoras en las técnicas de muestreo, harían posible corroborar estadísticamente que un aumento en el número de bacterias degradadoras pueda ser indicativo del uso intensivo del suelo. Sería recomendable incrementar el número de muestreo al año, a un mínimo de cuatro que incluyan las dos épocas secas y lluviosas. 9.3 ANALISIS DE DIVERSIDAD DE GREMIOS DEGRADADORES DE HC.

9.3.1 Cuenca del rio La Vieja. En el Gráfico 10 se presentan los indices de diversidad para los usos de suelo en la cuenca del rio La Vieja. Se observó que para el EM1, es pastizal el que presenta una diversidad significativamente mayor que bosque (Bootstrap, p<0,01) y cafetal (Bootstrap, p<0,01). Para el EM2 la diferencia en la diversidad entre pastizal y bosque no es significativa (Bootstrap, p=0,08), aunque para pastizal sea mayor; es cafetal quien posee una diversidad significativamente menor que bosque (Bootstrap, p<0,001) y que pastizal (Bootstrap, p<0,001). Incluso utilizando técnicas moleculares independientes de cultivo, Wu et al. (2008) no identificó diferencias entre cultivos de tomate con manejo orgánico y el uso pastizal, luego de cinco años de manejo.

Entre eventos de muestreo, la época seca marcó una disminución significativa en la diversidad tanto para bosque (Bootstrap, p <0,001) como para pastizal (Bootstrap, p <0,001); no fué así el caso para cafetal donde la época climática no influyó significativamente (Bootstrap, p=0,449). Esta ausencia de efecto de la epóca de muestreo en los indices de diversidad, fue observada tambien por Bruns et al.(1999), para diversidad de bacterias oxidadoras de amonio, y por Merer et al. (2008) para la comunidad bacteriana de un suelo agrícola.

63

Gráfico 10. Índices de diversidad de Shannon según usos del suelo en la cuenca del rio La Vieja (n=48). Diferente letra minúscula indica diferencia significativa (p ≤ 0,05) entre los eventos de muestreo en cada uso

del suelo. Diferente letra mayúscula indica diferencia significativa (p ≤ 0,05) entre usos del suelo para cada evento de muestreo. EM1: primer evento de muestreo: 14 a 21 Abril de 2007; EM2: segundo evento de muestreo: 24 Agosto a 1 Septiembre de 2007.

Se evidencia en la Tabla 4, que el uso de suelo pastizal, presenta en el EM1 la riqueza más alta, con menor dominancia, mayor equitabilidad y una distribución de palo quebrado. Es cafetal claramente el que presenta una menor diversidad, con menor riqueza, mayor grado de dominancia y una menor equitabilidad. Bosque presenta una situación intermedia, con el anexo de tener una distribución de abundancia de tipo geométrico, en la cual solo uno o algunos taxa dominan. En el EM2 pastizal sigue teniendo una mayor diversidad, con una riqueza mayor, una menor dominancia, y una equitabilidad ligeramente menor que bosque, sin embargo las distribuciones de abundancia se equiparan, haciendo que no exista una diferencia significativa en diversidad entre estos dos usos. Es cafetal claramente el que presenta menor diversidad dado que presenta menor riqueza, mayor dominancia y menor equitabilidad. Tabla 4. Índices de diversidad, dominancia y equitabilidad según usos del suelo en cada evento de

muestreo en la cuenca del rio La Vieja.

EM 1 EM 2

Bosque Pastizal CafetalSSA Bosque Pastizal CafetalSSA

Riqueza 17 22 9 13 15 10

Shannon 2,971 3,262 2,269 2,671 2,831 2,358

Dominancia 0,06963 0,05726 0,1345 0,08953 0,07808 0,112

Equitabilidad 1,049 1,055 1,032 1,041 1,045 1,024

Modelo de abundancia Geométrico Palo quebrado Palo quebrado Geométrico Geométrico Geométrico

Fuente: los autores. A : Cafetal sin sombrío. EM1: primer evento de muestreo: 14 a 21 Abril de 2007; EM2: segundo evento de muestreo : 24 Agosto a 1 Septiembre de 2007.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5


Ind

ice

de

div

ers

idad

de

Sh

ann

on

Uso del suelo

EM1

EM2

B

C

A

a

─

B

A

A

a

a

b

b a

─

─

─

─

─

Fuente: los autores

64

El descenso en los valores para el EM2, coincide con un incremento en el % de humedad del suelo para este evento, lo cual podría favorecer la formación de ambientes anoxigénicos; siendo la cantidad de oxígeno un limitante en las reacciones de hidrólisis; se denota un descenso en la diversidad tanto en pastizal como en bosque, prevaleciendo solo algunas especies que dominan el gremio. Esto afecta mucho menos a cafetal dado que sus suelos son más porosos, poseen menor grado de agregación, facilitando la infiltración lo que favorece que se mantengan áreas oxigénicas (Volverás, 2007).

Una mayor homogeneidad en los factores fisicoquímicos y ambientales en bosque puede resultar en pocas oportunidades para la diversificación de nichos, a pesar de la existencia de un alto número de sustratos, lo que puede conducir a competencia por los nichos existentes, redundancia en las funciones y reducción de la diversidad de especies.

Aunque aparentemente sorpresivo el resultado de una mayor diversidad en pastizales, puede verse explicada si tenemos en cuenta varios factores; en primer lugar, los pastizales presentan una mayor densidad radicular, mayor capacidad de humificación y ofrecen una cobertura de protección del suelo más uniforme que la presente en suelos no sembrados e incluso que suelos de bosque (Bjorn y McClaugherty, 2008), reduciendo la pérdida de humedad, aumentando el área de influencia del rizoplano y la rizósfera en las comunidades microbianas, lo que conlleva a una alta estabilidad a cambios ejercidos por la fauna edáfica (Davidson y Grieve, 2006). Esta alta homogeneidad de los pastizales fue evidenciada en la ausencia de diferencias en cuanto a índices de diversidad y coeficientes de similaridad entre pastizales mejorados y no mejorados por McCaig et al. (2001). En pastizal encontramos no solo especies gramíneas como el pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum Hoechst Ex Chiov), y pasto estrella africana (Cynodon plectostachyus) sino también otras especies rastreras leguminosas como la pega pega (Desmodium cajanifolius), además de árboles de forrajeo como la Leucaena o acacia forrajera (Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit) y el matarratón (Gliricidia sepium), que favorecen la incorporación de formas biodisponibles de nitrógeno; esto sumado a las deposiciones y deyecciones del ganado que incorporan gran cantidad de compuestos nitrogenados y material en proceso de descomposición, permiten la incorporación de diferentes sustratos, así como de poblaciones microbianas activas, procedentes de las cámaras estomacales e intestinos. Esta mayor diversidad también puede explicarse desde el punto de vista del consumo diferencial de sustratos por las comunidades microbianas, el cual puede estar condicionado por las actividades animales, como reporta Kohler et al. (2005) para la disminución del consumo de ácidos carboxílicos por forrajeo, de polímeros por pisoteo, y de carbohidratos en la interacción de forrajeo, pisoteo y fertilización por estiércol. Factores como el alto contenido de carbono y la heterogeneidad del tipo de compuestos, reducen la competencia, generando no solo mayores conteos y mayor riqueza, sino también una mayor resiliencia a sequía, favorecen la alta equitabilidad observada en el uso pastizal (van Diepeningen, et al., 2006), sin importar el contenido de agua o la profundidad como lo reporta Zhou et al. (2002). Esta equitabilidad puede ser observada funcionalmente; Degens et al. (2000), reporta una equitabilidad catabólica mayor en suelos de pastizales y vegetación indígena y menor en cultivos

65

de maíz y cereales, resaltando la idea que el mantenimiento de carbono orgánico puede ser importante para preservar la diversidad microbiana. Los cafetales presentan solo un tipo de entrada de materia orgánica, constituidas por frutos maduros, sobremaduros caidos y hojas deciduas del cafetal, los cuales son altos en azúcares, hace que la cantidad de sustratos disponibles para ser utilizados sean pocos, favoreciendo solo a unas especies, lo que aumenta la competencia, y conduce a la dominancia de pocos grupos de organismos. En cafetal, el ligero aumento en la diversidad puede verse favorecido por un aumento en la relación C:N, fruto de la incorporación de fertilizantes y pesticidas, permitiendo que se reduzcan las condiciones limitantes para la degradación de hidrocarburos y favoreciendo la incorporación de carbono en biomasa microbiana (Lejón et al., 2007). Los pesticidas, en el caso de cafetales, constituyen un sustrato adicional y antes no disponible para poblaciones que no pueden aprovechar sustratos provenientes de las entradas normales de frutos y hojas, como lo reportan Haney et al.(2002), para el caso de Round Up, y promover una ventaja temporal selectiva para organismos capaces de utilizar herbicidas como el glifosato o el 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético)(Macur et al., 2007). Estos cambios en la estructura del gremio pueden verse reducidos con el tiempo, restableciendo la equitabilidad luego de algunos dias o semanas como lo reporta Zhenmei et al. (2006.)

9.3.2 Cuenca del rio Otún. En el Gráfico 11 se presentan los índices de diversidad para los usos de suelo en la cuenca del rio Otún. Observamos que para el EM1, bosque y cebollar no presentaron diferencias significativas (Bootstrap, p=0,702); forestal presentó una diversidad significativamente menor que bosque (Bootstrap, p=0,001) y que cebollar (Bootstrap, p=0,001). Estas diferencias desaparecen en el EM2 para los tres usos del suelo [bosque vs cebollar (Bootstrap, p=0,06), bosque vs forestal (Bootstrap, p=0,879) y cebollar vs forestal (Bootstrap, p=0,089)].

Entre eventos de muestreo, la época seca (EM2) marcó una disminución significativa en la diversidad para bosque (Bootstrap, p=0,019) y un aumento para forestal (Bootstrap, p=0,007); no fue así el caso para cebollar donde la epoca climática no influyó significativamente (Botstrap, p=0,74).

66

Gráfico 11. Índices de diversidad de Shannon según usos del suelo en la cuenca del rio Otún (n=37). Diferente letra minúscula indica diferencia significativa (p ≤ 0,05) entre los eventos de muestreo en cada uso

del suelo. Diferente letra mayúscula indica diferencia significativa (p ≤ 0,05) entre usos del suelo para cada evento de muestreo. EM1: primer evento de muestreo: 14 a 21 Abril de 2007; EM2: segundo evento de muestreo: 24 Agosto a 1 Septiembre de 2007.

Esto se evidencia en la Tabla 5, en la cual los usos bosque y cebollar presentan en el EM1 riqueza, dominancia y modelo de abundancia similares; sin embargo en bosque la diversidad es más alta dado que es ligeramente más equitativo que cebollar. Es forestal claramente el que presenta una menor diversidad, con una menor riqueza, mayor grado de dominancia y una menor equitabilidad. Bosque presenta una situación intermedia, con el anexo de tener una distribución de abundancia de tipo geométrico, en la cual solo uno o algunos taxa dominan. Para el EM2 aunque es cebollar quien presenta mayor riqueza y menor dominancia, su equitabilidad es menor, razón por la cual su diversidad no fue significativamente diferente a los otros usos. Tabla 5. Índices de diversidad, dominancia y equitabilidad según usos del suelo en cada evento de muestreo en la cuenca del rio Otún.

EM1: primer evento de muestreo: 14 a 21 Abril de 2007; EM2: segundo evento de muestreo: 24 Agosto a 1 Septiembre de 2007.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Bosque Cebollal Forestal

Ind

ice

div

ersi

dad

Sh

ann

on

Uso del suelo

EM1

EM2

EM 1 EM 2

Bosque Cebollar Forestal Bosque Cebollar Forestal

Riqueza 12 12 8 10 12 10

Shannon 2,631 2,593 2,107 2,394 2,564 2,408

Dominancia 0,1096 0,09982 0,1441 0,1191 0,09421 0,1214

Equitabilidad 1,059 1,044 1,013 1,04 1,032 1,046

Modelo de abundancia Geométrico Geométrico Geométrico Geométrico Geométrico Geométrico

A A

A

A

B

A a

b

a

a

b a

─

─

─

─

─

─

Fuente: los autores

Fuente: los autores

67

Se debe destacar la ausencia de diferencias para bosque y cebollar en el EM1; teniendo en cuenta que los cebollares muestreados utilizan prácticas de fertilización orgánica como la no remoción de malezas, incorporación de abonos verdes y uso de compost y estiércol (Anexo F), Sun et al.(2004), reconocen que este tipo de fertilización establece comunidades más similares a las de un suelo no intervenido y diferente a la de un suelo tratado con fertilizantes, con un mayor número de ribotipos y equitabilidad en suelos abonados con estiércol, práctica realizada en los cebollares El Manzano, Bella Vista y Macarena abonados con estiércol de ave y compost (Anexo F). La combinación de fertilización orgánica e inorgánica, aplicación de herbicidas y pesticidas en cebollares, sumada a una agregación similar a la de un suelo no intervenido, proporcionan una variedad de microambientes y sustratos que amplían la oferta de nichos, reduciendo la competencia y las interacciones negativas; esto se manifiesta en una diversidad inesperadamente alta y comparable a la de un suelo de bosque, al menos para el grupo funcional en estudio.

Bosque que en el EM1 presentó la mayor diversidad, tuvo la mayor disminución para el EM2; el aumento del % de materia orgánica, y la temperatura del suelo son factores que favorecen el aumento en las tasas de respiración, sin embargo un aumento del pH podría indicar una disminución de poblaciones aerobias, tal como se evidenció por la disminución en recuentos para bosque (Gráfico 8); esto está respaldado, por los suelos altamente agregados, que no facilitan una buena penetración de gases ni el movimiento del agua, generando bolsillos de anaerobiosis. Dado que en nuestro estudio nos centramos en poblaciones de bacterias aeróbicas, esto puede estar reflejado en una disminución de la diversidad.

No se observaron cambios notables en cebollar donde la utilización de pesticidas y herbicidas es habitual, en forma similar a lo observado por Nicholson y Hirsch (1998), para poblaciones cultivables en suelos que han o no han recibido una combinación de pesticidas por 20 años (aldicarb, clorfenvinfos, benomyl, glifosob, clorotoluron, triadimefon); aunque las comunidades de esos suelos no eran iguales, no hubo diferencias obvias en diversidad. Como mencionamos anteriormente, el uso cebollar experimenta entradas de nutrientes y energía muy constantes en cantidad, calidad y predecibles en el tiempo, haciendo de este sistema, uno muy estable en términos de nichos con potencial a ser ocupados; se debe tener en cuenta también como ya se anotó, la alta estabilidad entre épocas climáticas en los parámetros fisicoquímicos y ambientales. Además, un manejo con fertilización orgánica del suelo puede manifestarse en una mayor resiliencia ante disturbios (Wu et al., 2008), que incluyen el impacto del uso de pesticidas, y herbicidas. Esto se suma al hecho que algunos herbicidas disminuyen su vida media con cada aplicación, como lo demostró Fang et al. (2009) para butaclor, quien no encontró reducción en el índice Shannon-Wienner, luego de varias aplicaciones.

Otra explicación posible a esta estabilidad, es que los efectos más relevantes del uso de xenobióticos y fertilizantes, hayan ocurrido sobre poblaciones de bacterias no cultivables, como lo sugiere el Fantroussi et al. (1999) para el caso del uso del herbicida fenil-urea.

Los cambios que permiten que la diversidad aumente en forestal, pueden verse relacionados con el aumento en la cantidad de sustratos disponibles en suelo para el EM2 como sugiere Bossio et al. (2005) para el cambio de época climática; esto se relaciona con una disminución de la

68

cobertura vegetal, estabilidad de la profundidad de la hojarasca que, sumado al aumento en la humedad y la temperatura del suelo, permite un aumento en la materia orgánica disponible y un posible aumento de las tasas metabólicas, evidenciado por una disminución en el pH. Aunque ignoramos cual es el factor desencadenante de este proceso, es muy posible que la humedad y la temperatura del suelo, muy cercanas a las que se detectan en cebollar, sean determinantes.

9.4 ANÁLISIS DE SIMILITUD DE GREMIOS DE BACTERIAS DEGRADADORAS DE HC.

Teniendo en cuenta las matrices de ausencia/presencia de especies según uso de suelo se realizaron dendrogramas de agrupación mediante el indice de similitud de Raup-Crick (Raup y Crick, 1979).

9.4.1 Cuenca del rio la Vieja. En el Gráfico 12 se pueden apreciar dos grupos con un 25% de similitud, constituidos por Bosque en el EM2 y el otro por los demás usos. Dentro del grupo inferior que presenta una similitud de 30%, se observa un grupo con un 49% de similitud compuesto por los usos de suelo con intervención humana. Se observa una alta estabilidad en la composición para el uso cafetal en los dos eventos de muestreo (Mantel, Raup-Crick, r=0,529, p(uncorr)=0,337). Esto no se observó en los usos de suelo bosque y pastizal cuyos eventos de muestreo se localizaron en grupos diferentes.

Al tener en cuenta los gremios por evento de muestreo, no se observaron diferencias significativas en la composición entre los usos de suelo en el EM1 (ANOSIM, Raup-Crick; p=0,322) y tampoco en el EM2 (ANOSIM, Raup-Crick; p=0,206). No se evidenció diferencia en la composición de los gremios por uso, entre eventos de muestreo (Mantel test, Raup-Crick; p(uncorr)= 0,928). Aunque autores como Kubartová et al. (2007) reconocen que las condiciones ambientales y el efecto estacional son determinantes en la dinámica poblacional.

Gráfico 12. Dendrograma de asociación de usos del suelo en la cuenca del rio La Vieja mediante índice de asociación de Raup-Crick (n=6). rRaup-Crick: 0,7689. EM1: primer evento de muestreo: 14 a 21 Abril de

2007; EM2: segundo evento de muestreo: 24 Agosto a 1 Septiembre de 2007.

Fuente: los autores

Similitud

69

-3 3

-23

11,9%

10

,6%

-3 3

-23

11,9%

10

,6%

Aunque existieron diferencias en la composición de los gremios entre los usos de suelo, éstas no fueron significativas; esta ausencia de diferencias se confirma al realizar el análisis de correspondencia como se evidencia en el Grafico 13, donde se observa la distribución de los sitios de muestreo en el plano de dimensiones.

Gráfico 13. Análisis correspondencia. Proyección en el plano de dimensiones de las fincas muestreadas en la cuenca del rio la Vieja (n=48). a. Agrupación según eventos de muestreo (época climática).

b. Agrupación según uso del suelo.

Aunque los usos con intervención humana o animal por explotación intensiva de recursos impliquen un impacto mucho mayor que el recibido por bosque secundario, puede ser que el tiempo que llevan de establecimiento usos como cafetal y pastizal, sea el suficiente para que los cambios ejercidos por disturbios al inicio del uso y durante el periodo de utilización, sean recibidos y soportados por las comunidades presentes y especificamente por el gremio de bacterias degradadoras de HC, como reporta Nourou et al.(2006), para comunidades en contacto o no, con hojarasca, las cuales luego de ocho horas adquirieron funciones celulolíticas similares.

Como ya se mencionó, no existieron diferencias significativas en estructura y textura del suelo entre usos; esta similitud tiende a favorecer la permanencia de estructuras similares de tipos bacterias dominantes. Esta similitud de los gremios puede presentarse incluso en suelos con estructuras diferentes, como es el caso de Gelsomino et al. (1999), quienes encontraron similitud en perfiles electroforéticos, a partir de diferentes tamaños de agregados, con respecto a bandas principales, siendo estos perfiles estables por un año de muestreo. No es extraño tampoco que existan similitudes entre tipos de usos diferentes, como reconocen Salles et al. (2006), entre pastizal permanente y maizal y Wu et al. (2008), entre pastizal y suelo no intervenido, luego de tres años de establecimiento. En el mismo sentido, sistemas con entradas de carbono constantes en cantidad y calidad, como cafetal, tienden a mantener poblaciones microbianas constantes en el tiempo; esto sumado al hecho que entre los eventos de muestreo no existió ningún tipo de cambio en la composición vegetal, contribuyen a la alta similitud en la composición de los gremios. Por otro lado, los cambios observados en pastizal entre eventos de muestreo, pueden coincidir con el efecto de la orina

b a

Bosque Pastizal

Cafetal

EM1 EM2

Fuente: los autores

EM1 EM2

Bosque Pastizal

Cafetal

70

sobre el gremio como lo reporta Rooney et al. (2006), luego de 10 días de exposición en pastizales no mejorados. Que se presenten diferencias en la composición no es extraño en suelos con diversidad igual o muy similar (Jiménez, 2004). Aunque Gelsomino et al., (1999) aporta evidencia para afirmar que tipos de suelo similar tienden a contener tipos dominantes comunes de bacterias, Bundy et al. (2002), afirman que suelos similares sometidos a impactos similares no necesariamente tienden que converger en la composición bacteriana; pueden volverse más disimilares ya que diferentes suelos tienen potencial microbiano inherente diferente.

Estos impactos que no solo derivan del uso indiscriminado de fertilizantes y pesticidas, sino de los cambios ambientales producto de la época climática del muestreo, producen alteraciones en la composición, percibidos como la detección o no de especies, en momentos y sitios especificos; sin embargo en conjunto el gremio parece mantener una estructura principal, generalmente compuesta por especies dominantes, a la que se asocian especies menos abundantes, mantenidas ya fuere por sinergismo o cometabolismo (Leahy y Colwell, 1990). 9.4.2 Cuenca del rio Otún. En el Gráfico 14 se pueden apreciar dos grupos con una similitud de 10%; un grupo superior con una similitud global de 35% y un segundo grupo compuesto por el EM1 de cebollar. En el grupo superior se observa una similitud del 92% de los EM1 de bosque y plantación forestal y una similitud de 45% entre los EM2 de los tres usos, teniendo bosque y cebollar una composición con mayor similitud que con forestal.

Gráfico 14. Dendrograma de asociación de usos del suelo en la cuenca del rio Otún mediante

índice de asociación de Raup-Crick. rRaup-Crick: 0,9058. EM1: primer evento de muestreo: 14 a 21 Abril de 2007;


Al tener en cuenta los gremios por eventos de muestreo, no se observaron diferencias significativas en su composición entre los usos de suelo para el EM1 (ANOSIM, Raup-Crick; p=0,18) y tampoco en el EM2 (ANOSIM, Raup-Crick; p=0,916). No se evidenció diferencia en la

Fuente: los autores

Similitud

71

-1.5 2.5

-1.5

2.0

13,6%

11,9

%

composición de los gremios entre los eventos de muestreo (Mantel test, Raup-Crick; p(uncorr)= 0,448). Aunque no existan diferencias en las composiciones entre los eventos de muestreo, se observa la tendencia a una agrupación de los usos por eventos de muestreo, mostrando que la época climática tiene cierto efecto en el cambio de los gremios. Esto se confirma al realizar el análisis de correspondencia que se muestra en el Gráfico 15.

Al tener en cuenta los usos del suelo, como se observa en el Gráfico 15b, salvo el caso de La Selva en el uso Bosque, los demás bosques presentan una alta similitud en la composición de sus gremios; ocurre lo mismo en el uso del suelo Forestal, exceptuando el caso de Lisbrán; en general se observa como el uso forestal está más relacionado al uso bosque que al uso cebollar; entre los gremios de cebollares se presentó una baja relación. Se observa una mayor homogeneidad entre gremios de bosques y plantaciones forestales que entre los cebollares lo que se corresponde con la mayor diversidad de especies degradadoras de HC encontrada en cebollares.

Gráfico 15. Análisis correspondencia. Proyección en el plano de dimensiones de las fincas muestreadas en la cuenca del rio Otún (n=37). a. Agrupación según eventos de muestreo (época climática). b.

Agrupación según uso del suelo.

El hecho que bosque y cebollar en el EM2, sean más similares entre sí, puede verse explicado si se tiene en cuenta que, los pesticidas utilizados en cebollar podrían constituir sustratos sustitutos, análogos a la variedad de sustratos que ofrece la hojarasca en descomposición de bosque. Forestal se aparta un poco de este grupo dado que como se mencionaba anteriormente, su diversidad aumentó para este evento; algunas de estas especies pueden depender de sustratos solo encontrados en las acículas de pino y por ende solo presentes en plantación forestal. A favor de esta situación Tolli y King (2005), mencionan que suelos con usos y coberturas diferentes pueden presentar similitudes, como lo reportan para bosque de pino y cultivos de maní. A pesar de existir similitudes altas en la composición de las comunidades o gremios, esto no asegura que sean totalmente iguales en su función como lo asegura Phillips et al. (2000) para bacterias oxidadoras de amonio.

-1.5 2.5

-1.5

2.0

13,6%

11,9

%Lisbrán

La Selva

a

a

EM1 EM2

b

Bosque Cebollar

Forestal

Fuente: los autores

72

Como ya lo hemos mencionado en el caso del NMP y la diversidad, no es extraño que el uso bosque y forestal posean una alta similitud de gremios de degradadores de HC, ya que bosques con predominancia de especies vegetales diferentes pueden tener alta similitud en la composición microbiana total como lo reporta Hackl et al. (2004) para bosques de roble y abeto. Por su parte Neufeld y Mohn (2005), no encontraron diferencias en la composición microbiana total entre un bosque de tundra ártica y un bosque boreal y Knief et al. (2005) no encuentraron diferencias en poblaciones de metanótrofos entre un bosque nativo y un área reforestada de 16 años de antigüedad.

9.4.3 Cuencas del rio La vieja y rio Otún. Globalmente, al tener en cuenta los usos de suelo en las dos cuencas por época climática, observamos en el Gráfico 16 que para el EM1, la composición de especies permite clasificar a los bosques en un grupo con 64% de similitud y a los usos cafetal cebollar y pastizal en un grupo con 76% de similitud. Se observa que los bosques de Otún presentan mayor similitud con plantación forestal tambien ubicada en la cuenca del rio Otún.

Gráfico 16. Dendrograma de asociación de usos del suelo en el EM1 mediante índice de asociación de Raup-Crick (n=6). rRaup-Crick: 0,6624. EM1: primer evento de muestreo: 14 a 21 Abril de 2007; EM2: segundo

evento de muestreo: 24 Agosto a 1 Septiembre de 2007.

Se observa como los usos de suelo con intervención constante como cafetal, pastizal y cebollar, no se relacionan con bosque. El hecho que forestal se relacione más con bosque de Otún en el EM1, se puede explicar dado el origen edáfico común de ambos usos, lo que reafirma que el tipo de suelo puede ser un determinante en la estructura de las comunidades.

Similitud

Fuente: los autores

73

Gráfico 17. Dendrograma de asociación de usos del suelo EM2 mediante índice de asociación de Raup-Crick. rRaup-Crick: 0,6522. EM1: primer evento de muestreo: 14 a 21 Abril de 2007; EM2: segundo evento de

muestreo: 24 Agosto a 1 Septiembre de 2007.

En el Gráfico 17 se observa como, para el EM2 se conforman tres subgrupos, formados por los usos bosque de ambas cuencas con una similitud del 87%, cebollar y pastizal con 86% y un tercer grupo formado por cafetal y plantación forestal con 69% de similiutd. Se observa que la similitud de bosques y los usos con intervención humana es de 28%.

Las asociaciones parecen ahora obedecer a similitudes en la composición vegetal de cada uso. Así, se reúnen los bosques, que poseen la mayor diversidad vegetal, pastizal y cebollar donde predomina una sola especie y cafetal y forestal, donde a pesar que existen grandes extensiones de una sola especie vegetal, ésta se ve mezclada con individuos de otras especies. Kubartová et al.(2007), por ejemplo, observó que el cambio de especie vegetal en bosques nativos de haya y roble a plantación de picea puede no evidenciarse en cambio de riqueza pero si en composición de especies.

9.5 RELACION ENTRE VARIABLES FISICOQUIMICAS Y AMBIENTALES Y COMPOSICION DE GREMIOS. Teniendo en cuenta los datos de las variables ambientales y fisicoquímicas, y las matrices de presencia/ausencia de especies según usos de suelo, se utilizó el análisis de correlación canónica, con el fin de determinar la existencia de relación entre estos conjuntos de variables; se desea entonces explicar los resultados de presencia/ausencia de especies mediante cambios en las variables fisicoquímicas y ambientales.

9.5.1 Cuenca del rio la Vieja. No se encontró una relación significativa entre las variables fisicoquímicas y ambientales con la composición de los gremios para los usos de suelo estudiados (Monte Carlo, F= 1,017, p= 0.418). Pese a la ausencia de relación, en la Figura 18a, se observa que con respecto a la época climática, existe una discriminación de la composición de los gremios, en donde el porcentaje de humedad, las temperaturas ambientales y el % de arena tienen un efecto en esta diferenciación. Variables que en el análisis de componentes principales tenían una mayor importancia como los porcentajes de agregados y los componentes de la característica textural, carecen de efecto en esta discriminación temporal.

Fuente: los autores

Similitud

74

-2 3

-23

Humedad

TemAmbMa

TemAmbMi

Hojarasca

CobVeg

Arcilla

Arena

Limo

agreg1.18

agreg600

agreg300

agreg54

agreg.54

-2 3

-23

Humedad

TemAmbMa

TemAmbMi

Hojarasca

CobVeg

Arcilla

Arena

Limo

agreg1.18

agreg600

agreg300

agreg54

agreg.54

Se puede observar que la composición temporal se ve afectada por variables que cambian con los eventos de muestreo como la humedad y la temperatura del suelo, evidenciando un efecto de la época climática; estos cambios temporales no son afectados por variables que son más estables o no cambian con la época climática como la textura y la estructura del suelo.

Al observar en el Gráfico 18b, la distribución de los usos del suelo basada en la composición de los gremios, se observa una discriminación a través de los gradientes de variables como % de

cobertura vegetal, % de arcilla y los % de agregados de 1,18 mm, 600 m y 54 m. Se observa que los bosques y los cafetales se encuentran en los extremos de estos gradientes, pastizal siendo localizado en el intermedio. Los gremios de bosques están más influenciados por una mayor cobertura vegetal, un mayor porcentaje de agregados de 1,18 mm y un mayor % de arcilla; los gremios de cafetales parecen estar más influenciados por una estructura del suelo menos compacta. En el caso de cafetales, son las temperaturas máxima y del suelo mayores, las que influencian la composición gremial; cabe destacar la mayor similitud entre los pastizales y los bosques.

Gráfico 18. Análisis de Correlación canónica. Proyección de las fincas, variables fisicoquímicas y ambientales para la cuenca del rio La Vieja (n=18). a. Agrupación según uso del suelo. b. Agrupación según

eventos de muestreo (época climática).

Aunque la relación entre composición del gremio y variables fisicoquímicas y ambientales no es significativa, en forma similar a otros estudios, la composición de cada uso del suelo se ve discriminada por factores que afectan la textura y estructura del suelo (i.e., % de arcilla, arena y limo, y % de agregados)(Girvan et al., 2003; Bossio et al., 2005; Fierer y Jackson 2006; Mummey et al., 2006). La cobertura vegetal puede ejercer algún efecto indirecto sobre estos gremios, modificando las temperaturas ambientales y de suelo; un análisis que permita discriminar la composición general de los hidrocarburos presentes en hojas y exudados radiculares podría aclarar el efecto cualitativo de cada cobertura vegetal en la composición gremial. De hecho Bossio et al., (2005) reporta que los suelos forestales tienen la mayor diversidad de sustratos comparado con suelos de uso agrícolas, sin embargo esto no garantiza una mayor diversidad en las

b a b

13

,5%

15,6%

EM1 EM2


15,6%

13

,5%

Fuente: los autores

Fuente: los autores

75

poblaciones, como lo aseguran Fierer y Jackson (2006) quienes reportan que los suelos amazónicos son los menos diversos en bacterias.

En un estudio a nivel continental, Fierer y Jackson (2006) encontraron que las diferencias en diversidad entre ecosistemas era explicado por pH del suelo siendo mayor a pH neutrales e independiente de la temperatura del lugar. Esta relación con el pH no pudo ser observada en el presente estudio posiblemente porque los valores promedio de los usos muestreados presentan valores cercanos a la neutralidad; en el presente estudio existió la tendencia que a menor pH, hubo una mayor densidad de bacterias degradadoras de HC; esto podría ser explicado por el hecho que para algunos herbicidas se ha observado un efecto de aumento en su persistencia en suelo a medida que disminuye el pH. (Smith et al., 2006), lo que permitiría un mayor tiempo de contacto entre este sustrato y las bacterias degradadoras de HC; sin embargo, afirmar que las bacterias estén usando estos herbicidas como fuente de carbono y/o energía debe ser aún comprobado. 9.5.2 Cuenca del rio Otún. No se encontró una relación significativa entre las variables ambientales y la composición de los gremios para los usos de suelo estudiados (Monte Carlo, F= 0,983, p= 0.532). En la Figura 19a, se observa que con relación a la época climática no existe una clara discriminación de la composición de los gremios; ninguna variable parece tener efecto discriminante. Variables que en el análisis de componentes principales tenían una mayor importancia como los porcentajes de agregados y los componentes de la característica textural, carecen de efecto en esta discriminación temporal. Al observar en la Figura 19b, la distribución de los usos del suelo basada en la composición de los gremios, aunque se presenta discriminación entre los usos del suelo, esta no es excluyente; algunos bosques son más similares a cebollar que a otros bosques. Se presenta una discriminación al observar los gradientes de la mayoría de las variables; en los extremos de los gradientes de variables como % de humedad, % de cobertura vegetal, % de

agregados de 300 m, % de arcilla, % de arena, y temperatura del suelo, se encuentran los gremios de cebollares y forestales; los gremios de bosque tienden a ser menos influenciados por las variables ambientales.

76

-2.0 3.5

-2.0

2.5

Humedad

TemAmbMaxTemAmbMin

Hojarasc

CobVeg

Arcilla

Arena

Limo

agreg1.18

agreg600

agreg300

agreg54

agreg<54

-2.0 3.5

-2.0

2.5

Humedad

TemAmbMaxTemAmbMin

Hojarasc

CobVeg

Arcilla

Arena

Limo

agreg1.18

agreg600

agreg300

agreg54

agreg<54

Gráfico 19. Análisis de Correlación canónica. Proyección de las fincas, variables fisicoquímicas y ambientales para la cuenca del rio Otún (n=18). a. Agrupación según eventos de muestreo (época climática).

b. Agrupación según uso del suelo.

Los gremios de forestales están influenciados por un mayor % de humedad, mayor % de cobertura

vegetal, mayor % de agregados de 300 m y mayor % de arena; en el caso de cebollares son las temperaturas más altas y estructura de suelo más compacta lo que parece estar influenciando la estructura gremial; en general existe una mayor similitud entre los gremios de bosques y plantaciones forestales.

Al igual que en la cuenca del rio La Vieja, aunque estadísticamente no se observó una relación de la composición gremial de los usos con las variables ambientales y fisicoquímicas, existe la tendencia a una discriminación que depende de los gradientes de algunas variables. En el caso de cebollares la ausencia de cobertura vegetal que permite alcanzar temperaturas más altas y la ausencia de labores de labranza, fertilización y aspersión de pesticidas que generan suelos más compactos, parecen afectar la composición gremial. Es decir que regímenes variables de estas actividades pueden afectar la composición bacteriana, lo que podría explicar las grandes diferencias entre fincas de cebollares; sin embargo, estos cambios no se reflejan en un cambio en la diversidad, debido tal vez a que los nichos dejados por una especie pueden ser ocupados parcial o totalmente por otras especies. En el caso de los bosques y una plantación forestal, debido a la estabilidad del sistema, los cambios ambientales y fisicoquímicos no se reflejan en cambios en la composición.

El grado de intervención parece ser también un factor que puede llegar a determinar las diferencias; tal como reporta Salles et al. (2006), que el arado y la fertilización son las prácticas más efectivas en cambiar la estructura de la comunidad, en ausencia de efecto de otros factores como contenido de carbono, nitratos, amonio y humedad, las cuales rara vez están asociados a cambios en estructura de la comunidad, como sucedió en nuestro caso (Bossio et al., 1998). Es posible que existan efectos de los parámetros fisicoquímicos y ambientales como materia

orgánica, contenido de Ca2+, nitrato y pH sobre poblaciones individuales (Buckley et al., 2006), pero eso está más allá del alcance de este trabajo.

14

,6%

18,1%

Bosque Cebollar Forestal

EM1 EM2

14

,6%

18,1%

Fuente: los autores Fuente: los autores

a b

Fuente: los autores

77

9.6 ANÁLISIS DE RIBOTIPOS POR SEPARACIÓN DIFERENCIAL MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL

DE GRADIENTE DENATURANTE (DGGE).

Mediante el uso de geles de poliacrilamida al 6%, con gradiente denaturante 30%-60% se identificaron los ribotipos correspondientes a las cepas degradadoras de hidrocarburos aisladas de suelos con diferente tipo de uso. En la Figura 4 se observa un corrido electroforético en el cual cada carril correspondiente a un aislado; en este gel se observa como los aislados P6, P7, (P9 y P11), (P13, P14), P15, (P17 y P18) y P20 presentan una sola banda correspondiente al amplificado a partir de un putativo operón ribosomal único. Por tener un frente de corrida equivalente, aislados de los carriles P9 y P11 así como los de los carriles P13 y P14, P17 y P18, se consideran una sola unidad taxonómica operativa (OTU), es decir que su afiliación taxonómica se consideró equivalente. Los aislados de los carriles restantes que presentaron entre dos y tres bandas fueron considerados como OTU únicas y distintas unas de otras.

Figura 4. Foto de un gel de poliacrilamida luego de un proceso de DGGE. Gel poliacrilamida 6%, gradiente formamida-urea (30-60%). Carril M: muestra marcador Carriles P2 a P20: productos PCR de aislados.

En la Figura 5, salvo los carriles P8, P9 y P13, todos los aislados presentan múltiples bandas; únicamente los aislados de los carriles P8 y P13 corresponden a una misma OTU; para este gel los demás aislados fueron considerados como OTU únicas o distintas. A diferencia del gel de la Figura 4, donde la mayoría de aislados solo presenta una banda, se observa como el corrido

a

Fuente: los autores

M P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20

78

electroforético de algunos aislados presenta un número superior a 5 bandas (carriles P7, P11 y P20).

Aunque muchas especies procarióticas poseen un solo operón ribosomal para la subunidad 16S, algunas han adoptado más de un operón comúnmente localizados a nivel cromosómico, como en el caso de E. coli y Vibrio fisheri que poseen siete y ocho operones de rADN respectivamente (Amikam y Kuhn, 1987), o en algunos casos también a nivel extracromosómico (Battermann, 2003). En otros casos se pueden presentar más de un cromosoma como en Burkholderia cenocepacea que presenta tres (Martinko et al., 1997). La heterogeneidad entre copias del gen que codifica para el ARNr 16S en varias especies puede ocasionar la visualización de múltiples bandas en un gel con gradiente denaturante. En estudios de comunidades microbianas esto puede conducir a una sobreestimación del número de organismos en una muestra; como

alternativa Dahllöf et al. (2000) y Case et al. (2007), recomiendan el uso del gen de la subunidad de la RNA polimerasa. Aún así, el análisis de DGGE de ADNr 16S, puede ser una herramienta útil al hacer seguimiento de cepas en ensayos de degradación o para el diseño de cultivos

eficientesDíaz-Ramírez et al., 2008). En nuestro caso, dado que OTUS con perfiles muy diferentes fueron taxonómicamente idénticos indica que la técnica DGGE puede ser útil en la identificación de cepas de una especie.

Figura 5. Foto de un gel de poliacrilamida luego de un proceso de DGGE. Gel poliacrilamida 6%, gradiente formamida-urea (30-60%). Carril M: muestra marcador; carriles P2 a P20: productos PCR de aislados.

M P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20

Fuente: los autores

79

9.7 DETERMINACIÓN DE LA AFILIACIÓN TAXONÓMICA. En el Gráfico 20 se muestra la distribución porcentual de los phyla representados por los aislamientos obtenidos en las cuencas de los ríos La Vieja y Otún. En todos los usos prevalecen especies pertenecientes al phyllum Proteobacteria. No se observaron phyla indicadores o exclusivos a un tipo de uso. En la cuenca del rio La Vieja el phyllum Bacteroidetes está ausente solo en cafetal; pastizal se caracterizó por presentar mayores porcentajes de representantes de los phyla Actinobacteria y Firmicutes; en la cuenca del rio Otún cebollar se caracterizó por presentar un porcentaje de representantes del phyllum Actinobacteria mayor que bosque y forestal. Dentro

del phyllum Proteobacteria se presentó un predominio de -Proteobacteria (77,8%), seguido de -

Protebacteria (17,82) y -Proteobacteria (4,3%). Esto resalta la utilización del recuento de miembros del phyllum Actinobacteria como posible indicador de usos diferentes a bosque.

El predominio de miembros del phyllum Proteobacteria coincide por lo reportado por Menezes, et al. (2005) para un suelo contaminado con diesel y Stach y Burns (2004), para biopelículas en suelo. Curiosamente, la distribución de abundancia de phyla presentada en este estudio es muy similar a la reportada por Ramos (2004), para diferentes sustratos en el rio Bogotá en una estación corriente abajo de descargas de residuos domiciliarios, con un mayor porcentaje de Proteobacterias seguido por Firmicutes, Actinobacteria y Bacteroidetes.

Gráfico 20. Distribución porcentual de los phyla representados por los aislamientos obtenidos en

las cuencas de los ríos La Vieja y Otún.

9.8 DINÁMICA DE LA COMPOSICIÓN DE GREMIOS EN LOS USOS DE SUELO.

Aunque los análisis de similitud y diversidad de los gremios muestran que no existen a nivel global diferencias significativas entre los usos del suelo, y que no existe un efecto de la época climática, al

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Bosque Cafetal Pastizal Bosque Cebollal Forestal

La Vieja Otún

Uso del suelo

Proteobacteria

Firmicutes

Bacteroidetes

Actinobacteria

Fuente: los autores

80

observar en forma individual las especies que componen estos gremios, se muestra claramente que existen no solo cambios en esta composición, tanto a nivel del uso del suelo, como de la época climática, sino que en casos particulares, ciertos usos del suelo pueden marcar la detección o no de algunas especies. Esta dinámica se observa no solo a nivel de la especie detectada, sino también a nivel de las variaciones temporales en la abundancia de los aislamientos para una especie dada.

9.8.1 Cuenca del rio La Vieja. Al examinar los datos de la Tabla 6, algunas especies solo son detectadas en el EM1 (época lluviosa); adicionalmente algunas se presentan en solo un uso del suelo. Para Bosque estas fueron: Bacillus aquimarinus, Bartonella sp., Exiguobacterium aurantiacum, Kokuria rhizophila, Ralstonia sp., Rhodococcus opacus y Sphingobacterium mizutai. Para pastizal Afipia sp., Nocardioides panaciterrae, Nocardioides simplex y Sinorhizobium sp. El uso cafetal no presentó especies exclusivas, más aún, Bacillus pumilus, Bacillus sp., y Burholderia cenocepacia, son especies que están ausentes solo en cafetal. Staphylococcus saprophyticus está ausente solo en bosque.

Para el EM2 (época seca), solo fueron detectadas en bosque: Micrococcus luteus, Ochrobactrum anthropi, Pseudomonas poae, Serratia marcescens. En el caso de pastizal fueron Acinetobacter gyllenbergii, Arthrobacter ureafasciens, Pseudomonas flavescens y Xanthomonas sp. Para cafetal fueron Burkholderia sp., Chryseobacterium indologenes y Pseudomonas tolasii. Sphingobacterium multivorum, Stenotrophomonas sp., Citrobacter freundii, y Paenibacillus sp., no fueron detectadas en cafetal; en este evento es Pseudomonas citronellis la especie que está ausente solo en bosque.

Algunas especies se presentaron en todos los usos del suelo, y denotamos los cambios en el número de aislados entre eventos de muestreo; entre estos estuvieron Acinetobacter calcoaceticus (disminuye 800% en el EM2), Microbacterium trichothenecenolitycum (disminuye 300% en EM2), Pseudomonas putida (disminuye 166% en EM2), Pseudomonas sp. (disminuye 600% en EM2) y Stenotrophomonas maltophilia (aumenta en 320% en EM2), las cuales por su ubicuidad, parecen ser especies dominantes, oportunistas, posiblemente por su flexibilidad metabólica. Cubillos y Roldán (2009), también reportan a Acinetobacter calcoaceticus y Pseudomonas sp., presentes en estos tres usos

En algunos casos algunas especies están ausentes o presentes en un uso del suelo en ambos eventos de muestreo; entre estos estuvieron Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter sp. Acinetobacter gylenbergii, Nocardioides panaciterrae, Nocardioides simplex, Pseudomonas fulva, P. flavescens, Rhodococcus sp., Sphingobacterium sp. Sinorhizobium sp. y Streptococcus suis (exclusivas de pastizal), Chryseobacterium indologenes, P. citronellis, P. tolaasii (exclusivas de cafetal), Burkholderia cepacea (ausente en pastizal), Comamonas testosteroni, Staphylococcus sp. y Variovorax sp. (ausentes en bosque).

Como se mencionó antes es muy importante reconocer la identificación de especies que son capaces de degradar mezclas complejas de HC como la presente en diesel y reafirmando el hecho que los degradadores de HC pueden ser detectados en suelos no contaminados (Schinner et al., 2003).

Salles et al. (2006) ya habían reportado similitudes en poblaciones microbianas entre pastizal y monocultivos (cereales), con una mayor riqueza de especies antagonistas en pastizal permanente,

81

Tabla 6. Taxa presentes por uso de suelo y evento de muestreo en la Cuenca del rio La Vieja.

Ausencia presencia de especies por uso de suelo

Bosque Pastizal Cafetal SSA

EM1

B EM2

B

EM1 EM2

EM1 EM2

Achromobacter xylosoxidans - -

- +

- -

Acinetobacter sp. - -

+ +

- -

A. calcoaceticus + -

+ +

+ -

A. gyllenbergii - -

- +

- -

Afipia sp. - -

+ -

- -

Arthrobacter ureafasciens - -

- +

- -

Bacillus sp. + -

+ -

- -

B. aquimarinus + -

- -

- -

B. pumilus + -

+ -

- -

Bartonella sp. + -

- -

- -

Brevibacterium casei - +

+ -

- -

Burkholderia sp. - -

- +

- +

B. cepacia + +

- -

+ +

B. cenocepacia + -

+ -

- -

Chryseobacterium indologenes - -

- -

- +

Citrobacter freundii - +

- +

- -

Comamonas testosteroni - -

+ +

- +

Cupriavidus pauculus + -

- -

- -

Exiguobacterium aurantiacum + -

- -

- -

Kokuria rhizophila + -

- -

- -

Microbacterium trichotecenolyticum + -

+ -

+ +

Micrococcus luteus - +

- -

- -

Nocardioides panaciterrae - -

+ -

- -

Nocardioides simplex - -

+ -

- -

Ochrobactrum anthropi - +

- -

- -

Paenibacillus sp. - +

- +

- -

Pseudomonas sp. + -

+ +

+ -

P. putida - -

+ +

+ +

P. fluorescens + +

+ -

- -

P. citronellis - -

- -

- +

P. tolaasii - -

- -

- +

P. fulva - -

+ -

- -

P. flavescens - -

- +

- -

P. poae - +

- -

- -

Ralstonia sp. + -

- -

- -

Rhodococcus sp. - -

+ -

- -

R. erythropolis - +

+ +

- -

R. opacus + -

- -

- -

Sphingobacterium sp. - -

- +

- -

S. mizutaii + -

- -

- -

S. multivorum - +

- -

- -

Sinorhizobium sp. - -

+ -

- -

Stenotrophomonas sp. - +

- -

- -

S.maltophilia + +

+ +

+ +

Staphylococcus sp. - -

+ -

+ +

S. saprophyticus - -

+ -

+ -

Streptococcus suis - -

+ -

- -

Variovorax sp. - -

+ -

+ - Xanthomonas sp. - - - + - -

A: CafetalSS: cafetal sin sombrío. B:

EM1: primer evento de muestreo : 14 a 21 Abril de 2007; EM2: segundo evento de muestreo : 24 Agosto a 1 Septiembre de 2007.

Fuente: los autores

82

representando un reservorio para especies de Burkholderia spp., y hace prevalecer el tipo de uso previo antes que la influencia vegetal, de forma semejante a lo reportado en este estudio. Por otro lado Garveva et al. (2003) en forma similar, detectan una mayor diversidad de clones de Bacillus spp. y taxas relacionados (Paenibacillus spp y Arthrobacter spp.) en pastizal permanente en comparación con suelo arable en rotación y Felske et al. (2000) encuentra que Bacillus spp., es la especie predominante en sucesión de pastizales que antes eran agroecosistemas.

No obstante la propiedad dinámica inherente a las comunidades bacterianas en el suelo, es posible sin embargo encontrar poblaciones persistentes tanto en el tiempo (i.e. durante cambios estacionales), como espacialmente. Esto lo demuestra Smit et al. (2001), para especies de los géneros Micrococcus, Arthrobacter y Corynebacterium detectadas todo el año para cultivos estacionales, mientras que otras poblaciones como Bacillus sp. son más representativas en ciertas épocas del año.

Es común también hallar taxa bacterianos cosmopolitas, como miembros de las divisiones y

Proteobacteria, Holophaga/Acidobacterium, Firmicutes, y Chloroflexi (Janssen, 2006), o especies endémicas y especificas de ciertas regiones como Cytophaga, reportado por Furlong et al. (2002), para suelos agrícolas y en cortezas de suelo desértico, o especies de los grupos Bacteriodetes, Chloroflexi y Gemmatinonadetes, como lo reporta Nagy et al. (2005), para cortezas de microorganismos en desiertos. Algunas especies registradas aquí ya habían sido reportadas en suelos utilizando diesel como fuente de carbono; Bacillus cereus, Pseudomonas sp. y B. pumilus, fueron reportadas por Menezes et al. (2005), en suelos contaminados con diesel; Micrococcus spp. y Bacillus spp. fueron aisladas por AlGhazawi et al. (2005) de un suelo con contaminación crónica. Las especies Exiguobacterium aurantiacum y Burkholderia cepacea fueron reportadas por Mohanty y Mukherji (2008) dada su capacidad de usar diesel como única fuente de carbono.

9.8.2 Cuenca del rio Otún. Al examinar los datos de la Tabla 7, algunas especies solo son detectadas en el EM1 (época lluviosa); adicionalmente algunas se presentan en solo un uso del suelo. Para bosque son exclusivas Bacillus pumilus, Bacillus aquimarinus, y Variovorax sp. En el caso de cebollar son Microbacterium trichothenecenolitycum, Nocardioides simplex, Rhodococcus fascians, Staphylococcus saprophyticus y Variovorax soli. En forestal fueron Exiguobacterium aurantiacum, y Paenibacillus sp. Burkholderia cenocepacia y Pseudomonas fluorescens no fueron detectadas en cebollar, así como Burkholderia cepacia no fue detectada en forestal y en el caso de bosque fue Sinorhizobium sp. Cubillos y Roldán (2009), tampoco detectaron en el EM1 a Burkholderia cenocepacia en cebollar y a Burkholderia cepacia en forestal, para el año de muestreo 2006 en la misma zona.

Para el EM2 (época seca) se presentó el mismo fenómeno que en el EM1. En bosque se presentaron únicamente Citrobacter freundii, Micrococcus luteus, Pseudomonas tolasii, Stenotrophomonas nitrireducens y Stenotrophomonas sp.; únicamente en cebollar se presentaron Achromobacter xylosoxidans, Pseudomonas flavescens, y Acinetobacter calcoaceticus, y únicamente en forestal Brevibacterium casei, Burkholderia sp. y Dyella japonica. Bacillus

83

thuringiensis y Pseudomonas poae, están ausentes en bosque, así como Ochrobactrum anthropi en forestal.

Algunas especies se presentaron en todos los usos del suelo, y denotamos los cambios en el número de aislados entre eventos de muestreo; entre estos estuvieron, Comamonas testosteroni (aumenta 300% en EM2), Pseudomonas sp. (disminuye 333% en EM2), Pseudomonas putida (disminuye 300% en EM2). Stenotrophomonas maltophilia (aumenta 220% en EM2) y Rhodococcus erythropolis (aumenta 300% en EM2). Cubillos y Roldán (2009) también reconocen la presencia de Stenotrophomonas maltophilia para estos tres usos del suelo en el año de muestreo 2006.

En algunos casos algunas especies están ausentes en un uso del suelo en ambos eventos de muestreo; entre estos estuvieron Acinetobacter calcoaceticus (ausente en bosque), Pseudomonas citronelollis (ausente en cebollar), Rhodococcus phenolicus (ausente en forestal). Para Cubillos y Roldán (2009), es Acinetobacter calcoaceticus una especie exclusiva del uso bosque.

Contrario a los que encontró Smit et al. (2001) quien reconoce que Micrococcus spp., Arthrobacter spp. y Corynebacterium spp. no son afectados por la época climática y que Bacillus spp. solo está presente en un mes del año, en nuestro estudio, fue a la inversa.

Estos resultados son similares a los reportados para bacterias degradadoras de HC en la misma zona de muestreo para el año 2006 por Cubillos y Roldán (2008), quienes reportan varias de las especies aisladas en el presente documento. Aunque como ya se mencionó, algunas especies fueron exclusivas de un uso o evento de muestreo o de la misma forma, algunas estuvieron ausentes solo en un uso o evento de muestreo, sería erróneo afirmar que una especie, género o grupo de especies, aparece o desaparece completamente de un uso del suelo, como consecuencia del manejo o por el cambio de la época climática; es más apropiado hablar de una ausencia de detección, dado que es posible que poblaciones con abundancias muy bajas, aunque estén presentes, dada las limitaciones de las técnicas dependientes de cultivo, no sean detectadas. Basados en nuestros datos y teniendo en cuenta las limitaciones de las técnicas utilizadas, podemos, sin embargo, concluir que es posible que algunas especies pueden entonces ser utilizadas como indicadores de uso del suelo ya sea por su presencia o por su ausencia en un uso. De manera similar, los cambios en la cantidad de aislados pueden utilizarse como un indicativo de impactos y disturbios causados por el establecimiento de un tipo de uso. Esta posibilidad sin embargo, solo puede ser verificada al evaluar al menos dos épocas lluviosas y secas.

Un aspecto importante del presente trabajo es mencionar que algunas de las especies aisladas nunca habían sido reportadas como degradadoras de HC. Entre estas se encuentran Acinetobacter gyllenbergii, Afipia sp., Arthrobacter ureafasciens, Arthrobacter nicotinae, Bacillus aquimarinus, Bartonella sp., Dyella japonica, Kokuria rhizophila, Microbacterium trichotecenolyticum, Nocardioides panaciterrae, Pseudomonas citronellis, P. tolassii, P. fulva, P. poae, Rhodococcus fascians, Stenotrophomonas nitrireducens, Streptococcus suis y Variovorax soli.

84

Tabla 7. Taxa presentes por uso de suelo y evento de muestreo en la Cuenca del rio Otún.

Ausencia presencia de especies por uso del suelo

Bosque

Cebollar

Forestal

EM1A

EM2A

EM1 EM2

EM1 EM2

Achromobacter xylosoxidans - -

- +

- -

Acinetobacter sp. - -

- -

- +

A. calcoaceticus - -

- +

+ -

Arthrobacter ureafasciens - -

- +

- -

Arthrobacter nicotinae - -

- +

- -

B. thuringiensis - -

- +

- +

B. aquimarinus + -

- -

- -

B. pumilus + -

- -

- -

Brevibacterium casei - -

- -

- +

Burkholderia sp. - -

- -

- +

B. cepacia - -

+ -

- -

B. cenocepacia + -

- -

+ -

Citrobacter freundii - +

- -

- -

Comamonas testosteroni + +

- +

- +

Dyella japonica - -

- -

- +

Exiguobacterium aurantiacum - -

- -

+ -

Microbacterium trichotecenolyticum - -

+ -

- -

Micrococcus luteus - -

+ -

- +

Nocardioides simplex - -

+ -

- -

Ochrobactrum sp. - -

- +

- -

O. anthropi - +

- -

- -

Paenibacillus sp. - -

- -

+ -

Pseudomonas sp. + +

+ +

+ -

P. putida + -

+ +

- -

P. fluorescens + -

- -

+ -

P. citronellis + -

- -

- +

P. tolasii - +

- -

- -

P. flavescens - -

- +

- -

P. poae - +

- +

- -

Rhodococcus sp. - -

+ -

- -

R. erythropolis - +

+ +

- +

R. fascians - -

+ -

- -

R. phenolicus + -

- +

- -

Sinorhizobum sp. + -

+ -

+ -

Stenotrophomonas sp. + +

- -

- -

S. maltophilia + +

- +

+ +

S. nitrireducens - +

- -

- -

S. saprophyticus - -

+ -

- -

Variovorax sp. - -

+ -

- - Variovorax soli - - + - - -

A:

EM1: primer evento de muestreo : 14 a 21 Abril de 2007; EM2: segundo evento de muestreo : 24 Agosto a 1

Septiembre de 2007.

Fuente: los autores

85

9.9 RELACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DEGRADACION CON LA DIVERSIDAD. En el Gráfica 21 se observa el porcentaje de remoción de THP por cada tratamiento. Exceptuando el tratamiento de suelo del pastizal Tesalia, todos los tratamientos permitieron la remoción efectiva de TPH. Se observa que en promedio, el porcentaje de remoción en tratamientos con

suelos procedentes de usos de suelo con intervención humana (45,3 ± 22,1 mgTPH/gps), es mayor

que el porcentaje de remoción de suelos procedentes de bosques (22,2 ± 19,8 mgTPH/gps). El mayor porcentaje de remoción se obtuvo en tratamientos con suelo de plantaciones forestales, seguido por suelos de cebollares y cafetales.

Grafico 21. Porcentajes promedio de mgTPH/gps removidos en cada tratamiento (n=6).

Un porcentaje de degradación negativa del tratamiento de Tesalia no indica una generación de TPH durante el ensayo; esto obedece a la probable extracción de HC presentes en un llamado bolsillo de contaminación, los cuales en ocasiones tienden a agregarse en cúmulos dada su alta hidrofobicidad; es posible que por sus características de compactación y presencia abundante de heces, el suelo de Tesalia (pastizal) mantenga este tipo de bolsillos, que al ser extraídos y cuantificados proporcionen sobreestimaciones del estado de concentración de los HC en suelo. En el Gráfico 22 se observa, que los mayores índices de diversidad se presentaron en suelos procedentes de pastizal, cebollar y bosque. Al relacionar la diversidad de los suelos usados en los tratamientos con la cantidad de TPH removido, se presentó una correlación inversa de ;a cantidad de TPH removidos y la diversidad (expresada mediante el índice se Shannon) (Grafico 23). En un estudio similar, Schinner et al. (2003) encontró una relación entre el número de genotipos de P. putida y Acinteobacter spp. y la cantidad de TPH en suelo, pero no encontró esta relación para Rhodococcus spp. y Mycobacterium spp., sin embargo, la prevalencia de estas especies no se relacionó con actividades biológicas.

30,17 30,91

-51,55

13,42

73,1365,92

61,95

42,11

8,17

36,27

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

aldea platanera tesalia ramada selva PF playa rica bella vista

macarena selva B lusitania% d

e r

em

oci

ón

TP

H

aldea

tesalia

selva PF

bella vista

selva B

Cafetal

Pastizal

Forestal

Cebollar

Bosque

Fuente: los autores

86

Indice de shannon-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25


macarena selva B lusitaniamgT

PH

/gp

s

Tratamientos

TPH degradado

Gráfico 22. Gráfico agrupado de mgTPH/gps degradado e índice de Shannon para cada tratamiento

(n=6).

No se observó relación entre la cantidad de TPH removido y el NMP de bacterias degradadoras (Gráfico 25); un número alto de bacterias degradadoras no necesariamente indica un mayor potencial degradador, como es el caso de los suelos procedentes de forestales que presentaron los recuentos más bajos y a su vez la mayor cantidad de TPH removidos (Gráfico 24). En forma similar, Schinner et al., (2003), no reconocen una relación entre actividad (respiración, fluoresceína, hidrólisis de diacetato y actividad de lipasa) y número de bacterias degradadoras cultivables, aunque si una relación con el contenido de materia orgánica y parcialmente con el nivel de TPH.

3

2,5

2

1,5

1

0,5

0

Índ

ice

de

Sh

ann

on

Fuente: los autores

Fuente: los autores

87

log NMP-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25


macarena selva B lusitaniamgT

PH

/gp

s

Tratamientos

TPH degradado

0

5

10

15

20

25

1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6TH

P d

egr

adad

o (

mg/

gps)

Indice de Shannon

Gráfico 23. Relación entre la cantidad de mg TPH/gps removidos y la diversidad, expresada con el

índice de Shannon (n=6).

Gráfico 24. Gráfico agrupado de mgTPH/gps degradado y Logaritmo del NMP de bacterias

degradadoras para cada tratamiento (n=6).

7

6

5

4

3

2

1

0

Log 1

0 N

MP

Fuente: los autores

y = -12,332x + 32,024

R² = 0,7068

Fuente: los autores

88

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25lo

g10

NM

P

Remoción neta de TPH (mgTPH/gps)

Gráfico 25. Relación entre la cantidad neta de mg TPH/gps degradados y el logaritmo del NMP de

bacterias degradadoras en los tratamientos (n=6).

Al tener en cuenta las especies degradadoras presentes en cada tratamiento (Tabla 8), aunque algunos de los tratamientos que mostraron alto porcentaje de remoción presentan especies exclusivas, existe la duda si éstas son determinantes en los resultados; es el caso de los tratamientos Playa Rica, Macarena y Lusitania, las cuales presentan especies exclusivas y a su vez presentan alto porcentaje de remoción, lo que señala un posible papel decisivo de estas especies en el proceso. Sin embargo los dos tratamientos con los valores de remoción más altos, como son Selva Forestal y Bellavista, no presentan especies exclusivas e incluso comparten especies, con otros tratamientos de bajo porcentaje de remoción de TPH. Los cebollares y los cafetales que están expuestos con regularidad a pesticidas y herbicidas que poseen compuestos estructural y químicamente relacionados con algunos HC y de hecho muchos son derivados de HC, podrían contener poblaciones pre-adaptadas al metabolismo de los compuestos presentes en el diesel (Leahy y Colwell, 1990). Este mismo es el caso de plantaciones forestales, en las cuales las acículas en la hojarasca presentan HC (polifenoles) y otros compuestos química y estructuralmente relacionados (alcohol coniferil); sin embargo a diferencia de cebollares y cafetal este impacto es constante, lo que permitiría mantener poblaciones constantemente adaptadas al consumo de HC presentes en mezclas como diesel o gasolina, lo cual mejoraría la eficiencia de la remoción (Palmroth et al., 2005). Sin embargo Griffiths et al. (2001), reconocen que las cinéticas de mineralización de sustrato están poco relacionadas con los antecedentes de los suelos (práctica extensiva versus intensiva) aunque si están estimuladas por la polución con hidrocarburos. La alta actividad degradadora asociada a suelos de cebollar puede ser influenciada por el uso de herbicidas como Round Up el cual puede estimular la actividad microbiana y la biomasa microbiana y relacionarse con la mineralizacion de C y N (Haney et al., 2002).

y = -0,0701x + 5,5914

R² = 0,1633

Fuente: los autores

89

Tabla 8. Taxa identificados en los suelos utilizados para pruebas de remoción de TPH’s.

Tratamiento

Aldea Platanera Tesalia Ramada

Selva forestal

Playa Rica

Bellavista Macarena Selva

Bosque Lusitania

Acinetobacter calcoaceticus - - - + - - + - - -

A. gylenbergii

- - - + - - - - - -

Achromobacter xylosoxidans - - - - - - - + - -

Arthobacter sp.

- - - + - - - - - -

A. nicotinae

- - - - - - - + - -

Burkholderia sp

- - - + - - - - - -

Burkholderia cepacea, - + - - - - - - - -

Citrobacter freundii - - - + - - - - + -

Chryseobacterium indologenes + - - - - - - - - -

Comamonas testosteroni - - - + - + - + - -

Dyella japonica

- - - - - + - - - -

Micrococcus luteus - - - - - - - - - +

Paenibacillus sp.

- - + - - - - - - -

Pseudomonas sp.

- - + - - - - + - -

Pseudomonas citronellis + + - - + - - - - -

P. flavescens

- - - + - - - - - -

P. fluorescens

- - - - - - - - - +

P. poae

- - - - + - - - + -

P. putida

- + - + - - + - - +

P. tolasii

+ - - - - - - - + -

Ochrobactrum anthropi - - - - - - + - + -

Rhodococcus erytrhopolis - - - + + - - + + +

R. phenolicus

- - - - - - - + - -

Stenotrophomonas maltophilia + + + + + + + - + +

S. nitrireducens

- - - - - - - - + -

Staphylococcus sp - + - - - - - - - -

Sphingobacterium multivorum - - - + - - - - - -

Igualmente es posible que haya ocurrido aclimatación cruzada en la cual la exposición a un compuesto favorece un incremento en las tasas de metabolismo de un compuesto de estructura similar (Leahy y Colwell, 1990), ya sea por la existencia de una baja especificidad de las poblaciones por los TPH o por la existencia de vías catabólicas comunes. La aclimatación también puede entenderse como el aumento en las tasas de metabolismo a medida que aumentan las concentraciones de los TPH. Por ello no es extraño que suelos nunca antes expuestos a HC aromáticos puedan degradarlos como lo reportó Sánchez et al. (2004), para triclorofenol, incluso sin cambios en los gremios. La tendencia en la obtención de mayores porcentajes de remoción de TPH conforme la diversidad y la riqueza disminuyen, puede deberse a que aunque haya mayor número de poblaciones que potencialmente puedan degradar los TPH contenidos en el diesel, tal vez no existe una población que aproveche en forma óptima estos recursos, compartiendo las mismas rutas metabólicas, lo que tiende a la acumulación de compuestos intermediarios y ausencia de mineralización total; otra opción la constituye el no estar pre-adaptadas para el consumo de este tipo de sustratos.

Fuente: los autores

90

En gremios en los cuales existe dominancia de una población, ésta puede aprovechar de manera más eficiente estos recursos, ya sea porque está pre-adaptada o que posee rutas metabólicas más flexibles, muchas de las cuales están dadas por genes localizados extracromosomalmente; se ha mostrado que las vías para el metabolismo de alcanfor, naftaleno, xileno, octano, salicilato y tolueno, están codificadas por plásmidos en Pseudomonas spp. (Leahy y Colwell, 1990); una menor diversidad puede ser signo de una mayor competencia, llevando al dominio de una o unas pocas poblaciones con cinéticas de crecimiento y tasas de consumo de sustrato mayores. Sin embargo realizar una predicción sobre los resultados de un proceso de bioremediación basados en la diversidad de organismos degradadores, aun dista mucho de ser posible, ya que como afirma Reardon et al. (2002), las interacciones entre especies son dependientes del sustrato y no pueden ser predichos por modelos de competición simple. No se debe olvidar tampoco, que para este estudio se tuvo en cuenta la diversidad inicial pero no se evaluaron los cambios en la misma durante el proceso y desconocemos si han ocurrido cambios que conduzcan a sucesiones en las cuales diferentes consorcios puedan tener preferencia por sustratos diferentes (Richard y Vogel, 1999); estos cambios en diversidad y composición de los gremios son frecuentes aunque reversibles, seleccionando poblaciones que pueden degradar

varios tipos de compuestos como PAH, naftaleno y tolueno (Milcic-Terzica et al., 2001). Röling et al. (2002), reportan una reducción de la diversidad durante la bioremediación con una rápida recuperación al estado previo a contaminación aunque con diferencias cualitativas. Vásquez et al. (2008), identificó cambios en el gremio de degradadores por T-RFLP durante bioremediación, siendo la adición de nutrientes el principal factor. Se debe tener en cuenta el posible papel de organismos no cultivables, como lo sugiere Zucchi et al. (2003), tras no observar cambios en la población de bacterias cultivables en la fase de activación de la degradación. Otros factores que pudieron incidir en éstos resultados incluye, la posible presencia de sustancias inhibitorias, una baja movilidad de los microorganismos en el suelo o una baja biodisponibilidad del compuesto blanco, factores que dependen de características de cada suelo. Desconocemos también si se hubieran logrado mayores porcentajes de remoción a mayor duración del ensayo; DelPanno et al. (2005), reporta por ejemplo que este tipo de proceso puede extenderse hasta por un año; igualmente se debe tener en cuenta el nivel de depredación por poblaciones de protozoos, para los cuales, Griffiths et al. (2001) reportan una mayor biomasa en suelos con manejo orgánico versus suelo con manejo intensivo. No es extraño que suelos con diversidad reducida sean capaces de llevar a cabo la remoción de una gran cantidad de HC; Wertz et al. (2006), encontró que incluso la remoción experimental de hasta el 99% de la diversidad, no imposibilitaba la función asociada. Claro está que una gran diversidad hace que la estabilidad funcional en ecosistemas sea insensible a erosión de diversidad, sobre todo cuando existe redundancia en las funciones de degradación y que esta pérdida no constituya una disminución significativa de funcionalidad (Sall et al., 2006). A pesar que no hubo una mineralización completa en ningún tratamiento, un porcentaje de remoción de 70% se considera bastante alto, teniendo en cuenta que no se mantuvo aireación

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6V24-429XVVH-7&_user=10&_coverDate=05%2F31%2F2001&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1189298615&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=476baa0f102a56d5d31b04081e452430#aff1

91

constante, aunque Gerksic et al. (2006), no encontraron diferencias en las tasas de degradación con respecto al venteo continuo. Por su parte Zucchi et al., (2003), logró en columnas empacadas, en 72 días con aireación constante, una remoción total de 39,5%; un porcentaje similar fue obtenido por Margesin y Schinner (2007) después de 780 d. Liste y Felgentreu (2006), lograron hasta 68,7% de remoción de TPH y 59% de remoción de PAH en suelos sin vegetación. Díaz-Ramírez et al. (2008), reportaron una degradación de 40,5% en TPH totales usando mezclas diseñadas de cepas por DGGE. Remociones entre 70 y 90%, son logradas frecuentemente utilizando pre-inóculos adaptadas a degradación de diesel y en biorreactores (Wongsa et al. 2004; Gallego et al., 2001). Pudiera parecer que la adición de nutrientes actúe como un inhibidor del proceso de degradación, sin embargo constituye un requisito para el proceso de degradación de HC, como reconocen

Röling et al. (2002) y Shabir et al. (2008), para degradación de diesel y querosene respectivamente. La inclusión de fertilizantes solubles inorgánicos como sales de nitrato (Margesin 2007) y amonio, mejora el proceso de remoción de contaminantes, incrementando las tasas de consumo de HC (Taylo y Vivaraghavan, 1999). Podríamos concluir entonces, que la capacidad degradadora dependería de la diversidad pero no de la densidad de organismos degradadores; queda entonces por comprobar si la densidad de estos organismos pre-adaptados tiene algún papel en el grado de remoción de HC en suelo. En los suelos muestreados existen poblaciones bacterianas autóctonas, que pueden utilizar el diesel como fuente de carbono y energía, constituyendo un reservorio de organismos con potenciales aplicaciones en bioaumentación in situ o ex situ, para procesos de bioremediación. Sin embargo el uso efectivo de las cepas aisladas exige evaluar aspectos adicionales como estabilidad genética, variabilidad durante el almacenaje, crecimiento rápido luego de almacenaje, alta capacidad enzimática y crecimiento en el ambiente e incapacidad de producir metabolitos tóxicos. Los organismos degradadores de hidrocarburos, pueden ser esenciales en procesos de resistencia y resiliencia ante disturbios generados por uso de pesticidas y herbicidas. Un mejor entendimiento de la ecología del suelo conducirá a manejos más precisos de estos organismos para propósitos benéficos en agricultura y biotecnología.

92

CONCLUSIONES El uso intensivo de suelos, como el realizado en usos de pastizal y cebollar puede evidenciarse en

mayores densidades de bacterias degradadoras de hidrocarburos, aunque sin diferencias

significativas con suelo no intervenido de bosque.

La época climática no constituye un factor influyente en los cambios de densidad de bacterias

degradadoras de hidrocarburos.

La discriminación de sistemas biológicos según su uso del suelo, puede realizarse efectivamente

utilizando variables fisicoquímicas y ambientales, siendo las variables que mantienen o modifican

la estructura del suelo los principales factores de clasificación.

El uso intensivo de suelos, como el realizado en usos de pastizal y cebollar no implica una pérdida

de riqueza y diversidad de especies de bacterias degradadoras de hidrocarburos con respecto a

suelo no intervenido de bosque.

La diversidad de bacterias degradadora de HC puede estar influenciada por época climática para

algunos de los usos de suelo incluidos en el estudio.

El cambio de uso del suelo conlleva variaciones en la composición de los gremios de bacterias

degradadoras de HC que pueden ser indicativos de cada uso.

Los cambios en la estructura de los gremios de bacterias degradadoras de hidrocarburos no están

determinados por factores ambientales ni por las propiedades fisicoquímicas del suelo, pero

pueden estar relacionadas por la historia de uso del suelo.

La época climática puede constituir un factor influyente de los cambios en la composición del

gremio de bacterias degradadoras de HC, determinando la ausencia o presencia de especies.

La capacidad degradadora de hidrocarburos está relacionada con la diversidad pero no con la

densidad de organismos degradadores de hidrocarburos y puede estar relacionada con la historia

de uso del suelo y la vegetación.

En los suelos muestreados existen poblaciones autóctonas de bacterias degradadoras de HC

capaces de remover en forma efectiva TPH a escala de microcosmos.

93

RECOMENDACIONES

Realizar un número de muestreos mayor que permita verificar que los cambios observados por

uso de suelo y época climática son característicos y no fortuitos.

Evaluar otras metodologías de muestreo que permitan reducir la variabilidad en las

determinaciones tanto de densidad de bacterias, como en variables ambientales y fisicoquímicas.

Reducir las variables ambientales y fisicoquímicas que son determinadas tanto in situ como ex situ

cuyo papel en la dinámica de los gremios degradadores de hidrocarburos, por no ser directo, es

impredecible y ambiguo, e incluir la determinación de variables como nitratos, fosfatos y carbono

disponibles que pueden tener un mayor efecto directo.

94

ANEXO A

Ecuación para determinar porcentaje de humedad en una muestra de suelo

% 𝒉𝒉𝒖𝒎𝒆𝒅𝒂𝒅 =𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑢𝑒𝑙𝑜 ℎú𝑚𝑒𝑑𝑜−𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑢𝑒𝑙𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜

𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑢𝑒𝑙𝑜 ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑜𝑥 100 Ecuación 1

Índice de riqueza de Shannon-Wiener

Ecuación 2

Donde pi, es la proporción de clones del i-esimo OTU (estimado usando ni/N), ni es el número de clones en un OTU, N es el número total de clones de la muestra.

Índice de equitabilidad de Shannon

Ecuación 3

Donde S es el número de OTUs en la muestra y H’ el índice de riqueza de Shannon.

Cociente de similitud de Søerensen-Dice

SQ = 2𝐽

𝐴+𝐵 Ecuación 4

Donde A: es número de especies en sitio X, B: número de especie en sitio Y y J: número de especies común a ambos sitios.

95

Ecuación para determinar la pérdida de peso por ignición para estimación de carbono orgánico

total.

%𝑃𝑃𝐼 =peso g 105°C −peso g 550°C

peso (g)(105°C)x 100 Ecuación 5

Ecuación para determinar el rango promedio de tamaño de agregados en suelo.

n

li

XiWiPDM Ecuación 6

Donde:

Xi es el diámetro medio de cualquier rango particular de tamaño de agregados separados por el

tamizaje, y Wi es el peso de los agregados como fracción del total de peso seco de la muestra

analizada, en el rango de tamaño tamizado. La sumatoria cuenta para todos los rangos de tamaño,

incluyendo el grupo de agregados más pequeños que las aberturas del tamiz de poro más fino.

96

ANEXO B

Caldo Bushnell & Hass (Bushnell y Hass, 1941) para 1 L :

KH2PO4 (J.T. Baker) 1 g

NH4NO3 (Carlo Erba) 1 g

CaCl2·2H2O (Carlo Erba) 0,02 g

FeCl3 (Merck) 0,05 g

K2HPO4 (J.T. Baker) 1 g

MgSO4 (Carlo Erba) 0,2 g

Medio sólido Bushnell-Hass (Bushnell y Hass, 1941) para 1 L:

KH2PO4 1 g

NH4NO3 1 g

CaCl2· 2H2O 0,02 g

FeCl3 0,05 g

K2HPO4 1 g

MgSO4 0,2 g

Agar Bacteriológico 15 g

Calentar en plancha con agitación magnética hasta la disolución completa del agar. Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos.

97

ANEXO C

Porcentaje de acrilamida:bisacrilamida 37.5:1 al 40% requerido de acuerdo al rango de longitud

del fragmento de DNA amplificado.

Porcentaje del gel(%) Rango de longitudes

6 300-1000 8 200-400 10 100-300

Solución acrilamida:bisacrilamida al 40%(p/v) 37.5:1.

Recuerde que el pesaje y preparado de esta solución debe realizarse en la cámara de extracción de vapores, utilizando guantes de nitrilo, mascarilla y gafas de protección.

Reactivo Cantidad

Acrilamida 19,465g

Bisacrilamida 0,535g

Adicionar en un volumen de agua desionizada menor a 50ml, agitar constantemente hasta

disolución completa, aforar a 50ml y filtrar por membrana de 0,45m. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC.

Solución 0% denaturante

Reactivo Cantidad

Acrilamida:bisacrilamida 37.5:1 al 40% 4,5ml Buffer TAE 50X 0,6ml Glicerol* 0,6ml

*el glicerol solo se añade si la tinción posterior del gel se realiza con nitrato de plata.

Disuelva en agua desionizada completamente y afore a 30ml, filtre por membrana 0,45um y almacene en frasco ámbar a 4ºC.

98

Solución 100% denaturante

Reactivo Cantidad

Acrilamida:bisacrilamida 37.5:1 al 40% 4,5ml Buffer TAE 50X 0,6ml Formamida* 12,0ml Glicerol** 0,6ml *La formamida es un reactivo toxico, sea precavido al dispensar en la solución.

**Solo se añade cuando se realiza tinción con nitrato de plata.

Mezclar todo los componentes, excepto la acrilamida:bisacrilamida, con el fin de disminuir al

máximo la manipulación y reducir el riesgo de derrames en el momento del filtrado. Filtre la

solución por membrana de 0,45um y adicionar la acrilamida:bisacrilamida, almacenar en frasco

ámbar a 4ºC.

Preparación de soluciones denaturantes de acrilamida:bisacrilamida, alta (60%), baja (30%) y

tapón (plug) para un gel en sándwich de 16 x 16 x 0,75 cm

Solución

Reactivo 60% 30% 0%

Solucion 0% denaturante 3,9 mL 5,2 mL 3 mL

Solucion 100% denaturante 9,1 mL 7,8 mL -

TEMED 13 L 13L 5L

Persulfato amonio 10% 40 L 40L 40 L

Recuerde adicionar el persulfato de amonio en el momento en que se va a servir preparar el gel y

recuerde actuar con rapidez para evitar que el sistema de llenado se obstruya.

Búfer TAE 50X

Reactivo Cantidad Concentración final

Base Tris 242g 2M Acido acético glacial 57,1ml 1M EDTA 0,5M(pH 8.0) 100ml 50mM

Mezclar todo en agua deionizada y agitar hasta disolver completamente la base Tris, aforar a

1000ml con agua desionizada y filtrar por membrana de 0,45um. Esterilizar a 121ºC y 15psi por 15

minutos. Almacenar en lugar no refrigerado.

99

ANEXO D

Ecuación para la estandarización de datos.

Valor estandarizado = 𝒅𝒂𝒕𝒐 𝒐𝒓𝒊𝒈𝒊𝒏𝒂𝒍 − 𝒙

𝝈

Donde 𝒙 es la media y 𝝈 la desviación estándar.

Prueba de comparaciones múltiples para ANAVA de Kruskall Wallis (Siegel y Castellan, 2005).

|Ti – Tj|

z/k(k-1) 𝑁(𝑁+1)

12(

1

𝑛𝑖+

1

𝑛𝑗) Ecuación 8

Donde k corresponde al numero de grupos o tratamientos, |Ti – Tj| corresponde a la diferencia absoluta entre los valores promedio de los tratamientos i y j, N corresponde al numero total de ij tratamientos; ni y nj corresponden al numero de mediciones para los tratamientos i y j. Dos tratamientos se consideran significativamente diferentes si el valor de |Ti – Tj| es igual o mayor al valor calculado pro la ecuación 8.

Ecuación 7

100

ANEXO E

Matrices de correlación de variables biológicas, ambientales y

fisicoquímicas para las cuencas de los ríos La Vieja y Otún.

101

Matriz de correlaciones de variables biológicas, ambientales y fisicoquímicas para cuenca del rio La Vieja EM1.

Log NMPA pH % humedad T°C Suelo% materia

orgánicaMáxima Mínima

% cobertura

vegetal C

Prof.

hojarasca

(cm) B C

% arcilla % limo % arena 1,18mm 600um 300um 54um < 54um

Log NMP A _ -,294 ,273 -,139 ,273 -,210 -,211 -,313 -,240 ,042 -,108 ,139 -,157 ,245 -,016 ,241 -,094

pH -,294 _ -,373 ,328 -,198 ,061 ,223 ,256 ,365 ,197 .448* -.416* ,223 -,354 -,280 -,052 ,088

% humedad ,273 -,373 _ -.723** .725** -.486* -.491** -.517** -,401 -.609** -.512** .629** -.506** .497** .522** ,339 ,108

T°C Suelo .551** .458* -.554** _ -.561** ,159 ,104 -.746** ,357 .592** ,204 -,314 ,332 -.469* -,335 -,201 .450*

% materia

orgánica,273 -,198 .725** -.570** _ -,300 -,161 -,247 -,067 -.639** -,251 .456* -.441* .444* .479* ,270 ,080

temp. ambiental

máxima-,210 ,061 -.486* .538** -,300 _ .806** -,080 -,350 -,050 .401* -,186 -,232 ,096 -,002 ,319 .488**

temp. ambiental

mínima-,211 ,223 -.491** .538** -,161 .806** _ -,161 -,108 ,027 .617** -,369 -,319 ,121 ,149 ,371 .528**

% cobertura

vegetal C-,282 ,030 -.462* ,323 -,193 ,082 -,028 _ ,417 ,104 ,080 -,226 .531** -.614** -.413* -.476* -.512**

Prof. hojarasca

(cm) B C .573* -.644** -,239 ,059 -,161 ,381 .485* ,255 _ -,198 -,011 -,076 -,015 ,128 -,159 -,018 -,083

% arcil la ,295 .444* -.582** .592** -.581** ,114 ,150 -.700** -,216 _ .461* -.676** .611** -.709** -.628** -.409* .435*

% limo -,108 .448* -.512** ,331 -,251 .401* .617** -,008 ,060 .400* _ -.821** -,046 -,145 -,058 ,125 .478*

% arena ,139 -.416* .629** -,268 .456* -,186 -,369 -,180 -.508* -.609** -.821** _ -,364 .520** .437* ,232 -,180

% agregado

1,18mm-,157 ,223 -.506** ,147 -.441* -,232 -,319 .683** ,418 .473* -,046 -,364 _ -.884** -.796** -.831** -.617**

% agregado

600um,245 -,354 .497** -,080 .444* ,096 ,121 -.649** -.497* -.421* -,145 .520** -.884** _ .789** .599** ,312

% agregado

300um-,016 -,280 .522** -,104 .479* -,002 ,149 -.466* -,366 -.496** -,058 .437* -.796** .789** _ .424* ,270

% agregado

54um,241 -,052 ,339 -,112 ,270 ,319 ,371 -.612** -,426 -,260 ,125 ,232 -.831** .599** .424* _ .615**

% agregado

<54um-,094 ,088 ,108 -,079 ,080 .488** .528** -.404* -,255 -,170 .478* -,180 -.617** ,312 ,270 .615** _

Temperatura ambiental % Agregados

Coeficiente de correlación

* La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).

** La correlación es significativa al nivel 0,05 (bilateral).

A Logaritmo base diez del número más probable

B Solo para coberturas Bosque y Cafetal.

C Se presenta el coeficiente de correlación de Spearman.

102

Matriz de correlaciones de variables biológicas, ambientales y fisicoquímicas para cuenca del rio La Vieja EM2.

Log NMPA pHC % humedad T°C Suelo% materia

orgánicaMáxima Mínima

%

cobertura

vegetal C

Prof. hojarasca

(cm) B C % arcilla % limo % arena 1,18mm 600um 300um 54um < 54um

Log NMP A _ -,114 -,291 ,274 -,152 ,313 ,299 ,040 ,415 ,034 -,105 ,050 -,020 ,087 ,035 ,055 -,197

pH C -,161 _ ,053 ,173 -,210 .396

*.463

* -,234 -.644** ,262 -,241 ,153 ,061 ,265 ,106 -,131 -,209

% humedad -,291 ,173 _ -.420*

.457*

-.395* -,284 -.411

* -,130 -.625** -,378 .434

* -,375 ,350 .453* ,195 ,030

T°C Suelo ,274 -,076 -.420* _ -,298 .382* .559** -,153 ,001 ,103 ,157 -,213 ,005 -,031 -,065 -,013 ,145

% materia

orgánica-,152 -,194 .457

* -,298 _ -,369 -,349 ,015 -,177 -.597** -,153 ,352 -,219 ,132 .476

* -,067 ,235

temp. ambiental

máxima,313 ,220 -.395* .382* -,369 _ .859** ,259 ,423 ,185 -,061 -,037 ,138 -,019 -,077 -,126 -,296

temp. ambiental

mínima,299 ,343 -,284 .559** -,349 .859** _ -,018 .470* ,106 -,121 -,007 ,074 ,066 -,052 -,128 -,215

% cobertura

vegetal C-,020 -,234 -,236 -,177 ,346 ,295 ,011 _ ,255 ,029 -,138 -,030 .441* -.568** -,354 -.423* -.453*

Prof. hojarasca

(cm) B C ,415 -.598** -,130 ,001 -,177 ,423 .470

* ,295 _ -,206 -,105 -,196 ,143 -,186 -,288 -,134 -,050

% arcilla ,034 ,103 -.625** ,103 -.597

** ,185 ,106 ,283 -,206 _ .400*

-.609**

.473*

-.421*

-.496** -,260 -,170

% limo -,105 -,218 -,378 ,157 -,153 -,061 -,121 -,137 -,105 .400* _ -.821

** -,046 -,145 -,058 ,125 .478*

% arena ,050 ,181 .434* -,213 ,352 -,037 -,007 -,125 -,196 -.609

**-.821

** _ -,364 .520**

.437* ,232 -,180

% agregado

1,18mm-,020 ,018 -,375 ,005 -,219 ,138 ,074 .700

** ,143 .473* -,046 -,364 _ -.884

**-.796

**-.831

**-.617

**

% agregado

600um,087 ,109 ,350 -,031 ,132 -,019 ,066 -.685** -,186 -.421* -,145 .520** -.884** _ .789** .599** ,312

% agregado

300um,035 ,093 .453

* -,065 .476* -,077 -,052 -.549

** -,288 -.496** -,058 .437

*-.796

**.789

** _ .424* ,270

% agregado

54um,055 -,041 ,195 -,013 -,067 -,126 -,128 -.553

** -,134 -,260 ,125 ,232 -.831**

.599**

.424* _ .615

**

% agregado

<54um-,197 -,231 ,030 ,145 ,235 -,296 -,215 -.437

* -,050 -,170 .478* -,180 -.617

** ,312 ,270 .615** _


Coeficientes de correlación



A. Logaritmo base diez del número más probable

B. Solo para coberturas Bosque y Cafetal.

C. Se presenta el coeficiente de correlación de Spearman.

103

Matriz de correlaciones de variables biológicas, ambientales y fisicoquímicas para cuenca del rio Otún EM1.

Log NMP A

pH C % humedad T°C Suelo

C % materia

orgánicaMáxima

C Mínima% cobertura

vegetal CProf. hojarasca

(cm) B C % arcilla C % limo % arena 1,18mm 600um 300um 54um < 54um

Log NMP A _ ,184 -.394

*.518

** ,036 -,130 -.389*

-.576** ,242 ,239 -,242 ,130 -,077 -,072 -,003 ,100 .438

*

pH C ,266 _ -.513

**.458

* -,368 ,180 ,100 -,311 -,239 .444*

.457*

-.490** ,380 -.589

** -,295 -,355 .430*

% humedad -.394*

-.646** _ -.575

**.416

* ,070 ,203 .712** ,401 -.576

** -,304 .421*

-.391*

.583**

.418* ,231 -.456

*

T°C Suelo C .551** .458* -.554** _ -.561** ,159 ,104 -.746** ,357 .592** ,204 -,314 ,332 -.469* -,335 -,201 .450*

% materia orgánica ,036 -.491** .416* -.521** _ -.527** -.409* .460* ,474 -.620** -.422* .532** -.599** .679** .586** .389* -,247

temp. ambiental

máxima C-,137 ,180 ,174 ,159 -.442

* _ .841** -,318 -,008 ,114 ,187 -,200 ,297 -,223 -,193 -,283 -,039

temp. ambiental

mínima-.389* ,000 ,203 -,018 -.409* .804** _ ,171 ,001 ,006 ,106 -,090 ,283 -,202 -,113 -,316 -,162

% cobertura

vegetal C-.581

** -,311 .542**

-.746**

.522** -,318 -,279 _ -,281 -.700

** -,140 ,308 -,369 .515** ,369 ,256 -.479

*

Prof. hojarasca

(cm) B C ,263 -,239 ,456 ,357 ,304 -,008 ,171 -,281 _ -,216 -,431 ,419 -,277 ,490 ,400 ,116 -,395

% arcilla C ,239 .398

*-.576

**.606

**-.620

** ,177 ,006 -.810** -,311 _ .467

*-.681

**.537

**-.675

**-.576

** -,368 .434*

% limo -,242 .473* -,304 ,182 -.422* ,197 ,106 -,293 -,470 .467* _ -.966** .445* -.469* -,302 -.418* -,045

% arena ,130 -.508** .421* -,329 .532** -,215 -,090 .481* ,491 -.681** -.966** _ -.526** .587** .420* .454* -,090

% agregado

1,18mm-,077 .394* -.391* ,326 -.599** ,312 ,283 -,370 -,407 .537** .445* -.526** _ -.947** -.801** -.875** -,203

% agregado 600um -,072 -.545** .583** -.459* .679** -,312 -,202 .560** .528* -.675** -.469* .587** -.947** _ .836** .752** -,084

% agregado 300um -,003 -,331 .418* -,321 .586** -,183 -,113 ,344 ,381 -.576** -,302 .420* -.801** .836** _ .428* -,105

% agregado 54um ,100 -,296 ,231 -,225 .389* -,306 -,316 ,279 ,242 -,368 -.418

*.454

*-.875

**.752

**.428

* _ .404*

% agregado <

54um.438

* ,312 -.456* ,311 -,247 ,006 -,162 -.502

** -,229 .434* -,045 -,090 -,203 -,084 -,105 .404

* _

% AgregadosTemperatura ambiental

Coeficiente de correlación




B. Solo para coberturas Bosque y Forestal.


104

Matriz de correlaciones de variables biológicas, ambientales y fisicoquímicas para cuenca del rio Otún EM2.

Log NMP A

pH C % humedad T°C Suelo

C % materia

orgánicaMáxima

C Mínima

%

cobertura

vegetal C

Prof.

hojarasca

(cm) B C

% arcilla C % limo % arena 1,18mm 600um 300um 54um < 54um

Log NMP A _ -,249 -,236 ,258 -,216 -,032 ,028 -,162 -,272 ,152 -,087 ,027 ,022 -,006 -,180 ,123 -,009

pH C -,249 _ .649

** -,349 ,185 -.469*

-.483*

.664** ,337 -.424

* -,266 ,345 -,339 .419* ,259 ,261 -,011

% humedadC -,251 .667

** _ -,320 ,186 -.590**

-.672**

.897** ,151 -.486

* -,082 ,208 -,107 ,374 ,178 ,005 -.610**

T°C Suelo ,258 -,349 -,324 _ -.497** ,170 ,276 -,310 ,246 ,110 ,129 -,140 -,348 ,278 ,280 ,270 ,120

% materia

orgánica-,216 ,185 ,191 -.497

** _ -,086 -,239 ,246 ,316 -,298 -,250 ,295 ,009 ,045 ,002 -,023 -,141

temp. ambiental

máxima -,032 -.469* -.649** ,170 -,086 _ .913** -.818** -,082 .727** .484* -.615** ,313 -.486* -,359 -,185 .475*

temp. ambiental

mínima C,035 -,375 -.672

** ,264 -,174 .839** _ -.644

** ,280 .641** ,349 -.453

* ,193 -.404* -,192 -,133 .555

**

% cobertura

vegetal C -,176 .674** .897** -,082 ,243 -.595** -.644** _ .508* -.647** -,166 ,327 -,339 .560** ,357 ,194 -.570**

Prof. hojarasca

(cm) B C -,272 ,337 ,223 ,246 ,316 -,082 ,125 ,403 _ -,328 -,190 ,237 -,286 ,406 .539* -,071 -,176

% arcilla C ,140 -.432

*-.486

* ,021 -,332 .714**

.641**

-.647** -,352 _ .461

*-.676

**.611

**-.709

**-.628

**-.409

*.435

*

% limo -,087 -,266 -,112 ,129 -,250 .484*

.414* -,292 -,190 .467

* _ -.966**

.445*

-.469* -,302 -.418

* -,045

% arena ,027 ,345 ,256 -,140 ,295 -.615**

-.561**

.479* ,237 -.681

**-.966

** _ -.526**

.587**

.420*

.454* -,090

% agregado

1,18mm,022 -,339 -,120 -,348 ,009 ,313 ,249 -,352 -,286 .537

**.445

*-.526

** _ -.947**

-.801**

-.875** -,203

% agregado

600um-,006 .419* ,358 ,278 ,045 -.486* -.438* .547** ,406 -.675** -.469* .587** -.947** _ .836** .752** -,084

% agregado

300um-,180 ,259 ,198 ,280 ,002 -,359 -,273 ,337 .539* -.576** -,302 .420* -.801** .836** _ .428* -,105

% agregado

54um,123 ,261 -,004 ,270 -,023 -,185 -,168 ,258 -,071 -,368 -.418* .454* -.875** .752** .428* _ .404*

% agregado <

54um-,009 -,011 -.572

** ,120 -,141 .475*

.520**

-.509** -,176 .434

* -,045 -,090 -,203 -,084 -,105 .404* _


Coeficientes de correlación




B. Solo para coberturas Bosque y Forestal.


105

ANEXO F

COBERTURA FINCA MANEJO M.O. RIEGO NOTAS

Nombre Tiempo Extensión Nombre Método Frecuencia Nombre Composición Frecuencia Fecha aplic. Frecuencia Fecha utiliz.

Variedad

Colombia

Si aplican

plaguicidas. Machete

Surcos NoVariedad

Colombia 17 años* 6 cuadras

Químico

Randa

Estelar.

Machete 1 año Abocol

20:30:10 (mg)

- N:P:KEnero de 2007

Thiodan

(Endosulfan)

Insectos

chupadores y

masticadores

Contra la

broca.

Se aplica

entre 1 y 2 l

/ha

Buenos Aires No

Café F-6

(Colombia) 55 cuadras Broca tiodan

Manual

(Fumigación) 1 año c/u

alternado

1. Da Kelate

2 Fertil izante

3 Fertil izante

4 Dap

1. 1/2 kilo

boro-azucar.

2. 13:3:43

3. 18-46

4. Urea+HK-

SO4 (Oxido

Magnesio)

Tesalia BajaRotación con café

Pollinaza+gal

linaza

Ecofertil Pastizal 31:8:8:2 (mg) - N:P:K:Mg

La ramada

Estiercol+cis

co

madera+cal.

Seco+1 mes

compostaje+

cal+urea.

Leucaena (sin

químico) Estrella 15 años 80 *

Herbicida

(Hormiga

aviera)

Compost Antes:

1.Caña

2.Yucales,

plátano y

café.

Villa Ximena Rotación Café - Estrella 17ha Fertipasto 35:8:33 (mg) - N:P:Kc/30d 07-abr

No se

adiciona,

solo en

verano

(manguera y

aspersiones)

4 cuadras y

media Maleza

Manual

Químico

(Roundup,

carmes)

Todo el

tiempo

(dependiendo

de

lluvias)

Chiza,

chinches,

lombriz,

babosa y

acaros

Químico

(Lorban,

clorpinto,

(Ca+ III) Cada 15 días

Rafus,

Nutrifit,

Urea, biosol,

KCl

Al incio del

ciclo

una vez en

elcorte SI (asadon)

Cada vez que

acaba el

ciclo

Biológico

En veranoCebolla 20-25 años 2ha Nutrifit 16:30:10 - N:P:K1 /ciclo

pH: 5.9

M.O: 8%

Gallinaza.

Con poco

frecuencia

cáscara de

café

No

Cebolla Jinca*35 años 3 cuadras Maleza Manual (asadon)

Lombriz,

mojojoy,

hongo

Chinche:

Lordsban Cada corte

Fertipapa

Triple 15 Al corte SI (asadon)

Cada corte

(2 1/2 meses)

CEBOLLAR

El descanso

Macarena

Bella vista

El manzanoSurcos.

Surcos.

Rotación

cultivos

poco

frecuente.

FERTILIZACION LABRANZA

CSS

PASTIZAL

La Aldea Surcos No

Compostaje.

Gallinaza

Gallinaza +

cisco

PLAGASCULTIVO

Fuente: Cubillos, A y Roldán F., 2008

Encuestas sobre manejo de cultivos de cafetal SS, pastizal y cebollares, en EM1 y EM2.

106

ANEXO G

Matriz de riqueza y abundancia de especies para las cuencas de las fincas de las cuencas de los ríos La Vieja y Otún en el EM1

Uso suelo FincaAcinetobacter

sp.

A.calcoaceticu

s

Afipia

sp.

Bacillus

sp.

Bacillus

aquimarinus

Bacillus

pumilus

Bartonella

sp.

Brevibacteriu

m casei

Burkholderia

cepacia

Burkholderia

cenocepacia

Comamamona

s testosteroni

Cupriavidus

pauculus

Exigu

auranti

Kocuria

rizophila

Microbacterium

trichotecenolyticum

Micrococcus

Luteus

N.

simplex

Paenibacillus

sp.

Ilusion 0 0 0 0 0 0 5,301 0 5,875 0 0 0 0 6,06 0 0 0 0

Veraguas 0 0 0 0 6,4457 5 0 0 0 5,07 0 0 4,699 0 0 0 0 0

Lusitania 0 6,099 0 6,5314 0 0 5,301 0 0 8,1925 0 4,6989 0 0 5 0 0 0

Aldea 0 4,0210 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4,711 0 0 0

Descanso 0 6,0791 0 0 0 0 0 0 6,3811 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Platanal 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tesalia 4,01 0 0 3,5118 0 5,4698 0 5,0737 0 0 0 0 0 0 4,3953 0 4,845 0

VillaXimena 0 5,6901 5,69 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Ramada 0 3,799 0 0 0 4,01 0 0 0 4,255 5,5593 0 0 0 0 0 5,1903 0

Bejucos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Manzano 0 0 0 0 0 8,3 0 0 0 0 7,8488 0 0 0 0 0 0 0

Selva 0 0 0 0 4,6989 4,875 0 0 0 4,301 0 0 0 0 0 0 0 0

Manzano 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

BellaVista 0 0 0 0 0 0 0 0 7,0711 0 0 0 0 0 6,658 0 5,7745 0

Macarena 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8,3 0 0

Selva 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4,398 0 0 0 0 7,2201

Lisbrán 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Playa Rica 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6,619 0 0 0 0 0 0 0 0

Pseudomonas sp. P. putida P. fluorescensP. citronellis P. fulva Rhodococcus sp.R. wratislaviensisR. erythropolis R. fascians Rhod opacus Rhodo phenolicSphing mizutaiiSinorhizobum sp.Stenotrophomonas sp.Steno.maltophiliaStaphylococcus sp.Staphy saprophStreptococcus suis Variovorax sp.

Ilusion 0 0 6,06 0 0 0 5,6119 0 0 0 0 4,6989 0 0 5,176 0 0 0 0

Veraguas 4,9826 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Lusitania 7,1145 0 5,37 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 6,2302 0 0 0 0

Aldea 6,7207 6,7461 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3,8129 3,6989 0 4,0413

Descanso 0 7,698 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6,7551 0 0

Platanal 5,1238 7,022 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6,2857 0 0 0 0

Tesalia 5,6496 0 0 0 8,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4,688 0 0 0 0

VillaXimena 5,9059 3,5118 8,3 0 0 0 0 4,176 0 0 0 0 5,718 0 4,176 0 0 0 7,039

Ramada 0 0 4,055 0 0 5,075 0 4,255 0 0 0 0 0 0 4,9419 3,799 4,4857 4,9777 0

Bejucos 7,0136 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 7,5315 0 0 0 0

Manzano 0 0 6,862 6,8621 0 0 0 0 0 0 0 0 7,981 0 8,3 0 0 0 0

Selva 6,8388 5,301 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6,9758 0 0 0 0 0

Manzano 0 5,7925 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4,903 0 0

BellaVista 6,6334 6,826 0 0 0 5 0 6,5965 0 0 0 0 6,653 0 0 0 0 0 0

Macarena 4,6403 5,7137 0 0 0 0 0 0 5,4771 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6,5378

Selva 6,1074 0 6,619 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4,602 0 0 0 0

Lisbrán 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Playa Rica 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8,3 0 7,5659 0 0 0 0

Forestal

Forestal

Bosque

Cafetal

Pastizal

Bosque

Cebollal

Bosque

Cafetal

Pastizal

Bosque

Cebollal

Fuente: Los autores.

107

Matriz de riqueza de especies para las cuencas de las fincas de las cuencas de los ríos La Vieja y Otún en el EM2

Uso de suelo FincaAchromobacte

r xylosoxidans

Acinetobact

er sp.

A.calcoaceticu

s

A.

gyllenbergii

Arthrobacter

sp.

Bacillus

cereus

Brevibacterium

casei

Burkholderia

sp. B. cepacia

Chryseobacterium

indologenes

Citrobater

freundii

Comamonas

testosteroni Dyella japonica

Microbacterium

sp.

Micrococcus.

Luteus

Ochrobactrum

sp.

Ochrobactrum

anthropi

Paenibacillu

s sp.

Ilusión 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6.423

Lusitania 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7.977 0 0 0

Veraguas 0 0 0 0 0 0 5.698 0 5.602 0 5.698 0 0 0 0 0 6.204 0

Ramada 0 0 6.612 6.698 7.061 0 0 7 0 0 7 6,88 0 0 0 0 0 0

Ximena 0 7.306 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6.796 0 0 0 0 0 0

Tesalia 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6.596 0 0 0 0 0 6.484

Descanso 0 0 0 0 0 0 0 5 7.645 0 0 7.326 0 7.062 0 0 0 0

Platanera 0 0 0 0 0 0 0 0 5.903 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Aldea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0

Manzano 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7.484 0 0 0 0 0 0

Bejucos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8.984 0 0 0 0 0 0

SelvaB 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 7.361 0

BellaVista 0 0 5.176 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7.176 0 0

Macarena 7.099 0 0 0 7.196 0 0 0 0 0 0 7.027 0 0 0 0 0 0

ManzanoC 0 0 0 0 0 5.698 0 0 0 0 0 7.447 0 0 0 0 0 0

SelvaPF 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

PlayaRica 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8.083 5.544 0 0 0 0 0

Lisbran 0 7.602 0 0 0 7.931 6.607 7.945 0 0 0 0 0 0 6.812 0 0 0

Pseudomonas

sp. P. putida P. fluorescens P. citronellis P. tolasii

P.

flavescens P. poae

R.

erythropolis

Rhodo

phenolic

Serratia

marscencens

Sphingobacteri

um multivorans

Sphingobacter

ium sp.

Stenotrophomona

s sp. S. maltophilia

S.

nitrireducens

Staphylococcu

s sp.

Xanthomonas

sp.

Ilusión 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6.113 0 6.258 7.630 0 0 0

Lusitania 0 0 7.176 0 0 0 0 6.698 0 0 0 0 0 5.705 0 0 0

Veraguas 0 0 5.176 0 0 0 7.362 0 0 6 0 0 5.845 6.554 0 0 0

Ramada 0 5.301 0 0 0 7.875 0 7.369 0 0 0 6.698 0 7.338 0 0 0

Ximena 0 0 0 0 0 0 0 7.377 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tesalia 6.879 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6.657 0 0 5,176

Descanso 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7.159 0 0 0

Platanera 0 6.698 0 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7.047 0 7.176 0

Aldea 0 0 0 6.991 7.103 0 0 0 0 0 0 0 0 6.915 0 0 0

Manzano 5.397 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6.886 0 0 0

Bejucos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7.375 0 0 0

SelvaB 0 0 0 0 5.653 0 7.909 7.832 0 0 0 0 7.047 6.529 7,9 0 0

BellaVista 0 7.698 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7.176 0 0 0

Macarena 7.271 0 0 0 0 0 6.698 7.301 7.420 0 0 0 0 0 0 0 0

ManzanoC 0 7.268 0 0 0 6 0 7.015 0 0 0 0 0 6.658 0 0 0

SelvaPF 0 0 0 5.301 0 0 0 7.491 0 0 0 0 0 7.194 0 0 0

PlayaRica 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7.699 0 0 0

Lisbran 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8.079 0 0 0

Cebollar

Forestal

Bosque

Pastizal

Cafetal

Bosque

Cebollar

Forestal

Bosque

Pastizal

Cafetal

Bosque

Fuente: Los autores.

108

BIBLIOGRAFIA

AlGhazawi, Z.; Saadoun, I. y AlShak'ah, A. Selection of bacteria and plant seeds for potential use in the remediation of diesel contaminated soils. J Basic Microbiol[Abstract], 2005; 45:251-256. Amikam, D. y Kuhn, J. Characterization of Vibrio fischeri rRNA operons and subcloning of a ribosomal DNA promoter. J Bacteriol[Abstract], 1987; 169: 2318–2321. Andren, O. y Balandreau, J. Biodiversity and soil functioning: from black box to can of Worms?. Appl Soil Ecol, 1999; 13: 105-108. April, W., y Sims, R., Evaluation of the use of prairie grasses for stimulating polycyclic aromatic hydrocarbon treatment in soil. Chemosphere[Abstract], 1990; 20: 253-265. American Society for Testing Materials. 1995. D 5831-96: Standard test method for screening fuels in soils. American Society for Testing Materials. West Conshohocken, PA. p. 1-9. Atlas, R. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective. Microb Rev, 1981; 45: 180-209. Atlas, R. y Bartha, R. Ecología microbiana y microbiología ambiental. 4 ed. España: Pearson Educación, S.A, 2002. p. 553-586. Bardgett, R.; Usher, M. y Hopkins, D. Biological diversity and function in soils. Cambridge: Cambridge University Press, Ecological Reviews, 2005. 411p. Battermann, A.; Disse-Krömker, C y Dreiseikelmann, B. A functional plasmid-borne rrn operon in soil isolates belonging to the genus Paracoccus. Microbiol, 2003; 149: 3587-3593. Bento F., y Gaulore, C., Biodeterioration of stored diesel oil: studies in Brazil. Int Biodet Biodeg, 2001; 47: 107-112. Bossio, D.; Scow, K.; Gunapala, N. y Gu, N. Determinants of Soil Microbial Communities: Effects of Agricultural Management, Season, and Soil Type on Phospholipid Fatty Acid Profiles. Microb Ecol, 1998; 36: 1-12. Bossio, D.; Girvan, M.; Verchot, L.; Bulimore, J.; Borrelli, T.; Albrecht, A.; Scow, K.; Ball, A.; Pretty, J. y Osborn, A. Soil Microbial Community Response to Land Use Change in an Agricultural Landscape of Western Kenya. Microb Ecol, 2005; 49: 50-62.

109

Boyer, S.; Flechtner, V. y Johansen, J. Is the 16S–23S rRNA internal transcribed spacer region a good tool for use in molecular systematics and population genetics? A case study in Cyanobacteria. Molecular Biology and Evolution, 2001; 18:1057-1069. Braddock, J. y Catterall, P. A simple method for enumerating gasoline- and diesel-degrading microorganisms. Biorem J, 1999; 3(2):81-88. Bjorn, B. y McClaugherty, C. 2008. Plan Litter: Decomposition, humus formation, carbon sequestration. 2 ed, Springer. pp. 175-190.

Brandt, K.; Petersen, A.; Holm, P. y Nybroe, O. Decreased abundance and diversity of culturable Pseudomonas spp. populations with increasing copper exposure in the sugar beet rhizosphere. FEMS Microbiol Ecol, 2006; 56:281-291. Bremer, C.; Braker, G.;Matthies, D.; Reuter, A.; Engels, C. y Conrad, R. Impact of plant functional group, plant species, and sampling time on the composition of nirK-type denitrifier communities in soil. Appl Environ Microbiol, 2007; 73: 6876-6884. Bruns, M.; Stephen, j.; Kowalchuk, G.; Prosser, J. y Paul, E. Comparative diversity of ammonia oxidizer 16S rRNA gene sequences in native, tilled, and successional soils. Appl Environ Microbiol, 1999; 65: 2994-3000. Buckley, D.; Huangyutitham, V.; Nelson, T.; Rumberger, A. y Thies, J. Diversity of Planctomycetes in soil in relation to soil history and environmental heterogeneity. Appl Environ Microbiol, 2006; 72: 4522-4531. Bundy, J., Paton G., y Campbell, C. Microbial communities in different soil types do not converge after diesel contamination. J Appl Microbiol, 2002; 92: 276-288. Bushnell, L. y Hass, H. The utilization of certain hydrocarbons by microorganisms. J Bacteriol, 1941; 41: 653-673. Rodriguez, J, et al. Valoración de la biodiversidad en la ecorregión del eje cafetero. Pereira, Colombia: CIEBREG. 238p. Cardona, C. y Sadeghian, K. Ciclo de nutrimientos y actividad microbiana en cafetales a libre exposición solar y con sombrío de Inga spp. Cenicafé, 2005; 56: 127-141.

Casamayor, E.; Schäfer, H.; Bañeras, L.; Pedrós-Alió, C. y Muyzer, G. Identification of and spatio-temporal differences between microbial assemblages from two neighboring sulfurous lakes: comparison by microscopy and denaturing gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol, 2000; 66: 499-508. Case, R., Boucher, Y.; Dahllöf, I.; Holmström, C. y Ford Doolittle,W. y Kjelleberg, S. Use of 16S rRNA and rpoB genes as molecular markers for microbial ecology studies. Appl Envionr Microbiol, 2007; 73: 278-288.

110

Castro, J.; Burbano, H. y Bonilla, C. Abundancia y biomasa de organismos edáficos en tres usos del terreno en el altiplano de Pasto, Colombia. Acta Agron, 2007; 56:127-130.

Chabrerie, O., Laval, K.; Puget, P.; Desaire, S.; Alard, D. Relationship between plant and soil microbial communities along a successional gradient in a chalk grassland in north-western France. Appl Soil Ecol, 2003; 24: 43-56. Chen, C.; Zu, H. y Mathers, N. Soil Carbon Pools in Adjacent Natural and Plantation Forests of

Subtropical Australia. Soil Sci Soc Am J, 2004; 68:282-291.

Chen J.; Xuliang, Z.; Huijun, X.; Bai, Z., Hongyan, Q.y Hongxun, Z. Associated impact of inorganic fertilizers and pesticides on microbial communities in soils. World J Microbiol Biotechnol, 2007; 23: 23-29. Claverie, J. y Notredame, C. 2003. Similarity searches on sequences databases. En: Bioinformatics for dummies. Wiley Publishing Group: Hoboken New Jersey. p. 215-246. Cubillos, A. y Roldán, F. 2009. Identificacion taxonómica de bacterias cultivables asociadas a los ciclos del carbono y nitrógeno en las cuencas de los ríos La Vieja y Otún (eje cafetero-Colombia). Bogotá D.C. pp.107-112. Tesis de pregrado. (Biología). Pontificia Universidad Javeriana. Curtis, T.; Sloan, W. y Scanell, J. Estimating prokaryotic diversity and its limits. PNAS, 2002; 99:10494-10499.

Dahllöf, I., Baillie, H y Kjelleberg, S. rpoB-Based microbial community analysis avoids limitations inherent in 16S rRNA gene intraspecies heterogeneity. Appl Environ Microbiol, 2000; 66:3376-80. Dar, S.; Yao, L.; van Dongen, U.; Kuenen, G. y Muyzer, G. Analysis of diversity and activity of sulfate-reducing bacterial communities in sulfidogenic bioreactors using 16S rRNA and dsrB genes as molecular markers. Appl. Environ. Microbiol, 2007; 73: 594-604. Davis, K.; Joseph, S. y Janssen, P. Effects of growth medium, inoculum size, and incubation time on culturability and isolation of soil bacteria. Appl. Environ Microbiol, 2005; 71: 826-834. Davidson, D. y Grieve, Y. Relationships between biodiversity and soil structure and function: Evidence from laboratory and field experiments. Appl Soil Ecol, 2006; 33:176-85. Degens, B. Schipper,I.; Sparling, G. y Vojvodic-Vukovic, M. Decreases in organic C reserves in soils can reduce the catabolic diversity of soil microbial communities. Soil Biol Biochem, 2000; 32: 189-196. DelPanno , M.; Morelli, I.; Engelen, B.; Berthe-Corti, L. Effect of petrochemical sludge concentrations on microbial communities during soil bioremediation. FEMS Microbiol Ecol, 2005; 53: 305-316.

111

Diaz-Ramirez, I.; Escalante-Espinosa, E.; Favela-Torres, E.; Gutierrez-Rojas, M.; Ramirez-Saad, H. Design of bacterial defined mixed cultures for biodegradation of specific crude oil fractions, using population dynamics analysis by DGGE. Int Biodet Biodeg, 2008; 62: 21-30. Drenovsky, R.; Vo, D.; Graham, K.; Scow, K. Soil Water Content and Organic Carbon Availability Are Major Determinants of Soil Microbial Community Composition. Microb Ecol, 2004; 48: 424-430. Duineveld, B.; Kowalchuk, G.; Keijzer,A.; van Elsas, D. y van Veen, J. Analysis of bacterial communities in the rhizosphere of chrysanthemum via denaturing gradient gel electrophoresis of

PCR-amplified 16S rRNA as well as DNA fragments coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol, 2001; 67: 172-178. Edenborn, S. y Exture, A. DGGE fingerprinting of culturable soil bacterial communities complements culture-independent analyses. Soil Biol Biochem, 2007; 39: 1570-1579. el Fantroussi, S.; Verschuere, L.; Verstraete, W. y Top, E. Effect of phenylurea herbicides on soil microbial communities estimated by analysis of 16S rRNA gene fingerprints and community-level physiological profiles. Appl Environ Microbiol, 1999; 65: 982-988. Ellis, R.; Morgan, P.; Weightman, A. y Fry, J. Cultivation-dependent and -independent approaches for determining bacterial diversity in heavy-metal-contaminated soil. Appli Environ Microbiol, 2003; 69: 3223-3230.

Eisenhauer, N.; Kliera, M.; Partscha, S.; Sabaisa, A; Scherberb, C.; Weisserc, W. y Scheu, S. No interactive effects of pesticides and plant diversity on soil microbial biomass and respiration. Appl Soil Ecol, 2009; 42:31-36.

Environmental Protection Agency (EPA). Method 9045C: Soil and waste pH. Revision No.3, 1995. p. 1-5. Fang, H.; Yu,Y.; Wang, X.; Chu, X. y Yang, X. Persistence of the herbicide butachlor in soil after repeated applications and its effects on soil microbial functional diversity. J Environ Sci Health B [Abstract], 2009; 44: 123-9. Federacion Nacional de Cafeteros de Colombia. El café de Colombia. Manejo agronómico del cultivo. Disponible en línea en: <<http://www.cafedecolombia.com/caficultura/manejoarvenses.html>>, Agosto 20 de 2009. Felske, A.; Wolterink, A.; Van Lis, R.; De Vos, W. y Akkermans, A. Response of a soil bacterial community to grassland succession as monitored by 16S rRNA levels of the predominant ribotypes. Appl Environ Microb, 2000; 66: 3998-4003.

Fierer, N. y Jackson, R. The biodiversity and biogeography of soil bacterial communities. PNAS, 2006; 103: 626-631.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T4B-4VP12FY-3&_user=10&_coverDate=05%2F31%2F2009&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1189248934&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=6f08a1294472d98c14685535417a622e#aff1





http://www.cafedecolombia.com/caficultura/manejoarvenses.html

112

Fischer, S. y Lerman, L. DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: correspondence with melting theory. PNAS, 1983; 80: 1579-1583 Freitag, T.; Chang, L.; Clegg, C. y Prosser, J. Influence of inorganic nitrogen management regime on

the diversity of nitrite-oxidizing bacteria in agricultural grassland soils. Appl Environ Microbiol, 2005; 71: 8323-8324.

Furlong, M.; Singleton, D.; Coleman, D.; Whitman, W. Molecular and culture-based analyses of prokaryotic communities from an agricultural soil and the burrows and casts of the earthworm Lumbricus rubellus. Appl. Environ. Microbiol, 2002; 68: 1265-1279. Gallego J.; Loredo, J.; Llamas, J.; Vásquez, F. y Sánchez, J. Bioremediation of diesel-contaminated soils: Evaluation of potential in situ techniques by study of bacterial degradation. Biodeg[Abstract], 2001; 12: 325-335 Gamo, M. y Shoji, T. A method of profiling microbial communities based on a most-probable-number assay that uses BIOLOG plates and multiple sole carbon sources. Appl. Environ. Microbiol, 1999; 65: 4419-4424. García, E.; Garzon, L. y Roldán, F. Evaluación de la biodegradación de hidrocarburos utilizando respirometria durante la bioestimulación con nutrientes en suelos contaminados. En: Colombia. 2007. Evento: Sexto Simposio Latinoamericano de Biodegradación y Biodeterioro, 6-LABS Ponencia: Libro: Memorias Sexto Simposio Latinoamericano de Biodegradación y Biodeterioro, 6-LABS.

Garveva, P.; van Veen J., y van Elsas, Predominant Bacillus spp. in Agricultural Soil under Different Management Regimes Detected via PCR-DGGE. J Microbial Ecol, 2003; 45:302-316. Gaston, K. Species richness: measure and measurement. En: Biodiversity: A biology of numbers and difference. Blackwell Science, Osney Mead: Oxford, 1996. 396p. Gelsomino, A.; Keijzer-Wolters, A.; Cacco, G. ; Van Elsas, D. Assessment of bacterial community structure in soil by polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis. J Microb Methods, 1999; 38: 1-5. Gerksic, S., Vrecko, D. y Hvala, N. Improving oxygen concentration control in activated sludge process with estimation of respiration and scheduling control. Water Sci Technol [Abstract], 2006; 53:263-272. Girvan, M.; Bullimore, J.; Pretty, J. y Osborn, M. Responses of Active Bacterial and Fungal Communities in Soils under Winter Wheat to Different Fertilizer and Pesticide Regimens. Appl Environ Microbiol, 2004; 70: 2692-2701. Girvan, M.; Bullimore, J.; Pretty, J. y Osborn, M. y Ball, J. Soil Type Is the Primary Determinant of the Composition of the Total and Active Bacterial Communities in Arable Soils. Appl Environ Microbiol. 2003; 69: 1800–1809.

113

Gigliotti, C. y Allievi, L. Differential effects of the herbicides bensulfuron and cinosulfuron on soil microorganisms. J Environ Sci Health B [Abstract], 2001; 36: 775-82.

Govaerts B.; Mezzalamab, M.; Sayreb, .; Crossab, J.; Nicolb, J. y Deckers, J. Long-term consequences of tillage, residue management, and crop rotation on selected soil micro-flora groups in the subtropical highlands. Appl Soil Ecol, 2008; 38: 197-210.

Green, S. A Guide to Denaturing Gradient Gel Electroforesis. Versión 2 – Updated Nov 28 2005. 32p. Disponible en línea: <<http://ddgehelp.blogspot.com/2005/11/updated-dgge-guide.html>>. Abril 6, 2007. Griffiths, B., Bonkouwski, H., Roy, J., Ritz, K. Functional stability, substrate utilisation and biological indicators of soils following environmental impacts. Appl Soil Ecol, 2001; 16: 49-61. Grundmann, L. y Gourbiere, F. A micro-sampling approach to improve the inventory of bacterial diversity in soil. Appl Soil Ecol, 1999; 13: 123-126. Grüter, D.; Schmid, B. y Brandl, H. Influence of plant diversity and elevated atmospheric carbon dioxide levels on belowground bacterial diversity. BMC Microbiol, 2006; 6: 1-8. Guisande, C., et al. Tratamiento de datos. Ediciones Díaz Santos, 2006. p. 207-274. Hackl, E.; Zechmeister-Boltenstern,S.; Bodrossy,L. y Sessitsch, A. Comparison of Diversities and Compositions of Bacterial Populations Inhabiting Natural Forest Soils. Appl Envir Microbiol, 2004; 70: 5057-5065.

Haines, J.; Wrenn, B.; Holder, E.; Strohmeier, K.; Herrington, R. y Venosa, A. Measurement of hydrocarbon-degrading microbial populations by a 96-well plate most-probable-number procedure. J Ind Microbiol, 1996; 16: 36-41. Hammer, Ø., Harper, D. y Ryan, P. PAST: Paleontological statistical software package for education and data analysis. Paleontologia Electronica, 2001; 4: 9.

Haney R.; Senseman S. y Hons F. Effect of roundup ultra on microbial activity and biomass from selected soils. J Environ Qual [Abstract]. 2002; 31(3):730-735.

Hatzinger, P.; Palmerb, P.; Smithc, R.; Peñarrietac, C. y Yoshinari, T. Applicability of tetrazolium salts for the measurement of respiratory activity and viability of groundwater bacteria. J Microbiol Methods, 2003; 52: 47-58.

Hill, C.; Walsh, K.; Harris, J. y Moffett, B. Using ecological diversity measures with bacterial communities. FEMS Microbiology Ecology, 2003; 43: 1-11.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T4B-4H99JD0-2&_user=10&_coverDate=07%2F31%2F2006&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1189266067&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=e1acc18eb99c47afdf2b75d9f611183e#aff2




http://ddgehelp.blogspot.com/2005/11/updated-dgge-guide.html

http://www.biomedcentral.com/1471-2180/6/68

http://www.biomedcentral.com/1471-2180/6/68

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T30-46MK9RY-3&_user=10&_coverDate=01%2F31%2F2003&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1189273720&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=44955e41c76fb698f22094a97a124e81#aff2



114

Höflich, G.; Tauschke, M.; Kühn, G. y Rogasik, J. Influence of agricultural crops and fertilization on microbial activity and microorganisms in the rhizosphere. J. Agron Crop Sci, 2000; 184: 49-54. Hugues, J.; Hellmann, J.; Ricketts, T. Y Bohannan, B. Counting the uncountable: statistical approaches to estimating microbial diversity. Appl Environ Microbiol, 2001; 67: 4399-4406. Janssen, P. Identifying the dominant soil bacterial taxa in libraries of 16S rRNA and 16S rRNA Genes. Appl Environ Microbiol, 2006; 72: 1719-1728. Jiménez, M. Diversidad bacteriana en la Cuenca alta del rio Bogotá. Análisis molecular de las comunidades obtenidas mediante técnicas dependientes de cultivo. Bogotá, D.C. Tesis de Maestría (Microbiología Interfacultades), Universidad Nacional de Colombia, 2004, 100p.

Kirk, J.; Beaudettea, L.; Hartb, M.; Moutoglisc, P.; Klironomosb, J.; Leea, H. yTrevors, J.. Methods of studying soil microbial diversity. J Microbiol Methods, 2004; 58: 169-188.

Kohler, F.; Hamelin, J. ; Gillet, F. ; Gobat, J. M. ; Buttler, A. Soil Microbial Community Changes in Wooded Mountain Pastures due to Simulated Effects of Cattle Grazing. Plat & Soil, 2005; 278:327-340. Kolattukudy, P. Plant waxes. Lipids, 1970; 5: 259-275. Kubartová, A.; Moukoumi, J.; Béguiristain, T.; Ranger, J y Berthelin, J. Microbial diversity during cellulose decomposition in different forest stands: I. Microbial communities and environmental conditions. Microb Ecol, 2007; 54: 393-405.

Kwapisz, E.; Wszelakaa, J.; Marchuta, O. y Bielecki, S. The effect of nitrate and ammonium ions on kinetics of diesel oil degradation by Gordonia alkanivorans S7. Int Biodet Biodeg, 2008; 61: 214-222.

Laboratorio de Ecología de Suelos y Hongos Tropicales (LESYHT). Protocolo para la determinación

de materia orgánica por medio del método de pérdidas por ignición. Bogotá D.C.: Pontificia

Universidad Javeriana, 2009. 2p.

Laboratorio de Ecología de Suelos y Hongos Tropicales (LESYHT). Protocolo para la determinación

de textura en muestras de suelo por el método de Bouyoucos. Bogotá D.C.: Pontificia Universidad

Javeriana, 2009. 4p.

Laboratorio de Ecología de Suelos y Hongos Tropicales (LESYHT). Protocolo para la medición de la distribución de agregados del suelo, Documento No. F-Q 0001. Bogotá D.C.: Pontificia Universidad Javeriana, 2009. 7p. Ladygina, N.; Dedyukhina, E. y Vainshtein, M. A review on microbial synthesis of hydrocarbons. Process Biochem, 2006; 41: 1001-1014.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T30-4CMMTSY-1&_user=10&_coverDate=08%2F31%2F2004&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1189277177&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=fcd98266e1d1e83b848a8c0f2bcd57ab#aff1





http://www.springerlink.com/content/?Author=F.+Kohler

http://infoscience.epfl.ch/search?f=author&p=Hamelin%2C%20J.&ln=en

http://infoscience.epfl.ch/search?f=author&p=Gillet%2C%20F.&ln=en

http://infoscience.epfl.ch/search?f=author&p=Gobat%2C%20J.%20M.&ln=en

http://infoscience.epfl.ch/search?f=author&p=Buttler%2C%20A.&ln=en

http://www.springerlink.com/content/73858k57468r0p21/?p=b2bdb47208ff4bb085979b7be2f65cd1&pi=28

http://www.springerlink.com/content/73858k57468r0p21/?p=b2bdb47208ff4bb085979b7be2f65cd1&pi=28

http://www.springerlink.com/content/rt4261448857/?p=4e796e6ab1a54456944f18f63df58a72&pi=0

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VG6-4PXNHD6-1&_user=10&_coverDate=04%2F30%2F2008&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1189281061&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=b1178979b62d0ba7aaaeda804ae83ae5#implicit0

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VG6-4PXNHD6-1&_user=10&_coverDate=04%2F30%2F2008&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1189281061&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=b1178979b62d0ba7aaaeda804ae83ae5#implicit0

http://www.sciencedirect.com/science/journal/13595113

115

Leahy, J., y Colwell, R., 1990. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment. Microbiol Rev, 54:305-315. Lejón, D.; Sebastia, J. ; Lamy, I.; Chaussod, R.; Ranjard, L. Relationships between soil organic status and microbial community density and genetic structure in two agricultural soils submitted to various types of organic management. Microb Ecol, 2007; 53: 650-63. Leys, N.; Ryngaert, A.; Bastiaens,L.; Verstraete, W.; Top, E.; y Springael, D. Occurrence and Phylogenetic Diversity of Sphingomonas Strains in Soils Contaminated with Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. Appl Environ Microbiol, 2004; 70: 1944- 1955. Liste, H. y Felgentreu, D. Crop growth, culturable bacteria, and degradation of petrol hydrocarbons (PHCs) in a long-term contaminated field soil. Appl Soil Ecol, 2006; 31: 43-52. Liu, W. y Stahl D. Molecular Approaches for measurement of density, diversity, and phylogeny. En: Hurst, C. J., Knudsen, G. R., McInerney, M. J., Stetzenbach, L. D., and Walter, M. V. (Eds.) Manual of Environmental Microbiology. Washington, D.C: ASM Press, 2001. p. 114-134. Lupwaji, N.; Arshad, M.; Rice, W.; Clayton, G. Bacterial diversity in water-stable aggregates of soils under conventional and zero tillage management. Appl Soil Ecol, 2001; 16: 251-261. Macur, R.; Wheeler, J. y Burr, M. Impacts of 2,4-D application on soil microbial community structure and on populations associated with 2,4-D degradation. Microbiol Res, 2007; 162: 37-45. Mardigan, M.; Martinko, J. y Parker, J., 1997. Biology of microorganisms. Octava edición, Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ.

Mailaa, M.; Randimaa, P.; Surridgeb, K.; Drønenc, K. y Cloete, T. Evaluation of microbial diversity of different soil layers at a contaminated diesel site. Int Biodet Biodeg, 2005; 55: 39-44.

Magurran, A. Ecological diversity and its measurement. Princeton, New Jersey: Princeton University Press, 1988.200p. Maldonado, C. Evaluación dela atenuación natural de hidrocarburos del petróleo utilizados como supresores de polvo en carreteras sin pavimentar. Bogotá, D.C., 2003, 102p. Tesis de pregrado (Bióloga y microbióloga). Universidad de los Andes. Margesin, R., Hämmerle, M. y Tscherko, D. Microbial activity and community composition during bioremediation of diesel-oil-contaminated soil: effects of hydrocarbon concentration, fertilizers, and incubation time. Microb Ecol, 2007; 53:259-69. Margesin, R. y Schinner, F. Bioremediation (natural attenuation and biostimulation) of diesel-oil-contaminated soil in an alpine glacier skiing area. Appl Environ Microbiol, 2001; 67: 3127-3133. McCaig, A.; Glover A, y Prossier, J. Numerical analysis of grassland bacterial community structure under different land management regimens by using 16S ribosomal DNA sequence data and

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VG6-4DTKXXY-1&_user=10&_coverDate=01%2F01%2F2005&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1189287084&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=c0de3a39c6bdff4302a56dd1760fddbc#aff1



116

denaturing gradient gel electrophoresis banding patterns Appl Environ Microbiol, 2001; 67: 4554-4559. McCluskey, C.; Quinn, J. y McGrath, J. An evaluation of three new-generation tetrazolium salts for the measurement of respiratory activity in activated sludge microorganisms. Microb Ecol, 2005; 49: 379-387. McCune B. y Mefford M. Multivariate analysis of ecological data version 3.17, MjM software, Gleneden Beach, Oregon, U.S.A, 1997.

Menezes, F.; de Oliveira, F.; Okekeb, B. yFrankenberger, W. Diversity of biosurfactant producing microorganisms isolated from soils contaminated with diesel oil. Microbiol Research, 2005; 160: 249-255.

Meier, C.; Wehrli, B. y van der Meer, J. Seasonal Fluctuations of Bacterial Community Diversity in Agricultural Soil and Experimental Validation by Laboratory Disturbance Experiments. Microb Ecol, 2008; 56:210-222. Meriles, J.; Vargas, S.; Conforto, C.; Figoni, G.; Lovera, E.; March, G; Guzman, C. Soil microbial communities under different soybean cropping systems: characterization of microbial population dynamics, soil microbial activity, microbial biomass, and fatty acid profiles. Soil and Tillage Research, 2009; 103: 271-281.

Milcic-Terzica, J.; Lopez-Vidalb, Y.; Vrvicc, M. y Saval, S. Detection of catabolic genes in indigenous microbial consortia isolated from a diesel-contaminated soil. Bioresour Technol, 2001; 78:47-54.

Mohanty, G y Mukherji, S. Biodegradation rate of diesel range n-alkanes by bacterial cultures Exiguobacterium aurantiacum and Burkholderia cepacia. Int Biodet Biodeg, 2008; 61:240-250. Mummey, D.; Holben, W.; Six, J.; Stahl, P. Spatial stratification of soil bacterial populations in aggregates of diverse soils. Microb Ecol, 2005; 51: 404-411. Murase, J.; Noll, M. y Frenzel, P. Impact of protists on the activity and structure of the bacterial community in a rice field soil. Appl Envionr Microbiol, 2006; 72: 5436-5444. Muyzer, G.; Waal, E.; Uitterlinden, A. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol, 1993; 59: 695-700. Muyzer, G. DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems. Curr. Opin Microbiol, 1999; 2: 317-322. Nakatsu, C; Torsvik, V y Øvreås, L. Soil community analysis using DGGE of 16S rDNA polymerase chain reaction products. Soil Sci Soc Am J, 2000; 64: 1382-1388.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B7GJ8-4G992MH-1&_user=10&_coverDate=07%2F06%2F2005&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1189292856&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=247c503ebd0c1409da9ab75369dc3c16#aff2

http://www.springerlink.com/content/c37258g0337611k1/?p=7b6947a642c24005a259c07c0ac57ab1&pi=1

http://www.springerlink.com/content/c37258g0337611k1/?p=7b6947a642c24005a259c07c0ac57ab1&pi=1

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%235162%232009%23998969997%231036160%23FLA%23&_cdi=5162&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=72bf8ab5e544bd7cd35e97f5efb2b2c6




http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VG6-4PYYG2M-1&_user=10&_coverDate=04%2F30%2F2008&_rdoc=6&_fmt=high&_orig=browse&_srch=doc-info(%23toc%236030%232008%23999389996%23683422%23FLA%23display%23Volume)&_cdi=6030&_sort=d&_docanchor=&_ct=10&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=3a82d4574b4db46e93daed9109b64e77

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VG6-4PYYG2M-1&_user=10&_coverDate=04%2F30%2F2008&_rdoc=6&_fmt=high&_orig=browse&_srch=doc-info(%23toc%236030%232008%23999389996%23683422%23FLA%23display%23Volume)&_cdi=6030&_sort=d&_docanchor=&_ct=10&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=3a82d4574b4db46e93daed9109b64e77

117

Nagy, M.; Perez, A. y García-Pichel, F. The prokaryotic diversity of biological soil crusts in the Sonoran Desert (Organ Pipe Cactus National Monument, AZ). FEMS Microbiol Ecol, 2005; 54: 233-45. National Center for Biotechnology Information (NCBI). BLAST. Disponible en línea en: << http://blast.ncbi.nlm.nih.gov>>. (citado Septiembre 22, 2009). Neufeld, J. y Mohn, W. Unexpectedly High Bacterial Diversity in Arctic Tundra Relative to Boreal Forest Soils, Revealed by Serial Analysis of Ribosomal Sequence Tags. Appl Environ Microbiol, 2005; 71: 5710-5718. Nicholson, P. y Hirsch, P. The effects of pesticides on the diversity of culturable soil bacteria. J Appl Microbiol, 1998; 84: 551-558.

Nourou, S.; Masseb, D.; Ndourc, N. y Chotte, JL. Does cropping modify the decomposition function and the diversity of the soil microbial community of tropical fallow soil?. Appl Soil Ecol, 2006; 31:211-9.

Nüsslein, K. y Tiedje, J. Soil Bacterial Community Shift Correlated with Change from Forest to Pasture Vegetation in a Tropical Soil. Appl Environ Microbiol, 1999; 65: 3622-3626. Olarte, L. et al. Métodos analíticos del laboratorio de suelos. 4 ed. Bogotá: Instituto Geográfico Agustín Codazzi (IGAC), 1979. 665p. Orwin, K. y Wardle, D. Plant species composition effects on belowground properties and the resistance and resilience of the soil microflora to a drying disturbance. Plant and Soil, 2005; 278: 205-221. Øvreas, L. y Torsvik, V. Microbial diversity and community structure in two different Agricultural soil communities. Microbial Ecol, 1998; 36: 303-315. Palmroth, M.; Münster, U.; Pichtel, J.; Puhakka,J. Metabolic responses of microbiota to diesel fuel addition in vegetated soil. Biodegradation, 2005; 16: 91-101. Parques Nacionales de Colombia. Santuario de fauna y florea Otun-Quimbaya. Disponible en línea en: <<http://www.parquesnacionales.gov.co/areas/lasareas/otun/otunintro.htm>>. Abril 10 de 2007. Paz, I., Sánchez de, P., y Sadeghian, S. Relación entre dos sistemas de sombrío de café y algunas propiedades del suelo en la meseta de Popayán, Colombia. Acta Agrono, 2006; 55: 1-6. Petti, C.; Polage, C. y Schreckenberger, P. The Role of 16S rRNA Gene sequencing in identification of microorganisms misidentified by conventional methods. J Clin Microbiol, 2005; 43: 6123-6125.

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T4B-4GNCXSJ-1&_user=10&_coverDate=03%2F31%2F2006&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1189333584&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=c0ba986bac5211a5ba8e3a06de1581c7#aff2

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T4B-4GNCXSJ-1&_user=10&_coverDate=03%2F31%2F2006&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1189333584&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=c0ba986bac5211a5ba8e3a06de1581c7#aff3

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T4B-4GNCXSJ-1&_user=10&_coverDate=03%2F31%2F2006&_rdoc=5&_fmt=high&_orig=browse&_srch=doc-info(%23toc%234970%232006%23999689996%23615338%23FLA%23display%23Volume)&_cdi=4970&_sort=d&_docanchor=&_ct=12&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=651bd12717791e06b131dbf324675201

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T4B-4GNCXSJ-1&_user=10&_coverDate=03%2F31%2F2006&_rdoc=5&_fmt=high&_orig=browse&_srch=doc-info(%23toc%234970%232006%23999689996%23615338%23FLA%23display%23Volume)&_cdi=4970&_sort=d&_docanchor=&_ct=12&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=651bd12717791e06b131dbf324675201

http://www.springerlink.com/content/pw4582645n472508/?p=026f4388b46e452f86be16921699f8d1&pi=19

http://www.springerlink.com/content/pw4582645n472508/?p=026f4388b46e452f86be16921699f8d1&pi=19

http://www.springerlink.com/content/j22k2l67372w7hj3/?p=30611ff7c9d84b909b25995477f900d1&pi=8

http://www.springerlink.com/content/j22k2l67372w7hj3/?p=30611ff7c9d84b909b25995477f900d1&pi=8

http://www.parquesnacionales.gov.co/areas/lasareas/otun/otunintro.htm

118

Phllips, C.; Harris, D.; Dollhopf, S.; Gross, K.; Prosser, J. y Paul, E. Effects of agronomic treatments on structure and function of ammonia-oxidizing communities. Appl Environ Microbiol, 2000; 66: 5410-5418. Prado, A y Airoldi, C. The effect of the herbicide diuron on soil microbial activity. Pest Manag Sci [Abstract], 2001; 57: 640-644. Rainey, F. Extensive Diversity of Ionizing-Radiation-Resistant Bacteria Recovered from Sonoran Desert Soil and Description of Nine New Species of the Genus Deinococcus Obtained from a Single Soil Sample. Appl Envir Microbiol, 2005; 71: 5225-5235. Ranjard, L.; Poly, F. y Nazaret, S. Monitoring complex bacterial communities using culture independent molecular techniques: application to soil environment. Res Microbiol, 2000; 151: 167-177. Ratcliff, A., Busse, M. y Shestak, C., Changes in microbial community structure following herbicide (glyphosate) additions to forest soils. Appl Soil Ecol 2006; 34: 114-24. Raup, D. y Crick, R. Measurement of faunal similarity in paleontology. J Paleontol, 1979; 53:1213-1227. Ribosomal database project. Seqmatch. Disponible en línea en: << http://rdp.cme.msu.edu/seqmatch/seqmatch_intro.jsp>>. (citado Septiembre 22, 2009) Reardon, K.; Mosteller, D.; Rogers, J.; DuTeau, N. y Kim, KH. Biodegradation kinetics of aromatic hydrocarbon mixtures by pure and mixed bacterial cultures. Environ Health Persp, 2002; 110: 1005-1011. Richard, J. y Vogel , T. Characterization of a soil bacterial consortium capable of degrading diesel fuel. Int Biodet Biodeg, 1999; 44: 93-100. Rodríguez, D. Diseño de la estructura organizacional del CIEBREG. Disponible en línea en: <<http://ciebreg.utp.edu.co/Plone/Ciebreg/estrctura/ >>. Abril 10 2007.

Rodríguez, J. La Ecorregión del Eje Cafetero y un desarrollo sustentado en bienes y servicios ambientales. p.15-20. En: Rodríguez, J., et al. Valoración de la Biodiversidad en la Ecorregión del Eje cafetero. CIEBREG. Pereira, Colombia. p.15-20 Roehm, N.; Rodgers, G.; Hatfield, S. y Glasebrook ,A. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT [Abstract]. J. Immunol. Methods, 1991; 142: 257-65. Roldán, F., et al. Evaluación del efecto de diferentes usos del suelo sobre grupos funcionales microbianos edáficos en la Ecorregión cafetera colombiana. En: Rodríguez, J., et al. Valoración de la Biodiversidad en la Ecorregión del Eje cafetero. CIEBREG. Pereira, Colombia. p.209-221

http://rdp.cme.msu.edu/seqmatch/seqmatch_intro.jsp

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VG6-3Y163XJ-7&_user=10&_coverDate=10%2F31%2F1999&_rdoc=7&_fmt=high&_orig=browse&_srch=doc-info(%23toc%236030%231999%23999559997%23145447%23FLA%23display%23Volume)&_cdi=6030&_sort=d&_docanchor=&_ct=13&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=59a8a4669ed43ad8f49dd4327ed1daab

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VG6-3Y163XJ-7&_user=10&_coverDate=10%2F31%2F1999&_rdoc=7&_fmt=high&_orig=browse&_srch=doc-info(%23toc%236030%231999%23999559997%23145447%23FLA%23display%23Volume)&_cdi=6030&_sort=d&_docanchor=&_ct=13&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=59a8a4669ed43ad8f49dd4327ed1daab

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hatfield%20SM%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Glasebrook%20AL%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

119

Roling, W.; Milner, M.; Jones, M.; Lee, K.; Daniel, F.; Swannell, R. y Head, I. Robust hydrocarbon degradation and dynamics of bacterial communities during nutrient-enhanced oil spill bioremediation. Appl Environ Microbiol, 2002; 68: 5537-5548. Rooney, D., Kennedy, N.; Deering, L.; Gleeson, D. y Clipson, N. Effect of sheep urine deposition on the bacterial community structure in an acidic upland grassland soil. Appl Environ Microbiol, 2006; 72: 7231-37. Rosenberg, E. Hydrocarbon-oxydazing organisms. Prokaryotes, 2006; 2: 564-577. Rossello-Mora, R. y Amann, R. The species concept for prokaryotes. FEMS Microbiol Reviews, 2001; 25; 39-67.

Roslev, P. y King, G. Application of a tetrazolium salt with a water-solublefFormazán as an indicator of viability in respiring bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 1993; 59: 2891 - 2896. Salles, J.F., van Elsas J.D., van Veen, J.A. Effect of agricultural management regime on Burkholderia community structure in soil. Microbiol Ecol, 2006; 52 : 267-279. Sadler, R. y Connell, D. 2003. Analytical methods for the determination of total petroleum hydrocarbons in soil. National Environment Protection Council Service Corporation: Adelaida, Australia. 20p. Sambrook, J, et al. Molecular cloning: a laboratory manual. 3 ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2000. 1320p.

Sánchez, M., Vásquez y González, B. A previously unexposed forest soil microbial community degrades high levels of the pollutant 2,4,6-trichlorophenol. Appl Environ Microbiol, 2004; 70: 7567-7570.

Saville, W. Does soil biodiversity depend upon metabiotic activity and influences?. Appl Soil Ecol, 1999; 13: 151-158. Schafer, H. y Muyzer, G. Denaturing gradient gel electrophoresis in marine microbial ecology. En: Methods in Microbiology. Academic press Ltd, 2000. 30 v.

Shabir, G.; Afzala, M.; Anwarb, F.; Tahseena, R. y Mahmood Khalid, Z. Biodegradation of kerosene in soil by a mixed bacterial culture under different nutrient conditions. Int Biodet Biodeg, 2008; 61: 161-166.

Schinner, F.; Margesin, R.; Whyte, L.; Greer, C.; Labbé, D. Characterization of hydrocarbon-degrading microbial populations in contaminated and pristine alpine soils. Appl Environ Microbiol, 2003; 69: 3085-3092. Schloter, M; Dilly, O y Munch, J. Indicators for evaluating soil quality. Agricult Ecosyst & Environ, 2003, 98: 255-262.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VG6-4PCXXGG-1&_user=10&_coverDate=03%2F31%2F2008&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1189350641&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=95ecce0a0839922afcbf5da207638736#aff1



http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VG6-4PCXXGG-1&_user=10&_coverDate=03%2F31%2F2008&_rdoc=6&_fmt=high&_orig=browse&_srch=doc-info(%23toc%236030%232008%23999389997%23680156%23FLA%23display%23Volume)&_cdi=6030&_sort=d&_docanchor=&_ct=12&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=af987141c3a218b448c3ddc80f007a19

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6VG6-4PCXXGG-1&_user=10&_coverDate=03%2F31%2F2008&_rdoc=6&_fmt=high&_orig=browse&_srch=doc-info(%23toc%236030%232008%23999389997%23680156%23FLA%23display%23Volume)&_cdi=6030&_sort=d&_docanchor=&_ct=12&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=af987141c3a218b448c3ddc80f007a19

120

Siegel, S. y Castellan, J. Estadistica no paramétrica. Aplicada las cuencias de la conducta. 4 ed. México: Editorial Trillan, 1995. 437p. Smit, E.; Leeflang, P.; Gommans, S.; van den Broek, J.; van Mil, S. y Wernars. K. Diversity and seasonal fluctuations of the dominant members of the bacterial soil community in a wheat field as determined by cultivation and molecular methods. Appl Environ Microbiol, 2001; 67: 2284-2291. Smith, A.; Coen, G.; Moyer, J. y Duun, R. Landscape segmentation modeling in agricultural fields: Correlating soil pH to herbicide persistence. J Soil Water Conser [Abstract], 2006; 61: 362-369. Song, C.; Uchida, U.; Ono, S.; Shimasaki, C.; Inoue, M. Estimation of the number of polyhydroxyalkanoate (PHA)-degraders in soil and isolation of degraders based on the method of most probable number (MPN) using PHA-film. Biosci Biotechnol Biochem [Abstract], 2001; 65: 1214-1217. Stach, J. y Burns, R. Enrichment versus biofilm culture: a functional and phylogenetic comparison of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading microbial communities. Environ Microbiol, 2002; 4: 169-182. Stanley-Samuelson, D. y Nelson, D. Insect Lipids: Chemistry, Biochemistry, and Biology. Lincoln: University of Nebraska Press, 1993. 476p. Stephan A.; Meyer, A. y Achmid, B. Plant diversity affects culturable soil bacteria in experimental grassland communities. J Ecol, 2000; 88: 988-98. Stirling, G. y Wilsey, B. Empirical Relationships between Species Richness, Evenness, and Proporcional Diversity. American Naturalist, 2001; 158: 286-299. Sun, H.; Deng, S. y Raun, W. Bacterial Community Structure and Diversity in a Century-Old Manure-Treated Agroecosystem. Appl Environ Microbiol, 2004; 70: 5868–5874. Suzuki, C.; Kunito, T.; Aono, T.; Liu, C-T.; Oyaizu, H. Microbial indices of soil fertility. J Appl Microb, 2005; 98: 1062-1074. Schwieger, F. y Tebbe, C. Effect of field Inoculation with Sinorhizobium meliloti L33 on the composition of bacterial communities in rhizospheres of a target plant (Medicago sativa) and a non-target plant (Chenopodium album) linking of 16S rRNA gene-Based single-strand conformation polymorphism community profiles to the diversity of cultivated bacteria. Appl Environ Microbiol, 2000; 66: 3556-3565. Sylvia, D. Principles and applications of soil microbiology. 2a ed. Upper Saddle River: Pearson Prentice Hall, 2005. 640p. Technelysium. Chromas v.2.33 for Windows. Disponible en línea en: <http://technelysium.com.au/chromas.html>. Technelysium Pty Ltd. (citado Septiembre 22, 2009).

http://www.journalofecology.org/details/journalArticle/168300/Plant_diversity_affects_culturable_soil_bacteria_in_experimental_grassland_commu.html

http://www.journalofecology.org/details/journalArticle/168300/Plant_diversity_affects_culturable_soil_bacteria_in_experimental_grassland_commu.html

http://technelysium.com.au/chromas.html

121

Ter Braak Cajo J. y Smilauer P. 1997-2003. Canoco for Windows versión 4.51; Biometris-Plant Research International, Wageningen, The Netherlands. Wu T.; Chellemi, D.; Graham, J.; Martin, K. y Rosskopf, E. Comparison of soil bacterial communities under diverse agricultural land management and crop production practices. Microbial Ecol, 2008; 55: 293-310. Tolli, J. y King, G. Diversity and structure of bacterial chemolithotrophic communities in pine forest and agroecosystem soils. Appl Environ Microbiol, 2005; 71: 8411–84. Torsvik, V.; Salte, K.; Sørheim, R. y Goksøyr, J. Comparison of phenotypic diversity and DNA heterogeneity in a population of soil bacteria. Appl Envir Microbiol, 1990; 56: 776-781. Universidad de Waterloo. Biodegradation Microbiology: Lignin structure. Disponible en línea en: 2009. http://wvlc.uwaterloo.ca/biology447/modules/module5/5_main.htm. Septiembre 16, 2009. Vallejo, V. y Rodán, F. Evaluación de la bioestimulación (adición de nutrientes) en la biodegradación de TPHs en un suelo contaminado con petróleo. Bogotá D.C.: 2004. Tesis de Maestria (Microbiología). Pontificia Universidad Javeriana. Vallejo, V. Comparación de dos sales de tetrazolium para la estimación de la densidad de microrganismos degradadores de hidrocarburos (HC’s) en la Ecorregión cafetera-Colombia. En: Sexto Simposio Latinoamericano de Biodegradación y Biodeterioro; Bogotá D.C.: Mayo, 2007.

van Diepeningen, A.; van Diepeningena,A.; de Vosa, O.; Korthalsb, G. y van Bruggen, A. Effects of organic versus conventional management on chemical and biological parameters in agricultural soils. Appl Soil Ecol, 2006; 31: 120-135.

van Hamme, J.; Singh, A. y Ward, O. Recent advances in petroleum microbiology. Microbiol Mol Biol Rev, 2003; 67:503–549. Vásquez, S.; Nogales, B.; Ruberto, L.; Hernández, E.; Christie-Oleza, J.; Lo Balbo, A.; Bosch, R.; Lalucat, J.; Mac Cormack, W. Bacterial community dynamics during bioremediation of diesel oil-contaminated Antarctic soil. Microbial Ecol, 2009; 57: 598-610. Velandia, D., Tinción con plata para gels de poliacrilamida. Procedimientos del laboratorio de epidemiología molecular. Instituto Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, 2007. Volverás, B.; Amézquita, E. y Tafur, H. Efecto del tiempo de uso en las condiciones físicas del suelo andino en el Departamento de Nariño. Acta Agron, 2007; 56: 29-36.

von Wintzingerode, F.; Göbel, U. y Stackebrandt, E. Determination of microbial diversity in environmental samples: pitfalls of PCR-based rRNA análisis. FEMS Microbiol Rev, 1997; 21: 213-229.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chellemi%20DO%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Graham%20JH%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Graham%20JH%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rosskopf%20EN%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22S%C3%B8rheim%20R%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Goks%C3%B8yr%20J%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://wvlc.uwaterloo.ca/biology447/modules/module5/5_main.htm.%20Septiembre%2016

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T4B-4G05M81-1&_user=10&_coverDate=01%2F31%2F2006&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1189354977&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=72c29a3dedf2e6149bb84b552724ba1e#aff1



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nogales%20B%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ruberto%20L%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hern%C3%A1ndez%20E%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Christie-Oleza%20J%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lo%20Balbo%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bosch%20R%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bosch%20R%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lalucat%20J%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mac%20Cormack%20W%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22G%C3%B6bel%20UB%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stackebrandt%20E%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstract

122

Wertz, S.; Degrange, V.; Prosser, J.; Poly, F.; Commeaux, C.; Freitag, T.; Guillaumaud, N. y Le Roux, X. Maintenance of soil functioning following erosion of microbial diversity. Environ Microbiol, 2006; 82: 2162-2169.

Whang, LM.; Liuc, PW.; Maa, CC. y Cheng, SS. Application of biosurfactants, rhamnolipid, and surfactin, for enhanced biodegradation of diesel-contaminated water and soil. J Hazar Mater, 2008; 151: 155-163.

Whitman, W., Coleman, D.; Wiebe, W. Prokaryotes: The unseen majority. PNAS, 1998; 95: 6578-6583. Wongsa, P.; Tanaka, M.; Ueno, A.; Hasanuzzaman, M.; Yumoto, I. y Okuyama, H. Isolation and characterization of novel strains of Pseudomonas aeruginosa and Serratia marcescens possessing high efficiency to degrade gasoline, kerosene, diesel oil, and lubricating oil. Curr Microbiol, 2004; 49: 415-22. Wrenn, B. y Venosa, A. Selective enumeration of aromatic and aliphatic hydrocarbon degrading bacteria by a most-probable-number procedure. Can J Microbiol, 1996; 42: 252-8. Zheng, H.; Ouyang, Z.; Wang, X.; Fang, Z.; Zhao, T. y Miao, H. Effects of forest restoration patterns on soil microbial communities. Ying Yong Sheng Tai Xue Bao, [Abstract].2004; 15: 2019-24. Yao, H., Jiao, X y Wu, F. Effects of continuous cucumber cropping and alternative rotations under protected cultivation on soil microbial community diversity. Plant and soil, 2006; 284: 195-203. Zhenmei, L.; Hang, M.; Na, L.; Tiejuan, S.YangFang, Y. Variation of bacterial community structure in flooded paddy soil contaminated with herbicide quinclorac. J Environ Sci Health B [Abstract], 2006; 41: 821-32.

Zhou, J.; Xia, B.; Treves, D.; Wu, L.; Marsh, T.; O’Neill, R.; Palumbo, A. y Tiedje, J. Spatial and resource factors influencing high microbial diversity in soil. Appl Envionr Microbiol., 2002; 68: 326-334. Zucchi, M.; Angiolini, L.; Borin, S.; Brusetti, L.; Dietrich, N.; Gigliotti, C.; Barbieri, P.; Sorlini, C.; Daffonchio, D. Response of bacterial community during bioremediation of an oil-polluted soil. J Appl Microbiol, 2003; 94: 248-57.

http://hal.archives-ouvertes.fr/index.php?action_todo=search&s_type=advanced&submit=1&search_without_file=YES&f_0=LASTNAME&p_0=is_exactly&f_1=FIRSTNAME&p_1=is_exactly&l_0=and&halsid=8p7n94hcbsm61obvitk19r74c1&v_0=Degrange&v_1=Val%C3%A9rie

http://hal.archives-ouvertes.fr/index.php?action_todo=search&s_type=advanced&submit=1&search_without_file=YES&f_0=LASTNAME&p_0=is_exactly&f_1=FIRSTNAME&p_1=is_exactly&l_0=and&halsid=8p7n94hcbsm61obvitk19r74c1&v_0=I.+Prosser&v_1=James

http://hal.archives-ouvertes.fr/index.php?action_todo=search&s_type=advanced&submit=1&search_without_file=YES&f_0=LASTNAME&p_0=is_exactly&f_1=FIRSTNAME&p_1=is_exactly&l_0=and&halsid=8p7n94hcbsm61obvitk19r74c1&v_0=Poly&v_1=Franck

http://hal.archives-ouvertes.fr/index.php?action_todo=search&s_type=advanced&submit=1&search_without_file=YES&f_0=LASTNAME&p_0=is_exactly&f_1=FIRSTNAME&p_1=is_exactly&l_0=and&halsid=8p7n94hcbsm61obvitk19r74c1&v_0=Commeaux&v_1=Claire

http://hal.archives-ouvertes.fr/index.php?action_todo=search&s_type=advanced&submit=1&search_without_file=YES&f_0=LASTNAME&p_0=is_exactly&f_1=FIRSTNAME&p_1=is_exactly&l_0=and&halsid=8p7n94hcbsm61obvitk19r74c1&v_0=Freitag&v_1=Thomas

http://hal.archives-ouvertes.fr/index.php?action_todo=search&s_type=advanced&submit=1&search_without_file=YES&f_0=LASTNAME&p_0=is_exactly&f_1=FIRSTNAME&p_1=is_exactly&l_0=and&halsid=8p7n94hcbsm61obvitk19r74c1&v_0=Guillaumaud&v_1=Nadine

http://hal.archives-ouvertes.fr/index.php?action_todo=search&s_type=advanced&submit=1&search_without_file=YES&f_0=LASTNAME&p_0=is_exactly&f_1=FIRSTNAME&p_1=is_exactly&l_0=and&halsid=8p7n94hcbsm61obvitk19r74c1&v_0=Le+Roux&v_1=Xavier

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TGF-4NTRT7C-7&_user=10&_coverDate=02%2F28%2F2008&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1189359969&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=cd5f39d1f4d647c6532e6b1ede12d71d#aff3

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TGF-4NTRT7C-7&_user=10&_coverDate=02%2F28%2F2008&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1189359969&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=cd5f39d1f4d647c6532e6b1ede12d71d#aff1

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TGF-4NTRT7C-7&_user=10&_coverDate=02%2F28%2F2008&_rdoc=22&_fmt=high&_orig=browse&_srch=doc-info(%23toc%235253%232008%23998489998%23678845%23FLA%23display%23Volume)&_cdi=5253&_sort=d&_docanchor=&_ct=41&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=e9c58da74f438fc3b1e232601125619f

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TGF-4NTRT7C-7&_user=10&_coverDate=02%2F28%2F2008&_rdoc=22&_fmt=high&_orig=browse&_srch=doc-info(%23toc%235253%232008%23998489998%23678845%23FLA%23display%23Volume)&_cdi=5253&_sort=d&_docanchor=&_ct=41&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=e9c58da74f438fc3b1e232601125619f

http://www.springerlink.com/content/x03451l21174m74g/?p=c3404d9a77034a4fb4a0118466a5ae84&pi=5



http://www.springerlink.com/content/98u1482600071u45/?p=94a4f7b9d9024269b58c8cc91a67b561&pi=16

http://www.springerlink.com/content/98u1482600071u45/?p=94a4f7b9d9024269b58c8cc91a67b561&pi=16

Evaluación de la diversidad de bacterias degradadoras de...

Documents

Transcript of Evaluación de la diversidad de bacterias degradadoras de...