METODE_SEPARACIJE

TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA

• KRUTA STACIONARNA FAZA

• TEKUĆA MOBILNA FAZA

• GEL - FILTRACIJA (MOLEKULSKA MASA)

• KROMATOGRAFIJA NA IONSKIM IZMJENJIVAČIMA (NABOJ)

• BIOSPECIFIČNA KROMATOGRAFIJA (AFINITET ZA POJEDINE LIGANDE)

GEL - FILTRACIJARAZDVAJANJE PREMA VELIČINI MOLEKULE

KRUTA FAZAKUGLICE GELA

TEKUĆA FAZAPUFER SA SMJESOM

PROTEINA

PRINCIP RAZDVAJANJA

KROMATOGRAFSKI SISTEM

PERISTALTIČKAPUMPA

TIKVICA S PUFEROM

KROMATOGRAFSKISTUPAC

UV - DETEKTOR

E 0.123

SAKUPLJAČFRAKCIJA

PISAČ

SVOJSTVA STACIONARNE FAZE

• TREBA OMOGUĆITI RAZDVAJANJE U ŠTO ŠIREM RASPONU MOLEKULSKIH MASA

• TREBA IZDRŽATI ŠTO VEĆI PRITISAK PRILIKOM PUNJENJA STUPCA I PROVOĐENJA RAZDVAJANJA

• TREBA IMATI ZADOVOLJAVAJUĆU KEMIJSKU INERTNOST

• TREBA IMATI ZADOVOLJAVAJUĆU KEMIJSKU STABILNOST

• ZA INDUSTRIJSKU PRIMJENU - TREBA BITI JEFTINA

• KORISTE SE:

– DEKSTRANI

– CELULOZA

– POLIAKRILAMID

– POLISTIRENI

– KOPOLIMERI RAZLIČITIH MATERIJALA

SVOJSTVA MOBILNE FAZE

• TREBA OSIGURATI DOBRU TOPLJIVOST PROTEINA

• TREBA SPRIJEČITI ILI UMANJITI INTERAKCIJE PROTEINA S DRUGIM MOLEKULAMA U OTOPINI (UKLJUČUJUĆI I PROTEIN-PROTEIN INTERAKCIJE)

• TREBA BITI KEMIJSKI INERTNA KAKO NE BI OŠTEĆIVALA STACIONARNU FAZU

• KORISTE SE:

– PUFERI U pH PODRUČJU 2 - 12, ČESTO UZ DODATAK 0.1 - 1.0 M NaCl

– OTOPINE DETERGENATA ZA MEMBRANSKE I TEŠKO TOPLJIVE PROTEINE

• TRITON X-100

• NONIDET P40

• TWEEN 20

• “ZWITTER”-IONSKI DETERGENTI

– 6 - 8 M UREA ILI 4 M GVANIDIN-HIDROKLORID

INTERPRETACIJA REZULTATAk o

l iči

n a p

rote

ina

( A/2

80n

m)

a kt i

v no s

t

volumen eluenta (ml / broj frakcije)

Ve (volumen elucije)V0

kol

ičin

a p

rote

i na

(A/2

8 0n

m)

akti

v no s

t

volumen eluenta (ml / broj frakcije)

Ve (volumen elucije)V0

Ponašanje proteina na stupcuodređeno je njegovimDISTRIBUCIJSKIM KOEFICIJENTOM:

Kd = Ve - V0

Vs

Ve = volumen elucijeV0 = volumen praznog

prostoraVs = volumen unutar

kuglica gelaKd - onaj dio stacionarne fazekroz koji difundira određenamolekulska vrsta (protein)

V0 Vs Vt

Kd = Ve - V0

Vs

teško odreditieksperimentalno

približno:Vs = Vt - V0

Kav = Ve - V0

Vt - V0Kav može imati vrijednosti 0 -1 !- ako je Kav vrijednost manja od 0 - stupac nije u redu i treba ga ponovno “pakirati”- ako je Kav vrijednost veća od 1 - protein ne putuje kroz stupac slobodnom difuzijom nego se zadržava interakcijama sa stacionarnom fazom

103 104 105 1060

0.25

0.50

0.75

1.00

S-200

S-300

S-400

Mm

Kav

PRAVCI RAZDIOBE

103 104 105 1060

0.25

0.50

0.75

1.00

Mm

Kav

GEL-FILTRACIJOMSE MOŽE ODREDITIMOLEKLSKA MASA

PROTEINA !!!

PROTEINI POZNATIH Mm (STANDARDI)

PROTEINNEPOZNATE Mm

FAKTORI KOJI UTJEČU NA RAZDVAJANJE

DIMENZIJE STUPCA

A/2

80nm

Ve

A/2

80nm

Ve

VELIČINA UZORKA

MAX. 3-5% OD VISINESTUPCA

VE

LIČ

INA

FR

AK

CIJA

količina proteina (A/280nm)aktivnostkoličina proteina (A/280nm)aktivnost

FR

AK

CIJE

FR

AK

CIJE

BRZINA PROTOKA:

- VEĆI PROTOK - JAČE ŠIRENJE ZONA- SLABIJE RAZDVAJANJE- KRAĆA KROMATOGRAFIJA

- MANJI PROTOK - MANJE ŠIRENJE ZONA- BOLJE RAZDVAJANJE- DULJA KROMATOGRAFIJA

KROMATOGRAFIJA NA IONSKOM IZMJENJIVAČU

• STACIONARNA FAZA - MATRIKS SLIČAN GELU ZA GEL-FILTRACIJU ALI SUPSTITUIRAN NABIJENIM GRUPAMA

• MOBILNA FAZA - OTOPINE IONA SOLI, ODNOSNO PROTEINA

--

---- - -

--

---- -

-KATIONSKI IZMJENJIVAČ

+

+

+++

+ + +

+

+

+++

+ ++

ANIONSKI IZMJENJIVAČ

FUNKCIONALNE SKUPINE

- O - CH2 - CH2 - NH3+

- O - CH2 - CH2 - NH -CH2 - CH3+

CH2 - CH3

- O - CH2 - CH2 - NH -CH2 - CH3+

CH2 - CH3

CH2 - CH3

AMINOETIL- (AE-)

DIETILAMINOETIL-(DEAE-)

KVATERNI AMINOETIL-(QAE-)

ANIONSKI IZMJENJIVAČI

KATIONSKI IZMJENJIVAČI

- O - CH2 - COO-- O - P O3 H2

-

- CH2 - CH2 - CH2 - S O3-

KARBOKSIMETIL- (CM-)

FOSFO-

SULFOPROPIL- (SP-)

--

---- - -

--

---- -

- ++

+

+

++

++

+

+

++

++

++

+

+

++

+

+

++

+

--

---

--

-

--

---

--

---

---

--

-

VEZANJE PROTEINA

--

---- - -

--

---- -

-

++

++

+

+

++

++

++

+

+

++

+

+

++

+

+ +

+ ELUCIJA POVEĆANJEMIONSKE JAKOSTI

--

---- - -

--

---- -

-

++

++

+

+

++

++

++

+

+

++

+

+

++

+

++

+

+ ++ +

+

+

--

---- - -

--

---- -

- ++

+

+

++

++

+

+

+++

++

++

+

++

--

---- - -

--

---- -

- ++

+

+

STUPAC SPREMAN ZANOVU KROMATOGRAFIJU

--

---- - -

--

---- -

-

++

++

+

+

++

++

++

+

+

++

+

+

++

+

ELUCIJA PROMJENOM pH

--

---- - -

--

---- -

-

++

++

+

+

++

++

++

+

+

++

--

--

-

--

---- - -

--

---- -

-

--

---

-

---

--

--

-

--

--

---- - -

--

---- -

- ++

+

+

REGENERACIJA STUPCA

OSNOVNA SVOJSTVA STACIONARNE FAZE

• JAČINA– OVISI O KONSTANTI DISOCIJACIJE FUNKCIONALNIH SKUPINA

IZMJENJIVAČA• JAKI IZMJENJIVAČI - VELIKA KONSTANTA DISOCIJACIJE

• SLABI IZMJENJIVAČI - MALA KONSTANTA DISOCIJACIJE

• KAPACITET– TEORETSKI KAPACITET

• BROJ EKVIVALENATA NABIJENIH SKUPINA PROTEINA KOJI SE TEORETSKI MOGU VEZATI PO JEDINICI MASE IZMJENJIVAČA

– RADNI KAPACITET• KOLIČINA NEKOG PROTEINA KOJA SE PRI EKSPERIMENTALNIM

UVJETIMA STVARNO VEŽE NA JEDINICU MASE IZMJENJIVAČA

PROVOĐENJE POSTUPKA

• IZBOR IONSKOG IZMJENJIVAČA– KATIONSKI / ANIONSKI

– JAKI / SLABI

– VELIČINA PORA

• IZBOR MOBILNE FAZE (PUFERA)– IONSKA JAKOST PUFERA ZA VEZANJE

PROTEINA

– pH PUFERA ZA VEZANJE PROTEINA

– DODATAK DETERGENATA

• IZBOR POSTUPKA– “ŠARŽNO” / U STUPCU

– NAČIN ELUCIJE• ELUCIJA U KORACIMA

• ELUCIJA POMOĆU GRADIJENTA IONSKE JAKOSTI (pH)

• IZBOR DIMENZIJA STUPCA

• IZBOR VELIČINE FRAKCIJA

• IZBOR POSTUPKA ZA REGENERACIJU I KONZERVIRANJE STUPCA

BIOSPECIFIČNA KROMATOGRAFIJA(AFINITETNA KROMATOGRAFIJA)

• ZASNOVANA NA SPECIFIČNIM INTERAKCIJAMA POJEDINIH PROTEINA S DRUGIM MOLEKULAMA (LIGANDIMA)

• INTERAKCIJE SPECIFIČNE ZA POJEDINE GRUPE PROTEINA– PROTEINI - DNA

– PROTEINI - UGLJIKOHIDRATI (LEKTINI)

– PROTEIN A - IMUNOGLOBULINI

– ENZIM - KOENZIM (ILI NJEGOV HOMOLOG)

– METALOPROTEIN - METALNI ION

• INTERAKCIJE SPECIFIČNE ZA POJEDINE PROTEINE– ENZIM - SUPSTRAT

– ENZIM - INHIBITOR

– HORMON - RECEPTOR

– ANTITIJELO - ANTIGEN

– PROTEIN - ODREĐENA SEKVENCIJA DNA

POSTUPAK BIOSPECIFIČNE KROMATOGRAFIJE

1. PRIPREMA GELA

INERTNI NOSAČ

AKTIVACIJA

1. PRIPREMA GELA

AKTIVIRANI NOSAČ

UGRADNJA RAZMAKNICE (“SPACER-a)

1. PRIPREMA GELA

AKTIVIRANI NOSAČ

VEZANJE LIGANDA

L

L

L

L

2. VEZANJE PROTEINA

AKTIVIRANI NOSAČ

L

L

L

L

3. ELUCIJA PROTEINA

AKTIVIRANI NOSAČ

L

L

L

L

1. DENATURIRAJUĆIM PUFEROM

3. ELUCIJA PROTEINA

AKTIVIRANI NOSAČ

L

L

L

L

2. KONKURENTNIM LIGANDOM

L

L

L

L

3. ELUCIJA PROTEINA

AKTIVIRANI NOSAČ

L

L

L

L

2. KONKURENTNIM LIGANDOM

L

L L

3. ELUCIJA PROTEINA

AKTIVIRANI NOSAČ

L

L

L

L

3. KONKURENTNOM MOLEKULOM

METODE AKTIVACIJE GELAAKTIVACIJA GLUTARALDEHIDOM

NOSAČ -CONH2 +

CHO

(CH2)3

CH

C CHO(CH2)2

CHO

CH C (CH2)2 CHO

NOSAČ -CONH

CHO

(CH2)3

CH

CH CHO(CH2)2

CHO

CH C (CH2)2 CHO

NOSAČ -CONH

CHO

(CH2)3

CH

CH CHO(CH2)2

CHO

CH CH (CH2)2 CHO

LIGAND

LIGAND NH2

AKTIVACIJA CIANOGEN BROMIDOM

NOSAČ-OH

-OH+ CNBr

NOSAČ-O

-O

NOSAČ-O

-OH

C = NH

C N

CIKLIČKIIMIDOKARBONAT

CIANATESTER

LIGAND NH2

NOSAČ-O

-OH

C NH

NH

LIGAND

DERIVAT IZOUREE

NOSAČ-O

-OC = N

LIGAND

SUPSTITUIRANI IMIDOKARBONAT

NOSAČ-O

-OH

C NH

OLIGAND

N-SUPSTITUIRANI KARBAMAT

AKTIVACIJA BISEPOKSIRANIMA

NOSAČ -OH CH2 CH CH CH2

O O

+

NOSAČ -O CH2 CH CH CH2

OO

LIGAND NH2

(OH) (SH)

NOSAČ -O CH2 CH CH CH2

OH OHN LIGAND

(O) (S)

POSTUPAK KROMATOGRAFIJE

• ŠARŽNI

• U STUPCU

• NAČIN PROVOĐENJA KROMATOGRAFIJE NE RAZLIKUJE SE BITNO OD KROMATOGRAFIJE NA IONSKOM IZMJENJIVAČU

• PRI VEZANJU PROTEINA NA LIGAND TREBA VODITI RAČUNA O POSEBNIM ZAHTJEVIMA PROTEINA, ALI I LIGANDA (pH, IONSKA JAKOST, DODATAK POSEBNIH IONA ITD.)

BIOSPECIFIČNA KROMATOGRAFIJA REKOMBINANTNIH PROTEINA

• DODATAK PROTEINSKOG PRIVJESKA (“TAG”)– PROTEINSKI EPITOP ZA KOJI POSTOJI DOBRO

MONOKLONSKO ANTITIJELO (HEMAGLUTININSKI EPITOP)

– 6 ILI VIŠE HISTIDINA U NIZU KOJI KOMPLEKSIRAJU METALNE IONE

– DIO NEKOG PROTEINA KOJI SPECIFIČNO VEŽE NEKI LIGAND (GLUTATION-S-TRANSFERAZA KOJA VEŽE GLUTATION)

• KROMATOGRAFIJA NA ODGOVARAJUĆEM LIGANDU

PROTEIN His-NASTAVAK

METALNI ION(Co2+, Ni2+)

KUGLICA GELA

KORIŠTENJE METODE ZA SPECIFIČNO OBILJEŽAVANJE PROTEINA

KROMATOGRAFIJA REKOMBINANTNIH PROTEINA S GLUTATION-S-TRANSFERAZOM

GSTŽŽELJENI PROTEINELJENI PROTEINP

V8

GSH

GSH

GSH

GSTGSH

ŽŽELJENIELJENIPROTEINPROTEIN

KROMATOGRAFIJA REKOMBINANTNIH PROTEINA S GLUTATION-S-TRANSFERAZOM

PROTEAZAPROTEAZA

KROMATOFOKUSIRANJE

• PRILIKOM KROMATOGRAFIJE NA IONSKOM IZMJENJIVAČU PROTEINSKA VRPCA SE ŠIRI PRILIKOM ELUCIJE, PROLASKOM KROZ STUPAC

• PRILIKOM KROMATOFOKUSIRANJA STVARA SE GRADIJENT pH UNUTAR STUPCA KOJI SE POMIČE ZA VRIJEME ELUCIJE - EFEKT FOKUSIRANJA PROTEINSKE VRPCE

POČETNI PUFER

ZAVRŠNI PUFER

UZORAK

+ + + + + + + ++ -++

+ ----

• KROMATOGRAFIJA BAZIRANA NA HIDROFOBNIM INTERAKCIJAMA IZMEĐU PROTEINA I NOSAČA KOJI JE SUPSTITUIRAN HIDROFOBNIM GRUPAMA

• MOBILNA FAZA – VODENA OTOPINA SOLI• VEZANJE PROTEINA U UVJETIMA KOJI POGODUJU VEZANJU NA NOSAČ – VISOKA KONCENTRACIJA SOLI• ELUCIJA PROTEINA:

• SMANJENJEM IONSKE JAKOSTI• SMANJENJEM POLARNOSTI OTAPALA• DODATKOM DETERGENTA• PROMJENOM pH

•KORISTI SE PRETEŽNO ZA RAZDVAJANJE HIDROFOBNIJIH PROTEINA

HIDROFOBNA KROMATOGRAFIJA

• KROMATOGRAFIJA BAZIRANA NA SPECIFIČNIM INTERAKCIJAMA IZMEĐU PROTEINA I BOJA ZA PROTEINSKE TEKSTILNE TKANINE (VUNA, SVILA)

• MOLEKULARNI MEHANIZMI VEZANJA BOJE RAZLIČITI I U NEKIM SLUČAJEVIMA NEPOZNATI• NEKE BOJE SU ANALOZI KOENZIMA ILI ENZIMSKI INHIBITORI PA SE KROMATOGRAFIJA U OSNOVI NE RAZLIKUJE OD DRUGIH BIOSPECIFIČNIH KROMATOGRAFIJA• OBIČNO NIJE MOGUĆE PREDVIDJETI INTERAKCIJE PROTEINA S BOJAMA PA TREBA U PREDPOKUSU ISPROBATI VIŠE BOJA

CIBACHRON BLUE 3G-A

• KROMATOGRAFIJA BAZIRANA NA MANJE ILI VIŠE SPECIFIČNIM INTERAKCIJAMA IZMEĐU PROTEINA I HIDROKSIAPATITA

• VEZANJE:• POZITIVNI NABOJI PROTEINA VEŽU SE NA NEGATIVNE NABOJE HIDROKSIAPATITA• KARBOKSILNE SKUPINE PROTEINA KOMPLEKSIRAJU KALCIJ

•ELUCIJA:• BAZNI PROTEINI ELUIRAJU SE DODATKOM ANIONA KOJI REAGIRAJU S AMINOSKUPINAMA ILI DODATKOM Ca2+ ILI Mg2+ KOJI KOMPLEKSIRAJU FOSFATNE GRUPE HIDROKSIAPATITA

KROMATOGRAFIJA NA HIDROKSIAPATITU

•ELUCIJA:• KISELI PROTEINI ELUIRAJU SE DODATKOM FOSFATNIH IONA KOJI KOMPLEKSIRAJU Ca2+ IONE JAČE OD KARBOKSILNIH SKUPINA PROTEINA

• NA TAJ NAČIN MOGU SE SPECIFIČNO ELUIRATI KISELI, ODNOSNO BAZIČNI PROTEINI

KROMATOGRAFIJA NA HIDROKSIAPATITU

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

HPLC

• Rezolucija pri svakoj tekućinskoj kromatografiji ovisi o površini krute faze

• Povećanje površine krute faze može se postići smanjenjem promjera kuglica gela

• Stupac sitnih kuglica je gušće sabijen i pruža veći otpor prolasku tekuće faze

• Potreban povišeni pritisak

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

HPLC

• Povišeni pritisak zahtjeva kompliciraniju aparaturu

• Posebni zahtjevi se postavljaju na materijale od kojih je izrađen uređaj

• Posebni zahtjevi za pumpe

• Posebni materijali za izradu gelova (često silikatna osnova )

UPOTREBA HPLC

• GEL FILTRACIJA

• IONSKA IZMJENA

• KROMATOGRAFIJA NA REVERZNOJ FAZI

UPOTREBA HPLC

• GEL FILTRACIJA– HPLC smanjuje efekt širenja vrpci prolaskom

kroz stupac

širinazone

protok

veći proteini

manji proteini

- moguća je primjena znatno većeg protoka u odnosu na površinu presjeka stupca

- skraćuje se postupak gel-filtracije

UPOTREBA HPLC

• IONSKA IZMJENA– HPLC omogućuje:

• Povećan kapacitet stupca

• Povećanu sposobnost razdvajanja

• Povećanu brzinu kromatografije

• Olakšanu upotrebu gradijenta za eluciju

UPOTREBA HPLC

• KROMATOGRAFIJA NA REVERZNOJ FAZI– Particijska adsorpcijska tekućinska kromatografija

– Reverzna faza:• Stacionarna faza hidrofobna (čestice silikagela s vezanim

ugljikovodicima – C2, C8, C12)

• Mobilna faza hidrofilna (smjesa vode i hidrofilnog organskog otapala –na pr. acetonitrila)

• Elucija:– Gradijentom koncentracije organskog otapala

– Promjenom pH koja dovodi do promjene hidrofobnosti proteina

– Najčešće se koristi za razdvajanje peptida, rijeđe proteina

UPOTREBA HPLC• Identifikacija proteina kartiranjem peptida

– Tripsinoliza

– HPLC na reverznoj fazi

UPOTREBA HPLC• Kontrola kvalitete

• Strategija ovisi o: – namjeni pročišćenog proteina

– potrebi aktivnosti proteina

Kako odabrati strategiju pročišćavanja

PRIMJENA POTRBNA KOLIČINA

POTREBNA ČISTOĆA

Identifikacija 2 ng – 2 µg >95%

Dobivanje antitijela 30 – 300 µg >80%

enzimologija 1 – 5 mg >95%

Biofizičke analize 1 mg – 1g >95%

3D struktura 10 – 20 mg >98%

Farmaceutska primjena g – kg >99.5%

• Metoda izolacije proteina ovisi o:– Izvoru

• Vrsti stanica

• Lokaciji unutar stanica

– Potrebnom iskorištenju

– Osjetljivosti konformacije proteina (ako je potrebno izolirati aktivan enzim)


• Nakon izolacije potrebno je pripremiti uzorak za pročišćavanje:– Centrifugiranje/filtracija

• Broj okretaja i duljina centrifugiranja ovisi o načinu razbijanja stanica

– Koncentriranje uzorka• Ultrafiltracija

• Liofilizacija

– Podešavanje temperature i pH


• Planiranje koraka pročišćavanja:– Koliko?

• Ovisno o količini proteina u ekstraktu

• Ovisno o različitosti proteina kojeg se izolira od ostalih

• Bazirano na literaturnim podacima 100 objavljenih postupaka pročišćavanja:

– Prosječan broj koraka: 4 (u literaturi postoje opisani postupci pročišćavanja od 1 do 10 koraka)

– Manji broj koraka povećava iskorištenje postupka – prosječno iskorištenje 28%

– Prosječan stupanj pročišćavanja 6380

– Koji koraci?• Ovisno o različitosti proteina kojeg se izolira od ostalih


• Planiranje koraka pročišćavanja:– Kojim redoslijedom planirati korake?

• Obično od metoda s manjim stupnjem pročišćavanja prema onima s većim


METODA PROSJEČAN STUPANJ

PROČIŠĆAVANJA

MAKSIMALAN STUIPANJ

PROČIŠĆAVANJA

TALOŽENJE 3 10

IONSKA IZMJENA 10 70

HIDROFOBNA KROMATOGRAFIJA 30 70

GEL FILTRACIJA 10 100

BIOSPECIFIČNA KROMATOGRAFIJA 100 1000

• Planiranje metode praćenja pročišćavanja:– Biološka aktivnost

• Enzimski testovi

• Testovi vezanja

• Biološki testovi

– Veličina/naboj• SDS elektroforeza

• Izoelektrično fokusiranje

– Imunološke metode• Imunoblot

• ELISA



prirodni materijal

izolacija

smjesa proteina

s p

proteini

s p

aktivnost

elektroforeza

100 mg proteina100 I.U. aktivnostisp. akt. 1 I.U./mg

smjesa proteina

taloženje+

supernatant talog

elektroforeza

st s

proteini

st s

aktivnost

t t


gel-filtracija

A/280 nm

frakcija

elektroforeza

st A

proteini

st A

aktivnost

B B

A B


ionska izmjena

A/280 nm

frakcija

A B

elektroforeza

st A

proteini

st A

aktivnost

B B


Kako olakšati pročišćavanje

• Izbor izvora proteina– Stanice s visokim specifičnim aktivitetom– Podešavanje uvjeta ekspresije– Stanice iz kojih je protein lakše dostupan (na pr. kao sekretorni

protein)– Gen za protein kloniran u prikladniji izvor

• Genetske modifikacije proteina u svrhu lakšeg pročišćavanja– Dodatak signala za sekreciju– Gensko obilježavanje (“tagging”)– Stvaranje genskih fuzija

METODE_SEPARACIJE

Documents

Transcript of METODE_SEPARACIJE